KR100288718B1 - 치료용 항체 유발 및 항암 및 항비루스 활성을 위한지질-에이 동족체: 신규한 단당류 및 이당류 중간체 - Google Patents

Abstract

지질-A에 결합하는 항체를 유발하는데 유용하고, 그람-음성 세균 감염에 대한 보호 면역을 유발하고, 비루스 감염을 막고, 암 성장을 억제하고, 지질-A와 경쟁하여 수용체에 결합하는 화합물을 기재한다. 또한 이들 화합물을 함유하는 조성물을 기재한다. 더우기, 이 화합물에 의해 유발된 항체, 뿐만 아니라 예컨대 패혈증 치료시에 상기 항체의 사용에 관한 것도 개시된다.

Description

치료용 항체 유발 및 항암 및 항비루스 활성을 위한 지질-에이 동족체: 신규한 단당류 및 이당류 중간체{LIPID-A ANALOGS: NEW MONOSACCHARIDE AND DISACCHARIDE INTERMEDIATES FOR ELICITING THERAPEUTIC ANTIBODIES AND FOR ANTITUMOR AND ANTIVIRAL ACTIVITIES}

본 발명은 지질-A 동족체 및 LPS 및 지질-A의 무독화를 위한 촉매 항체 유발과 같은 상기 동족체의 사용방법에 관한 것으로, 상기 동족체는 패혈성 쇼크 치료를 위해, 그람-음성 세균 감염의 유해 효과에 대항해 면역성을 유발하기 위해, 비루스 감염에 대항해 보호하기 위해, 암 성장 치료 및 억제를 위해, 및 지질-A 와 경쟁하여 수용체에 결합하기 위해 지질-A 및 LPS에 결합한다. 또한, 본 발명은 LPS 및 지질-A 의 무독화를 위한 촉매 항체를 유발하기 위한 전이 상태 동족체로서 지질-A 동족체에 관한 것으로, 조성물은 항 비루스 조성물로서, 항암 조성물로서 그람-음성 세균 감염에 대한 보호 활성을 위해 및 지질-A와 경쟁하며 수용체에 결합하는데 유용하다. 또한 본 발명은 LPS 및 지질-A의 무독화를 위해 지질-A의 에스테르 결합 및 글리코시드 결합을 끊는 촉매 항체; LPS, 지질-A 및 지질-A 동족체에 결합하는 항체; 및 예컨대 패혈증 치료시에 상기 항체 이용 방법에 관한 것이다.

본 발명은 부가적으로 지질-A 및 그의 동족체에 대항한 IgG 및 IgM 동기준표본(isotype) 항체 및 유사 구조의 양성 분자 생산 방법에 관한 것이다.

본 명세서의 문장을 통해 다양한 서류들이 인용되며, 이들 서류에 대한 완전한 언급은 청구범위 바로 앞의 목록에 있다. 이들 서류는 본 발명의 분야에 속하고; 이들 서류 각각은 본원에 참고 문헌으로 병합된다.

균혈증은 혈관내 심각한 미생물 감염이다. 미생물은 열, 쇼크, 일시적 백혈구 증가증 및 트롬보세포 증가증을 포함하여 다양한 증후군을 야기한다. 심장 산출량이 혈관내 부피 감소로 인해 혈압을 유지할 수 없을 때 패혈성 쇼크가 야기된다. 패혈성 쇼크는 그람-음성 및 그람-양성 세균, 곰팡이, 및 빈번하지 않지만 라케챠 또는 비루스에 의해 야기될 수 있다. 그람-음성 균혈증의 대부분은 에쉬리키아 콜리 (Escherichia coli) 때문이다.

그람-음성 바실러스로 인한 원내 균혈증의 빈도는 항생제의 출현에도 불구하고 1950년 이래로 증가해 왔다. 심지어 최적 상황하에 치료될 때도 미합중국에서 매년 260,000 내지 300,000 환자에게 영향을 미치며 20 내지 50%의 치사율을 갖는다고 추정된다(1, 2). 균혈증이 더 나아가 신장 또는 호흡기 장애로 악화되면, 치사율이 90-100%에 달한다(3).

패혈증 및 패혈성 쇼크는 많은 원인, 예컨대 외상 환자의 상처 오염, 수술후 외과 합병증, 국재 감염의 전파, 또는 침습 도구를 통한 또는 그 주위의 미생물 공격으로부터 야기된다. 패혈증은 더 나아가 면역 억제로 악화될 수 있는데, 이는 중요한 질병중에 종종 일어난다. 대부분의 환자는 감염 생물로부터 독성 물질의 방출(예컨대 내독소), 2차 외래 중개물의 방출 및 대사 상태 변화 때문이라고 생각되는 점진적인 다-기관 장애로 사망하며, 이들은 점진적인 조직 허혈을 초래한다.

그람-음성 균혈증의 증상 및 효과중 다수는 내독소, 또는 세균 외막의 유다당류(LPS)성분이 세균-유발 쇼크의 원인제라는 가정과 일치한다. LPS의 지질-A 부분은 엔테로박테리아세 (Enterobacteriaceae)중에 구조적으로 보존되고 내독소로 인한 대부분의 생물학적 효과의 원인이다. 아실 및 아실옥시아실 사슬의 길이, 수, 포화도 및 위치가 지질-A 구조마다 다르지만, 기본 구조는 모든 지질-A 분자가 동일하다. 이. 콜리 같은 몇몇 유기체로부터의 지질-A 분자는 다양하지 않다. LPS는 다양한 세포 유형을 자극하여, 중개물, 호르몬 또는 기타 인자들, 특히 암회사 인자 (TNF), 인터루킨-1 및 인터루킨-2를 방출시키며, 이는 이어서 다른 기관 또는 표적 조직에 대해 작용한다(4). 현행 치료 조정은 항생제 및 혈관내 부피를 증가시키는 유체를 포함하나, 이런 치료는 LPS에 의해 개시된 연속적인 효과를 종종 성공적으로 멈추지 못한다. 항생제는 패혈증을 감소시키나, 또한 혈류내로 흐르는 LPS의 양을 증가시킨다(5). 2차 합병증이 일어나므로, 의사는 손상된 표적 기관을 보상하거나 구하기 위해 다른 치료법을 사용해야만 한다. 지질-A에 대해 특이적인 쥐 및 사람 모노클로날 항체를 사용하는 실험적 치료는 고무적인 결과를 얻고 있다(6, 7).

또한 패혈증 또는 패혈성 쇼크에 대한 치료로서 LPS의 지질-A 부분에 특이적인 항체를 사용하는 것이 제안되었다. 상기 항체는 비교적 큰 분자이고 조직을 용이하게 침투하지 않는 IgM 항체였다.

LPS의 지질-A 영역에 대해 생산된 대부분의 모노클로날 항체는 R-돌연변이 그람-음성 세균의 죽은 세포, 또는 부가적 지질-A 또는 동족체로써 피복된 상기 세포로써 면역화함으로써 생산되었다. 이 연구는 면역 체계가 천연 지질-A 구조물에 의해 제공되고 동시에 그것이 동족체와 함께 제공되므로 주어진 Mab에 대해 항원을 유발하는 것이 무엇인지 정확히 알 수 없다는 단점을 갖는다. 촉매 활성을 포함하는 개선된 치료 성질을 갖는, 지질-A에 대한 신규한 항체를 생산하기 위하여 한정된 동족체로써 면역 체계를 특이적으로 자극하는 것이 바람직하다.

그외에 리포솜이 불량한 면역원 단백질에 대한 항체 반응을 발생하거나 해로운 보조약의 필요성을 경감시키는 면역원 및 백신에 대한 기초물로써 널리 성공적으로 사용되었다(8, 9). 또한 지질-A를 혼입한 리포솜이 정제 지질-A와 반응할 수 있는 항체를 유발할 수 있다는 것도 알려져 있다(10). 최근 지질-A를 혼입한 리포솜을 사용하여 펩티드 서열이 유래된 천연 단백질과 반응하는 짧은 합성 펩티드에 대한 항체를 야기했다(11).

최근 모노클로날 항체 단편을 골수종 세포와 특이적 B-세포를 융합하여 MAb 를 분비하는 하이브리도마를 생산하는 통상의 방법이 아닌 방법에 의해 분리할 수 있음을 알았다. 새로운 방법은 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 및 클로닝 이어서 섬유상 파지 입자의 표면 상에 (12, 13) 또는 재조합 람다-파지로써 감염된 세균의 플라스마 주변 공간에(14) 기능성 항원 결합 분자로서 발현시킴으로써 증폭에 의해 항체 분자를 코딩하는 유전자 단편의 분리를 수반한다. 항체-코딩 유전자 단편의 PCR 증폭을 위한 출발점은 다음중 임의 것일 수 있다: 항원, 예컨대 전이 상태 동족체로써 면역화된 생쥐 또는 기타 동물로부터 단리된 비세포; 면역화 안된 동물로부터 단리된 비세포; 사람 공급자로부터 단리된 말초 혈액 임파세포. 본 명세서를 통틀어 항체 (또는 촉매 항체) 또는 그의 단편에 대한 언급은 하이브리도마 기술에 의해 유래된 항체 및 상기 서술된 박테리오파지 기술을 사용하여 단리된 항체 둘다에 적용됨을 알 수 있다. 상기 기술에 대한 충분한 설명은 1992년 2월 24일자로 출원된 동시계류중인 출원 일련 번호 07/841,648에 제공되며, 이는 참고문헌으로써 본원에 병합된다.

촉매 항체가 지지체 (또는 항체)에 대해 화학 반응을 수행하는 방식은 근본적으로 효소의 화학반응 수행방법을 서술한 동일한 이론적 원리에 의해 조정된다. 발생하는 대부분의 화학적 형질 전환에 있어, 반응물과 생성물 사이에 존재하는 에너지 장벽을 극복하기 위해 실질적인 활성 에너지가 필요하다. 효소는 전이상태로서 공지된 에너지 장벽의 정상에 있는 짧은 수명의 불안정한 화학종을 형성하는데 필요한 활성화 에너지를 낮춤으로써 화학 반응을 촉매한다(15, 16).

전이 상태를 제한하는 속도의 자유 에너지를 낮춰 화학 반응 속도를 가속시키는 효소 촉매반응에는 4개의 기초 메카니즘이 사용된다. 먼저, 효소의 활성 부위는 원자 및 전자 구조가 전이 상태에 상보적이므로, 전이 상태의 에너지는 용액상태에 자유롭게 있을 때보다 효소에 결합될 때 낮아진다. 둘째로, 종종 일반 산 및 염기 잔여물이 대안적인 및 낮은 에너지 전이 상태를 통해 반응을 진행시키는 촉매 활성 부위에서의 촉매 반응에 참가하기 위해 최적으로 위치조정됨을 알 수 있다. 세번째 메카니즘은 공유 효소-기질 중간체의 형성을 수반한다. 네번째로, 모델 체계는 반응에 대한 적절한 방향으로 결합 반응물이 적어도 7차의 등급으로 반응물의 '유효 농도'를 증가시킬 수 있음을 보였다(7).

이러한 효소 촉매 반응에 대한 이해를 통해, 촉매 활성을 갖는 몇몇의 항체가 고안되고 단리되었다(18). 항체는 서술된 반응의 전이상태와 유사한 화합물 (즉, 전이 상태 동족체)에 대해 유발된다.

몇몇 연구소는 LPS 및 지질-A 동족체의 붕괴 및 무독화를 연구했다(19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33). 이들 연구는 하나이상의 아실옥시아실기가 제거된 지질-A의 합성 동족체 (E. 콜리)가 지질-A 그 자체보다 덜 독성임을 시사했다. 또한 LPS의 무독화 가능성이 효소 아실옥시아실 가수분해효소로써 지질-A의 에스테르 결합을 가수분해함으로써 증명되는데, 이는 LPS의 3-히드록시테트라데카노일 사슬을 제거하여 히드록실기를 남긴다(34, 35, 36, 37). 또 다른 연구는 합성 0-데아실화 지질-A 화합물이 비독성임을 시사한다(38, 39).

이들 연구에 근거하여 지질-A 및 LPS의 에스테르 결합을 끊어 내독소를 무독화할 수 있는 촉매 항체를 유발하는 지질-A 및 LPS의 전이상태 동족체를 개발하는 것이 바람직하다. 촉매 항체에 있는 표적 결합은 제40도에 화살표로 표시되며 에스테르 결합 가수분해를 위해 표적은 Immu-1, Immu-2, 및 Immu-3으로 지정된다. 또한 지질-A 및 LPS의 합성 단당류 동족체가 비독성임을 보였다(40). 이 사실에 근거하여, 또한 LPS 및 지질-A의 글리코시드 결합을 단당류 유도체를 절단하는 (제40도에서 Immu-4 부위) 촉매 항체를 유발하는 전이 상태 동족체를 고안하는 것이 바람직하다. 지질-A의 아미딘 전이 상태 동족체에 대한 촉매 항체를 유발함으로써 이를 수행하는 것이 바람직하다.

촉매 항체를 사용하여 패혈증 및 패혈성 쇼크를 치료하는 것이 바람직하다. 촉매 항체는 단일 분자가 LPS의 많은 분자들을 불활성화할 수 있으므로 보통 항체보다 더 유효하다. 촉매 항체는 촉매 항체가 IgG 형 항체 또는 그의 촉매활성 단편 (예컨대, Fab, Fv, SCAb (단일-사슬 항체), 크기가 더 작음)일 수 있으므로 더 우수하게 관입될 수 있다. 이들이 IgM 보다 작은 크기의 통상적인 (비-촉매성) LPS 결합 항체라면 (예컨대 IgG 또는 단편) 치료 작용과 관련된 효과기 기능이 결핍되므로 치료시에 효과를 내기 어렵거나 덜 효과적이다. 반면에, 촉매 항체의 효과기 기능, 즉 LPS의 화학적 무독화는 결합 부위에 의해 중개되므로 상기 부위를 함유하나 작은 임의 단편이 동일하게 활성일 것이다. 또한 패혈증 또는 폐혈성 쇼크 치료에 유용한 신규한 IgM-형 항체가 바람직하다. 더 나아가, 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 치료하기 위해-다양한 촉매항체의 또는 촉매 및 결합항체의 혼합물의 (및 IgG, IgM, 항체 단편, 또는 IgG 및 IgM 및 항체단편의 혼합물의)-칵테일을 사용할 수 있으면 바람직하다. 따라서, 원하는 촉매 및 결합 항체를 유발할 수 있는 지질-A 동족체를 얻는 것이 훨씬 바람직하다.

더 나아가, 지질-A 및 LPS의 무독화를 위해 두 단당류 사이의 글리코시드 결합을 절단함으로써 패혈증 및 패혈성 쇼크를 치료하는데 치료용 촉매 항체가 바람직하다. 게다가, LPS의 지질-A 부분에 결합한 동족체에 대항해 발생된 항체는 패혈증 치료시에 치료 효과를 가지므로 바람직하다. 기타 화합물 예컨대 글리코시드 결합 함유 약제의 독성을 감소시키기 위한 또는 화합물, 예컨대 글리코시드 전약제를 활성화하기 위한 촉매 항체가 바람직하다. 또한 예컨대 독소 물질에 대항해 백신화하기 위해 면역학적 반응으로서 상기 항체를 유발시킬 수 있으면 바람직하다. 따라서 상기 원하는 항체를 유발할 수 있고 투여될 수 있는 지질-A 동족체를 얻는 것이 훨씬 바람직하다.

내독성 활성의 원인인 지질-A는 또한 이로운 항암(TNF 유도) 및 항비루스 (IFN 유도)활성을 나타낸다. 감소된 독성을 갖는 지질-A 동족체가 제조되었고 그의 생물학적 활성을 연구했다(39, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91). 모노포스포릴화 지질-A 동족체는 리뮤러스(Limulus), 유사분열물질의, PBA, TNF (암 회사 인자)-유도 및 IFN (인터페론)-유도 활성 뿐만아니라 그람-음성 세균에 대한 보호활성, 항비루스 활성 및 항암 활성을 나타냈다.

또한 감소된 독성을 가지나 동등하거나 증가된 이로운 항암 및 항비루스 활성을 갖는 지질-A 동족체를 제조하는 것이 바람직하다. 상기 언급된 연구서들은 아실 사슬을 갖는 지질-A의 단당류 유도체 및 모노포스포릴 지질-A 동족체가 비독성이나 약간의 유효한 활성들을 보유함을 증명한다. 이들 분자의 활성은 지질 사슬의 조성 (예컨대, 기능기 및 개개 지질 사슬의 존재 및 위치)에 좌우될 수 있으나; 출원인은 특정 이론에 구애받지 않는다. 예컨대, 단당류의 2-아미노기에 부착된 라우릴옥시 테트라데칸산기 및 3-히드록시기에 부착된 지질 사슬 상의 유리 히드록시기 (즉, 히드록시 테트라데칸산)둘다의 존재가 활성을 유도하나 단지 온화한 IFN 활성을 갖는 우수한 TNF를 갖는 화합물을 생산함을 보였다. 반대로, 이들 두 기, 즉 3-히드록시기에 부착된 라우로일옥시 테트라데칸산기 및 2-아미노 위치에 부착된 히드록시 테트라데칸산기의 위치를 역전시키면 우수한 IFN 유발활성이나 단지 온화한 TNF 유도 활성을 초래한다. 상기 연구는 지질-A 및 LPS의 소수성 지질 영역내 기능기의 존재 및 위치가 활성 발현에 중요한 기능 역할을 함을 알려 준다.

치료제로서 사용하기 위한 신규한 화합물을 고안하는 것이 바람직하다. 예컨대, 아실 사슬을 제거하여 소수성도를 변화시키지 않고 지질 영역내의 히드록시 기능성을 갖는 신규한 화합물을 고안하는 것이 바람직하다.

에스테르 결합에서 카르보닐 탄소 대신에 5가 인을 갖는 동족체를 합성하는 것이 특히 이로운데, 이는 동일 위치에 히드록시기 및 지질 사슬 모두를 허용한다. 상기 지적된 구조-활성 관계는 상기 화합물이 독특하고 개선되고 바람직한 생물학적 활성을 가짐을 나타낸다.

독성이 감소됐거나 심지어 독성이 없는 지질-A 또는 상기 지질-A 유도체의 이로운 활성을 나타내는 지질-A 동족체를 얻는 것이 바람직하다. 또한 (예컨대 동족체의 활성이 지질-A의 활성과 근접하도록) 적응 확실성을 갖는 지질-A 동족체, 뿐만아니라 (예컨대 친유성 영역내 5가 인에 의해) 친유도가 감소되지 않는, 히드록실과 같은 친핵 기능을 도입하기 위한 수단을 얻는 것이 바람직하다. 더우기 당 주쇄에 5가 당을 직접 부착할 수 있는 지질-A 동족체를 갖는 것이 바람직하다. 보다 특히, 결과의 지질-A 동족체가 더 우수한 IFN 및 TNF 유도 활성을 나타내도록 Immu-1 또는 Immu-2 위치 (제40도) 중 하나에 에스테르 및 히드록시 부분을 모두 갖는 것이 바람직하다.

지질-A의 동반 구조에 라벨링된 4개의 위치, 예컨대 Immu-1, Immu-2, Immu-3 및 Immu-4 (제40도)를 더욱더 생각해보면, 이들은 지질-A를 무독화하기 위해 촉매 항체로써 지질-A를 절단하기 위한 부위일 것이다. 그러나, 이전에는 이를 유발하는 상기 촉매 항체 또는 화합물이 서술되지 않았다. 따라서 예컨대 지질-A 또는 LPS의 에스테르 결합 및/또는 글리코시드 결합의 절단에 의해 지질 A를 무독화할 수 있는 우수한 촉매 항체를 유발하기 위해 지질-A 내 상기 위치들에서 가수분해 반응의 전이 상태 (전이상태 동족체)를 모방하는 화합물을 제공하는 것이 바람직하다.

본원에 공개된 발명은 LPS 및 지질-A를 불활성이거나 감소된 독성을 갖는 생성물로 가수분해하여 내독소 활성을 무독화하는 촉매 항체의 생산에 관한 것이다. 임상적 시도는 IgM 부류의 통상적 항체로써 패혈증을 치료할 때 약간의 성공을 입증했다. 즉 항체 치료에 대한 약운동성 (pharmacokinetics)이 이롭다. 본 발명에 의한 촉매 분해물의 첨가는 혈류에 도착하기 전에 조직에 더 잘 침투하고 LPS를 무독화하는데 더 작은 항체 단편을 사용하는 활성 및 더 우수한 효험을 갖는 감소된 투여량의 이점을 제공한다.

본 발명은 지질-A, 그의 동족체 및 기타 유사한 양성 분자에 대한 고역가 IgG 및 IgM 면역 반응을 발생하는 새로운 방법을 제공한다. 이는 반응시에 T-세포의 수반에 첨가하는 비히클 및 특수 자극 펩티드로써 리포솜을 사용한다. 이 방법에 의한 고역가 IgM의 발생이란 상기 배합물이 내독소증 및 그람-음성 패혈증의 해로운 효과에 대항해 보호 면역을 유발하는 백신으로서 대부분 유효하다.

고친화의, 매우 다양한 IgG 성분을 초래하는 지질-A 및 그의 동족체에 대한 T-의존성 면역 반응을 발생하는 능력은 따라서 내독소증 및 그람-음성 패혈증 치료에 유효한 LPS를 무독화할 수 있는 촉매성 모노클로날 항체를 단리할 수 있는 능력을 크게 증가시킨다.

항체를 야기하기 위해 리포솜 혼입 지질-A를 사용하여 본 발명의 새로운 특징은 T-세포를 보충하여, 지질-A 및 그의 동족체에 대한 면역 반응을 극적으로 증가시키는 리포솜 내 헨 에그 리조자임 (HEL)로써 면역화된 Balb/c (H-2^d) 생쥐내 주요 T-세포 자극 영역이라고 공지된 펩티드 서열의 사용이다(92).

본 발명은 그람-음성 균혈증 및 패혈성 쇼크의 치료를 위한 치료용 활성 촉매의 개발을 포괄한다. 지질-A 및 LPS 분자의 4 부위는 촉매 항체에 의한 절단 표적이다: 1) 2'-N 글루코사민 위치에 연결된 아실옥시아실 사슬의 에스테르 결합 (제40도에 Immu-1로 명시) (2) 3'-O 아실 기의 아실옥시아실사슬의 에스테르 결합 (제40도에 Immu-2로 명시 (3) 글루코사민의 3'-O 위치의 0-아실 사슬의 에스테르 결합 (제40도에서 Immu-3으로 명시), 및 4) β1-6 결합 글루코사민 잔기 사이의 결합 (제40도에서 Immu-4).

본 발명은 지질 영역내 특정 위치의 4가 탄소를 5가 인으로 대체하여 소수성도의 변화없이 (아실 사슬을 제거하지 않고) 지질영역내에 히드록시 관능기를 갖는 지질-A-동족체를 제공한다. 본 발명의 전이 상태 동족체는 동일한 위치에 히드록시 및 에스테르 기능을 함유하므로 더 우수한 항체를 유발한다.

따라서 본 발명의 목적은 원하는 치료 항체-결합 또는 촉매 항체 중의 하나, 또는 둘다를 유발하는 지질-A 동족체를 제공하는 것이다. 본 발명의 부가적 목적은 지질-A 또는 상기 지질-A 동족체의 이로운 활성을 나타내나, 감소된 독성을 갖거나 독성이 없는 새로운 지질 A 동족체를 제공하는 것이다. 본 발명의 부가적 목적은 하기중 임의 것 또는 전부를 갖는 지질-A 동족체를 제공하는 것이다: 적응 확실성: 친유도를 감소시키지 않고 히드록실과 같은 친핵 관능 도입을 위한 수단 (예컨대 친유성 영역내 5가인); 및 당 주쇄에 5가 인의 직접 부착을 위한 수단.

하기 상세한 서술은 참고로 본원에 병합된 첨부 도면을 참고하여 보다 잘 이해될 것이다, 이때:

제1-39 및 48-52 도는 (I) 화합물 및 그의 중간체 합성을 위한 반응 도식 1 내지 10 (제1-10도), 반응 도식 10a (제11도), 반응 도식 11 내지 19 (제12-20도), 반응 도식 19a (제21도), 반응도식 20 내지 37 (제22-39도), 반응도식 41 내지 42 (제48, 49도), 반응도식 43a (제50도), 반응 도식 43b (제51도) 및 반응 도식 44 (제52도)를 나타나고; 이들 도면은 특정 '도식'을 언급함에 의해 상세한 설명에서 논의된다.

제40도는 지질-A 및 LPS의 무독화를 위해 촉매 항체에 의한 촉매 작용을 위한 표적으로서 라벨링된 Immu-1, Immu-2, 및 Immu-3 및 Immu-4를 갖는 지질-A의 구조를 나타낸다;

제41도는 본 발명의 아미딘 TS 동족체 (79)의 구조를 나타낸다;

제42-44도는 일반식(II) 화합물 및 그의 중간체의 합성을 위한 반응 도식 38 내지 40을 나타낸다;

제45-47도는 일반식(II) 화합물 및 그의 중간체의 합성을 위한 반응 도식을 나타낸다.

제53도는 본 발명의 일반식(I) 화합물을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 일반식(I)의 화합물을 제공한다.

