KR100292912B1 - 지질피복되지않은바이러스를불활성시키는방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 55 - 67℃ 범위의 고온에서 5 - 30 시간동안 유효량의 디알킬 또는 트리알킬 포스페이트 및 임의로 계면활성제로 혈액, 혈장 또는 유사한 천연원료를 동시에 또는 연속적으로 처리시킴으로써, 특히 상기 원료들로부터 얻어진 단백질 -함유 조성물내에 존재하면서 지질피복물을 갖지않는 바이러스를 불활성시키는 방법에 관한다.

Description

지질 피복되지 않은 바이러스를 불활성시키는 방법

본원의 목적은 혈액, 혈장 또는 유사한 천연 원료에서 얻어진 단백질 함유 조성물내 지질 피복되지않은 바이러스를 불활성시키는 방법이다.

EP제 0 131 740 B1 호에서는 불안정한 단백질을 함유한 조성물내 바이러스를 불활성시키는 방법에 대하여 기술하고 있다. 불활성시킬 바이러스는 지질을 함유하고 구체적으로 지질 피복물을 가질 것이다. 지질 - 함유 바이러스에서 제거시킬 조성물은 전혈 ( whole blood ), 혈장, 혈장 농축물, 상기 혈장의 혹종의 분급물로부터 얻어진 침전물, 상기 혈장의 혹종의 분급물로부터 얻어진 상청액, 혈청, 극저온 침전물, 세포 용균액, 혈액세포에 내포된 단백질, 혈액으로부터 유도되지 않는 정상 또는 암세포 생성물, 및 유전자 접합 공정의 생성물로 이루어지는 그룹에서 선택된 천연원료에서 유도된 것이다. EP 제 0 133 740 B1 호에 기술된 방법은 단백질의 실질적인 변성을 일으키지 않으면서 불안정한 단백질을 함유한 조성물에서 지질 - 함유 바이러스를 제거할 수 있는 충분한 시간동안 불안정한 단백질을 함유한 조성물을 유효량의 디알킬 또는 트리알킬 포스페이트와 접촉시키는 것으로 이루어진다. 지질 - 함유 바이러스를 불활성시키기 위하여 기술된 상기 방법은 최소한 5 시간 동안 50 - 70 ℃에서의 열처리와 결합하여 사용될 수 있다.

그러나 상기에서 언급된 형태의 제조물에서, 어떠한 지질도 함유하지 않은, 구체적으로 지질 피복물을 갖지않는 바이러스 ( " 지질 피복되지 않은 바이러스 ") 를 불활성시키는 것이 점차 중요해지고 있다. EP 제 - 131 740 B1 호에서 " 지질을 함유하지않는 바이러스 " 로 간주된 지질 피복되지 않은 바이러스 그룹은 구체적으로는 헤파티티스 A 바이러스, 파르보바이러스 B 19와 같은 파르보바이러스 및 폴리오바이러스를 포함한다. 이러한 바이러스는 혈액, 혈장, 혈청, 극저온침전물, 세포 용균액 및 유사한 천연원료내의 병원체로 존재할 것이다.

본 발명의 목적은 지질피복물을 함유하지않거나 또는 단지 소량의 지질만을 함유하는, 혹종의 제조물내에 존재하는 바이러스를 불활성 시키는 방법을 제공하는 것이다. 상기 제조물은 구체적으로 전혈, 혈장, 혈장농축물, 상기 혈장의 혹종의 분급물로부터 얻어진 침전물, 상기 혈장의 특종의 분급물로부터 얻어진 상청액, 혈청, 극저온침전물, 세포용균액, 또는 유사한 천연원료로부터 얻어진 불안정한 단백질을 함유하는 조성물을 포함할 것이다.

본 발명 목적은 놀랍게도 55 - 67 ℃ 범위의 고온에서 5 - 30 시간동안 유효량의 디알킬 또는 트리알킬 포스페이트 및 임의로 계면활성제로 혈액, 혈장 또는 유사한 천연원료를 동시에 또는 연속적으로 처리시킴으로써 구체적으로 상기 원료들로부터 얻어진 단백질 - 함유 조성물내에 존재하면서 지질피복물을 갖지않는 바이러스를 불활성시키는 방법에 의해 달성된다.

디알킬 또는 트리알킬 포스페이트의 양은 바람직하게는 0.001 - 1 % 범위이다. 본 방법을 수행하기 위하여, 온도는 바람직하게는 60 - 65 ℃로 조정한다. 열처리는 바람직하게는 최소한 10 시간 지속되어야 한다.