화학식 I

이때:

서로 독립적으로 R₁,R_1',R₂및 R_2'각각은 치환 또는 비치환, 분자 또는 선형 C_1-12알킬, 알켄 또는 알킨 기이고, R₃는 OH, OCH₃, CH₂COOH 또는

이고,

이때 각각의

R_2'및 R_2''는 서로 독립적으로 치환 또는 비치환, 분지 또는 선형 C₁-C₁₂알킬, 알켄 또는 알킨 기이고;

A = NH₂, X = P(OH), Y = Z = C, B (존재한다면) = OCH₃, 또는

A = OH, X = P(OH), Y = Z = C, B (존재한다면) = OCH₃, 또는

A = OCO(CH₂)_nNH₂, X = P(OH), Y = Z = C, B (존재한다면) = OCH₃, 이때 n = 1-10, 또는

A = OH, X = P(OH), Y = Z = C, B (존재한다면) = O(CH₂)_nCO₂H, 이때 n = 1-10, 또는

A = NH₂, X = Z = C, Y = P(OH), B (존재한다면) = OCH₃, 또는

A = OH, X = P(OH), Y = Z = C, B (존재한다면) = OCH₃, 또는

A = OCO(CH₂)_nNH₂, X = Z = C, Y = P(OH), B (존재한다면) = OCH₃, 이때 n = 1-10, 또는

A = OH, X = Z = C, Y = P(OH), B = O(CH₂)_NCO₂H, 이때 n = 1-10, 또는

A = OH, X = Z = C, Y = P(OH), B (존재한다면) = (CH₂)_nCO₂H, 이때 n = 1-11, 또는

A = NH₂, X = Y = C, Z = P(OH), B (존재한다면) = OCH₃, 또는

A = OH, X = Y = C, Z = P(0H), B (존재한다면) = OCH₃, 또는

A = OCO(CH₂)_nNH₂, X = Y = C, Z = P(0H), B (존재한다면) = OCH₃, 이때 n = 1-10, 또는

A = OH, X = Y = C, Z = P(OH), B (존재한다면) = O(CH₂)_nCO₂H, 이때 n = 1-10, 또는

A = OH, X = Y = C, Z = P(0H), B (존재한다면) = (CH₂)_nCO₂H 및 n = 1-11.

R₁, R_1', R₂, R_2', R_2'및 R_2''의 임의 또는 전부의 분지 또는 선형 C_1-11알킬, 알켄 또는 알킨기 상에 있을 수 있는 치환체는 일반식(I) 화합물에 대해 항체가 유발되게 할 수 있고 바람직하게 일반식(I) 화합물의 치료 유효성을 유의하게 감소시키지 않는 임의 치환체일 수 있다. 이들 치환체는 -OH, 알킬, 클로로, 플루오로, 브로모, 요오도, -SO₃, 아릴, -SH,에스테르기, 에테르기, 알케닐, 알키닐, -N₂ ⁺, 시아노, 에폭시드기, 헤테로시클릭기, 및 -N(R₄)₂(이때, R₄는 H 또는 (치환 및 비치환 아민을 포함하도록) 상기 기재된 치환체)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체일 수 있다.

또한 본 발명은 지질-A 및 LPS의 에스테르 결합 또는 글리코시드 결합을 절단할 촉매 항체를 유발하기 위한 방법, 및 면역원으로서 항체 반응을 최소화하도록 고안된 조성물의 일부인 일반식(I) 또는 일반식(II)의 화합물을 동물에게 투여하는 것으로 구성되는 항체 유발 방법을 제공한다.

부가적으로 본 발명은 일반식(I) 또는 일반식(II)의 화합물 및 적당한 부형제로 구성되는 그람-음성 세균 감염의 효과에 대항한 보호 활성을 위한 조성물을 제공한다. 유사하게, 본 발명은 조성물 투여로 구성되는 상기 보호가 필요한 동물의 그람-음성 세균 감염 효과에 대항한 보호 활성 유도 방법을 포함한다.

더우기, 본 발명은 일반식(I) 또는 일반식(II) 화합물 및 적절한 부형제로 구성되는 항암 조성물, 및, 항암 조성물을 투여하는 것으로 구성되는 암 성장 치료 또는 억제 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 지질-A 및 일반식(I) 또는 일반식(II)의 화합물 둘다에 결합하는 항체, 뿐만 아니라 하기로 구성되는 방법에 의해 제조된 지질-A 및 일반식(I) 또는 일반식(II)에 결합하는 항체를 고려한다:

일반식(I)의 화합물을 함유하는 조성물로써 동물을 면역화하고,

상기 동물로부터 항체-생산 임파구를 제거하고,

임파구를 골수종 세포와 융합시켜 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 생산한다.

본 발명은 또한 이 방법을 포괄한다.

본 발명은 부가적으로 하기로 구성되는, 지질 A 및 일반식(I) 또는 (II)의 화합물에 결합하는 항체 생산 방법을 포괄한다:

동물을 화합물로 구성되는 조성물로 면역화하고,

상기 동물로부터 비장 세포를 단리시키고,

상기 비장 세포로부터 적어도 하나의 항체의 긴(heavy) 및 짧은(light) 사슬 모두의 전부 또는 일부를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 단편을 증폭시키고,

상기 유전자 단편을 재조합 방식으로 비루스 벡터내에 삽입하고,

유전자 단편으로부터 유래된 단백질을 발현하는 생장가능 비루스 임자의 라이브러리를 생산하고;

바람직하게 지질 A 또는 화합물에 대해 유전자 단편의 발현된 항체 결합 단백질에 의해 결합 및/또는 촉매활성을 위해 상기 라이브러리를 스크리닝한다.

본 발명은 또한 촉매 항체를 포함하는, 본 발명에 의해 생산된 항체를 포함한다.

동물의 면역화를 수반하는 상기 항체 생산 방법에서, 바람직한 실시양태로, 면역화는 동물을 적당한 면역원 부형제와 복합된 화합물로 면역화하는 것, 즉 화합물, 지질 A, 및 HEL[105-120]과 같은 T-세포 자극 펩티드로써 동물을 면역화하는 것으로 구성된다.

이 명세서에서 '항체-코딩 유전자'는 항체 또는 그의 기능성 (결합 또는 촉매 활성에 의한) 항체 단편을 코딩하고 발현하는 상기 유전자의 단편을 포함한다.

본 발명의 항체는 촉매 항체일 수 있다. 이들 항체는 상기 치료가 필요한 환자에게 항체를 투여하여 패혈증을 치료하는 데 유용하고; 따라서 본 발명은 상기 항체 및 적당한 부형제로 구성되는 조성물을 투여하는 것으로 구성되는 패혈증 치료 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 적당한 부형제 및 일반식(I)화합물로 구성되는 조성물을 투여하는 것으로 구성되는, 지질-A 와 경쟁하며 수용체에 결합하기 위한 방법을 포함한다.

일반식(I)에 대해, 바람직한 실시양태에서 R₃는

이고, R₁, R_1', R₂, R_2', R_2'및 R_2''각각은 C₁₂H₂₄와 같은 C₁₂선형 알킬기이고;

Y = C, Z = C, X = P(OH), B = OCH₃이고 A = OH ; 이거나,

Y = C, Z = C, X = P(OH), B = OCH₃이고 A = NH₂; 이거나,

Y = C, Z = C, X = P(OH), B = OCH₃이고 A = OCO(CH₂)_nNH₂이고, 이때 n = 1-10 ; 이거나,

Y = P(OH), Z = C, X = C, B = OCH₃이고 A = OH ; 이거나,

Y = P(OH), X = C, Z = C, B = OCH₃이고 A = NH₂; 이거나,

Y = P(OH), X = C, Z = C, B = OCH₃이고 A = OCO(CH₂)_nNH₂이고, 이때 n = 1-10 ; 이거나,

Y = C, X = C, Z = P(0H), B = OCH₃이고 A = OH ; 이거나,

Y = C, X = C, Z = P(0H), B = OCH₃이고 A = NH₂; 이거나,

Y = C, X = C, Z = P(0H), B = OCH₃이고 A = OCO(CH₂)_nNH₂이고, 이때 n = 1-10 이다.

본 발명은 부가적으로 또한 전이 상태 동족체이고 따라서 글리코시드 결합을 함유하는 화합물에 대한 결합 및 그의 절단을 위한 항체, 특히 촉매 항체를 유발하는데 유용한 일반식(II)의 새로운 아미딘 화합물에 관한 것이다. 일반식(I) 화합물과 유사하게, 본 발명의 아미딘 화합물 및 그에 대해 유발된 항체는 여러가지 용도로 유용하다. 아미딘 화합물에 대해 유발된 항체는 지질-A 및 LPS에 결합하고 아미딘 화합물에 대해 유발된 촉매 항체는 (LPS 및 지질-A를 덜 독성이거나 독성이 없게 만드는) 글리코시드 결합의 절단을 촉매한다. 새로운 아미딘 화합물은 지질-A/LPS의 수용체 길항질, 뿐만아니라 항암제, 항비루스제, 및 세균 감염에 대항해 보호할 수 있는 화합물로서 사용될 수 있다. 본 발명의 일반식(II) 화합물은 하기 구조를 갖는다:

이때 서로 독립적인 R_a, R_b, R_c, R_d, R_e및 R_f각각은 치환 또는 비치환, 분지 또는 선형 C_1-11알킬, 알켄 또는 알킨기이고; 치환체는 상기 제공된 R₁, R_1', R₂, R_2', R_2'및 R_2''에 대한 것들일 수 있으며, 바람직하게 각각의 R_a, R_b, R_c, R_d및 R_f는 선형 알킬기이고, 가장 바람직하게 각각은 C₁₁H₂₃이고: E 는 NH 또는 0 이다.

또한 본 발명은 일반식(I) 및 (II) 화합물의 제약학적으로 허용가능한 염 및 제약학적으로 허용가능한 유도체를 포괄한다. 더우기, 본 발명은 일반식(I) 및 (II)화합물의 신규한 중간체, 뿐만 아니라 그의 제약학적으로 허용가능한 염 및 제약학적으로 허용가능한 유도체, 그의 중간체, 및 그의 제약학적으로 허용가능한 염 및 유도체를 포괄한다.

일반식 (I) 및 (II) 의 화합물의 합성은 본 발명에 첨부된 도면으로 제시된 도식에 따를 수 있다. 지질-A 및 상기 지질-A 동족체로서 사용할 수 있는 일반식(I) 및 (II)의 그리고 아미딘 TS 동족체의 화합물이 문헌에서 사용된다.

몇몇의 합성 방법 및 화합물이 특정 입체화학에 대해 특이적인 반면, 이는 어떤식으로도 입체화학 (또는 입체이성질체)의 혼합물의 또는 상이한 입체화학을 갖는 화합물 및 방법을 배제함을 의미하지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 자연 발생 지질-A 및 LPS와 동일한 입체화학을 갖는 화합물 및 방법을 수반한다.

일반식(I)의 화합물은 지질-A 의 Immu-1 및 Immu-2 위치의 히드록시 및 에스테르기가 우수한 IFN 및 TNF 유발 활성을 나타내는 화합물을 제공하도록 한다. IFN 활성은 항비루스 활성이고; TNF 활성은 항암 활성이다. 더우기, 일반식(I) 및 (II)의 화합물은 지질-A의 전이상태 동족체이므로, 항체 유발에 유용할 뿐만아니라 촉매 항체 유발에 유용하다. 촉매 항체 유발 방법에 대해서는 슈체트만 일동의 미합중국 특허 번호 4,888,281을 참고로 하며 이는 참고 문헌으로 병합된다. 이들 항체는 치료 용도를 갖는다 (또한 상기 관련 참고 문헌에 언급되는 상기 본원에 병합된 출원서 참조). 상기 치료 용도는 유다당류 또는 LPS 에 의해 야기된 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 치료와 같은 화합물의 독성 감소를 포함한다. 일반식(I) 화합물에 대하여, 지질-A 분자의 세 부위가 그곳에 대해 유발된 촉매 항체에 의해 표적이 된다: 2'-N 글루코사민 부위에 연결된 아실옥시아실 사슬의 에스테르 결합; 글루코사민의 3'-O 위치의 에스테르 결합 O-아실 사슬; 및 베타 1-6 결합 글루코사민 잔기 사이의 결합. 일반식(II)에 대해 유발된 촉매 항체는 지질-A의 글리코시드 결합을 포함하는 글리코시드 결합을 표적으로 한다. 각 가수분해 반응에 대한 전이 상태의 일반식(I) 및 (II)에 대항해 생산된 모노클로날 항체를 지질-A (및 LPS)에 대한 결합 및 그의 절단 (촉매 활성)에 대해 스크리닝하여 무독화 지질-a (및 LPS)구조를 생산한다. 단독 또는 배합물로 촉매 항체는 (예컨대 '칵테일' 처럼) 치사 균혈증 및 패혈성 쇼크의 몇몇 동물 모델에서 및 사람 질병 치료에 치료 효과를 갖는다고 예측된다. 따라서, 새로운 지질-A 전이 상태 동족체는 지질-A 의 하나 이상의 결합을 표적으로 한다(제40도 참조).

기타 유용성은 글리코시드 전약제와 같은 전약제의 활성화 같은 조건 야기를 포함한다. 더우기, 일반식(I) 및 일반식(II) 화합물은 또한 예컨대 독성 물질에 대해 백신화하기 위한 면역학적 반응으로서 항체를 유발하는데 유용하다. 또한, 일반식(I) 및 (II) 화합물은, 일반식 (I) 및 (II) 화합물이 LPS 또는 지질-A (수용체 길항질)의 결합 부위에 경쟁하거나 그에 대해 면역 반응을 자극할 수 있으므로 내독소증 또는 패혈증 또는 패혈성 쇼크 치료가 필요한 것들을 치료하는데 유용하다.

일반식(I) 및 (II)의 화합물, 또는 (일반식(I) 및 (II) 중 하나 또는 둘 다에 대해) 유발된 항체는 치료 상황과 같은 전형적 요인 (예컨대, 비루스, 세균, 암, LPS 등), 및 나이, 체중, 성별 및 환자의 건강도를 고려하여 기술자, 내과의 또는 수의사가 전형적 투여량으로 투여한다.

일반적으로, 제1-39도를 참고하여, 일반식(I) 화합물의 합성과 사용은 다음과 같다.

면역원 BK-1의 합성은 역합성 분석에 제시된 바대로 수행된다(도식 1)(제1도). 합성은 주요 중간체(1)의 1차 제조에 의해 성취되며, 이는 그 다음 적절한 화학 반응을 경유하여 BK-1으로 변형된다. 이어서 중간체(1)는 세개의 중요 중간체(2, 3 및 4)로부터 출발하여 합성된다. 따라서 화합물(2, 3 및 4)는 하기와 같이 제조된다.

중간체(2)는 구입가능한 트리-O-아세틸-D-글루칼로부터 출발하여 제조된다. 아세토니트릴내 질화 암모늄 세륨을 사용한 트리-O-아세틸-D-글루칼의 아지도질화에 이어 디옥산내 수성 질산나트륨을 사용한 가수분해에 의해 글루코 및 만노 유도체(5a 및 5b)의 혼합물을 얻었다(도식 2)(제2도)(93). 혼합물을 이미다졸의 존재하에 DMF내 t-부틸디메틸실릴 염화물을 사용하여 실릴화 반응에 적용시켜 2.4:1의 비율로 β-글루코 화합물(6a) 및 α-만노(6b)의 혼합물을 얻었다. β-글루코 화합물(6a)을 분리하고 메탄올내 나트륨 메톡시드로 처리하여 상응하는 트리올을 얻었고, p-톨루엔 설폰산의 존재하에 염화메틸렌내 2,2-디메톡시프로판으로 처리하여 아지도당 화합물(2)을 얻었다.

기타 주요 중간체, 산(3) 및 산(4)는 하기 반응 절차에 의해 제조했다. 두 중간체(3 및 4)는 아릴 알콜(7)로부터 얻어진 공통의 중간체(10)로부터 제조했다(도식 3)(제3도). 알킬 알콜(7)은 치환 또는 비치환, 분지 또는 선형일 수 있다.

산(3)의 합성은 도데실 알데히드로부터 출발하여 수행된다(도식 4)(제4도). 염화 메틸렌내 메틸(트리페닐포스포랄에닐에덴) 아세테이트와 알데히드의 위티그 반응은 상응하는 E-β, α 불포화 에스테르를 생성하고(94), -78℃에서 염화메틸렌내 DIBAL-H로써 환원시켜 알릴 알콜(7)을 얻었다(95). -20℃에서 염화 메틸렌내 (-)디에틸타르트레이트, 티타늄 테트라이소프로폭시드, 및 t-부틸 과산화수소를 사용하여 알릴알콜은 거울상 선택성 에폭시화(96, 97)시켜 에폭시드(8)를 생성했다. 그 다음 에폭시드를 레드-A1로써 환원시켜 (98) 10:1의 1,2 디올 비율과 함께 1,3 디올(9)을 얻었다. 레지오아이소머의 비율은 그의 아세테이트 유도체의 NMR에 의해 측정했다. 1,3 디올의 입체 화학 및 광학 순도는 디올을 3-히드록시테트라데칸산으로 전화시켜 측정했고(도식 4)(제4도), 이는 문헌에 보고된 값에 필적했다(99).

디올(9)은 산(3 및 4)의 제조용 주요 중간체이다. 디올(9)의 1차 알콜 관능기는 t-부틸디메틸실릴 에테르로서 선택적으로 실릴화되어 화합물(10)을 생성했다(도식 5)(제5도). 화합물(10)을 DCC 및 DMAP의 존재하에 라우린산과 커플링시켜 커플링 화합물(11)을 얻었다. 화합물(11)의 실릴 제거는 0℃에서 메탄올내 PTSA로써 처리하여 상응하는 1차 알콜 화합물을 얻고 이를 존스(Jones) 산화시켜 산(3)을 얻음으로써 성취했다.

나머지 산(4)의 제조는 하기 반응 순서에 의해 수행된다(도식 6)(제6도). 산(4) 합성에 필수 성분인 포스포클로리데이트(12)는 디벤질 포스파이트로부터 출발하여 제조했다. 디벤질 포스파이트를 칼륨 t-부톡시드의 존재하에 건조 DMF내 라우릴 브로마이드로 알킬화하여 알킬화 포스페이트(14)를 얻었다. 포스페이트 화합물(14)을 건조 클로로포름내 오염화인으로 처리하여 포스포클로리데이트(12)를 얻었다. 포스포클로리데이트(12)를 DMAP의 존재하에 염화 메틸렌내 히드록시 실릴 화합물(10)과 커플링시켜 상응하는 커플링된 화합물(13)을 얻었다. 그 다음 커플링된 화합물(13)을 화합물(11)로부터 산(3)의 제조를 위해 사용된 동일한 반응 순서에 의해 산(4)으로 전화시켰다.

세개의 중간체 아지도 당(2), 산(3) 및 산(4)를 얻어, 하기 반응 절차에 따라 BK-1을 제조했다(도식 7)(제7도). 아지도화합물(2)을 DCC 및 DMAP의 존재하에 염화메틸렌내 산(3)과 커플링시켜 상응하는 커플링된 화합물(15)을 얻었다. 화합물(15)의 아세토니드는 염화메틸렌내 트리플루오로아세트산을 사용하여 탈보호시켜 상응하는 디올을 얻고, 이를 t-부틸디메틸 실릴 염화물을 사용하는 선택적 실릴화에 적용시켜 모노실릴화 화합물을 얻었다. 그 다음 얻어진 모노실릴화 화합물을 메탄올내 Pd-C (10%)를 사용하여 수소첨가하여 상응하는 아미노 화합물(16)을 얻었다. 아미노화합물(16)을 EDC 및 HOBT의 존재하에 염화메틸렌내 산(4)과 커플링시켜 화합물(1)을 얻었다. 화합물(1)의 4 위치를 테트라졸 존재하에 염화메틸렌내 N,N-디이소프로필아미노 디벤질 포스파이트로써 포스파이트화하고 이어서 얻어진 포스파이트를 m-CPBA로 산화시켜 상응하는 포스페이트(17)를 얻었다. 메탄올내 Pd-C (10%)를 사용하는 화합물(17)의 수소첨가, 이어서 HF-피리딘을 사용하여 실릴 제거시켜 면역원 BK-1을 얻었다.

면역원 BK-3의 합성은 도식 8에서 도시된 바대로 수행된다(제8도). 따라서 주요 중간체(20)는 세중간체: 산(3), 아미노 화합물(8) 및 포스포클로리데이트(19)로부터 제조된다.

중간체 포스포클로리데이트(19)는 구입가능한 디메틸메틸포스포네이트로부터 출발하여 제조된다(도식 9)(제9도). 디메틸 메틸포스포네이트는 -78℃에서 n-부틸리튬을 사용하여 탈양자화하고 메틸라우레이트를 첨가하여 케토 포스포네이트(21)를 얻었다. 케토 포스포네이트를 메탄올내 나트륨 보로하이드리드로써 환원시켜 상응하는 히드록시 화합물(22)을 얻었다. 화합물(22)을 DCC의 존재하에 라우린산과 커플링시켜 상응하는 에스테르(23)를 얻었다. 디클로로메탄내 TMSI로써 화합물(23)을 메틸 제거하여 디히드록시 화합물(24)을 얻었다. 화합물(24)의 모노벤질화는 피리딘 및 클로로포름내 벤질 알콜 및 트리클로로아세토니트릴을 사용하여 수행하여 모노벤질화 화합물(25)을 얻었다. 클로로포름내 오염화인으로써 화합물(25)을 처리한 후에 포스포클로리데이트(19)를 얻었다.

그 다음 하기 절차에 의해 면역원 BK-3을 제조했다. 아미노 당(18)(상기 BK-1 합성에 관한 논의 참조)을 표준 EDC 반응 조건하에 산(3)(상기 BK-1 합성에 관한 논의 참조)과 커플링시켜 아실화 당(26)을 제공했다(도식 10)(제10도). 히드록시 화합물(26)을 포스포클로리데이트(19)와 커플링시켜 디아실화 당(27)을 얻었다. 화합물(27)의 아세토니드를 디클로로메탄내 트리플루오로아세트산을 사용하여 탈보호시켜 상응하는 디올(28)을 얻었다(도식 10a)(제11도). 화합물(28)을 에틸 아세테이트내 Pd-C (10%)를 사용한 가수소분해에 적용시켜 상응하는 벤질 제거된 화합물을 얻고, HF-피리딘을 사용하여 실릴 제거시킨 후에 면역원 BK-3을 얻었다.

면역원(3M)의 합성은 역합성 분석에 도시된 바대로 수행된다(도식 11)(제12도). 면역원(3M)은 적절한 화합 반응을 경유하여 중간체(29), 포스포클로리데이트(19) 및 산(3)을 사용하여 화합물(29)을 제공함으로써 제조되며, 이는 차후에 면역원(3M)으로 전환된다.

면역원(3M), 아미노 화합물(30)의 합성을 위한 중간체의 하나는 구입가능한 D-글루코사민 히드로클로라이드로부터 출발하여 제조된다(도식 12(제13도). 따라서, 글루코사민 히드로클로라이드를 실온에서 수성 중탄산나트륨내 Cb_z-Cl으로 처리하여 아미노-보호된 화합물을 얻고 그 다음 메탄올성 HCl로써 처리하여 화합물(31)을 얻었다. 그 다음 실온에서 PTSA의 존재하에 디클로로메탄내 2,2-디메톡시프로판으로 화합물(31)을 처리하여 보호된 화합물(32)을 얻었다. 화합물(32)을 에틸 아세테이트내 Pd-C (10%)를 사용하여 수소첨가에 의해 탈보호시켜 아미노 화합물(30)을 얻었다.

나머지 중간체 포스포클로리데이트(19) 및 산(3)은 BK-1 및 BK-3에 대해 사용된 동일 절차에 따라 제조했다.

아미노 화합물(30)을 하기 반응 순서를 경유해 면역원(3M)으로 전환시켰다(도식 13)(제14도). 아미노 화합물(30)을 EDC 및 HOBT의 존재하에 디클로로메탄내 산(3)과 반응시켜 아실화 화합물(33)을 얻었다. 화합물(33)을 이미다졸의 존재하에 DMF내 t-부틸디메틸 클로라이드로써 처리하여 실릴화 화합물(34)을 얻었다. 화합물(34)의 아세토니드 관능기를 디클로로메탄내 트리플루오로아세트산으로써 화합물(34)을 처리함으로써 제거하여 디올(35)을 얻었다. 화합물(35)의 1차 알콜 관능기를 DMAP 존재하에 토실 클로라이드로써 화합물(35)을 처리함으로써 토실레이트로 전화시키고, 토실레이트 중간체(도식 14)(제15도)를 DMF내 나트륨 아지드와 반응시켜 아미도 화합물(36)을 얻었다. 화합물(36)의 포스포릴화는 테트라졸의 존재하에 디클로로메탄내 N,N-디이소프로필아미노 디벤질 포스파이트로써 처리하고 m-CPBA로써 산화시켜 상응하는 포스포릴화 화합물(29)을 얻음으로써 수행했다. 메탄올 및 디클로로메탄내 PTSA를 사용하여 포스포릴화 화합물(29)을 실릴 제거하여 상응하는 히드록시 화합물(37)을 얻었다(도식 15 (제16도)의 구조 참조). 히드록시 화합물(37)을 DMAP 및 트리에틸아민의 존재하에 디클로로메탄내 포스포클로리데이트(19)와 커플링시켜 커플링된 화합물(38)을 얻었다. 화합물(38)을 에틸 아세테이트내 Pd-C (10%)를 사용하여 가수소분해에 의해 탈보호시켜 면역원(3M)을 얻었다(도식 14)(제15도).

면역원(2M)의 합성은 도식 15에 제시된 바대로 수행된다(제16도). 중간체(37)는 면역원(3M)에 대해 상기 서술된 절차에 따라 제조된다. 도식 16(제 17 도)에서 커플링(37)을 디클로로메탄내 DCC를 사용하여 산(4)과 커플링시켜 화합물(39)을 얻었다. 화합물(39)을 가수소분해하여 면역원 2M을 얻었다.

이당류 면역원 3D의 합성은 도식 17 (제18도)에 도시된 바대로 수행된다. 이당류 면역원의 합성에 수반된 주요 단계는 상응하는 커플링된 화합물을 제공하는 이미데이트(40)와 디올(41) 사이의 커플링 반응이며 이는 후속의 적합한 화학적 변형으로 면역원 -3D에 이른다.

따라서, 중간체(40)의 합성은 화합물(6a)로부터 출발된다(도식 18 및 19)(제19 및 20도). 화합물(6a)는 BK-1 합성을 위해 서술된 바와 동일한 절차에 의해 제조된다. 화합물(6a)을 에틸 아세테이트내 촉매로서 Pd-C를 사용하여 수소첨가시켜 상응하는 아미노 화합물을 얻었고, 피리딘 및 디클로로메탄내 Troc-Cl으로써 처리하여 트리클로로에틸카바메이트-보호된 화합물(42)을 얻었다. 화합물(42)을 메탄올내 나트륨 메톡시드로써 처리하여 상응하는 트리올을 얻고, 이를 PTSA 존재하에 디클로로메탄내 2,2-디메톡시프로판으로써 처리한 후에 상응하는 아세토니드(43)를 얻었다. 화합물(43)을 DMAP의 존재하에 포스포클로리데이트(19)와 커플링하여 (포스포클로리데이트(19)의 합성은 3M의 합성에 대해 상기 서술됨) 커플링된 화합물(44)을 얻었다. 그 다음 화합물(44)을 THF 및 디클로로메탄내 테트라부틸암모늄 플루오라이드로써 그 다음 이어서 트리클로로아세토니트릴로써 처리하여 아노머 혼합물로서 주요 중간체, 아미데이트(40)를 얻었다.

나머지 중간체 디올(41)은 화합물(30)(화합물(30)의 제법은 3M의 합성에 대해 서술됨)과 화합물(47)의 커플링 및 후속 탈보호 도식 19a (제21도)에 의해 제조된다.

화합물(47)은 화합물(10)로부터 제조했다(화합물(10)의 제법은 BK-1의 합성에 대해 서술됨). 화합물(10)은 트리플산의 존재하에 디클로로메탄내 벤질 2,2,2-트리클로로-아세티미데이트를 사용하여 첫번째 벤질화시켜 화합물(45)을 얻었다. 화합물(45)을 메탄올 및 디클로로메탄내 PTSA를 사용하여 실릴제거시켜 상응하는 히드록시 화합물(46)을 얻었다. 화합물(46)을 존스 산화에 적용시켜 화합물(47)을 얻었다. 화합물(47)을 화합물(30)과 커플링시켜(도식 19a)(제21도) 커플링된 화합물(48)을 얻었다. 화합물(48)을 디클로로메탄내 트리플루오로아세트산으로써 처리하여 디올 화합물(41)을 얻었다.

따라서 글리코실 공여체(40) 및 수용체(41)를 얻어, 보론 트리플루오라이드 에테레이트 및/또는 TMS 트리플레이트와 같은 루이스 산을 사용하여 커플링 반응을 수행했다. 디클로로메탄내 화합물(41) 및 화합물(40)을 보론 트리플루오라이드에테레이트 및/또는 TMS 트리플레이트로써 처리하여 커플링된 화합물(49)를 얻었다(도식 20)(제22도). 커플링된 화합물(49)을 DMF내 t-부틸디메틸실릴 클로라이드로써 처리하여 실릴화 화합물을 얻었다. 실릴화 화합물의 아세토니드 관능기를 디클로로메탄내 트리플루오로아세트산을 사용하여 제거하여 디올(50)을 얻었다.

디올(50)의 1차 알콜 관능기는 아실화 반응 조건을 사용하여 t-부틸디메틸 실릴 에테르로서 선택적으로 보호시켜(도식 21)(제23도) 화합물(51)을 얻었다. 아세트산 및 THF내 아연을 사용하여 화합물(51)을 탈보호시켜 아미노 화합물(52)의 부분입체이성질체 혼합물(52)을 얻었다. 아미노 화합물(52)을 산(3)과 커플링시켜 커플링된 화합물(53)을 얻었다. 화합물(53)의 4'-위치의 포스포릴화는 테트라졸 존재하에 디클로로메탄내 N,N-디이소프로필아미노 디벤질 포스파이트로써 화합물(53)을 처리하여 상응하는 포스파이트를 얻음으로써 수행하고, 이를 m-CPBA로써 산화시켜 포스포릴화된 화합물(54)을 얻었다(도식 22)(제24도). 화합물(54)을 에틸 아세테이트내 Pd-C (10%)상에서 수소첨가에 의해 벤질 제거시켜 화합물(55)을 얻었다. 화합물(55)을 HF-피리딘으로 처리하여 면역원 3D를 얻었다.

면역원 1D의 합성은 중간체(56) 및 화합물(41)로부터 출발하여 성취된다(도식 23)(제25도).

중간체(56)의 제조는 도식 24 (제26도)에 서술된 반응 순서에 따라 수행된다. 따라서, 화합물(43)을 DCC 및 DMAP의 존재하에 디클로로메탄내 산(3)과 커플링한 후에 커플링된 생성물(57)을 얻었다. 화합물(57)을 THF내 테트라부틸암모늄 플루오라이드로써 처리하여 트리클로로아세토니트릴를 첨가한 후에 이미데이트(56)의 아노머 혼합물을 얻었다.

루이스산(보론 트리플루오라이드 에테레이트 또는 TMS-트리플레이트)의 존재하에 디클로로메탄내 이미데이트 화합물(56) 및 디올 화합물(41)은 커플링된 화합물(58)을 생성했다(도식 25)(제27도). 화합물(58)의 히드록시 관능기를 이미다졸의 존재하에 DMF내 t-부틸디메틸실릴 클로라이드를 사용하여 t-부틸디메틸실릴 에테르로서 보호시키고, 결과의 실릴화 화합물을 트리플루오로아세트산으로써 처리한 후에 상응하는 디올 화합물(59)을 얻었다. 디올 화합물(59)의 1차 히드록시 관능기를 이미다졸(2.2 당량)의 존재하에 DMF내 t-부틸디메틸실릴 클로라이드(1.1 당량)를 사용함으로써 TBDMS 에테르로서 선택적으로 보호하고(도식 26)(제28도) 결과의 화합물을 아세트산 및 THF내 아연으로써 처리한 후에 아미노 화합물(60)을 얻었다. 아미노 화합물(60)을 EDC 및 HOBT의 존재하에 디클로로메탄내 산(4)과 커플링하여 커플링된 화합물(61)을 얻었다.

화합물(61)의 C-4' 히드록시 위치를 면역원 3D의 합성을 위해 사용된 바와 동일한 방법을 사용하여 포스포릴화했다. 포스포릴화된 화합물(62)을 수소첨가 이어서 HF-피리딘을 사용한 실릴 제거에 의해 면역원 1D로 전화시켰다(도식 27)(제29도).

면역원 2D의 합성은 이미데이트(62a) 및 화합물(41)을 커플링하여 커플링 화합물을 얻음으로써 성취했고, 이를 적당히 화학적 변형시켜 면역원 2D를 얻었다(도식 28)(제30도).

히드록시 화합물(43)을 수소화 나트륨의 존재하에 THF내 4-메톡시벤질 클로라이드로써 처리하여 화합물(63)을 얻었다. 화합물(63)을 THF내 테트라부틸-암모늄 플루오라이드로써 처리하고 트리클로로아세토니트릴(62a)로써 처리한 후에, 아노머 혼합물로서 이미데이트(62a)를 얻었다(도식 29)(제31도). 이미데이트를 루이스산(보론 트리플루오라이드 에테레이트 또는 TMS-트리플레이트종 하나)의 존재하에 화합물(41)로써 커플링하여 커플링된 화합물(64)을 얻었다. 이미다졸의 존재하에 DMF내 t-부틸디메틸실릴 클로라이드로써 화합물(64)을 처리하여 상응하는 실릴화 화합물을 얻고 이를 트리플루오로아세트산으로 처리하여 디올을 얻었다(도식 30)(제32도). 디올 화합물의 1차 히드록시 관능기를 이미다졸(2.2 당량)의 존재하에 DMF내 t-부틸디메틸실릴 클로라이드(1.1 당량)로 처리하여 t-부틸디메틸실릴 에테르로서 선택적으로 보호하여 화합물(65)을 얻었다. 화합물(65)을 아세트산 및 THF내 아연으로써 처리한 후에 상응하는 아미노 화합물을 얻고, EDC 및 HOBT의 존재하에 디클로로메탄내 산(3)으로 처리한 후에 커플링된 화합물(66)을 얻었다.

화합물(66)의 C-4' 히드록시를 기타 면역원에 대해 사용된 방법을 사용하여 포스포릴화시켜 상응하는 포스포릴화된 화합물을 얻고, DDQ로써 처리한 후에 상응하는 탈보호된 화합물(67)을 얻었다(도식 31)(제33도). DCC 및 DMAP의 존재하에 디클로로메탄내 산(4)으로써 화합물(67)을 처리한 후에 커플링된 화합물(68)을 얻었다. 화합물(68)을 수소첨가에 이어 실릴 제거하여(HF-피리딘) 면역원 2D로 전환시켰다.

면역원 3D-A의 합성은 중간체(54)로부터 출발하여 성취했다(도식 32)(제34도). 따라서, 화합물(54)을 메탄올내 PTSA로써 처리하여 상응하는 히드록시 화합물을 얻었다. MsCl로써 히드록시 화합물을 처리하여 메실레이트를 얻고, 나트륨 아지드로 처리하여 상응하는 아지드 화합물을 얻었다. 아지도 화합물을 에틸 아세테이트내 Pd-C로써 수소첨가하고 HF-피리딘으로써 처리하여 면역원 3D-A를 얻었다.

기타 면역원 2D-A 및 1D-A의 합성은 또한 각각 68 (도식 33)(제35도) 및 62 (도식 34)(제36도)로부터 출발하여 유사한 반응 순서에 의해 수행했다.

면역원 3D-AL의 합성은 중간체(54)로부터 출발하여 성취했다(도식 35)(제37도). 따라서 화합물(54)을 메탄올내 PTSA로써 처리하여 상응하는 히드록시 화합물을 얻었다. 히드록시 화합물을 DCC의 존재하에 디클로로메탄내 아미노 보호된 산으로써 처리하여 상응하는 커플링된 화합물을 얻었다. 커플링된 화합물을 에틸 아세테이트내 Pd-C로써 수소첨가하고 HF-피리딘으로 처리한 후 면역원 3D-AL을 얻었다.

기타 면역원 2D-AL 및 1D-AL의 합성은 (54)로부터의 3D-AL에 적용된 유사한 반응 서열에 의해 각각 중간체(68)(도식 36)(제38도) 및 (62)(도식 32)(제39도)로부터 출발하여 수행했다.

도식 38 내지 45를 언급하면(제41-47도), 일반식(II), 본 발명의 지질-A의 이미딘 TS 동족체의 합성 및 사용은, 특히 그의 바람직한 실시양태에 관련해 하기와 같다:

아미딘 TS 동족체(79)(제41도)의 합성은 하기와 같이 수행된다. 제41도에서, 화합물(79)은 R=C₁₁H₂₃을 갖는 것으로 도시되나; 일반식(II)에서, 서로 독립적인 각각의 R_a, R_b, R_c, R_d및 R_e는 분지 또는 선형, 치환 또는 비치환 C₁-C₁₁알킬, 알켄 또는 알킨일 수 있다. 부당한 실험없이 동족체(79)에 대해 본원에 서술된 합성 방법으로부터 기술자는 일반식(II)의 정의에 포괄되는 화합물을 얻을 수 있도록 절차를 변형할 수 있다. 동족체(79)의 합성은 두개의 중간체 화합물(71 및 77)을 먼저 제조하고 그들을 적절한 화학 반응에 의해 커플링한 다음 커플링된 화합물을 아미딘 화합물로 전환시킴으로써 수행했다.

중간체(71)의 합성(면역원 3D 합성 참조)은 디올 화합물(41)(제42도)로부터 출발했다. 화합물(41)을 이미다졸 존재하에 DMF내 약 2.4 당량 TBDMS-Cl로써 처리하여 디아실화 화합물을 얻었다. 디아실화 화합물을 0℃에서 메탄올내 PTSA 촉매 양으로 처리하여 1차 실릴 절단된 화합물(69)을 얻었다. 히드록시 화합물(69)을 Ms-Cl로써 처리하여 메실레이트로 전환시키고, 나트륨 아지드로 처리하여 상응하는 아지드 화합물(70)을 얻었다. 화합물(70)을 수소첨가하여 아미노 화합물(71)을 얻었다.

다른 중간체(77)는 구입가능한 락톤(72)으로부터 제조했다(제43도). 화합물(72)을 2,2-디메톡시프로판으로써 처리하여 아세토니드를 얻고, 약 2.4 당량 TBDMS-Cl로써 처리하여 화합물(73)을 얻었다. 히드록시 에스테르 화합물을 Ms-Cl로 처리하여 메실레이트 화합물을 얻고, 요오드화 나트륨으로써 처리하여 상응하는 요오드 화합물을 얻었다. 요오드 화합물을 나트륨 아지드로 처리하여 아지도 화합물(74)을 얻었다. 화합물(74)을 수소첨가하여 락탐을 얻고 테트라부틸암모늄 플루오로라이드로써 처리하여 히드록시 락탐(75)을 얻었다. 화합물(75)을 DCC 및 DMAP의 존재하에 약 2.2 당량 산(3)(산(3)의 합성 : BK-1 참조)로 처리하여 커플링된 화합물을 얻었다. 커플링된 화합물을 트리플루오로아세트 산으로 처리하여 디올을 제공하고 이를 약 1.1 당량 TBDMS-Cl과 반응시켜 1차 히드록시 보호된 화합물(76)을 선택적으로 얻었다. 화합물(76)을 테트라졸의 존재하에 N,N-디이소프로필아미노 디벤질포스파이트로 처리하여 4 위치의 포스포릴화를 수행했다. 이는 상응하는 포스파이트 형성을 초래했고 m-CPBA로 산화시켜 상응하는 포스페이트 화합물(77)을 얻었다(제44도). 화합물(77)을 미르벤 시약으로 처리하고 이어서 화합물(71)을 첨가하여 커플링된 화합물(78)을 얻었다. 화합물(78)을 수소첨가에 이어 HF-피리딘으로 처리하여 화합물(79)로 전환시켰다. 대안적으로, 화합물(78)을 또한 TMS-I로써 처리하고 산성화시켜 (79)로 전환시켰다.

아미딘 TS 동족체(89)를 화합물(71) 및 화합물(87)로부터 제조했고, 화합물(71)의 합성은 상기 서술되었다(제47도). 화합물(87)은 하기 방식으로 제조했다. 화합물(5a 및 5b)(합성은 도식 2 참조)의 혼합물을 존스 시약을 사용하여 산화시켜 화합물(80)을 얻었다(제45도). 화합물(80)의 히드록실 보호기를 표준 화학 절차에 따라 대체시켜 락톤(81)을 얻었다. 화합물(81)의 락톤 고리를 벤질 알콜을 사용하여 가용매분해시켜 중간체 δ-히드록시 에스테르를 얻었다. 그 다음, 히드록실 기를 키랄의 이중 역전을 사용하여 아지도 기로 치환시켜 화합물(82)을 얻었으며, 이는 정확한 화학양론을 갖는다. 화합물(82)을 수소첨가하여 α,β-디아미노산을 얻고, 이를 선택적으로 락탐화시켜 δ-락탐, 화합물(83)을 형성했다. 화합물(83)의 아미노 기를 하나의 4-니트로벤질 기로써 보호시켜 화합물(84)을 얻었다. 화합물(84)의 실릴-보호된 히드록실 기를 탈보호시켜 화합물(85)을 얻은 다음(제46도), 화합물(85)을 2 당량의 산(3)(합성은 도식 5 참조)과 축합시켜 화합물(86)을 얻었다. 화합물(86)의 이소프로필리덴 보호 기를 가수분해하여 디올을 얻고, 이의 1차 히드록실 기를 선택적으로 TBDMS 기로써 재보호했다. 2차 히드록실 기의 포스포릴화 및 포스페이트로의 트리알킬포스파이트의 차후 산화는 화합물(87)을 생성했다.

화합물(87) 및 (71)을 커플링시켜 화합물(88)을 형성하는 것은(제47도 참조) 화합물(78)의 제조를 위해 사용된 바와 동일한 방법을 사용하여 수행했다(제44도). 화합물(88)을 후속 탈보호시켜 아미딘 TS 동족체, 화합물(89)을 얻었다.

일반식(I) 및 (II)의 정의내 치환 또는 알켄 또는 알킨 화합물의 제조는 적합한 전구체 화합물이 치환되거나 그 상에 알켄 또는 알킨을 갖는 것을 제외하고 상기 제공된 바대로이다.

항체(촉매 및 결합) 유발에 대한 유용함에 더하여, 일반식(I) 및 일반식(II)의 화합물은 항비루스, 항암, 및 항균제로서 유용하다. 일본산 흰토끼에게 약 10㎍/kg의 투여량에서, 일반식(I) 및 (II) 화합물은 발열 활성을 보이지 않은 반면, 천연 지질-A는 0.001㎍/kg의 투여량에서 현저한 발열성을 나타낸다. 1㎍/생쥐의 투여량에서 지질-A는 그람-음성 세균에 의해 보호 활성을 나타내며, 약 1-100의 다양한 투여량을 포함하고, 약 1-10이 바람직하고, 약 10㎍/생쥐가 가장 바람직하며, 일반식(I) 및 (II) 화합물은 그람-음성 세균(피이. 아에루기노사)에 대해 보호활성을 나타낸다. 이들 시험에서 생쥐를 접종한 후에 공격한다. 항비루스 활성에 관해, 생쥐를 약 0.1-100, 바람직하게 1-10㎍의 일반식(I) 또는 (II)와 같은 다양한 투여량으로 정맥내 접종한 후 적당한 양, 예컨대 백신 비루스의 약 10⁴pfu로써 공격했다. 일반식(I) 및 (II)화합물은 지질-A와 유사하게 수행했다. 항암 활성에 대해, 1 또는 2×10⁵Meth A 섬유육종 세포 또는 약 10⁵흑색종 세포 또는 10⁶Pro b 세포를 생쥐에게 투여하고; 지질-A 또는 일반식(I) 또는 (II) 화합물 250, 100 또는 10㎍/생쥐 (예컨대 Meth A 섬유육종) 또는 10㎍/kg 체중 이하의 투여량으로 암세포의 이식 또는 투여 후에 정맥내로 또는 암내로 투여한다. 지질-A 또는 일반식(I) 또는 (II) 화합물을 주사한 생쥐는 암성장이 지연되거나 예방된다. 이 결과로부터, 기술자들을 부당한 실험없이 환자의 체질, 치료 상황, 및 나이, 체중, 성별 및 환자의 일반 건강과 같은 전형적 요인들을 고려하여 일반식(I) 및 (II) 화합물 및 그에 대한 항체를 임의 적당한 동물 또는 사람 환자에게 투여하는데 적절한 투여량을 결정할 수 있다.

일반식(I) 및 (II) 화합물 및 이들에 대한 항체를 임의의 적합한 효과적인 형태로, 예를 들면, 경구로, 정맥내로, 피하로, 피내(皮內)로, 종양내로 등으로 투여할 수 있다. 임의의 적합한 부형제 또는 보조약 예컨대 살린내 일반식(I) 및 (II) 화합물 및 이들에 대한 항체를 투여할 수 있다. 상기 배합물은 다른 처리제와 동시 투여될 수 있으며; 예를 들면, 일반식(I) 화합물 및/또는 일반식(II)의 화합물은 다른 항신생물제와 함께 투여될 수 있거나, 항체는 항생물질과 함께 투여될 수 있다. 더욱이, 일반식(I) 화합물, 일반식(II) 화합물에 대한 항체를 다른 항체들, 예를 들면 다른 일반식(I) 또는 다른 일반식(II) 화합물에 대한 항체와 및/또는 다른 지질-A 동족체에 대한 항체와 및/또는 지질-A에 대한 항체와의 혼합물로서 투여할 수 있으며, 즉, 본 발명의 항체들을 '칵테일'로서 투여할 수 있다. 상기 칵테일은 IgG 및 IgM 항체 뿐만 아니라 결합 및 촉매 항체를 포함할 수 있다. 그리고, '항체'에 있어서 본 발명은 항체의 결합 또는 촉매적 활성 단편을 포함한다.

또한, 본 발명은 최종 사용자가 희석하기 위한 농축 형태 또는 친액성화 형태로 일반식(I) 및 (II) 화합물 및 이들에 대한 항체를 조제할 수 있다고 의도한다. 상기 제제는 키트 형태로 있을 수 있다. 키트 형태는 또한 상기 발명에 따른 투여에 적합한 지시를 포함할 수 있다.

하기 비-제한 실시예는 설명으로써만 제공되고 본 발명의 제한으로 생각되어서는 안되며, 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어남없이 많은 명백한 변형이 가능하다.

[실시예]

실시예에 관해서, 일반적인 인지사항은 하기와 같다:

융점은 Haake Buchler 융점 장치 상에서 기록되었으며, 전기 코일 가열은 교정되지 않았다. F 254 (0.25mm 두께)를 가진 E. Merck 하도 실리카겔, 얇은-막 크로마토그래피(TLC) 플레이트를 반응을 모니터하기 위해 사용하였다. E. Merck 실리카 겔 60 (70-230) 메쉬)를 컬럼 크로마토그래피용으로 사용하였다. 유기 층을 무수 MgSO₄로 건조시켰다.적외(IR) 흡수 스펙트럼을 달리 언급되지 않는다면 순수하게 Perkin-elmer (1710) 분광광도계 상에서 기록하였다. 내부 표준으로서 테트라메틸실란을 사용하는, 달리 언급이 없는 한 용매로서 CDCl₃를 사용하여 제너럴 일렉트릭 QE-300 (300Mhz) 분광계상에서 양성자 핵 자기 공명(¹H NMR) 스펙트럼 및 탄소 핵 자기 공명(¹³C NMR)을 측정하였다.

상기 설명서에서 및 특히 하기 실시예에서, 하기 약어(정의된 바)를 사용한다:

AHB 산 가수분해된 박테리아

Cbz-Cl: 벤질클로로포르메이트

CFA 완전 프로인드 애주번트

DCC: 1,3-디시클로헥실카르보디이미드

DET: 디에틸 타르트레이트

DIPT: 디이소프로필 타르트레이트

DMAP: 4-디메틸아미노피리딘

DMF: N,N-디메틸포름아미드

EDC: 1-에틸 3 (3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드

ELISA: 효소-표식된 이뮤노소르반트 검정

HCl: 염산

HEL 암탉 난백 리소자임

HEL [105-120] 바람직하게 부가의 C-말단 시스테인 잔기를 가진 HEL의

위치 105-120에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드,

또는 상동 펩티드, 또는 HEL의 위치 105-120과 실질적인

상동을 가지는 아미노산 서열을 갖는 펩티드(바람직하게

부가의 C-말단 시스테인 잔기를 가짐) 및 바람직하게 펩

티드는 합성 펩티드이다.

HOBT : 1-히드록시벤조트리오졸

IFA 불완성 프로인드 애주번트

IFN 인터페론(알파, 베타 또는 감마)

IL-1 인터루킨-1

IL-6 인터루킨-6

LD₅₀약물 투여한 동물중 50%를 죽이기에 충분한 독성 성분의 투

여량

m-CPBA: 3-클로로퍼옥시벤조산

MAb 모노클로날 항체

PBS 인산염 완충 식염수(10mM Na 인산염, 0.15M NaCl, pH 7.2)

PPBE 프로테오제 펩톤 비프 추출물(박테리아 배양 배지)

PTSA: p-톨루엔설폰산

SCAb 단일 사슬 항체

SRBC 양 적혈구 세포

TBDMS-Cl: t-부틸디메틸실릴 클로라이드

TFA: 트리플루오로아세트산

THF: 테트라히드로푸란

TMS-I: 트리메틸실릴 요오드화물

TMS-Tf: 트리메틸실릴메틸

트리플루오로메탄설폰산

TNF 종양 괴저 인자 알파

Troc-Cl: 2,2,2-트리클로로에틸 클로로포르메이트

실시예 1 ― 2-아지도-2-데옥시-3,4,6-트리-O-아세틸 β-D-글루코피라노스

(5a) 및 2-아지도-2-데옥시-3,4,6-트리-O-아세틸

α-D-만노피라노스 (5b)의 제조

-25℃에서 건조 아세토니트릴(600ml)내 트리-O-아세틸-D-글루칼(27.24g, 0.1m)의 교반 용액에, 나트륨 아지드(7.2g, 0.11mol) 및 질산제이세륨암모늄(219.20g, 0.4mol)의 혼합물을 첨가하였고 현탁액을 16시간동안 -25℃에서 교반하였다(TLC 분석은 반응의 완결을 보였다). 그 다음 냉각 에테르(500ml) 및 물(200ml)을 반응 혼합물에 첨가하였고 유기층을 분리시키고, 건조시키고(MgSO₄), 여과시키며 농축시켜 유성 화합물을 얻었다(Rf 0.72, 실리카, 에틸 아세테이트:석유 에테르 1:1, 29g, 77%). 상기 절차로부터 얻어진 조 화합물을 정제없이 다음 반응에 적용시켰다. 디옥산(500mL)내 상기 화합물(29g, 77mmol), 및 아질산 나트륨 수용액(27.6g, 몰 200mL내 0.4mol)의 혼합물을 80℃에서 8시간동안 가열하였다. 그 다음 유기층을 분리시켰고 수성층을 에틸 아세테이트(300mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고 (MgSO₄) 농축시켜 글루코 및 만노 피라노스 5a 및 5b의 분리할 수 없는 혼합물로서 담황색 오일을 얻었다(24g, 94%).