지질을 함유하지 않는 불활성시켜야할 바이러스를 함유한 단백질 분급물은구체적으로 상기에서 언급한 형태의 천연원료로부터 유도된 것이고, 구체적으로 불활성 반응전에 침전법 또는 크로마토그래피 방법으로 당해 단백질을 농축시켜야 할 것이다.

EP 제 0 367 840 A1 호에서 기술한 바와같이 크로마토그래피 방법을 이용한 단백질 분급물의 농축은 특히 유용한 것으로 입증되었다. 상기 방법은 먼저 단백질을 제공하는 천연 원료를 음이온 - 교환 크로마토그래피시키는 단계를 포함한다. 디에틸아미노에틸렌그룹으로 개질시킨 크로마토그래피기질 물질이 특히 유용한 것으로 입증되었다.

그다음, 천연원료 또는 천연원료에서 얻어진 농축 분급물을 열처리 및 디알킬 또는 트리알킬 포스페이트로 처리시키는 상기한 바이러스 불활성 방법을 실시한다.

계면활성제 존재하에 디알킬 또는 트리알킬 포스페이트를 사용한 상기 처리를 수행하는 것이 이로움을 알게되었다. 알킬 포스페이트로서는 구체적으로 C_1-10, 특히 C_2-10을 함유한 알킬 그룹을 갖는 디알킬 포스페이트 또는 트리알킬 포스페이트와 같은 EP 제 0 131 740 B1 호에 언급된 포스페이트가 사용될 것이다. 구체적으로, 트리 - n - 부틸 포스페이트, 트리 - t - 부틸 포스페이트, 트리 - n - 헥실 포스페이트, 트리 (2 - 에틸헥실) 포스페이트, 및 트리 - n - 데실포스페이트와 같은 트리알킬 포스페이트가 사용될 것이다. 혼합 트리알킬 포스페이트도 유용하다. 유사하게는 디알킬 또는 트리알킬 포스페이트의 당해 치환된 디알킬 포스페이트 또는 혼합물 역시 사용할 수 있을 것이다.

계면활성제로서는 구체적으로 비독성 세제가 사용될 것이다. 최소한 0.1 중량 %의 양으로 존재해야하는 비이온성 세재로서는 다음과 같은 유도체들을 언급할 수 있을 것이다 : 구체적으로 Triton ×100 (에톡실화한 알킬 페놀) 이라는 상표명으로 공지된 지용성의 비이온성 계면활성제뿐 아니라 예를들면 Tween 80, Tween 20 및 Polysorbat 80 이라는 상표명으로 공지된 제품과 같은 무수 소르비톨의 부분적 에스테르, 지방산의 폴리옥시에틸렌 유도체. 예를들면 N - 도데실 - N,N - 디메틸 - 2 - 암모니오 - 1 - 에탄설포네이트와 같은 설포베타인 또는 이의 유도체와 같은 양쪽이온성 계면활성제 또는 옥틸 - β- D - 글루코피라노사이드와 같은 비이온성 세제 역시 사용할 수 있을 것이다. 계면활성제의 양은 바람직하게는 0.01 - 10 %이다.

특히 바람직하기로는 트리 - n - 부틸 포스페이트 및 Tween, 또는 소듐 콜레이트/TNBP (트리 - n - 부틸 포스페이트) 의 혼합물들이다.

사카로스, 소르비톨, 또는 단쇄의 중성 아미노산과 같은 보조제의 존재하에 고온에서 상기 처리방법을 수행하는 것이 이로운 것으로 밝혀졌다. 원칙적으로, EP 제 0 018 561 호 및/또는 DE 제 40 01 451 A1 호에서 언급된 안정화 인자들을 기술된 양으로 사용할 수 있을 것이다. 예를들면 사카로스의 농도가 최대 200 중량 %인 것이 바람직한 것과같이 보조물질 (안정화 인자들)의 농도는 매우 높을 것이다. 구체적으로, 단쇄의 아미노산으로서는 글리신, 리신 및/또는 아르기닌이 사용될 것이다.

놀랍게도, 혈액, 혈장 또는 유사 천연원료로부터 얻어진 단백질 - 함유 조성물의 처리는 심지어 칼슘이온을 가하지 않고도 고온에서 수행될 수 있을 것이다. EP 제 0 106 269 호에서는 칼슘이온을 가하는 것이 필수적으로 요구되는 것으로 간주된다. 따라서, EP 제 0 106 269 호에서는 여기에 기술된 저온 살균 공정내에서 Ca²⁺가 혈우병 극저온 침전물의 분급물을 안정화시킨다고 기술하고 있다. 이는 본 발명에 따르면 필요치 않다.