실시예 2 ― t-부틸디메틸실릴-2-아지도-2-데옥시 3,4,6 트리-O-아세틸

b-D-글루코피라노스(6a) 및 t-부틸디메틸실릴-2-아지도-2

-데옥시 3,4,6 트리-0-아세틸 α-D-만노피라노스(6b)의 제조

0℃에서 N,N-디메틸포름아미드내 히드록시 화합물(혼합물로서 상기에서 얻어짐, 23g, 69mmol)의 용액에, 이미다졸(11.26g, 166mmol, 2.4 당량) 및 t-부틸디메틸실릴 클로라이드(12.5g, 83mmol, 1.2 당량)를 차례로 첨가하였고, 혼합물을 4시간동안 교반하였다. 반응의 완결 후 (TLC), 혼합물을 에틸 아세테이트(300mL)로 희석하였고 물(3×150mL)로 세척하였다. 유기층을 건조시키고 농축시켜 두 화합물의 혼합물을 얻었으며 이를 용리제로서 석유 에테르내 8% 에틸 아세테이트를 사용하는 플래시 크로마토그래피(실리카)에 의해 분리시켜 6a 및 6b를 얻었다. 화합물-6a (Rf 0.60, 실리카, 에틸 아세테이트: 석유에테르, 1:4, 16.8g, 55%)가 β-글루코 유도체인 것으로 밝혀졌다.

¹H NMR (CDCl₃): 4.915(m, 2H), 4.604(d, J=7.8Hz, 1H, C-1), 4.110(m, 2H), 3.633(m, 1H), 3.366(t, 1H), 2.020(s, 3H, OAc), 2.006(s, 3H, OAc), 1.958(s, 3H, OAc), 0.881(s, 9H, t-bu) 및 0.08(s, 6H, Me₂Si).

¹³C NMR: 170.324, 169.778, 169.487, 97.002, 72.128, 71.757, 68.788, 65.788, 65.914, 62.251, 25.443, 20.556, 20.459, 17.857, -4.557, -5.319. IR: 3484, 2958, 2859, 2114, 1752, 1659, 1435, 1240, 1107, 1007, 940, 843, 785 및 676.

보다 느리게 이동하는 화합물 6b (Rf 0.51, 실리카, 에틸 아세테이트:석유 에테르, 1:4, 7g, 23%)가 α만노 유도체인 것으로 밝혀졌다.

¹H NMR (CDCl₃): 5.12(t, 1H), 4.96(m, 2H), 4.0-4.19(m, 3H), 3.61(m, 1H), 2.06(s, 3H, OAc), 2.02(s, 3H, OAc), 1.94(s, 3H, OAc), 0.91(s, 9H, t-bu), 0.15(s, 3H, MeSi) 및 0.1(s, 3H, MeSi).

실시예 3 ― t-부틸디메틸실릴-2-아지도-2-데옥시-3-히드록시-4,6-O

-이소프로필에덴-β-D-글루코피라노스(2)의 제조

메탄올(120ml)내 나트륨 메톡시드(3ml, 1M), 화합물 6a (19g, 42mmol)의 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반시켰다. 반응의 완결 후(TLC), 메탄올을 진공하에서 제거하였고 결과로서 얻은 물질을 용리제로서 에틸 아세테이트를 사용하는 실리카겔의 작은 패드를 통해 여과시켜 상응하는 트리올을 오일로서 얻었다(Rf 0.21, 실리카, 석유 에테르: 에틸 아세테이트, 1:1, 12.7g, 95%).

¹H NMR (CDCl₃): 4.60(d, J=7.2Hz, 1H, 아노머릭), 3.841(m, 2H), 3.60(t, 1H), 3.32(m, 3H), 0.91(s, 9H, t-bu), 0.1(s, 6H, Me₂Si).

¹³C NMR: 97.167, 75.362, 74.351, 70.027, 68.314, 61.751, 25.564, 17.920, -4.311, 및 -5.232.

IR: 3369, 2956, 2860, 2114, 1566, 1464, 1364, 1218, 1173, 1079, 957, 843, 760 및 691.

상기에서 얻어진 트리올 화합물(12g, 37mmol)을, p-톨루엔설폰산(0.3g)의 존재하에 염화메틸렌(150mL)내 2,2-디메톡시 프로판(7.70g, 74mmol)으로 처리하였고 혼합물을 실온에서 4시간동안 교반하였다. 그 다음 반응 혼합물을 염화메틸렌(200mL)으로 희석하였으며, 물(200mL), 중탄산나트륨 용액(5%, 100mL) 및 물(150mL)로 세척하였다. 유기층을 분리시키고, 건조시키고, 농축시켜 농후 덩어리를 얻었으며, 이를 플래시 크로마토그래피한 후 화합물 2를 오일로서 얻었다(Rf 0.32, 실리카, 에틸 아세테이트:석유에테르, 1:4, 11.4g, 86%).

¹H NMR (CDCl₃): 4.601(d, J=7.5Hz, 1H, 아노머릭), 3.84(m, 2H), 3.589(t, 9.3Hz, 1H), 3.470(t, J=9.3Hz, 1H), 3.30(m, 1H), 3.O(bs, 1H, D₂O로 교환됨), 2.232(m, 2H), 1.58(s, 3H, 다른 CH₃), 1.46(s, 3H, 이소프로필리덴의 CH₃), 0.94(s, 9H, t-bu), 0.12(s, 3H, CH₃), 0.1(s, 3H, CH₃).

¹³C NMR: 99.930, 97.503, 73.497, 72.072, 69.151, 67.930, 61.909, 28.952, 25.519, 19.049, -4.397, -5.238.

IR: 3453, 2932, 2114, 1643, 1382, 1279, 1040, 866 및 680.

실시예 4 ― (E)-2-테트라도데켄-1-올(7)의 제조

클로로포름(400ml)내, 메틸(트리페닐포스포르알레닐에덴) 아세테이트(40.3g, 120mmol), 도데칸알(18.4g, 100mmol)의 혼합물을 실온에서 4시간동안 교반하였다. 반응의 완결 후(TLC), 용매를 제거하였고 결과로서 얻은 물질을 에테르(100mL)에 용해시켰다. 침전된 산화 트리페닐포스핀을 여과에 의해 제거하였다. 여액을 진공하에 농축시키고 플래시 크로마토그래피에 적용시켜 α,β-불포화 에스테르의 E 및 Z 이성질체의 혼합물을 오일로서 얻었다(Rf 0.62, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산 1:7, 20g, 86%).

¹H NMR(CDCl₃): 6.98(m, 1H, 올레핀계), 5.82(d, J=7.2Hz, 올레핀계), 3.76(s, 3H, OCH₃), 2.1(m, 2H, 알릴 메틸렌), 1.20(bs, 18H, 9 x CH₂) 및 0.86(t, 3H, 말단 CH₃).

-78℃에서, 염화메틸렌(250mL)내 상기에서 얻은 에스테르 화합물(18g, 75mmol)의 용액에, DIBAL-H 용액(160mL, 1M)을 첨가하였고, 반응 혼합물을 상기 온도에서 1시간동안 교반하였다. 반응의 완결 후(TLC), 과량의 DIBAL-H를 메탄올(15mL)로 켄칭하였고 에틸 아세테이트(750mL) 및 로셀 염 용액(200mL)이 담긴 원뿔형 플라스크로 옮겼으며 2개의 투명한 상이 분리될 때까지(대략 1시간) 교반시켰다. 그 다음 유기층을 분리시키고, 건조시키고, 농축시켜 무색 오일을 얻었으며, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제하여 알릴 알콜 7을 무색 오일로서 얻었다(Rf 0.25, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 1:4, 14.5g, 92%).

¹H NMR (CDCl₃): 5.60(m, 2H, 올레핀계), 4.06(d, 2H), 2.02(m, 2H, 알릴의 CH₂), 1.20(bs, 18H, 9 x CH₂) 및 0.9(t, 3H, CH₃).

실시예 5 ― (2S, 3R)-2,3-에폭시 테트라데칸-1-올(8)의 제조

-20℃에서, 분말 활성화 분자체(4A, 8g) 및 티타늄테트라-이소프로폭시드(1.41g, 5mmol, 10 중량%)를 함유한 염화메틸렌(150mL)의 용액에, 각 첨가 사이에 5분 간격을 두고 (-) 디에틸 타르트레이트(1.23g, 6mmol, 12%), 염화메틸렌(50mL)내 알릴 알콜 7(10.50g, 50mmol) 및 염화메틸렌내 t-부틸 히드로퍼옥시드(15mL, 5.19M, 1.5 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 상기 온도에서 2시간동안 교반하였고 -20℃에서 밤새 정치시켰다(그와 동시에 반응은 완결되었음, TLC). 여과에 의해 분자체를 제거하였고 여액을 2시간동안 포화 황산나트륨 용액(5ml)으로 처리하였다. 침전된 무기염을 셀라이트를 통한 여과에 의해 제조하였고, 용매를 제거하였으며, 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 에폭시드 8을 무색고체로서 얻었다(Rf 0.54, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 1:5, 9.10g, 81%). 융점 = 85-86℃.

¹H NMR (CDCl₃): 3.92(m, 1H, C-1의 부분이성질체의 양성자), 2.98(m, 2H), 3.60(m, 1H), 1.61(q, 2H), 1.20(bs, 18H, 9 x CH₂) 및 0.9(t, 3H, CH₃).

¹³C NMR: 63.211, 60.124, 57.397, 33.232, 32.899, 30.983, 30.863, 30.720, 30.662, 27.262, 23.995, 15.394.

IR: 3573, 2918, 2848, 1584, 1549, 1480, 1430, 1377, 1252, 1154.

실시예 6 (R)-3-히드록시 테트라데칸-1-올(9)의 제조

-20℃에서 테트라히드로푸란 (80mL)내 에폭시드 8 (9.00g, 40mmol)의 용액에 Red-Al의 용액 (40mL, 3M)을 첨가하였고 반응 온도를 0℃로 그리고 연속해서 실온으로 서서히 증가시키고 12시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후(TLC), 과량의 Red-Al을 메탄올 (10mL)로 켄칭하였고 에틸 아세테이트(400mL) 및 로셀염 용액(100mL)이 담긴 원뿔형 플라스크에 쏟아부었으며 두 층의 명백한 분리가 일어날 때까지 2시간 동안 교반하였다. 유기층을 분리시키고, 건조시키고 농축시켜 디올 9를 무색 고체로서 얻었다. (8.1g, 89%) 융점 59-60℃.

¹H NMR: 3.783(m, 3H), 1.652(m, 2H), 1.236(m, 20H), 0.855(t, J=6.6Hz, 3H).

¹³C NMR: 73.033, 62.528, 39.697, 39.122, 33.268, 31.019, 30.709, 26.978, 24.024 및 15.429.

IR: 3310, 2917, 2849, 1565, 1431, 1108, 1029, 980, 860 및 721.

디올을 그의 아세테이트 유도체로서 특성화하였다. 염화메틸렌내 DMAP, 무수 아세트산을 사용하는 표준 절차에 의해 아세테이트를 제조하였다.

¹H NMR(CDCl₃): 4.98(m, 1H, C-3), 4.04(t, 2H, C-1), 2.04(s, 6H, 2 x OAc), 1.84(4H), 1.30(bs, 18H, 9 x CH₂), 0.9(t, 3H, CH₃).

실시예 7 ― 화합물 9a의 제조

0℃에서 디클로로메탄 (20mL)내 DMAP (610mg, 5mmol) 및 디올 9 (920mg, 4mmol)의 용액에, 디클로로메탄 (1mL)내 염화피볼로일 (600mg, 5mmol)의 용액을 첨가하였고 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응의 종결 후, 과량의 염화물을 메탄올로 중화시켰고 용매를 진공하에서 제거하여 오일을 얻었으며, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제한 후 피볼로일 보호 화합물을 오일로서 얻었다 (Rf 0.62, 실리카, 헥산내 8% 에틸 아세테이트, 1.04g, 83%).

¹H NMR: 4.12(m, 2H), 3.46(m, 1H), 1.56(m, 4H), 1.24(bs, 18H), 1.16(s, 9H), 0.86(t, 3H).

DMF (8mL)내 상기-얻어진 화합물 (520mg, 1.65mmol)에 이미다졸 (272mg, 4mmol) 및 t-부틸디메틸실릴 클로라이드 (308mg, 2mmol)을 차례로 첨가하였고 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 혼합물을 에틸 아세테이트 (10mL)로 희석하였고 물 (3 x 5mL)로 세척하였다. 유기상을 분리시키고, 건조시키고, 농축시켜 오일을 얻었으며, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제한 후 화합물 9a를 오일로서 얻었다 (Rf 0.61, 헥산 내 5% 에틸 아세테이트, 0.592g, 84%).

¹H NMR : 4.16(m, 2H), 3.46(m, 1H), 1.64(m, 4H), 1.26(bs, 18H), 1.16(s, 9H), 0.842(m, 12H), 0.03(s, 6H).

실시예 8 - R(-) 3-히드록시 14-테트라데칸산의 제조

-78℃에서 디클로로메탄(8mL)내 화합물 9a (690mg, 1.6mmol)의 용액에, DIBAL-H 용액 (2.5mL, 5mmol, 톨루엔 내 1.6M)을 아르곤 대기 하에 첨가하였고 혼합물을 상기 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 과량의 DIBAL-H를 메탄올(2mL)이 담긴 원뿔형 플라스크로 옮기고 1시간 동안 교반하였다. 유기상을 분리시키고, 건조시키고, 농축시켰으며 플래시 크로마토그래피에 의한 정제는 히드록시 화합물을 농후 오일로서 얻었다 (Rf 0.24, 헥산 내 8% 에틸 아세테이트, 430mg, 78%).

¹H NMR : 3.48(m, 3H), 1.58(m, 4H), 1.26(bs, 18H), 0.86(m, 12H), 0.03(s, 6H).

상기에서 얻은 알콜 (0.342, 1mmol)을 아세톤(10mL)에 용해시키고 0℃로 냉각시켰으며 오렌지색이 지속될 때까지 존스 시약을 첨가하였다. 반응의 완결 후, 용매를 진공 하에서 제거하였고, 결과로서 얻은 물질을 에틸 아세테이트(10mL)에 용해시키고 물(3 x 5mL)로 세척하며, 유기상을 분리시키고, 건조시키고, 농축시켰으며 플래시 크로마토그래피로 정제하여 상응하는 산을 오일로서 얻었다 (Rf 0.18, 헥산 내 10% 에틸 아세테이트, 195mg, 54%).

¹H NMR : 10.02(bs, 1H), 3.48(s, 1H), 2.24(m, 2H), 1.64(m, 2H), 1.24(bs, 18H), 0.84(m, 12H), 0.03(s, 6H).

상기에서 얻은 실릴산 (180mg, 0.5mmol)을 플라스틱 용기내 THF(2mL)에 용해시키고 -20℃로 냉각시켰으며 HF-피리딘(1mL)을 첨가하였고 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후 과량의 산을 중탄산나트륨 용액 (5%, 2mL)로 중화시키고 디클로로메탄(5mL)으로 추출하였다. 유기 상을 분리시키고, 건조시키고, 농축시켰으며 플래시 크로마토그래피로 정제하여 히드록시 산을 무색 고체로서 얻었다 (Rf 0.16, 헥산 내 30% 에틸 아세테이트, 85mg, 70%). 융점 74℃.

(a)_D ²¹(-) 16.44 (C 0.46, CHCl₃)

문헌 (76), 융점 73℃, (a)_D ²⁵(-) 16.20 (C 2, CHCl₃).

¹H NMR : 10.12(s, 1H), 3.46(m, 1H), 2.36(m, 2H), 1.26(bs, 20H), 0.846(t, 3H).

실시예 9 - (R)-1-t-부틸디메틸실릴옥시-3-히드록시테트라데칸 (10)의 제조

0℃에서 N,N-디메틸포름아미드 (50mL)내 디올 화합물 9 (2.28g, 10mmol)의 용액에, 이미다졸 (1.63g, 2.4mmol), 및 t-부틸디메틸실릴 클로라이드(1.65g, 11mmol)를 차례로 첨가하였고, 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후(TLC), 혼합물을 에틸 아세테이트(200mL)로 희석하였고, 물(2 x 50mL)로 세척하고, 건조시켰으며 농축시켜 무색 오일을 얻었으며, 플래시 크로마토그래피에 의한 정제 후, 순수한 모노실릴 화합물 10을 오일로서 얻었다 (Rf 0.71, 실리카, 에틸 아세테이트 및 헥산, 1:10, 2.80g, 84%).

알콜을 그의 아세테이트 유도체로서 특성화하였다.

¹H NMR (CDCl₃) : 5.0(q, 1H, C-3), 3.62(t, 2H, C-1), 1.80(q, 2H), 1.56(m, 2H), 0.92(m, 12H, CH₃및 t bu), 0.1(s, 6H, Me₂Si).

실시예 10 - (R)-1-t-부틸디메틸실옥시-3-도데카노일옥시 테트라데칸(11)의 제조

염화메틸렌(12mL)내 라우르산 (720mg, 3.6mmol), DCC (680mg, 3.3mmol) 및 DMAP (400mg, 3.3mmol) 및 화합물 10 (1.02g, 3mmol)의 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후 불용성 물질을 여과에 의해 제거하였고, 용매를 제거하였으며, 생성물 플래시 크로마토그래피로 유리시켜 커플링 화합물 11을 오일로서 얻었다 (Rf 0.64, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산 1:9, 1.26g, 81%).

¹H NMR (CDCl₃) : 4.96(q, 1H), 3.75(t, J=6.6Hz, 2H), 2.228(t, J=7.5Hz, 2H), 1.691(m, 4H), 1.512(m, 2H), 1.228(bs, 36H), 0.91(m, 15H), 0.002(s, 6H, 실릴의 메틸들).

¹³C NMR : 174.469, 72.660, 72.623, 60.903, 38.585, 35.936, 35.738, 33.261, 30.970, 30.917, 30.828, 30.686, 30.532, 27.244, 27.184, 27.059, 26.534, 26.463, 24.008, 19.511, 15.392.

1R : 2926, 1738, 1585, 1494, 1415, 1255, 1176, 1097, 940, 837, 723.

실시예 11 - (R)-3-도데카노일옥시 테트라데칸산(3)의 제조

0℃에서 메탄올 및 염화메틸렌 (20mL, 1:1 혼합물)내 화합물 11 (2.63g, 5mmol)의 용액에, PTSA (200mg)을 첨가하였고 결과로서 얻은 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 산을 트리에틸아민(1mL)으로 중화하였고 용매를 진공하에서 제거하였으며 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 상응하는 알콜을 오일로서 얻었다 (Rf 0.24, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 1:1, 1.44g, 70%).

¹H NMR : 4.984(m, 1H), 3.501(m, 2H), 2.775(bs, 1H, 0H), 2.329(t, J=7.2Hz, 2H), 1.571(m, 6H), 1.226(bs, 36H), 0.864(t, J=6.6Hz, 6H).

¹³C NMR : 175.488, 72.550, 69.959, 59.824, 38.913, 38.864, 37.732, 35.997, 35.891, 35.676, 33.251, 30.963, 30.875, 30.682, 30.613, 30.513, 26.979, 26.780, 26.462, 26.324, 24.012, 15.408.

IR : 3535, 2924, 1739, 1692, 1565, 1494, 1427, 1379, 1171, 1059, 936.

상기에서 얻어진 알콜 (1.49g, 3.61mmol)을 아세톤(40mL)에 용해시켰고, 존스 시약을 오렌지색이 지속될 때까지 서서히 첨가하였다. 반응의 완결 후, 용매를 진공 하에서 제거하였고 결과로서 얻은 물질을 에틸 아세테이트(50mL)에 용해시키고 유기 상이 거의 무색이 될 때까지 물(3 x 30mL)로 세척하였다. 유기 층을 분리시키고, 건조시키며, 농축시켜 오일을 얻었으며, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제하여 산 3을 무색 고체로서 얻었다 (1.32g, 86%).

¹H NMR : 9.86(bs 1H, COOH의 OH, 5.186(m, 2H), 2.579(t, J=6.6Hz, 6H), 2.44(t, J=7.5Hz, 2H), 1.592(bs, 4H), 1.231(bs, 36H), 0.847(t, J=6.6Hz, 6H, 말단 메틸).

¹³C NMR : 177.659, 174.650, 71.390, 40.277, 35.774, 35.292, 33.247, 30.969, 30.880, 30.636, 30.617, 30.445, 26.326, 24.010, 15.383.

IR: 3573, 2921, 2675, 1746, 1713, 1675, 1549, 1513, 1466, 1379, 1283, 1206, 1164, 1114, 1070, 1012, 935, 723.

실시예 12 - 디벤질 도데칸포스포네이트(14)의 제조

아르곤 대기 하에, 건조 DMF (50mL)내, 칼륨 t-부톡시드(6.16g, 55mmol)의 용액에 건조 DMF (5mL)내 디벤질 포스파이트 (13.1g, 50mmol)의 용액을 주입기를 통해 적가하였고, 반응 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 그 다음 건조 THF (15mL)내 라우릴 브로마이드(18.6g, 75mmol)의 용액을 아르곤 대기 하에서 적가하였고, 혼합물을 실온에서 1시간 더 교반하였다. 반응의 완결 후, 혼합물을 묽은 HCl (40mL)로 중화하였고 에틸 아세테이트 (200mL)로 추출하였고, 유기상을 건조시키고, 농축시키고, 플래시 크로마토그래피로 정제하여 순수한 디벤질 포스페이트 14를 무색 오일로서 얻었다 (Rf 0.46, 실리카, 에틸 아세테이트 및 헥산, 1:2, 10.5g, 50%).

¹H NMR (CDCl₃) : 7.36(m, 10H, 방향족), 5.02(m, 벤질의 4H), 1.52(m, 2H), 1.24(bs, 18H), 0.9(t, 3H).

실시예 13 - 포스포클로리데이트(12)의 제조

클로로포름(40mL)내, 포스포러스 펜타클로라이드(2.9g, 14mmol) 및 화합물 14 (6g, 14mmol)의 혼합물을, 60℃에서 2시간 동안 가열하였다. 반응의 완결 후 (반응의 진행을 NMR로 모니터하였음) 용매를 진공하에서 제거하여 포스포클로리데이트 12를 오일로서 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃) : 7.36(m, 5H, 방향족), 5.24(m, 2H, 벤질계), 1.26(bs, 18H), 0.92(t, 3H).

실시예 14 - 화합물 13의 제조

히드록시 화합물 10 (1.05g, 3mmol) 및 포스포클로리데이트 화합물 12 (1.42g, 4mmol)의 혼합물을 3시간 동안 DMAP (0.41g, 3.3mmol) 및 트리에틸아민 (2mL)의 존재하에 염화메틸렌 (12mL)내에서 교반하였다. 반응의 완결 후, 메탄올 (1mL)을 첨가하였고, 용매를 진공하에서 제거하였으며, 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제하였다 (Rf 0.46, 실리카, 에틸 아세테이트 및 헥산 1:9, 1.36g, 68%).

¹H NMR (CDCl₃) : 7.42(m, 5H, 방향족), 5.02(m, 2H, 벤질), 4.58(m, 1H), 3.76(m, 2H), 1.82(m, 6H), 1.28(bs, 36H), 0.92(m, 9H), 0.12(s, 3H) 및 0.1 (s, 3H).

실시예 15 - 산 4의 제조

메탄올 및 염화메틸렌(6mL, 1:1 혼합물)내 PTSA (60mg) 및 화합물 13 (800mg, 1.2mmol)의 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후 산을 트리에틸아민(2mL)으로 중화하였고, 용매를 제거하였으며, 혼합물을 플래시 크로마토그래피에 적용시켜 상응하는 히드록시 화합물을 오일로서 얻었다 (Rf 0.24, 실리카, 에틸 아세테이트 및 헥산 1:4, 580mg, 87%).

¹H NMR : 7.36(m, 5H, 방향족), 5.124(m, 2H, 벤질계), 4.612(m, 1H), 3.728(m, 2H), 3.052(bs, 0H), 1.642(m, 4H), 1.264(bs, 40H), 0.846(t, 6H).

상기 알콜 화합물 (550mg, 1mmol)을 아세톤(10mL)에 용해시켰고 0℃로 냉각시켰으며, 존스 시약을 적색이 지속될 때까지 첨가하였고 혼합물을 상기 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후 아세톤을 제거하였고, 결과로서 얻은 물질을 에틸 아세테이트(10mL)에 용해하였으며 유기층이 거의 무색이 될 때까지 물(3 x 5mL)로 세척하였다. 유기 층을 건조시키고 농축시켜 산 4를 오일로서 얻었다 (520mg, 81%).

¹H NMR : 7.36(m, 5H, 방향족), 5.124(m, 2H), 4.746(m, 1H), 2.562(m, 2H), 1.462(m, 4H), 1.264(bs, 40H), 및 0.861(t, 6H).

실시예 16 - 화합물 15의 조제

염화메틸렌(20mL)내 화합물 2(1.79g, 5mmol), 산 3(2.13g, 5mmol), DCC (1.24g, 6mmol) 및 DMAP (0.74g, 6mmol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 불용성 물질을 여과에 의해 제거하였고, 용매를 제거하였으며, 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 커플링된 화합물 15를 오일로서 얻었다 (Rf 0.24, 실리카, 에틸 아세테이트 및 헥산 1:19, 2.76g, 72%).

¹H NMR(CDCl₃) : 5.26(m, 1H), 4.98(t, 1H), 4.70(d, J=8.6Hz, 1H, 아노머릭), 3.80(m, 3H), 3.32(m, 2H), 2.72(AB 사중상태, 2H), 2.32(t, 2H), 1.68(m, 2H), 1.42(s, 3H, 이소프로필리덴 Me), 1.30(s, 3H, 이소프로필리덴 Me), 1.26(bs, 36H), 0.92(m, 15H), 0.2(2 x s, 6H).

실시예 17 - 아미노 화합물 16의 제조

염화메틸렌(20mL)내 트리플루오로아세트산(8mL) 및 화합물 15 (2.37g, 3.1mmol)의 혼합물을 실온에서 교반하였다. 반응의 완결 후 산을 트리에틸아민(10mL)으로 중화시켰고, 용매를 제거하여 농후 오일을 얻었다. 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 디올을 오일로서 얻었다. (Rf 0.36, 실리카, 에틸 아세테이트 및 헥산, 1:6, 1.62g, 72%).

¹H NMR(CDCl₃) : 5.20(m, 1H), 4.80(t, 1H), 4.70(d, 1H, 아노머릭), 3.82(AB 사중상태, 2H), 3.60(t, 1H), 3.41(m, 1H), 3.30(dd, 1H), 3.08(m, 1H), 2.60(d, 2H), 2.32(t, 2H), 1.60(m, 2H), 1.28(bs, 36H), 0.94(s, 9H), 0.90(t, 6H) 및 0.1(s, 6H).

상기에서 얻어진 디올 (1.53g, 2.1mmol)의 일차 알콜 관능기를 에테르 8의 제조를 위해 사용된 동일한 절차를 따른 후 t-부틸디메틸실릴 에테르로서 보호하여 일차 실릴 에테르를 얻었다 (Rf 0.34, 실리카, 에틸아세테이트 및 헥산, 1:19, 1.54g, 87%).

¹H NMR : 5.20(m, 1H), 4.82(t, 1H), 4.61(d, 1H, 아노머릭), 3.84(d, 2H), 3.60(t, 1H), 3.40(m, 1H), 3.30(dd, 1H), 2.61(d, 2H), 2.30(t, 2H), 1.60(m, 2H), 1.26(bs, 36H), 0.92(m, 24H), 0.14(2 x s, 6H), 0.1(s, 6H).

상기에서 얻어진 모노실릴화 화합물(1.49g, 1.77mmol)을 메탄올(10mL)내 Pd-C, (10%, 200mg)상에서 수소첨가하여 상응하는 아미노 화합물 16을 오일로서 얻었다 (Rf 0.24, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 1:9, 1.38g, 96%).

¹H NMR(벤젠-d₆) : 5.40(m, 1H), 5.14(t, 1H), 4.51(d, 1H, 아노머릭), 3.82(m, 2H), 3.72(t, 1H), 3.30(m, 1H), 2.91(m, 3H, D₂O와 교환 후 적분은 감소한다, 아미노), 2.60(d, 2H), 2.20(m, 2H), 1.62(m, 2H), 1.24(bs, 36H), 0.92(m, 24H), 0.2(2 x s, 6H), 0.0(s, 6H).

실시예 18 - 화합물 1의 제조

염화메틸렌(5mL)내 산 4 (526mg, 1mol)의 용액에, EDC (200mg, 1mmol)을 첨가하였고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 그 다음 아미노 화합물 16 (815mg, 1mmol), 및 1-히드록시 벤조트리아졸 (130mg, 1mmol)을 첨가하였으며 결과로서 얻은 혼합물을 4시간 동안 아르곤 대기 하에 교반하였다. 반응의 완결 후 혼합물을 에테르(10mL)로 희석시키고 물 (2 x 5mL)로 세척시켰고 건조시키고, 농축시키며 크로마토그래피하여 커플링된 화합물 1을 오일로서 얻었다 (Rf 0.71, 실리카, 염화메틸렌:에테르, 3:1, 640mg, 49%).

¹H NMR : 7.40(m, 5H, 방향족), 6.32(d, 1H, NH), 4.60-5.23(m, 5H), 3.82(m, 2H), 3.40(m, 2H), 3.36(m, 2H), 3.30(m, 1H), 2.52(m, 2H), 2.24(t, 2H), 1.62(m, 2H), 1.24(bs, 36H), 0.91(m, 24H) 및 0.06(bs, 12H).

실시예 19 - 화합물 17의 제조

염화메틸렌(2mL)내 화합물 1 (400mg, 0.302mmol), N,N-디이소프로필 아미노 디벤질 포스파이트(164mg, 0.5mmol), 및 테트라졸 (55mg, 0.75mmol)의 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응의 완결 후 (TLC), 혼합물을 -20℃로 냉각시켰고 m-CPBA (140mg, 0.85mmol)을 첨가하였으며 반응 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 산화 반응의 완결 후 혼합물을 에테르(10mL)로 희석하고 물(5mL)로 세척한 다음, 중탄산나트륨 용액 (5%, 5mL)으로 다시 세척하였다. 유기 층을 건조시키고, 농축시키며, 플래시 크로마토그래피로 정제하여 포스포릴화 화합물 17을 오일로서 얻었다 (Rf 0.36, 실리카, 에틸 아세테이트 및 헥산, 1:3, 435mg, 91%).

¹H NMR : 7.340(m, 15H, 방향족), 5.012(m, 6H), 4.742(m, 2H), 4.395(m, 1H), 3.676(m, 2H), 3.264(m, 2H), 2.421(m, 8H), 1.521(m, 8H), 1.246(bs, 72H), 0.862(m, 30H, 및 0.08(m, 12H).

실시예 20 - 면역원 BK-1의 제조

메탄올(1mL)내 화합물 17 (220mg, 0.014mmol)의 현탁액을 Pd-C (10%, 20mg)을 사용하여 수소첨가에 적용시켰다. 반응의 완결 후, 여과에 의해 촉매를 제거하였고 그 다음 용매를 제거하여 탈벤질화된 화합물을 얻었다 (Rf 0.36, 실리카, 에틸 아세테이트내 30% 메탄올, 165mg, 90%).

¹H NMR(CDCl₃) : 5.102(m, 2H), 4.642(m, 2H), 3.962(m, 2H), 3.24(m, 2H), 2.42(m, 8H), 1.521(m, 8H), 1.241(bs, 72H), 0.824(m, 30H) 및 0.08(m, 12H).

상기에서 얻어진 화합물 (131mg, 0.01mmol)을 0℃에서 30분 동안 플라스틱 용기내에서, THF (1mL)내, HF-피리딘 (0.5mL)로 처리하였다. 반응의 완결 후, 혼합물을 에틸 아세테이트 (5mL)로 희석하고 중탄산나트륨 (5%, 2mL) 용액과 함께 20분 동안 교반하였다. 유기층을 분리시켰고 수용액을 클로로포름(5mL)으로 세척하였고, 유기 상을 건조시켰고 용매를 진공하에 제거하여 오일을 얻었다. 오일을 클로로포름-메탄올 혼합물(1:1, 10mL)에 용해시켰고 불용성 입자를 여과하였다. 여액을 건조시키고 농축시켜 농후 오일을 얻었고 잔류물을 물에 재용해시키고 친액성화하여 BK-1을 얻었다 (Rf 0.21, 실리카, 클로로포름내 50% 메탄올, 55mg, 51%).

¹H NMR : 5.112(m, 2H), 4.462(m, 2H), 3.621(m, 4H), 2.221(m, 8H), 1.562(m, 8H), 1.221(bs, 72H), 및 0.824(t, 12H).

실시예 21 - 화합물 18의 제조

에틸 아세테이트(40mL)내 아지도 화합물 2(3.59g, 10mmol) 및 Pd-C(10%, 0.35g)의 현탁액을 수소 대기 하에서 교반하였다. 반응의 완결 후(TLC) 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과시켜 촉매를 제거하였고 용매를 진공하에 제거하여 농후 오일을 얻었다. 오일을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 18을 무색 고체로서 얻었다 (Rf 0.26, 실리카, 에틸 아세테이트, 3.0g, 90%). 융점 154-155℃.

¹H NMR : 4.463(d, J=7.8Hz, 1H, C-1), 3.785(m, 2H), 3.538(t, J=9.3Hz, 1H), 3.415(t, J=9.3Hz, 1H), 3.229(m, 1H), 2.682(m, 1H), 1.463(s, 3H), 1.385(s, 3H), 0.869(s, 9H, t-부틸), 0.082(s, 6H, SiMe₂).

¹³C NMR : 99.655, 99.313, 74.049, 73.104, 67.557, 62.130, 59.904, 29.080, 25.682, 19.149, -4.088, -5.190.

IR :3573, 3391, 2931, 2249, 1666, 1512, 1464, 1383, 1266, 1181, 1141.

실시예 22 - 화합물 26의 제조

Ar 대기 하에서 디클로로메탄 (18mL)내 산 3 (3.83g, 9mmol) 및 아미노 화합물 18 (2.85g, 8.55mmol)의 용액에, EDC (1.91g, 10mmol) 및 HOBT (1.30gms, 10mmol)을 차례로 첨가하였고, 결과로서 얻은 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후 용매를 진공하에 제거하였고 생성물을 플래시 크로마토그래피 후 오일로서 유리시켰다 (Rf 0.34, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산 3:7, 4.81g, 76%).

¹H NMR : 6.249(d, J=6.9Hz, 1H, NH), 5.133(m, 1H, CHOCO), 4.875(d, J=8.1Hz, 1H, C-1), 3.833(m, 3H), 3.615(t, J=9Hz, 1H), 3.415(m, 1H), 3.280(m, 1H), 2.439(m, 2H), 2.263(t, J=7.2Hz, 2H), 1.513(s, 3H, 아세토니드 메틸), 1.427(s, 3H, 아세토니드 메틸), 1.247(bs, 34H), 0.876(m, 15H, t-부틸 및 말단 메틸) 및 0.08(s, 6H, SiMe₂).

¹³C NMR : 174.242, 171.041, 99.719, 95.891, 74.284, 71.657, 71.406, 67.280, 62.036, 60.810, 42.508, 34.534, 34.478, 31.880, 29.594, 29.513, 29.482, 29.262, 29.167, 29.036, 25.608, 25.259, 24.271, 22.642, 19.035, 17.836, 14.080, -4.135, -5.196.

IR : 3298, 2928, 1733, 1654, 1465, 1306, 1257, 1098, 941, 842, 784, 673.

실시예 23 - 케토 포스포네이트 21의 제조

건조 THF (250mL)내 디메틸 메틸포스포네이트 (6.20g, 50mmol)의 냉각 용액 (-78℃)에서 Ar 대기 하에서 주입기를 통해 n-부틸리튬 (1.6M, 30mL, 52.8mmol)용액을 첨가하였고 혼합물을 상기 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 그 다음 THF (30mL)내 메틸 라우레이트 (12.8g, 60mmol)의 용액을 첨가하였고 반응 혼합물을 -78℃에서 1시간 동안 그 다음 0℃에서 30분 동안 더 교반하였다. 반응의 완결 후, 염기를 염화 암모늄 용액(10%, 100mL)으로 중화하였고 유기 층을 분리시키고, 건조시키며, 농축시켜 오일을 얻었다. 생성물, 케토 포스포네이트 21을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 무색 고체를 얻었다 (Rf 0.46, 에틸 아세테이트, 9.8gms, 64%). 융점 43-44℃.

¹H NMR : 3.757(s, 3H, 0Me), 3.720(s, 3H, OMe), 3.038(d, J=22.5Hz, 2H, CH₂), 2.559(t, J=7.5Hz, 2H), 0.826(t, J=6.6Hz, 3H, 측쇄 말단 메틸).

¹³C NMR : 203.012, 54.122, 54.043, 45.291, 43.231, 41.534, 33.070, 30.777, 30.634, 30.503, 30.562, 30.114, 24.567, 23.849, 15.252.

IR :2967, 1704, 1588, 1474, 1378, 1237, 1193, 1105, 1057, 895, 826, 794.

실시예 24 - 히드록시 포스포네이트 22의 제조

0℃로 냉각된 메탄올 (100mL)내, 케토 포스포네이트 21 (6.12g, 20mmol)의 용액에 나트륨 보로하이드라이드 (0.95g, 25mmol)을 4분량으로 첨가하였고, 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 과량의 하이드리드 시약을 물(2mL)로 켄칭하였고 용매를 진공하에서 제거하여 조 히드록시 포스포네이트를 얻었다. 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 히드록시 포스포네이트 22를 무색 고체로서 얻었다 (Rf 0.21, 실리카, 에틸 아세테이트, 5.80g, 94%). 융점 72-73℃.

¹H NMR : 4.02(m, 1H, CHOH), 3.7325(d, J=9.9Hz, 6H, P OCH₃), 3.410(bs, 1H, OH), 1.976(m, 2H, CH₂), 1.352(m, 4H, 2 x CH₂), 1.206(bs, 16H), 0.826(t, J=6.6Hz, 3H, 말단 메틸).

¹³C NMR : 90.241, 67.796, 67.711, 40.124, 39.538, 34.855, 33.211, 33.026, 30.944, 30.919, 30.885, 30.787, 30.636, 26.721, 23.972, 15.381.

IR :3338, 2956, 2743, 1741, 1471, 1266, 1129, 1030, 988, 854, 727, 572.

실시예 25 - 화합물 23의 제조

디클로로메탄 (40mL)내 라우르산 (4.0g, 20mmol) 및 히드록시포스포네이트 22 (5.54g, 18mmol)의 용액에 DCC (4.12g, 20mmol) 및 DMAP (2.44g, 20mmol)을 차례로 첨가하였고 내용물을 실온에서 4시간 동안 아르곤 대기 하에서 교반하였다. 반응의 완결 후 (4시간, TLC), 여과에 의해 불용성 물질을 제거하였고 용액을 농축시켜 조 에스테르 23을 얻었으며, 플래시 크로마토그래피한 후, 에스테르 23을 무색 고체로서 얻었다 (Rf 0.64, 에틸 아세테이트, 7.23g, 82%). 융점 74-75℃.

¹H NMR : 5.186(m, 1H, CHCOO), 3.732(d, J=6.9Hz, 6H, P OCH₃), 2.346(t, J=7.5Hz, 2H), 2.102(m, 2H), 1.614(m, 4H, 2 x CH₂), 1.240(bs, 32H), 0.826(t, J=6.2Hz, 6H).

¹³C NMR : 174.005, 69.761, 53.545, 53.460, 36.221, 36.111, 35.587, 33.099, 32.151, 30.804, 30.670, 30.526, 30.430, 30.336, 30.290, 26.257, 26.079, 23.850, 15.222.

IR : 2926, 2855, 1739, 1494, 1251, 1183, 1035, 844, 756, 666.

실시예 26 - 이산(diacid) 24의 제조

Ar 대기 하에서, 얼음욕에 의해 냉각된 디클로로메탄 (25mL)내 화합물 23 (6.86gms, 14mmol)이 용액에 요오드화트리메틸실릴(7mL)을 첨가하였고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 혼합물을 디클로로메탄(20mL)으로 희석하고 나트륨 티오설페이트 용액(10%, 20mL)과 함께 10분 동안 교반하였다. 그 다음 유기 층을 분리시키고 농축시켜 조 이산 24을 얻었다. 조 물질을 THF (50mL) 묽은 HCl (5%, 20mL)에 용해시켰고 용액을 1시간 동안 교반하였다. 상기 용액에 디클로로메탄(100mL)을 첨가하였고, 유기층을 분리시키고, 건조시키며, 농축시켜 화합물 24을 무색고체 (5.30g, 82%)로서 얻었다. 융점 78-79℃.

¹H NMR : 5.186(m, 1H, CHOH), 2.324(t, J=7.2Hz, 2H), 2.084(m, 2H), 1.632(m, 4H), 1.286(bs, 34H), 0.826(t, J=6.6Hz, 6H).

¹³C NMR : 175.488, 70.250, 36.755, 36.610, 35.875, 33.299, 31.058, 31.058, 31.037, 30.947, 30.738, 30.582, 26.392, 26.227, 24.049, 15.436.

IR : 2954, 1740, 1687, 1471, 1277, 1170, 1090, 998, 900, 855, 720, 610, 570.

실시예 27 - 화합물 25의 제조

화합물 24 (4.62g, 10mmol), 벤질 알콜 (3.24g, 30mmol), 트리클로로 아세토니트릴 (5mL), 피리딘 (10mL) 및 클로로포름(20mL)의 혼합물을 50℃에서 밤새 가열하였다. 반응의 완결 후, 용매를 진공하에서 제거하였고 결과로서 얻은 물질을 THF (40mL)에 용해시키고 HCl (5%, 20mL)와 함께 1시간 동안 교반하였다. 그 다음 유기 층을 분리시키고, 농축시키며, 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 모노벤질화 화합물 25을 갈색 농후 오일로서 얻었다 (3.64g, 64%).

¹H NMR : 11.56(bs, 1H, 0H), 7.363(m, 5H, 방향족), 5.197(m, 1H), 5.062(d, 2H), 2.112(m, 4H), 1.652(m, 4H), 1.264(bs, 36H), 0.896(t, 3H).

¹³C NMR : 174.442, 137.520, 137.615, 129.845, 129.172, 129.367, 69.930, 67.947, 36.553, 36.430, 35.770, 33.581, 33.302, 31.024, 30.966, 30.738, 30.693, 30.548, 26.393, 26.244, 24.065, 15.476.

IR : 3359, 3063, 2957, 2873, 1869, 1717, 1636, 1499, 1382, 1072, 997.

실시예 28 - 포스포클로리데이트 19의 제조

건조 클로로포름(10mL)내 화합물 25 (1.707g, 3mmol) 및 포스포러스 펜타클로라이드 (0.615g, 3mmol)의 용액을 Ar 대기내 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응의 완결(3시간, NMR)후 용매를 제거하였고 결과로서 얻은 생성물 포스포클로리데이트를 더 정제할 필요없이 다음 반응에 사용하였다.

¹H NMR : 7.340(m, 5H, 방향족), 5.124(m, 3H, 벤질계 ＆ CHCOO), 2.241(m, 4H), 1.42(m, 4H), 1.24(bs, 34H), 0.864(t, 6H, 말단메틸들).

실시예 29 - 화합물 27의 제조

아르곤 대기 하에서 디클로로메탄(8mL)내 화합물 26 (1.48g, 2mmol), DMAP (0.244g, 2mmol) 및 트리에틸아민 (4mL)의 용액에 10분의 기간에 걸쳐 주입기를 통해 디클로로메탄 (5mL)내 포스포클로리데이트 19 (1.76gms, 3mmol, 조)의 용액을 첨가하였고 결과로서 얻은 반응 혼합물을 실온에서 1시간 더 교반하였다. 반응의 완결 후, 용매를 진공하에서 제거하였고 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 27을 오일로서 얻었다 (Rf 0.36, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산 1:5, 1.5g, 56%).

¹H NMR : 7.340(m, 5H, 방향족), 6.589(m, 1H, NH), 5.033(m, 4H, 벤질계 및 2 x CHCOO), 2.231(m, 8H), 1.592(m. 8H), 1.521(s, 3H, 아세토니드 메틸), 1.367(s, 3H, 아세토니드 메틸), 1.258(bs, 68H), 0.874(m, 21H, t-부틸 및 측쇄 말단 메틸), 0.08(s, 3H, SiMe), 0.07(s, 3H, SiMe).

¹³C NMR : 174.678, 172.091, 169.665, 128.516, 127.875, 99.558, 97.067, 72.538, 70.366, 68.523, 66.840, 61.811, 56.701, 42.021, 34.448, 31.835, 29.884, 29.002, 25.569, 25.196, 22.642, 19.109, 17.192, 14.054, -4.300 및 -5.416.

IR : 3289, 2993, 1744, 1661, 1464, 1306, 1252, 1199, 1098, 942, 842, 732, 698, 525.

실시예 30 - 화합물 28의 제조

0℃로 냉각된 디클로로메탄 (5mL)내 화합물 27 (0.51g, 0.4mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산(3mL)를 첨가하였고 결과로서 얻은 반응 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 산을 트리에틸아민(4mL)으로 중화시켰고, 용매를 진공하에서 제거하여 조 디올 28을 오일로서 얻었으며, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제한 후 순수한 디올 28을 오일로서 얻었다 (Rf 0.16, 에틸 아세테이트:헥산, 1:4, 0.30g, 81%).

¹H NMR : 7.346(m, 5H, 방향족), 6.211(m,1H, NH), 5.116(m, 4H), 4.842(d, J=7.2Hz, 1H, C-1), 4.420(m, 1H), 3.642(m, 5H), 2.228(m, 8H), 1.33(m, 8H), 1.261(bs, 68H), 0.824(m, 21H, 말단 메틸 및 t-부틸), 0.08(s, 3H, SiMe), 0.074(s, 3H, SiMe).

¹³C NMR : 173.799, 173.287, 169.818, 128.634, 128.347, 95.666, 74.927, 70.810, 68.884, 62.879, 34.524, 34.405, 31.892, 29.775, 29.682, 29.397, 29.332, 29.129, 25.607, 24.974, 24.939, 24.868, 24.848, 22.658, 17.822, 14.083, -4.002, -5.014.

IR : 3286, 2955, 2362, 1736, 1656, 1500, 1416, 1379, 1229, 1081, 939, 784.

실시예 31 - BK-3의 제조

에틸 아세테이트(2mL)내 화합물 28 (123mg, 0.1mmol) 및 Pd-C (10%, 12mg)의 현탁액을 수소 대기 하에서 교반하였다. 반응의 완결 후 여과에 의해 촉매를 제거하였고 용매의 제거는 탈벤질화된 화합물을 오일로서 얻었다 (103mg, 90%).

¹H NMR : 6.208(m, 1H, NH), 5.012(m, 1H), 4.782(m, 2H), 3.742(m, 3H), 3.124(m, 2H), 2.228(m, 8H), 1.32(m, 8H), 1.261(bs, 68H), 0.824(m, 2H), 0.80(s, 6H).

상기에서 얻은 화합물 (100mg, 0.087mmol)을 0℃로 냉각된 플라스틱 용기내 THF (2mL)에 용해시켰고 HF-피리딘 (0.2mL)을 첨가하였다. 반응의 완결(30분)후 혼합물을 디클로로메탄(5mL)으로 희석하였고, 중탄산나트륨 용액(5%, 2mL)와 함께 교반하였다. 유기 층을 분리시키고, 건조시키며, 농축시켜 BK-3을 오일로서 얻었다. 오일을 물(5mL)에 용해시키고 친액 성화하여 BK-3을 농후 오일로서 얻었다. (65mg, 74%).

¹H NMR : 6.021(m, 1H, NH), 5.034(m, 1H), 4.420(m, 2H), 3.342(m, 5H), 2.228(m, 8H), 1.30(m, 8H), 1.24(m, 68H), 0.832(t, 12H).

실시예 32 - 화합물 31의 제조

0℃로 냉각된 중탄산나트륨 수용액 (14.4g, 300mmol, 400mL 물)내 글루코사민 히드로클로라이드(21.55g, 100mmol)의 용액에 Cbz-Cl (18.75g, 110mmol)을 적가하였고 반응 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 그 다음 실온에서 밤새 교반하였다. 침전된 화합물을 여과시키고, 냉 아세톤(40mL)로 세척하고 건조시켜 아미노 보호 화합물을 무색고체로서 얻었다 (26.90g, 86%).

상기에서 얻은 아미노-보호 화합물(25g, 79.8mmol)을 메탄올성 염화 수소 용액(2% 부피/중량, 350ml)에 용해시켰고, 혼합물을 환류에서 4시간 동안 가열하였다. 반응의 완결 후, 용매를 진공 하에서 제거하여 화합물 31을 무색 고체로서 얻었다 (Rf 0.24 실리카, 디클로로메탄내 10%, 메탄올, 20.30g, 78%).

실시예 33 - 화합물 32의 제조

화합물 32 (22g, 67.2mmol), 아세톤(200mL)내 PTSA(0.5g), 디클로로메탄(300mL), 및 2,2-디메톡시프로판(28g, 4당량)의 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 산을 트리에틸아민(5mL)으로 중화시키고 물(50mL)로 세척하였으며, 건조시키고, 농축시켜 슬러리를 얻었으며, 이를 플래시 크로마토그래피한 후, 화합물 32을 무색 고체로서 얻었다(Rf 0.52, 에틸 아세테이트:헥산 2:3, 20.71g, 84%). 융점 64-65℃.

¹H NMR : 7.313(m, 5H, 방향족), 5.362(d, J=9Hz, 1H, NH), 5.093(m, 2H, 벤질계), 4.683(d, J=3Hz, 1H, C-1), 3.709(m, 6H), 3.308(s, 3H, OCH₃), 2.432(bs, 1H, OH), 1.483(s, 3H, 아세토니드메틸), 1.414(s, 3H, 아세토니드 메틸).

¹³C NMR : 158.159, 137.547, 129.879, 129.714, 129.546, 101.202, 100.075, 75.902, 71.398, 68,531, 64.723, 63.658, 56.570, 30.435, 20.461.

IR : 3422, 3382, 2995, 1708, 1531, 1374, 1268, 1163, 1022, 991, 895, 752.

실시예 34 - 아미노 화합물 30의 제조

에틸 아세테이트 (200mL)내, 화합물 32 (19g, 51.7mmol) 및 Pd-C (10%, 1g)의 현탁액을 수소 대기 하에서 교반하였다. 반응의 완결 후, 셀라이트의 패드를 통한 여과에 의해 촉매를 제거하였고 용매의 제거는 아미노 화합물 30을 무색 고체로서 얻었다 (Rf 0.46, 실리카, 에틸 아세테이트, 11.3g, 92%). 융점 152-153℃.

¹H NMR : 4.637(d, J=3.6Hz, 1H, C-1), 3.714(m, 2H), 3.483(m, 3H), 2.700(m, 1H), 2.342(bs, 2H, NH₂), 1.481(s, 3H), 1.398(s, 3H).

¹³C NMR : 102.532, 100.963, 75.960, 73.320, 64.811, 63.823, 58.070, 58.030, 56.601, 30.512, 20.522.

IR : 3454, 2938, 1580, 1466, 1383, 1273, 1201, 1122, 1041, 994, 898, 752, 738.