임의로 고온에서, 디알킬 또는 트리알킬 포스페이트로 처리한 다음 크로마토그래피시켜 정제시킬 것이다. 이러한 크로마토그래피에 의한 정제단계는 바람직하게는 DEAE 개질시킨 이온 교환수지들과 같은 음이온 교환 물질상에서 수행한다.

상기와 같이 농축되거나 얻어진 VIII 인자, IX 인자, 피브리노겐, 감마 - 글로불린 등과같은 약리학적으로 중요한 단백질은 헤파티티스 A, 파르보바이러스 B 19와 같은 파르보바이러스, 또는 폴리오바이러스 형태의 활성바이러스를 함유하지 않는다.

본 발명에 따른 방법은 VIII 인자 제조물내에서 지질을 함유하지않는 바이러스를 불활성시키는 다음 실시예에서 보다 더 자세히 예시되어 있다.

실시예 1

Fractogel^RDEAE 수지로 충전된 컬럼상에 시판되는 극저온 침전물을 도포하였다. 배출물을 수거하여 VIII 인자 활성에 대하여 검사한다음, 110 mM 의 소듐 클로라이드, 10 mM의 소듐 시트레이트 × 5H₂O, 120 mM의 글리신, 1 mM의 칼슘 클로라이드 × 2H₂O를 함유하고 pH가 6.9 - 7.0 (1M의 HCl로 조정하여)인 완충용액으로 상기 컬럼을 세척하였다. 연속하여, 250 mM의 소듐 클로라이드, 20 mM의 소듐 시트레이트 × 5H₂O, 80 mM의 글리신, 16 mM의 리신, 2.5 mM의 칼슘클로라이드 × 2H₂O를 함유하고 pH가 6.9 - 7.0인 완충 용액으로 상기 칼럼을 처리하였다.

이렇게 얻어진 분급물에 사카로스를 가한다음, 이 분급물을 64℃에서 12시간동안 정치시키면서 트리 - n - 부틸 포스페이트/Tween ( 0.1 %/0.3 %)을 가하였다. TSK Fractogel^RDEAE 또는 EMD Fractogel^RDEAE 상에서 이온교환 크로마토그래피를 다시 수행하였다.

250 mM의 소듐 클로라이드, 20 mM의 소듐 시트레이트 × 5H₂O, 80 mM의 글리신, 16 mM의 리신, 2.5 mM의 칼슘 클로라이드 × 2H₂O를 함유하는 완충용액으로 VIII 인자 활성 분급물을 용리시켰다.

실시예 2

열처리전에 칼슘 화합물을 완충용액 (세척 완충용액 및 용리 완충용액) 에 가하지 않고 실시예 1에 기술한 바와같이 시판되는 극저온 침전물을 처리하여 칼슘이온이 존재하지 않는 가운데 바이러스를 불활성시켰다. 칼슘 이온을 가하지 않고 열처리시킨 다음 실시예 1 에 기술된 바와같이 추가적으로 가공하였다.

Claims (10)

1. 55 - 67℃ 범위의 고온에서 5 - 30 시간동안 0.001 - 1% 양의 디알킬 또는 트리알킬 포스페이트로 혈액, 혈장 또는 유사한 천연원료를 동시에 또는 연속적으로 처리시킴으로써, 상기 원료들로부터 얻어진 단백질 - 함유 조성물내의 지질이 피복되지 않은 바이러스를 불활성시키는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 계면 활성제가 부가되는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 열처리를 최소한 10 시간 지속시키는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 우선 크로마토그래피법 또는 침전법으로 상기 천연원료로부터 단백질을 농축시키는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 고온에서 처리시킴과 동시에 디알킬 또는 트리알킬 포스페이트로 처리시키기전에, 사카로스, 소르비톨 또는 단쇄의 중성 아미노산과 같은 보조물질을 가하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 사카로스의 농도가 최대 200 중량%인 방법.
7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 아미노산으로서 글리신, 리신 및/또는 아르기닌이 사용되는 방법.
8. 제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 고온에서의 처리가 칼슘이온을 가하지 않으면서 수행되는 방법.
9. 제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 열처리시킴과 동시에 상기 디알킬 또는 트리알킬 포스페이트로 처리시킨 다음 별도의 크로마토그래피법으로 정제시키는 방법.
10. 제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 고온에서 디알킬 또는 트리알킬 포스페이트로 처리시킬때의 pH 가 6.0 - 8.5인 방법.