실시예 35 - 화합물 33의 제조

디클로로메탄(100mL)내 산 3 (8.52g, 20mmol) 및 아미노 화합물 30 (4.66g, 20mmol)의 용액에 EDC (4.18g, 22mmol) 및 HOBT (2.86g, 22mmol)을 차례로 첨가하였고 혼합물을 아르곤 대기 하의 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 혼합물을 분리 깔때기 내로 옮기고, 물(25mL)로 세척하고, 건조시키며, 농축시켜 오일을 얻었다. 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 33을 오일로서 얻었다 (Rf 0.41, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 9.58g, 68%).

¹H NMR : 6.134(d, J=9Hz, 1H, NH), 5.159(m, 1H, CHOCO), 4.634(d, J=3.9Hz, 1H, C-1), 4.134(m, 1H), 3.766(m, 5H), 3.352(s, 3H, OCH₃), 3.193(bs, 1H, OH), 2.483(d, J=6Hz, 2H), 2.290(t, J=7.5Hz, 2H), 1.605(m, 4H), 1.524(s, 3H), 1.431(s, 3H, 아세토니드의 CH₃), 1.246(bs, 34H), 0.875(t, J=6.6Hz, 3H, 말단 CH₃).

¹³C NMR : 174.960, 172.237, 101.191, 100.162, 75.913, 72.549, 72.176, 64.671, 63.618, 56.441, 55.535, 43.149, 35.884, 35.451, 33.237, 30.954, 30.863, 30.837, 30.668, 30.515, 26.633, 26.318, 24.004, 20.423, 15.425.

IR : 3418, 3354, 2994, 1734, 1652, 1467, 1339, 1267, 1197, 1131, 1074, 994, 896, 735.

실시예 36 - 화합물 34의 제조

DMF (40mL)내 화합물 33 (7.16g, 11.17mmol)의 용액에 이미다졸(1.76g, 26mmol) 및 t-부틸디메틸실릴 클로라이드 (1.95g, 13mmol)을 차례로 첨가하였고 혼합물을 아르곤 대기 하에 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 혼합물을 분리깔때기로 옮기고, 에틸 아세테이트(150mL)로 희석시키며, 물(2 x 100mL)로 세척하였다. 유기 층을 분리시키고, 건조시키며, 농축시켜 오일을 얻었다. 생성물을 플래시 크로마토그래피 후 유리시켜 실릴화 화합물 34를 오일로서 얻었다 (Rf 0.62, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 6.83g, 81%).

¹H NMR : 5.726(d, J=9.6Hz, 1H, NH), 5.124(m, 1H, 0CHCO), 4.615(d, J=3.6Hz, 1H, C-1), 4.190(m, 1H), 3.827-3.537(m, 5H), 3.31(s, 3H, OCH₃), 2.462(m, 2H, CH₂CO), 2.287(t, J=7.5Hz, 2H, CH₂CO), 1.612(m, 4H), 1.522(s, 3H), 1.432(s, 3H), 1.321(bs, 34H), 0.894(m, 15H, t-부틸 및 측쇄 말단 CH₃), 0.042(s, 6H, SiMe₂).

¹³C NMR : 174.419, 170.738, 100.736, 76.157, 73.000, 72.947, 72.888, 72.280, 64.977, 63.768, 56.360, 55.388, 43.169, 35.860, 35.765, 33.229, 30.935, 30.865, 30.810, 30.654, 30.616, 30.501, 30.382, 27.112, 27.064, 27.031, 26.473, 26.323, 23.992, 20.271, 19.482, 15.408.

IR : 2995, 1724, 1667, 1516, 1382, 1267, 1164, 1083, 1005, 910, 838, 780, 734.

실시예 37 - 화합물 35의 제조

0℃의 디클로로메탄(10mL)내 아세토니드 화합물 34 (4.53g, 6mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산 (5mL)을 첨가하였고 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후 산을 트리에틸아민(6mL)으로 중화시켰고 혼합물을 물(10mL)로 세척하였다. 유기 층을 분리시키고, 건조시키며, 농축시켜 조디올을 얻었으며, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제한 후 디올 35을 오일로서 얻었다 (Rf 0.36, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 1:1, 3.98g, 93%).

¹H NMR : 5.724(d, J=9.6Hz, 1H, NH), 5.124(m, 1H, OCHCO), 4.612(d, J=3.6Hz, 1H, C-1), 3.724-3.401(m, 5H), 3.32(s, 3H, OCH₃), 2.416(t, J=7.6Hz, 2H), 2.232(t, J=7.6Hz, 2H), 1.618(m, 4H), 1.321(bs, 34H), 0.894(m, 12H, t-부틸 및 측쇄 말단 CH₃), 0.042(s, 3H, SiMe), 0.038(s, 3H, SiMe).

¹³C NMR : 174.519, 171.030, 100.153, 74.732, 73.220, 72.992, 72.611, 63.675, 56.391, 54.923, 43.272, 35.873, 35.790, 33.231, 30.941, 30.872, 30.820, 30.686, 30.652, 30.517, 27.107, 26.107, 26.476, 26.339, 23.992, 19.420, 15.393, -2.602, -3.060.

IR :3567, 3434, 3300, 2922, 1719, 1654, 1466, 1254, 1190, 1055, 861, 756, 736.

실시예 38 - 화합물 36의 제조

디클로로메탄(10mL)내 화합물 35(2.14g, 3mmol) 및 DMAP(0.488g, 4mmol)의 용액에, 디클로로메탄(3mL)내 토실 클로라이드(0.686g, 3.6mmol)의 용액을 아르곤 대기 하에 0℃에 주입기를 통해 서서히 첨가하였고 혼합물을 0℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 과량의 토실 클로라이드를 메탄올(1mL)과 반응시켰고, 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 물(10mL)로 세척하고, 건조시키며 농축시켜 오일을 얻었다. 모노토실화 화합물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 오일을 얻었다 (Rf 0.34, 실리카, 에틸 아세테이트 : 헥산, 1:4, 2.16g, 83%).

¹H NMR : 7.814(d, J=8.1Hz, 2H, 방향족), 7.363(d, J=8.1Hz, 2H, 방향족), 5.674(d, J=9.3Hz, 1H, NH), 5.088(m, 1H, CHOCO), 4.517(d, J=3.6Hz, 1H, C-1), 4.058(m, 3H), 3.665(m, 3H), 3.279(s, 3H, OCH₃), 2.458(s, 3H, CH₃), 2.276(m, 4H), 1.638(m, 4H), 1.267(bs, 34H), 0.864(m, 12H, t-부틸 ＆ 말단 측쇄 메틸), 0.042(s, 3H, SiMe), 0.038(s, 3H, SiMe).

¹³C NMR : 174.402, 170.848, 146.180, 134.360, 131.103, 129.283, 100.006, 74.633, 72.905, 72.465, 70.911, 70.515, 56.472, 54.594, 43.192, 35.829, 35.774, 33.205, 30.902, 30.838, 30.790, 30.624, 30.602, 30.482, 27.058, 26.440, 26.310, 23.964, 22.897, 19.371, 15.376, -2.688, -3.092.

IR : 3524, 3359, 2914, 2535, 2063, 1992, 1780, 1717, 1652, 1541, 1348, 1292, 1174, 1098, 1065, 1004, 978, 862, 835.

상기에서 얻어진 모노토실레이트 화합물 (1.73g, 2mmol)을 DMF(10mmol)에 용해시키고 60℃에서 아지도나트륨(0.39g, 6mmol)의 존재하에 6시간 동안 가열하였다. 반응의 완결 후, 혼합물을 분리 깔대기에 옮기고, 에틸 아세테이트(20mL)로 희석시키며 물(10mL)로 세척하였고 유기 층을 분리시키고, 건조시키며, 농축시켜 오일을 얻었으며, 플래시 크로마토그래피에 의한 정제 후, 아지드 36를 오일로서 얻었다 (Rf 0.58, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 1:4, 1.15g, 78%).

¹H NMR : 5.701(d, J=9.6Hz, 1H, NH), 5.093(m, 1H, CHOC0), 4.619(d, J=3.6Hz, 1H, C-1), 4.138(m, 1H), 3.63(m, 5H), 3.372(s, 3H, OCH₃), 2.417(m, 2H), 2.285(t, J=7.6Hz, 2H), 1.620(m, 4H), 1.264(bs, 34H), 0.874(m, 15H, t-부틸 및 말단 측쇄 메틸), 0.056(s, 3H, SiMe), 0.052(s, 3H, SiMe).

¹³C NMR : 174.470, 170.885, 100.118, 90.241, 74.834, 73.804, 72.969, 72.263, 56.535, 54.634, 52.959, 43.280, 35.853, 35.791, 33.219, 30.926, 30.855, 30.803, 30.643, 30.618, 30.501, 27.055, 26.457, 26.327, 23.980, 19.971, 15.396, -2.672, -2.993.

IR : 3567, 3434, 2920, 2852, 2252, 2100, 1718, 1654, 1466, 1259, 1125, 1063, 910, 839, 735.

실시예 39 - 포스포릴화 화합물 29의 제조

화합물 1을 화합물 17(실시예 19)로 전환시키기 위해 사용된 동일한 절차에 의해 화합물 36의 포스포릴화를 수행하여, 상응하는 포스포릴화 화합물 29을 오일로서 얻었다 (Rf 0.54, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 1:4, 82%).

¹H NMR : 7.343(m, 10H, 방향족), 5.653(d, J=9.6Hz, 1H, NH), 5.07(m, 5H, 2 x CH₂0 및 CHCOO), 4.608(d, J=3.6Hz, 1H, C-1), 4.112(m, 2H), 3.802(m, 2H), 3.553(m, 2H), 3.367(s, 3H, OCH₃), 2.419(m, 2H), 2.287(t, J=6.6Hz, 2H), 1.630(m, 4H), 1.261(bs, 34H), 0.892(t, J=6.2Hz, 6H, 측쇄 말단 CH₃), 0.841(s, 9H, t-부틸), 0.084(s, 3H, SiMe), 0.064(s, 3H, SiMe).

¹³C NMR : 174.465, 171.200, 136.394, 131.437, 130.980, 130.183, 130.103, 129.991, 129.961, 129.933, 129.795, 99.365,73.067, 72.449, 71.497, 71.047, 66.439, 56.749, 54.7521, 52.616, 43.341, 35.827, 35.880, 33.257, 30.959, 30.889, 30.841, 30.534, 27.150, 26.483, 26.355, 24.030, 19.163, 15.163, 15.447, -2.523, -2.701.

IR : 2927, 2101, 1728, 1679, 1529, 1464, 1380, 1257, 1135, 1016, 924, 858, 780, 698, 675, 647.

실시예 40 - 화합물 37의 제조

상기에서 얻은 포스포릴화 화합물 29(1.1g, 1.1mmol)을 0℃로 냉각된 메탄올 (3mL) 및 디클로로메탄 (3mL)에 용해시키고 PTSA의 촉매량 (100mg)과 함께 2시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 산을 트리에틸아민(1mL)으로 중화시켰고 용매를 진공 하에서 제거하여 조히드록시 화합물을 오일로서 얻었으며, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제한 후 히드록시 화합물 37을 오일로서 얻었다 (Rf 0.46, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 1:1, 0.53g, 59%).

¹H NMR : 7.343(m, 10H, 방향족), 6.281(d, J=8.4Hz, 1H, NH), 5.067(m, 5H, 2 x OCH₂Ph 및 CHOCO), 4.717(d, J=3.6Hz, 1H, C-1), 4.185(m, 2H), 3.851(m, 2H), 3.361(s, 3H, OCH₃), 3.300(m, 2H), 2.493(m, 2H), 2.281(t, J=7.5Hz, 2H), 1.608(m, 4H), 1.247(bs, 34H), 0.877(t, J=6.6Hz, 6H, 측쇄 말단 메틸).

¹³C NMR : 174.723, 171.801, 136.977, 136.889, 136.821, 130.046, 129.970, 129.897, 129.694, 129.464, 129.299, 99.374, 79.880, 79.249, 72.526, 72.363, 71.508, 71.431, 71.257, 71.187, 70.726, 70.627, 69,910, 56.748, 54.912, 52.338, 42.953, 38.520, 35.869, 35.124, 33.246, 30.958, 30.875, 30.844, 30.705, 30.669, 30.533, 27.178, 26.614, 26.331, 24.015, 15.441.

IR : 3419, 3348, 2921, 2100, 1719, 1654, 1641, 1457, 1380, 1283, 1214, 1152, 1121, 998, 887, 698, 597, 486.

실시예 41 - 커플링된 화합물 38의 제조

화합물 26으로부터 화합물 27의 제조(실시예 29)에 관해 서술된 동일한 절차를 사용함으로써, 상기에서 얻은 히드록시 화합물 37(0.42g, 0.48mmol) 및 포스포클로리데이트 19 (0.380g, 0.672mmol)의 커플링 반응을 달성하여 화합물 38을 얻었다 (Rf 0.42, 실리카, 에틸 아세테이트, 헥산, 1:4, 0.37g, 56%).

¹H NMR : 7.347(m. 15H, 방향족), 7.013(m, 1H, NH), 4.997(m, 8H, 3 x OCH₂Ph 및 2 x CHOCO), 4.710(d, J=3.6Hz, C-1), 4.569(m, 2H), 4.235(m, 1H), 4.039(m, 1H), 3.794(m, 1H), 3.486(m, 1H), 3.352(s, 3H, 0CH₃), 2.262(m, 8H), 1.535(m, 8H), 1.26(bs, 68H), 0.870(t, 12H).

실시예 42 - 면역원 3M의 제조

메탄올 내 상기에서 얻은 커플링된 화합물(0.24g, 0.17mmol)의 현탁액을, 4시간 동안 Pd-C (10%, 30mg)을 사용하여 수소첨가하였다. 반응의 완결 후, 작은 셀라이트 패드를 통한 여과에 의해 촉매를 제거하였고 용매를 진공 하에서 제거하여 오일을 얻었다. 오일을 클로로포름(5mL)에 용해시키고 아세트산(0.5mL)으로 산성화하며 작은 셀라이트 패드를 통해 여과시켜 임의 고체 입자를 제거하였다. 용매를 진공 하에서 제거하여 농후 오일을 얻었다. 오일을 아세토니트릴(1mL), 및 물(3mL)에 용해시키고 초음파처리하며 (혼합물은 여전히 혼탁하였음) 친액성화하여 면역원 3M을 무색 고체로서 얻었다 (140mg, 78%).

¹H NMR : 5.206(m, 2H, CHOCO), 4.682(m, 2H), 4.242(m, 5H), 3.801(m, 1H), 3.401(s, 3H, OCH₃), 2.842(m, 2H), 2.400(m, 6H), 1.807(m, 8H), 1.26(m, 68H), 0.892(t, 12H, 측쇄말단 메틸).

실시예 43 - 화합물의 39의 제조

디클로로메탄내 산 4(1.2 당량) 및 화합물 37(1 당량)의 용액에 DCC(1.2 당량)을 첨가하고 결과로서 얻은 반응 혼합물을 4시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후, 여과에 의해 염을 분리시킨다. 용매 제거 및 플래시 크로마토그래피하여 화합물 39를 얻는다.

실시예 44 - 면역원 2M의 제조

에틸 아세테이트내 화합물 39 및 Pd-C(10%)의 현탁에 의한 화합물 39을 수소첨가하여 면역원 2M을 얻는다.

실시예 45 - 화합물 42의 제조

에틸 아세테이트(50mL)내 화합물 6a (4.45g, 10mmol) 및 Pd-C(10%, 0.5g)의 현탁액을 수소 대기 하에서 밤새 교반하였다. 반응의 경과를 TLC로 모니터하고 출발 물질의 소실 및 새로운, 보다 극성인, 화합물의 형성을 제시하였다. 여과에 의해 촉매를 제거하였고 용매를 진공 하에서 제거하여 오일을 얻었으며, 플래시 크로마토그래피 후, 아민을 무색 결정성 고체로서 얻었다 (Rf 0.16, 에틸 아세테이트:헥산 1:3, 3.98g, 95%). 융점 63-64℃.

¹H NMR : 4.869(m, 2H, CHOAc), 4.41(d, J=7.8Hz, 1H, 아노머릭), 4.075(m, 2H, CH₂OAc), 3.610(m, 1H), 2.74(m, 1H), 1.96(s, 6H, 2 아세테이트), 1.92(s, 3H, 아세테이트), 1.36(bs, 2H, NH₂), 0.824(s, 9H, t-부틸), 0.0(s, 6H, Si(CH₃)₂).

¹³C NMR : 171.837, 171.767, 171.022, 100.343, 90.241, 76.622, 76.459, 73.197, 70.629, 70.463, 63.964, 58.986, 26.989, 22.040, 21.939, 19.275, -2.914, -3.877.

IR : 2954, 2862, 2777, 2743, 2482, 2127, 1939, 1771, 1717, 1594, 1473, 1386, 1331, 1282, 1145, 1017, 973.

　아르곤 대기 하에서 디클로로메탄 (20mL) 및 피리딘(12mL)내 아미노 화합물(2.72g, 6.5mmol)의 용액에 디클로로메탄(3mL)내 트리클로로에틸 클로로포르메이트 (1.60g, 7.6mmol)의 용액을 주입기를 통해 적가하였고, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후(TLC), 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 디클로로메탄(40mL)로 희석시키며, 물(10mL), 중탄산나트륨 (5%, 10mL) 및 물(10mL)로 차례로 세척한다. 유기 층을 분리시키고, 건조시키며, 농축시켜 조 생성물을 얻었으며, 플ㄹ시 크로마토그래피에 의한 정제 후, 카르바메이트 42를 무색 고체로서 얻었다 (Rf 0.51, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 1:3, 3.55g, 92%). 융점 170-171℃.

¹H NMR : 5.541(d, J=9.3Hz, 1H, NH), 5.227(t, J=9.9Hz, 1H, C-3), 4.980(t, J=9.6Hz, 1H, C-4), 4.776(d, J=8.1Hz, 1H, C-1), 4.652(AB, 2H, Troc의 CH₂), 4.146(m, 2H, C-6), 3.675(m, 2H, C-2 및 C-5), 2.033(s, 3H, 아세테이트), 2.012(s, 6H, 2 아세테이트), 0.839(s, 9H, t-bu), 0.05(s, 3H, SiMe), 0.03(s, 3H, SiMe).

¹³C NMR : 172.175, 171.951, 170.830, 155.488, 97.508, 75.921, 73.460, 73.092, 70.654, 63.927, 59.472, 32.982, 26.860, 23.950, 21.943, 21.975, 22.004, 19.242, 15.429, -2.962, -3.934.

IR (KBr) : 3291, 3171, 3087, 2959, 2932, 2531, 1752, 1747, 1708, 1473, 1464, 1435, 1370, 1230, 1191, 1141, 1108, 980, 957, 887.

실시예 46 - 화합물 43의 제조

메탄올(25mL) 내 화합물 42(3.56g, 6mmol) 및 메탄올내 나트륨 메톡시드(1M, 0.2mL)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 염기를 아세트산(1mL)로 중화시켰고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 조 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 상응하는 트리히드록시 화합물을 무색 결정성 고체로서 얻었다(Rf 0.45, 실리카, 에틸아세테이트, 2.42g, 92%). 융점 136-137℃

¹H NMR (CD₃OD) : 4.657 (m, 2H, Troc의 CH₂), 4.595 (d, J=7.5 Hz, 1H, C-1), 3.790 (m, 2H), 3349 (m, 4H), 0.840 (s, 9H, t-부틸), 0.031 (s, 3H, SiMe), 0.020 (s, 3H, SiMe).

¹³C NMR (CD₃OD) : 156.828, 97.823, 79.208, 79.107, 77.464, 75.930, 75.430, 72.144, 62.897, 61.030, 26.483, 26.442, 18.954, -3.605, -4.721.

IR (KBr) : 3365. 2957, 2887, 2805, 2712, 2045, 1718, 1545, 1362, 1255, 1175, 1083, 949, 785.

상기에서 얻어진 트리히드록시 화합물 (2.33g, 5 mmol), 디클로로메탄(20mL), PTSA(200mg), 및 2,2-디메톡시 프로판91.56g, 15mmol)의 용액을 아르곤 대기 하에서 4시간 동안 교반하였다. 반응의 완결(TLC)후, 산을 트리에틸아민(1mL)으로 중화시켜고 혼합물을 분리 깔때기로 옮겼다. 혼합물을 디클로로메탄(40mL)으로 희석시키고 물(10mL)로 세척하였다. 유기 층을 분리시키고, 건조시키며(MgSO₄), 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 43을 오일로서 얻었다 (Rf 0.46, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 1 : 4, 2.12g, 84%).

융점 = 90-91℃

¹H NMR : 5.711 (d, J=7.5 Hz, 1H, NHCO), 4.824 (d, J=6.9 Hz, 1H, C-1), 4.715, (AB, 2H, Troc의 CH₂), 3.874 (m, 2H), 3.771 (t, J=10.2 Hz, 1H), 3.578 (t, J=9.2 Hz, 1H), 3.496 (bs, 1H, OH), 3.22 (m, 2H), 1.496 (s, 3H, 아세토니드의 CH₃), 1.415 (s, 3H, 아세토니드의 CH₃), 0.861 (s, 9H, t-bu), 0.086 (s, 3H, SiCH₃) 0.069 (s, 3H, SiCH₃).

¹³C NMR : 155.904, 110.996, 101.176, 97.499, 96.654, 76.134, 75.670, 72.318, 68.507, 63.400, 62.285, 30.435, 26.958, 20.520, 19.255, -2.870, -3.874.

IR (KBr) : 3094, 2996, 2193, 1987, 1718, 1560, 1474, 1382, 1288, 1200, 1166, 1095, 986, 842, 735.

실시예 47 - 화합물 44의 제조

Ar 대기 하에서, 트리에틸아민(1.10g) 및 DMAP(0.488g, 4mmol)을 함유한 디클로로메탄(20mL)내 화합물 43(2.20g, 4mmol)의 용액에, 디클로로메탄(5mL)내 포스포클로리데이트 19 (2.70g, 5mmol)의 용액을 15분의 기간에 걸쳐, (주입기를 통해) 첨가하였다. 반응의 종결 후(TLC), 내용물을 분리 깔때기로 옮기고 물(10mL)로 세척하였다. 유기 층을 분리시키고 건조시키며 농축시켜 오일을 얻었다. 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제시켜 화합물 44를 유성 화합물로서 얻어다 (Rf 0.61 실리카, 에틸아세테이트:헥산 1 : 3, 2.90g, 72%).

¹H NMR(CDCl₃) : 7.299 (m, 5H, 방향족), 6.979 (t, 1H, NH), 5.190 (1H, CHCO), 5.00 (m, 2H, OCH₂Ph), 4.775 (m, 1H, C-1, 아노머릭), 4.605 (m, 1H), 4.431 (AB, Troc의 CH₂), 3.916-3.796 (m, 4H), 3.513 (m, 1H), 2.165 (m, 4H, CH₂CO, 및 CH₂-P), 1.548 (s, 3H, CH₃아세토니드), 1.423 (s, 3H, 아세토니드의 CH₃), 1.26 (m, 28H, CH₂), 0.860 (m, 15H, 측쇄 말단 CH₃및 t-bu si), 0.003 (s, 6H SiMe).

¹³C NNR : 174.00, 155.943, 137.255, 129.898, 129.137, 100.932, 98.674, 96.467, 76.050, 74.144, 69.842, 67.722, 67.409, 63.252, 60.571, 35.675, 30.984, 26.878, 24.040, 20.498, 20.436, 19.161, 15.469, -2.863, -3.778.

IR : 2926, 1718, 1671, 1520, 1430, 1354, 1214, 1156, 1021, 908, 864, 740.

실시예 48 - 이미데이트 40의 제조

디클로로메탄 (3mL)내 화합물 44 (1.61g, 1.6mmol)의 용액을 테트라부틸암모늄 플루오라이드(THF 내 1M 용액, 2.6ml)와 함께 4시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후 (TLC)트리클로로아세토니트릴(3mL)을 첨가하였고 용액을 부가의 4시간 동안 교반하였다. 중간체 히드록시 화합물이 거의 소비된 후 (TLC), 용매를 진공 하에서 제거하였고 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 이미데이트를 아노머릭 혼합물로서 얻었다. α-이미데이트(Rf, 0.52, 실리카, 에틸아세테이트:헥산 1:3, 0.583g, 34%)

¹H NMR : 8.746 (s, 1H, 이미데이트의 NH), 7.289 (m, 5H, 방향족), 6.489 (d, J=3.9 Hz, 1H, C-1), 6.234 (d, J=7.8 Hz, 1H, Troc의 NH), 5.064 (m, 3H, OCH₂Ph 및 CHOCO), 4.571 (m, 3H, Troc의 CH₂및 1H), 4.173 (m, 1H), 3.835 (m, 4H), 2.199 (m, 4H), 1.422 (s, 3H, 아세토니드의 메틸), 1.391 (s, 3H, 아세토니드의 메틸), 1.26 (bs, 34H), 0.824 (t, 6H).

β-이미데이트 (Rf 0.49, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 1:3, 0.59g, 34%).

¹H NMR : 8.721 (s, 1H, 이미데이트의 NH), 7.361 (m, 5H, 방향족), 6.501 (t, 1H, NH), 6.392 (d, J=7.5 Hz, 1H, C-1), 5.018 (m, 3H, OCH₂Ph 및 CHOCO), 4.512 (m, 3H), 4.186 (m, 1H), 3.993 (m, 4H), 2.241 (m, 4H), 1.462 (s, 3H, 아세토니드의 메틸), 1.392 (s, 3H, 아세토니드의 메틸), 1.201 (bs, 34H), 0.910 (t, 6H).

실시예 49 - (R)-3-벤질옥시-1-t-부틸디메틸실옥시테트라데칸(45)의 제조

실온에서 디클로로메탄 및 시클로헥산의 1:1 혼합물 (320 mL)내 알콜 10 (6.9g, 2mmol) 및 벤질 트리클로로아세트이미데이트 (12.3g, 49mmol)의 혼합물에 트리플루오로메탄설폰산(0.14mL, 1.6mmol)을 첨가하였다. 반응의 완결 (5시간) 후 포화 중탄산나트륨 용액(50mL)을 첨가하였고 상을 분리시켰다. 수성상을 에틸 아세테이트 (2×50mL)로 추출시켰고 유기상을 살린(50 mL)으로 세척하고, 건조시키고 (MgSO₄), 진공 하에서 농축시켰다. 생성물을 플래시 크로맡그래피로 정제하여 화합물 45을 오일로서 얻었다 (Rf 0.19, 실리카, 헥산 내 2% 에틸 아세테이트, 7.7g, 88%).

¹H NMR : 7.49-7.23 (m, 5H, 방향족, 4.60 (AB, 2H, 벤질계), 3.85-3.70(m, 2H), 3.67-3.55 (m, 1H), 190-1.77 (m, 2H), 1.67-1.55 (m, 2H), 1.45-1.35 (m, 18H), 0.97 (m, 12H), 0.11 (s, 6H).

¹³C NMR : 139.25, 128.19, 127.64, 127.26, 76.25, 71.02, 59.89, 37.52, 34.21, 31.89, 29.78, 29.60, 29.30, 25.94, 25.27, 22.63, 18.23, 14.00, -5.33.

IR (순수한) : 3089, 3066, 3031, 2927, 2855, 1497, 1464, 1388, 1361, 1255,1224, 1097, 1029, 1006, 939, 836, 776, 733, 697, 682, 666.

실시예 50 - (R)-3-벤질옥시-1-테트라데칸올 (46)의 제조

HF 수용액(50%, 12mL)을 아세토니트릴(120 mL)내 화합물 45 (6.3g, 14.5mmol)의 혼합물에 첨가하였고 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 산을 포화 중탄산나트륨 용액으로 중화시키고 에틸 아세테이트 (3×150mL)로 추출하였으며, 유기 상을 분리시키고, 건조시키고, 농축시켰으며, 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 46을 무색 오일로서 얻었다 (Rf 0.42, 헥산 내 25% 에틸 아세테이트, 3.4g, 74%).

¹H NMR : 7.43-7.25 (m, 5H), 4.60 (AB, 25H), 3.90-3.73 (m, 2H), 3.70-3.63 (m, 1H), 1.92-1.47 (m, 4H), 1.42-1.23 (m, 18H), 0.93 (t, 3H).

¹³C NMR : 138.44, 128.42, 127.81, 127.67, 78.55, 70.92, 60.74, 35.92, 33.44, 31.91, 29.81, 29.60, 29.34, 25.13, 22.67, 14.10.

실시예 51 - (R)-3-벤질옥시테트라데칸산(47)의 제조

0℃에서 아세톤(50mL)내 알콜 46 (3.23g, 10.1mmol)의 혼합물에 존스시약을 분량으로 알콜이 소비될 때가지 첨가하였다. 혼합물을 0.1M HCL(100mL) 및 에틸 아세테이트 (400mL) 사이에서 분배하였고, 유기상을 살린 (100mL)으로 세척하고, 건조시키며, 진공 하에서 농축시켰다. 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 47을 오일로서 얻었다 (Rf 0.38, 실리카, 헥산내 25% 에틸 아세테이트, 2.09g, 62%).

¹H NMR : 7.42-7.26 (m, 5H), 4.61 (bs, 2H), 3.91 (q, 1H), 2.63 (ddd, 2H), 1.76-1.51 (m, 2H), 1.46-1.24 (m, 20H), 0.93 (t, 3H).

¹³C NMR : 177.29, 138.16, 128.36, 127.83, 127.67, 75.74, 71.54, 39.56, 34.18, 31.91, 29.63, 29.57, 25.12, 22.69, 14.11.

IR (순수한) : 3400-2400 (넓은), 3065, 3032, 2926, 2855, 1713, 1497, 1377, 1353, 1295, 1240, 1207, 1097, 1070, 1029, 939.

실시예 52 - 화합물 48의 제조

건조 디클로로메탄 (30mL)내 아미노 화합물 30 (2.35g, 100mmol), 화합물 47 (3.34g, 10mmol), EDC (1.91g, 10mmol), 및 HOBT (1.35g, 10mmol)의 용액을 아르곤 대기 하의 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후 용매를 진공 하에서 제거하였고, 결과로서 얻은 물질을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 커플링 화합물을 오일로서 얻었다 (Rf 0.31, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 1:1, 4.93g, 90%).

¹H NMR : 7.321 (m, 5H, 방향족), 4.512 (m, 3H, 벤질계 및 C-1), 3.814 (m, 7H), 3.194 (s, 3H, OCH₃), 2.421 (m, 2H), 1.546 (s, 3H, 아세토니드의 메틸), 1.486 (s, 3H, 아세토니드의 메틸), 1.214 (bs, 20H), 0.894 (t, 3H, 말단 측쇄메틸).

차례로 첨가된 디클로로메탄 (30 mL)내 상기에서 얻은 화합물 (4.40g, 8 mmol) 및 화합물 47 (3.34g, 10mmol)에 DCC(2.06g, 10mmol) 및 DMAP (1.22g, 10mmol)을 첨가하였고 혼합물을 실온에서 아르곤 대기 하에서 4시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 불용성 물질을 여과에 의해 제거하였고 용매를 진공 하에 증발시켜 오일을 얻었다. 조 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 48을 오일로서 얻었다 (Rf 0.60, 실리카, 에틸아세테이트:헥산 3:7, 6.25g, 90%).

¹H NMR : 7.362 (m, 10H, 방향족), 6.312 (d, J=7.6 Hz, 1H, NH), 5.200 (t, J=7.6 Hz, 1H, CHCOO), 4.562 (m, 6H), 3.812 (m, 6H), 3.189 (s, 3H, OCH₃), 2.741-2.346 (m, 4H), 1.456 (s, 3H, 아세토니드 메틸), 1.312 (s, 아세토니드 메틸), 1.216 (bs, 40H), 0.816 (t, J=6.3 Hz, 6H).

실시예 53 - 화합물 41의 제조

트리플루오로아세트산(6mL), 및 디클로로메탄 (20mL)내 화합물 48 (4.30g, 5mmol)의 냉각 용액을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후 산을 트리에틸아민 (6mL)으로 중화시켰고, 용매를 증발시켰으며, 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 디올 화합물 48을 오일로서 얻었다 (Rf 0.24, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 1:1, 3.55g, 86%).

¹H NMR : 7.360 (m, 10H, 방향족), 6.346 (d, J=7.5 Hz, 1H, NH), 5.226 (m, 1H), 4.612 (d, J=3 Hz, 1H, C-1), 4.502 (m, 4H), 3.724 (m, 5H), 3.191 (s, 3H, OCH₃), 2.464 (m, 4H), 1.264 (bs, 40H), 0.826 (t, J=6.6 Hz, 6H).

¹³C NMR : 172.499, 172.077, 138.329, 137.902, 128.810, 128.313, 127.551, 127.395, 98.050, 97.975, 71.274, 70.412, 69.926, 69.544, 62.426, 54.911, 51.941, 50.813, 41.275, 33.951. 31.873, 29.598, 29.309, 25.407, 25.306, 21.643, 13.911, 13.778.

IR : 3324, 2952, 1728, 1674, 1499, 1168, 965, 834.

실시예 54 - 화합물 49의 제조

Ar 대기 하에서, 디클로로메탄 (5 mL)내 화합물 41 (0.570g, 0.689 mmol) 및 이미데이트 40 (α 또는 β, 0.685g, 0.63 mmol) 및 화합물 41 (0.570g, 0.689mmol)의 냉각 용액 (-78℃)에 디클로로메탄(1mL)내 보론 트리플루오라이드 에테레이트(0.1mL)의 용액을 (주입기를 통하여) 첨가했다. 반응 혼합물을 -78℃에서 2시간 동안 그다음 -20℃ 에서 12시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 트리에틸아민(0.3 mL)을 첨가하였고, 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 디클로로메탄 (5mL)으로 희석시키고, 중탄산나트륨(5%, 5mL)으로 세척하였다. 유기 층을 분리시키고, 건조시키며 농축시켜 오일을 얻었으며, 이를 플래시 크로마토그래피에 적용시켜 화합물 49를 오일로서 얻었다 (Rf 0.54, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산 1:1, 0.75g, 68%).

¹H NMR : 7.332 (m, 15H, 방향족), 6.521 (bs, 1H. Troc의 NH), 6.224 (d, J=6.6 Hz, 1H, NH), 5.082 (m, 4H), 4.556 (m, 7H), 3.874 (m, 12H), 3.242 (s, 3H, OCH₃), 2.462 (m, 8H), 1.542 (s, 3H, 아세토니드의 메틸), 1.464 (s, 3H, 아세토니드의 메틸), 1.246 (bs, 80H), 0.846 (t, 12H, 말단 에틸).

¹³C NMR : 174.485, 174.414, 173.967, 172.385, 156.138, 156.171, 139.830, 139.729, 137.065, 136.946, 129.925, 129.701, 129.653, 129.187, 128.894, 109.246, 105.421, 100.724, 96.246, 78.610, 72.889, 72.354, 70.246, 67.424, 63.246, 43.246, 41.208, 35.481, 33.290, 31.012, 30.729, 30.513, 26.585, 26.501, 26.240, 24.061, 21.142, 15.492.

IR : 3276, 2996, 1735, 1670, 1499, 1379, 1178, 1095, 941, 821.

실시예 55 - 화합물 50의 제조

건조 DMF (3mL)내 화합물 49 (0.84g, 0.48mmol), 이미다졸(0.067g, 1mmol) 및 t-부틸디메틸실릴 클로라이드(0.135g, 0.9mmol)의 용액을 50℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 혼합물을 에틸 아세테이트(10mL)로 희석시키고 물(5mL)로 세척하였다. 유기층을 분리시키고, 건조시키며 농축시켜 오일을 얻었다. 오일을 정제하여 실릴 화합물을 오일로서 얻었다 (Rf 0.42, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산 1:3, 0.69g, 78%).

¹H NMR : 7.312 (m, 5H 방향족), 6.541 (bs, 1H. NH of troc), 6.194 (d, J=6.3Hz, 1H, NH), 5.014 (m, 4H), 4.524 (m, 7H) 4.184 (m, 2H), 3.746 (m, 12H), 3.186 (s, 3H, OCH3), 2.462 (m, 8H), 1.542 (s, 3H, 아세토니드의 메틸), 1.462 (s, 3H, 아세토니드의 메틸), 1.246 (bs, 80H), 0.884 (t, 12H, 말단 측쇄 메틸), 0.812 (s, 9H, t-부틸), 0.04 (s, 3H, SiMe), 0.032 (s, 3H, SiMe).

상기에서 얻은 실릴 화합물(1.05 gm, 0.57 mmol)을 디클로로메탄(5 mL)에 용해시키고 0℃로 냉각시키며 트리플루오로아세트산(1.5 mL)을 첨가하였다. 결과로서 얻은 용액을 상기 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 (TLC) 후 산을 트리에틸아민(2 mL)으로 중화시켰고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 디올 화합물 50을 플래시 크로마토그래피로 정제하였다 (Rf 0.42, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산 1:1, 0.84g, 81%).

¹H NMR : 7.294 (m, 15H, 방향족), 6.192 (d, J=6.3Hz, 1H, NH), 5.120 (m, 4H), 4.542 (m, 7H), 4.169 (m, 2H), 3.642 (m, 12H), 3.184 (s, 3H, OCH₃), 2.824-2.246 (m, 8H), 1.246 (bs, 80H), 0.892 (t, 12H), 0.812 (s, 9H, t-부틸), 0.040 (s, 3H. SiMe), 0.036 (s, 3H. SiMe).

실시예 56 - 화합물 51의 제조

0℃에서 DMF (4mL) 내 디올 50 (0.82g, 0.45 mmol)에, 이미다졸 (0.068g, 0.1mmol) 및 t-부틸디메틸실릴 클로라이드 (75mg, 0.5mmol)을 차례로 첨가하였고 결과로서 얻은 용액을 상기 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 혼합물을 에틸 아세테이트 (10mL)로 희석시키고, 물 (2×5mL)로 세척하였다. 유기 층을 분리시키고, 건조시키며, 농축시켜 오일을 얻었으며, 플래시 크로마토그래피로 정제한 후, 화합물 5l을 오일로서 얻었다 (Rf 0.41, 에틸 아세테이트:헥산, 1:3, 0.69g, 80%).

¹H NMR : 7.310 (m, 15H, 방향족), 6.146 (d, J=6.3Hz, 1H, NH), 5.146 (m, 4H), 4.746 (m, 7H), 4.184 (m, 2H), 3.746 (m, 12H), 3.178 (s, 3H, OCH₃), 2.476 (m, 8H), 1.246 (bs, 80H), 0.876 (m, 30H), 0.040 (m, 12H).

실시예 57 - 화합물 52의 제조

아연 가루 (300 mg) 및 수성 THF (20%, 2mL) 내 화합물 5l (240mg, 0.12 mmol)의 현탁액을 실온에서 교반하였다. 그다음 아세트산 (0.5 mL)을 반응물에 첨가하였고 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 (TLC, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 1:1) 후, 무기염을 여과에 의해 제거하였고 클로로포름(10mL)으로 세척하였다. 유기층을 트리에틸아민(1 mL)으로 중화시키고, 에틸아세테이트(5 mL)로 희석시키고, 물(5mL)로 세척하고, 건조시키고, 농축시키며, 플래시 크로마토그래피로 정제하여 아미노 화합물 52을 얻었다 (부분입체 이성질체를 분리하였음).

생성물 A (Rf 0.40, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산 1:1, 100mg, 48%) :

¹H NMR : 7.324 (m, 15H, 방향족), 6.246 (d, J=6.3Hz, 1H, NH), 5.124 (m, 4H), 4.674 (m, 7H), 4.14-3.64 (m, 12H), 3.124 (s, 3H, OCH₃), 2.468-2.124 (m, 8H), 1.246 (bs, 80H), 0.892 (m, 20H), 0.04 (m, 6H).

생성물 B (Rf 0.14, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산 1:1, 64mg, 30%) :

¹H NMR : 7.294 (m, 5H, 방향족), 6.204 (d, J=6.3 Hz, 1H, NH), 5.184 (m, 4H), 4.584 (m, 5H), 4.241 (m, 3H), 3.786 (m, 11H), 3.126 (s, 3H, OCH₃), 2.942 (m, 1H), 2.642-2.242 (m, 8H), 1.296 (bs, 80H), 0.896 (m, 30H), 0.04 (m, 12H).

실시예 58 - 화합물 53의 제조

디클로로메탄 (2mL) 내 아미노 화합물 52 (340 mg, 0.195 mmol, 실시예 57로부터의 생성물 A), 산 3 (90mg, 0.211 mmol), EDC (45mg, 0.2mmol), 및 HOBT (27mg, 0.2mmol)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응의 완결 후, 용매를 진공 하에서 제거하고 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 53을 오일로서 얻었다 (부분입체 이성질체 혼합물을 분리시켰다).

생성물 53a (Rf 0.62 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 2:3, 105mg, 25%):

¹H NMR : 7.346 (m, 15H, 방향족), 6.196 (m, 2H, NH), 5.196 (m, 5H), 4.562 (m, 5H), 4.21-3.624 (m, 12H), 1.296 (bs, 120H), 0.918 (m, 36H), 0.04 (m, 12H).

생성물 53b (Rf 0.41, 실리카, 에틸아세테이트:헥산, 2;3, 140mg, 33%):

1H NMR : 7.304 (m, 15H, 방향족), 6.346 (m, 1H, NH), 6.192 (m, 1H, NH), 5.210 (m, 5H), 4.612 (m, 6H), 4.201-3.562 (m, 14H), 3.192 (s, 3H, OCH₃), 2.746-2.196 (m, 12H), 1.286 (bs, 120H), 0.942 (m, 36H), 0.04 (m, 12H).

실시예 59 - 화합물 54의 제조

디클로로메탄 (1.0mL) 내 N,N-디이소프로필아미노 디벤질 포스파이트 (17mg, 1.5 당량) 및 화합물 53 (72mg, 0.033mmol)의 용액에 테트라졸(1.4mg, 2 당량)을 첨가하였고 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 알콜이 소비된 (TLC) 후, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시켰고, m-CPBA(2 당량)을 첨가하였으며, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 혼합물을 디클로로메탄(5mL)으로 희석시키고 중탄산나트륨(10%, 5mL)으로 세척하였다. 유기층을 분리시키고, 건조시키며, 농축시켜 오일을 얻었으며, 이를 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 54를 오일로서 얻었다 (Rf 0.28, 실리카, 에틸 아세테이트:헥산, 3:7, 55mg, 69%).

¹H NMR : 7.346 (m, 25H, 방향족), 6.246 (m, 2H, NH), 5.146 (m, 9H), 4.521 (m, 5H), 4.124-3.426 (m, 14H), 3.102 (s, 3H, OCH₃), 2.746-2.194 (m, 12H), 1.286 (bs, 120H), 0.942 (m, 36H), 0.036 (m, 12H).

실시예 60 - 화합물 55의 제조

에틸 아세테이트 내 화합물 54 (39mg, 0.016mmol) 및 Pd-C (10%, 6mg)의 현탁액을 실온에서 3시간 동안 수소 대기 하에 교반하였다. 반응의 완결 후, 촉매를 여과에 의해 제거하였고, 용매를 증발시켜 화합물 55를 오일로서 얻었다 (28mg, 92%).

¹H NMR (CDCl₃+TFA-d) : 5.246 (m, 3H), 4.624 (m, 4H), 3.942 (m, 11H), 2.412 (m, 12H), 1.294 (bs, 120H), 0.896 (m, 30H).

실시예 61 - 면역원 3D의 제조

-20℃로 냉각된 THF (1mL)내 화합물 55 (24mg, 0.012mmol)의 용액에 HF-피리딘 (0.2mL)을 첨가하였고 혼합물을 아르곤 대기 하에 -20℃에서 1시간 동안 그다음 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 반응 혼합물을 클로로포름 95mL)으로 희석시키고, 중탄산나트륨(5% 1mL)과 함께 교반하였다. 유기층을 분리시켰고, 수성 층을 클로로포름으로 추출하였으며, 합친 유기상을 건조시키고 농축시켜 면역원 3D를 오일로서 얻었다. 화합물을 아세토니트릴 (2mL) 및 물(6mL)에 용해시키고 초음파처리하여 거의 균질인 용액을 얻었으며, 친액성화한 후 면역원 3D를 무색 분말로서 얻었다 (18mg, 86%).

실시예 62 - 화합물 57의 제조

디클로로메탄 (0.2M)내 히드록시 화합물 43 (1 당량), 산 3 (1.1 당량), DC (1.1 당량) 및 DMAP (1.1 당량)의 용액을 실온에서 4시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후, 불용성 물질을 여과 제거하였고, 용매의 제거 및 플래시 크로마토그래피하여 화합물 57을 얻는다.

실시예 63 - 면역원 1D을 통한 화합물 58의 제조

면역원 3D를 통한 화합물 49를 제조하기 위해 상기 서술된 절차들 (실시예 54-61)과 유사한 절차를 따름으로써, 모든 상기 화합물의 제조를 실행하였는데, 특히 :

화합물 56 제조 : Ar 대기 하에 THF 및 디클로로메탄 (1:1, 0.2M)내 화합물 57의 용액에, 테트라부틸암모늄 플루오라이드(1당량)의 용액을 첨가하고 결과로서 얻은 혼합물을 출발 물질 (화합물 57)이 사라질 때까지 실온에서 교반한 다음, 트리클로로아세토니트릴(4 당량)을 첨가하고 교반을 부가의 4시간 동안 계속한다. 반응의 완결 후, 용매를 진공 하에서 제거하고 플래시 크로마토그래피하여 화합물 56을 아노머릭 혼합물로서 얻었다.

화합물 58의 제조 : Ar 대기 하에 -78℃에서 디클로로메탄 (0.2M) 내 화합물 4l (1.2 당량) 및 이미데이트 화합물 56 (1 당량)의 용액에 디클로로메탄 내 보론 트리플루오라이드 에테레이트 (촉매량)의 용액을 첨가하고 결과로서 얻은 혼합물을 초기에는 -78℃에서, 그다음 -20℃에서 12시간 동안 교반한다. 반응의 완결 (TLC) 후, 혼합물을 트리에틸 아민으로 중화시키고, 용매를 진공 하에서 제거하며 플래시 크로마토그래피하여 화합물 58을 얻는다.

화합물 59의 제조 : 실온에서 건조 DMF (0.2M)내 화합물 58 (1 당량)의 용액에 이미다졸 (2.4 당량) 및 t-부틸디메틸실릴 클로라이드 (1.2 당량)를 차례로 첨가하고 : 결과로서 얻은 혼합물을 Ar 대기 하에 상기 온도에서 출발물질이 사라질 때까지 (TLC) 교반한다. 반응의 완결 후 혼합물을 분리 깔때기내로 옮기고 에틸 아세테이트로 희석시키며 물로 세척한다. 유기 상을 분리시키고, 건조시키며 농축시키고, 플래시 크로마토그래피하여 실릴화된 화합물을 얻는다. 디클로로메탄(0.2M)내 실릴 화합물(1 당량)에 트리플루오로아세트산(2 당량)의 용액을 첨가하고 결과로서 얻은 혼합물을 0℃에서 출발 물질이 사라질 때까지 (TLC) 교반한다. 반응의 완결 후, 산을 0℃에서 트리에틸아민으로 중화시키고 용매를 진공 하에서 제거하며 플래시 크로마토그래피하여 화합물 59을 얻는다.

화합물 60의 제조 : 0℃에서 건조 DMF (0.2M)내 화합물 59 (1 당량)의 용액에 이미다졸 (2.4 당량) 및 t-부틸디메틸실릴 클로라이드 (1.2 당량)를 차례로 첨가하고 결과로서 얻은 혼합물을 상기 온도에서 출발물질이 사라질 때까지 교반한다. 반응의 완결 후, 혼합물을 분리 깔때기내로 옮기고, 에틸 아세테이트로 희석시켜 물로 세척하고; 유기상을 분리시키고, 건조시키며 용매를 진공 하에서 제거하고 플래시 크로마토그래피하여 모노실릴화 화합물을 얻는다. THF (0.2M)내 실릴화 (1 당량) 화합물, 아세트산 및 아연가루의 현탁액을 출발 물질이 사라질 때까지 실온에서 교반한다. 반응의 완결 후, 무기 염을 여과제거하였고 용매를 진공 하에서 제거하였다. 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 60을 얻는다.

화합물 6l의 제조 : 화합물 60 (1 당량), 산 4 (1.2 당량) EDC (1.2 당량) 및 HOBT (1.2 당량)의 용액을 출발물질이 사라질 때까지 Ar 대기 하에서 디클로로메탄 (0.2M)내에 교반한다. 반응의 완결 후, 용액을 분리 깔때기 내로 옮기고 물로 세척한다. 유기 상을 분리시키고, 건조시키며 농축시키고, 플래시 크로마토그래피하여 화합물 6l을 얻는다.

화합물 62의 제조 : 디클로로메탄 (0.2M)내 N,N-디이소프로필아미노 디벤질포스파이트(1.2 당량), 화합물 6l (1 당량)의 용액을 테트라졸의 존재하에 Ar 대기 하에서 교반한다. 반응의 완결 (TLC)후, 혼합물을 0℃로 냉각시키고 m-CPBA (1.4 당량)을 첨가하며 혼합물을 출발 물질이 사라질 때까지 (TLC) 더 교반한다. 반응의 완결 후 용매를 진공 하에서 제거하고 생성물 62을 플래시 크로마토그래피로 정제한다.

면역원 1D의 제조 : Pd-C (10%)의 존재하에 에틸 아세테이트내 화합물 62 (1 당량)의 현탁액을 수소 기구(ballon)을 사용함으로써 수소 첨가한다. 반응의 완결 후, 셀라이트의 패드를 통해 촉매를 여과시키고 용매 제거하여 수소첨가된 화합물을 얻는다. 수소 첨가된 화합물(1 당량)을 플라스틱 용기내 THF에 용해시키고, 0℃로 냉각시키며 HF-피리딘을 첨가한다. 결과로서 얻은 혼합물을 0℃에서 0.5 시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후 중탄산나트륨 용액 (10%)을 첨가하고 유기층을 분리시키고, 건조시키고 농축시켜 면역원 1D을 얻는다.

실시예 64 - 화합물 63의 제조

건조 THF 내 화합물 43 (1 당량)의 냉각된 용액에, 수소화나트륨 (미네랄 오일내 60% 현탁액, 1.1 당량)을 첨가하고 결과로서 얻은 현탁액을 아르곤 대기 하에서 1시간 동안 교반한다. 그다음 4-메톡시벤질 클로라이드(1.4 당량)를 반응 혼합물에 첨가하고 교반을 2시간 동안 계속한다. 반응의 완결 (TLC) 후, 과량의 염기를 염화암모늄 용액으로 중화시키고, 유기 층을 분리시키고, 건조시키고, 농축시키며, 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 63을 얻는다.

실시예 65 - 이미데이트 화합물 62a의 제조

디클로로메탄내 화합물 63 (1 당량)의 용액에, 테트라부틸암모늄 플루오라이드 (THF 내 1M, 1.1 당량)를 첨가하고 출발 물질(화합물 63)이 사라질 때까지 (TLC) 아르곤 대기 하에서 반응 혼합물을 교반한다. 그다음 트리클로로 아세토니트릴 (3 당량)을 반응 혼합물에 첨가하고 교반을 부가의 4시간 동안 계속한다. 반응의 완결 후, 용매를 제거하고 플래시 크로마토그래피하여 이미데이트를 아노머릭 혼합물로서 얻는다.

실시예 66 - 화합물 64의 제조

디클로로메탄 내 디올 화합물 41(1당량) 및 이미데이트 화합물 62a(1당량)의 냉각된 용액(-20℃)에 촉매량의 루이스 산(보론 트리플루오라이드 에테레이트 또는 TMS-트리플레이트)을 첨가하고 혼합물을 아르곤 대기 하에 상기 온도에서 밤새 교반한다. 반응의 완결 후, 산을 염화 암모늄 용액으로 중화시키고, 유기 층을 분리시키고, 건조시키고, 농축시키며, 플래시 크로마토그래피로 정제하여 커플링된 화합물 64을 얻는다.

실시예 67 - 화합물 65의 제조

건조 DMF (0.2M)내 화합물 64 (1 당량)의 용액에 이미다졸 (2.4 당량) 및 t-부틸디메틸실릴 클로라이드 (1.2 당량)를 차례로 첨가하고 혼합물을 아르곤 하의 실온에서 6시간 동안 교반한다. 반응의 종결 후, 반응 혼합물을 클로로포름으로 희석하고 물로 세척하며 유기상을 분리시키고, 건조시키고, 농축시키며 플래시 크로마토그래피로 정제하여 실릴화 화합물을 얻는다.

0℃에서 디클로로메탄내 실릴화 화합물의 용액에 트리플루오로아세트산을 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후, 산을 트리에틸아민으로 중화시키고, 용매를 제거하며 디올을 플래시 크로마토그래피로 정제한다.

아르곤 대기 하에서 건조 DMF 내 디올 (1 당량)의 냉각 용액 (0℃)에 이미다졸 (2.2 당량) 및 t-부틸디메틸실릴 클로라이드 (1.1 당량)를 차례로 첨가하고, 혼합물을 상기 온도에서 2시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후, 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하며 물로 세척하고, 유기층을 분리시키고, 건조시키고, 농축시키며 플래시 크로마토그래피로 정제하여 화합물 65을 얻는다.

실시예 68 - 화합물 66의 제조

THF 및 아세트산 내 화합물 65 (1 당량)의 용액에 아연 가루를 첨가하고, 출발 물질 (화합물 65)이 사라질 때까지(TLC) 혼합물을 교반한다. 반응의 완결 후, 여과에 의해 염을 제거하고, 여액을 트리에틸아민으로 중화시키며 용매를 제거한다. 아미노 화합물을 플래시 크로마토그래피로 정제한다. 디클로로메탄내 산 3 (1.1 당량) 및 아미노 화합물(1 당량)의 용액에 EDC (1.1 당량) 및 HOBT (1.1 당량)를 차례로 첨가하고 혼합물을 밤새 교반한다. 반응의 완결 후, 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 물로 세척하며, 유기 층을 분리시키고, 건조시키고, 농축시키며, 생성물 66을 플래시 크로마토그래피로 정제한다.

실시예 69 - 화합물 67의 제조

디클로로메탄 내 화합물 66 (1 당량), N,N-디이소프로필아미노 디벤질 포스파이트 (1.2 당량) 및 테트라졸 (1.4 당량)의 혼합물을 아르곤 대기 하에서 2시간 동안 교반한다. 포스피틸화 반응의 종결 (TLC) 후, 혼합물을 0℃로 냉각시키고 m-CPBA (1.3 당량)을 첨가하고 교반을 부가의 1시간 동안 계속한다. 산화 반응의 완결 후, 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 중탄산나트륨 용액(5%)으로 세척한다. 유기 층을 분리시키고, 건조시키고, 농축시키며, 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제한다.

아세트니트릴내 포스포릴화 화합물 (1 당량)의 용액에 DDQ (1.5 당량)을 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후, 플래시 크로마토그래피에 이어서 수성 처리하여 화합물 67을 얻는다.

실시예 70 - 화합물 68의 제조

디클로로메탄내 산 4(1.2 당량) 및 화합물 67 (1 당량)의 용액에 DCC (1.2 당량) 및 DMAP (1.2 당량)를 차례로 첨가하고 혼합물을 6시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후, 불용성 물질을 여과 제거하고, 여액을 농축시키며, 생성물, 화합물 68을 플래시 크로마토그래피로 정제한다.

실시예 71 - 면역원 2D의 제조

화합물 62의 면역원 1D로의 전환을 위해 상기에 진술된 바와 유사한 조건에 의해 화합물 68의 면역원 2D로의 전환을 수행한다.

특히, Pd-C (10%)의 존재하에 수소 기구를 사용함으로써 에틸 아세테이트내 화합물 68 (1 당량)의 현탁액을 수소첨가하였다. 반응의 완결 후 셀라이트의 패드를 통해 촉매를 여과시키고 용매의 제거는 수소첨가된 화합물을 얻는다. 수소첨가된 화합물 (1 당량)을 플라스틱 용기내 건조 THF (0.2M)에 용해시키고 HF-피리딘을 첨가하고 혼합물을 Ar 대기 하에 0℃에서 교반한다. 반응의 완결 후 교반과 함께 중탄산나트륨 용액(10%)을 첨가한다. 유기 층을 분리시키고 건조시키며, 용매 제거하여 면역원 2D를 얻는다.

실시예 72 - 면역원 3D-A, 2D-A 및 1D-A의 제조

메탄올내 화합물 54 및 촉매량의 PTSA의 용액을 출발 물질이 사라질 때까지 (TLC) 0℃에서 교반한다. 반응의 완결 후, 산을 트리에틸아민으로 중화시키고 용매의 제거 및 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 히드록시 화합물을 얻는다.

디클로로메탄내 트리에틸아민 (2 당량) 및 상기 히드록시 화합물(1 당량)의 용액에, 염화메탄설폰산을 0℃에서 첨가하고 혼합물을 아르곤 대기 하에서 1시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후, 용매를 진공하에서 제거하고 메실레이트 반응 생성물을 더 정제할 필요없이 다음 반응에 사용한다.

건조 DMF내 아지드나트륨 (3 당량) 및 메실레이트 화합물 (상기 반응 생성물) (1 당량)의 용액을 아르곤 대기의 50℃에서 4시간 동안 가열한다. 반응의 완결 후 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 물로 세척하며, 유기상을 분리시키고, 건조시키고, 농축시키며, 플래시 크로마토그래피로 정제하여 아지드를 얻는다.

에틸 아세테이트내 Pd-C (10%)및 아지드의 현탁액을 수소 대기 하에서 4시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후, 촉매를 여과시키고, 용매의 제거는 상응하는 아미노 화합물을 얻으며, 이를 HF-피리딘으로 처리시, 면역원 3D-A를 얻는다.

면역원 1D-A의 제조 : 메탄올내 화합물 62 및 촉매량의 PTSA의 용액을 출발 물질이 사라질 때까지 (TLC) 0℃에서 교반한다. 반응의 완결 후, 산을 트리에틸아민으로 중화시키고 용매의 제거 및 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 히드록시 화합물을 얻는다. 디클로로메탄내 트리에틸아민(2 당량) 및 히드록시 화합물 (1 당량)의 용액에, 염화메탄설폰산의 용액을 0℃에서 첨가하고 혼합물을 아르곤 대기 하에 1시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후, 용매를 진공 하에서 제거하고 메실레이트 화합물을 정제 없이 다음 반응에 사용한다. 건조 DMF내 아지드나트륨 (3 당량) 및 메실레이트 화합물 (1 당량)의 용액을 아르곤 대기 하의 50℃에서 4시간 동안 가열한다. 반응의 완결 후 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 물로 세척한다. 유기 상을 분리시키고 건조시키며 농축시키고, 아지드를 플래시 크로마토그래피로 정제한다. 에틸 아세테이트내 아지드 및 Pd-C (10%)의 현탁액을 수소 대기 하에서 4시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후 촉매를 여과시키고 용매 제거하여 상응하는 아미노 화합물을 얻으며, 이를 HF-피리딘으로 처리하여 면역원 1D-A를 얻는다.

면역원 2D-A의 제조 : 메탄올내 화합물 68 및 촉매량의 PTSA의 용액을 출발물질이 사라질 때까지 (TLC) 0℃에서 교반한다. 반응의 완결 후, 산을 트리에틸아민으로 중화시키고 용매의 제거 및 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 히드록시 화합물을 얻는다. 디클로로메탄 내 트리에틸아민(2당량) 및 히드록시 화합물(1당량)의 용액에, 염화메탄설폰산의 용액을 0℃에서 첨가하고 혼합물을 아르곤 대기 하에 1시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후, 용매를 진공 하에서 제거하고 메실레이트 화합물을 정제없이 다음 반응에서 사용한다. 건조 DMF내 아지드나트륨(3당량) 및 메실레이트 화합물(1당량)의 용액을 아르곤 대기 하의 50℃에서 4시간 동안 가열한다. 반응의 완결 후, 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 물로 세척한다. 유기 상을 분리시키고, 건조시키며 농축시키고, 아지드를 플래시 크로마토그래피로 정제한다. 에틸 아세테이트 내 아지드 및 Pd-C(10%)의 현탁액을 수소 대기 하에서 4시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후 촉매를 여과시키고 용매 제거하여 상응하는 아미노 화합물을 얻으며, 이를 HF-피리딘으로 처리하여 면역원 2D-A를 얻는다.

실시예 73 - 면역원 3D-AL, 2D-AL, 및 1D-AL의 제조

0℃의 촉매량의 PTSA 및 메탄올내 화합물(54)의 용액을 출발 물질(화합물 54)이 사라질 때까지 (TLC) 교반한다. 반응의 완결 후, 산을 트리에틸아민으로 중화시키고, 용매를 제거하고 플래시 크로마토그래피하여 해당 히드록시 화합물을 얻는다.

디클로로메탄 내 상기 히드록시 화합물 (1 당량) 및 CBZ-보호된 아미노산의 용액에 차례로 DCC (1.2 당량) 및 DMAP (1.2 당량)을 첨가하고; 혼합물을 아르곤 대기 하에 4시간 동안 교반한다. 반응 완결 후, 불용성 염을 여과에 의해 제거한다. 여액을 진공하에 농축시키고 플래시 크로마토그래피에 의해 생성물을 정제하여 커플링된 화합물을 얻는다.

에틸 아세테이트 내 상기 커플링된 화합물 및 Pd-C (10%)의 현탁액을 Ar 대기 하에 4시간 교반한다. 반응의 완결 후 촉매를 여과하고 용매를 제거하여 아미노 화합물을 얻으며, HF-피리딘으로 처리시 면역원 3D-AL을 얻는다.

면역원 2D-AL의 제조 : 0℃의 촉매량의 PTSA 및 메탄올 내 화합물 68의 용액을 출발 물질이 사라질 때까지 (TLC) 교반한다. 반응의 완결 후, 산을 트리에틸아민으로 중화하고 용매를 제거하고 플래시크로마토그래피하여 해당 히드록시 화합물을 얻는다. 디클로로메탄 내 히드록시 화합물(1 당량) 및 CBZ 보호된 아미노산 (1.2 당량)의 용액에 차례로 DCC (1.2 당량) 및 DMAP (1.2 당량)을 첨가하고 혼합물을 아르곤 대기하에 4시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후, 불용성염을 여과에 의해 제거한다. 여액을 진공하에 농축시키고 플래시 크로마토그래피에 의해 생성물을 정제하여 커플링된 화합물을 얻는다. 에틸 아세테이트 내 상기 커플링된 화합물 및 Pd-C (10%)의 현탁액을 Ar 대기하에 4시간 교반한다. 반응의 완결 후 촉매를 여과하고 용매를 제거하여 아미노 화합물을 얻으며, HF-피리딘과 처리시 면역원 2D-AL을 얻는다.

면역원 1D-AL의 제조 : 0℃의 촉매량의 PTSA 및 메탄올 내 화합물 62의 용액을 출발 물질이 사라질 때까지 (TLC) 교반한다. 반응의 완결 후, 산을 트리에틸아민으로 중화하고 용매를 제거하고 플래시크로마토그래피하여 해당 히드록시 화합물을 얻는다. 디클로로메탄 내 히드록시 화합물 (1 당량) 및 CBZ 보호된 아미노산 (1.2 당량)의 용액에 차례로 DCC (1.2 당량) 및 DMAP (1.2 당량)를 첨가하고 혼합물을 아르곤 대기에서 4시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후, 불용성염을 여과에 의해 제거한다. 여액을 진공하에 농축시키고 플래시 크로마토그래피에 의해 생성물을 정제하여 커플링된 화합물을 얻는다. 에틸아세테이트내 커플링된 화합물 및 Pd-C (10%)의 현탁액을 Ar 대기하에 4시간 교반한다. 반응의 완결 후 촉매를 여과하고 용매를 제거하여 아미노 화합물을 얻으며, HF-피리딘과 처리시 면역원 1D-AL을 얻는다.

실시예 74 - 모노클로날 항체 생성을 위한 지질-A 동족체를 사용하는 면역화

bK-1

양 적혈구 (SRBC)를 하기와 같이 BK-1으로 코우팅했다(100) :

i) 포름 알데히드 고정되고 동결 건조된 SRBC (Sigma Chemicals)를 멸균 PBS에 재현탁시켜 10% v/v 현탁액을 얻었다. 이 현탁액 0.5ml를 원심분리에 의해 PBS 10ml로 3회 세척하고 최종적으로 0.5ml로 재현탁시켰다. BK-1을 0.05% 트리에틸아민 내에 음파파쇄에 의해 1mg/ml의 농도로 용해시켰다. 그리고나서 이 용액을 1M 트리스 완충액 pH 7의 1/10 부피를 첨가하여 중화시켰다. 이 용액 150㎕를 PBS로 3ml까지 희석시켜 농도 50㎍/ml를 얻고 이를 세척된 SRBC에 첨가하여 총부피 3.5ml를 얻었다. 이 혼합물을 실온에서 회전 혼합기 상에 밤새 항온처리했다. 그리고 나서, 코우팅된 SRBC를 원심 분리에 의해 펠릿화하고 PBS 4ml로 2회 세척하고 최종적으로 PBS내 1.5ml로 재현탁시켜 3.3% 현탁액을 얻었다.

ii) 애주번트의 존재하에 이들 BK-1-코우팅된 SRBC로 생쥐를 여러회 면역화했다. 나중 출혈 후, 개개의 생쥐로부터 혈청을 후-완와동으로부터 출혈시켜 얻고, BK-1-특이적 IgM 및 IgG 항체를 ELISA 검정에 의해 이들 혈청내에서 따로 측정했다. 이 방법으로 면역화된 생쥐는 IgM 반응만 나타냈다. 고역가 항-BK-1 반응을 나타내는 상기 개체들을 선택하고, 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 통상적인 세포 융합 기술에 의해 그 비장 세포로부터 얻었다.

bK-3

BK-3로써 코우팅된 산 가수 분해된 세균(AHB)을 하기와 같이 제조했다(101):

i) 부피 100ml의 PPBE 배지를 같은 배지 내 정상기의 밤새 배양물 0.5ml로 접종시킴으로써 이. 콜리 균주 HB 101을 후기 로그 상(late log pnhase)으로 성장시켰다. 배양물을 O.D.₅₄₈0.85에 이를 때까지 37℃에서 250 rpm으로 회전 혼합시키면서 약 5시간 동안 성장시켰다. 세포를 원심분리에 의해 수거하고 1% 아세트산으로 세척하고 원심 분리에 의해 다시 수거했다. 배양물 총 500ml는 세균 0.92g 습윤 중량을 생산했다. 이들 세포를 1% 아세트산 45ml에 재현탁시키고 100℃의 끓는 물 욕 내에서 2시간 동안 가숩 분해한 후 4℃에서 밤새 유지시켰다. 세포를 1% 아세트산내에서 2회, 물내에서 1회, 아세톤내에서 1회 세척한 후 진공하에 건조시켜 산 가수 분해된 세균 130mg을 얻었다. 이들을 물에 재현탁시키고 10mg 분획으로 나누고 진공하에 건조시키고 사용할 때까지 -20℃에서 저장했다.

ii) AHB 2mg을 50ml 둥근 바닥 플라스크 내 물 4ml에 현탁시켰다. 0.05% 트리에틸아민 내 격렬하게 음파파쇄된 BK-3 2.5mg/ml 용액 (20 ㎍) 80㎕를 첨가했다. 혼합물을 회전 증발기상에서 건조시키고 음파 파쇄에 의해 2ml 물 내에 재현탁시키고 다시 건조시켰다. 면역화를 위해 사용할 때까지 이들 항원 코우팅된 AHB를 건조 저장시켰다. 코우팅된 AHB를 0.9% NaCl 내에 재현탁시켜 1mg/ml 농도 AHB (100㎍/ml BK-3)를 얻고 같은 부피의 주사용 완전 또는 불완전 프로인드 애주번트와 혼합했다. 생쥐를 이 현탁액 100㎕로써 복막내로 또는 피하로 면역화시켰으며, 제 1 면역화는 CFA를 사용하고 후속되는 면역화는 IFA를 사용했다.

iii) 생쥐를 상기와 같이 여러회 면역화했다. 나중 출혈 후, 후-안와동으로부터 출혈시킴으로써 각각의 생쥐로부터 혈청을 얻고 BK-3-특이적 IgM 및 IgG 항체를 ELISA 검정에 의해 이들 혈청에서 따로 측정했다. 고역가 항-BK3 IgG 반응을 나타낸 생쥐를 선택하고 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 통상적인 세포 융합 기술에 의해 그 비장 세포로부터 생산했다.

면역원 3D

면역원 3D를 하기와 같이 리포좀 내로 혼입했다 :

i) 비율 1.0:0.11:0.75로 디미리스토일 포스파티딜 콜린, 디세틸 포스페이트 및 콜레스테롤 (모드 Sigma Chemical 로부터)의 10mM 용액들을 혼합함으로써 리포좀 형성을 위한 지질의 원료 용액을 제조했다. 이 원료 용액을 1.0ml 부피로 나누고, 아르곤하에 건조시키고, 사용할 때까지 -20℃에서 저장했다.

ii) CHCl₃내에 용해된 면역원 3D 500㎍을 회전 증발기 상의 50ml 둥근 바닥 플라스크 내로 건조시켰다. 지질 원료의 한 분량을 CHCl₃:MeOH (9:1) 1ml에 용해시키고 건조된 면역원 3D에 첨가했다. 용해된 지질을 철저히 혼합한 후, 모든 용매가 제거될 때까지 아르곤하 회전 증발기 상에서 함께 건조시키고 그리고나서 15분 더 상기에서 건조시켰다. 그리고나서, 플라스크를 고 진공 건조기내에 2시간 동안 두어다. 팽윤 용액 1.0ml, 약 0.9% NaCl을 유리 구슬 0.5g을 갖는 건조 지질 필름에 첨가하고 소용돌이 및 외동에 의해 격렬히 혼합했다. 리포좀을 실온에서 밤새 팽윤시켰다. 이들 리포좀 제제 내 면역원 3D의 공칭 농도는 따라서 500㎍/ml (0.25 mM) 였고 다른 지질의 농도는 10 mM 이었다.

iii) 이들 리포좀을 사용한 생쥐의 면역화를 위한 최적 조건은 예비 실험에서 보조약의 부재하에 0.1ml (면역원 3D 50㎍)의 주사로 밝혀졌다. 따라서 생쥐를 이 방식으로 0일, 21일 및 35일내 면역화한 후 ELISA에 의해 면역원 3D 반응의 측정을 위하 42일에 후-안와동으로부터 출혈시켰다.

iv) 이 기본 공정성적표의 수정에서, Balb/c 생쥐내에서 주 T-세포 자극 에피토프로 알려진 합성 펩티드를 혼입한 리포좀을 합성했다. 이 펩티드는 Hen Egg Lysozyme(HEL)의 잔기 105-120으로 구성되며 이를 팽윤 용액내에 농도 25㎍/ml로 용해시킴으로써 리포좀내로 혼입시켰다. 상기된 계획에 따라 생쥐를 면역화하기 위해 이 제제를 사용했다. CFA 내 HEL 10㎍으로 리포좀을 첫번째 주사하기 10일 전 이들 생쥐를 초회 항원 자극시켰다.

실시예 75 - 지질-A 동족체에 대해 생성된 모노클로날 항체

bK-1

BK-1/SRBC로 면역화된 C57 BL/6 생쥐로부터의 비장세포로 수행된 두 융합물로부터 ELISA에서 지질-A에 특이적으로 결합된 총 14 MAbs를 얻었다. 이들 MAbs 모두는 IgM/Kappa 동기준표본이었다. 지질-A 동족체에 대한 이들 MAbs의 상대적 친화성을 측정하기 위해 저해 ELISA를 수행했다. (사용된 동족체는 : 모노포스포릴 지질-A, MPL ; 살모넬라 미네소타 균주 R 595 로부터의 ReLPS ; BK-1 및 BK-3 였음) MAbs는 이들 리간드에 대한 그 상대적 친화성을 기준으로 하여 4개의 특이성 군에 속했다 :

I MPL = ReLPS ＞ BK1 ＞＞ BK3

II MPL = ReLPS = BK1 ＞＞ BK3

III MPL = BKI ＞ ReLPS ＞＞ BK3

IV MPL = ReLPS ＞＞ BK1BK3

서로다른 LPS 케모타입(chemotype)을 사용한 유사한 저해 ELISA는 MAbs 모두가 ReLPS와 반응했고, 약간은 ReLPS와 저친화도를 갖고 반응했으나 이들중 어느 것도 완전히 0-글리코실화된 이. 콜리 S-LPS에 대해 친화성을 갖지 않았다. 이들 MAbs 중 다섯 (II 군으로부터 4개 및 I 군으로부터 1개)을 복수액으로부터 정제하고³H-지질-A 및³H-ReLPS 기질로부터 지방 아실쇄를 방출하는 그 능력에 대해 시험했다. 어느 것도 촉매적으로 활성이 아니었다. 그러나, 이들 MAbs의 각각은 LPS에 대한 결합을 위해, 그리고 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 치료하는데 유용하다. 이는 또한 일반식(I) 화합물이 지질-A 및 LPS와의 결합 부위에 대해 경쟁할 수 있으므로 이 방법으로 치료하는데 유용하다는 것을 증명한다.

bK-3

5개 융합물을 수행하고, 저해 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 지질-A 및 BK-3에 대한 특이적 결합을 나타낸 총 24개 MAbs를 선택했다. 이들 MAbs 중 23개는 IgM/kappa 이고 1개는 IgG/kappa 였다. 23개 MAbs는 BK-3에 대한 것보다 지질-A에 대해 보다 고친화성을 나타낸 한편, 2개는 지질-A에 대한 보다 고친화성을 나타낸 한편, 2개는 지질-A에 대한 것보다 BK-3에 대해 보다 고친화성을 가졌다. 이들 MAbs 중 11개를³H-지질-A- 및³H-ReLPS 기질로부터 지방 아실쇄를 방출하는 그 능력에 대해 시험했으나; 어느 것도 촉매적으로 활성이 아니었다. 그러나, 이들 MAbs의 각각은 LPS 결합을 위해 및 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 치료하는데 유용하다. 이는 또한 일반식(I) 화합물이 지질-A와의 결합 부위에 대해 경쟁할 수 있고 따라서 이 방법으로 치료하는데 유용함을 증명한다.

면역원 3D

BK-1 및 BK-3에 대해 상기된 바와 같이 융합을 수행한다. IgM 및 IgG MAbs 둘다가 생성된다. MAbs는 면역원 3D 및 지질-A 둘 다에 대해 고친화성을 갖는데; 어느 것도 촉매적으로 활성이 아니나; 모두 LPS에 대한 결합에 유용하여 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 치료하는데 유용하다. 이는 또한 일반식(I) 화합물이 지질-A와의 결합 부위에 대해 경쟁할 수 있고 따라서 이 방법으로 치료하는데 유용함을 증명한다.

실시예 76 - 촉매 항체

실시예 74 및 75의 절차를 수행하고 항-BK-1, 항-BK-3 및 항-면역원 3D MAbs를³H-지질-A 및³H-ReLPS로부터 지방 아실쇄를 방출하는 그 능력에 대해 시험하면; 이들 MAbs는 지방 아실쇄를 방출하므로 촉매 항체이다. 이들 촉매 항체는 하기에 더욱 기재되는 바와 같이 단독으로, 또는 서로간의 혼합물로 또는 실시예 75의 MAbs와의 혼합물 (칵테일로서)로 패혈증 또는 독물 쇼크를 치료하는데 유용하다.

상기된 바와 같이 전이 상태 동족체 (일반식(I) 화합물)에 대해 생성된 임의의 동기준표본의 MAbs, 그러나 바람직하게 IgG를 에스테르 결합을 가수분해하는 그 능력에 대해 스크리닝하여, Munford 및 Hall(36)에 기재된 방법에 따라³H-표지된 ReLPs로부터 지방 아실쇄의 방출을 결과시킨다.

그리고나서, 이 검정에서 촉매적으로 활성인 MAbs (또는 항원 결합 부위를 포함하는, 항체를 코딩하는 유전자, 또는 항체 부분들을 코딩하는 상기 유전자 단편의 임의의 시스템에서의 발현에 의해 또는 단백질 화학적 기술에 의해 MAbs로부터 유도되는 보다 작은 단편) (본원에서 ABZYMEs^TM으로 명명됨)를 그의 정제된 형태로서 LPS와 반응하는 능력에 대하여, Dermal Schwartzman Reaction 에서의 반응성, 또는 이로부터의 면역보호, 공격; 발열성; 백혈구 감소증; 보체 활성 작용; 시토킨(TNF, IL-1, IL-6) 유도; 산소 라디칼 방출을 위한 호중구의 초회항원자극; 및 배양된 상피 세포내 응혈 촉진제 활성의 유도를 포함하나 이에 제한되지 않는 당업자에게 잘 알려진 그 생체외 및 생체내 생활성을 중화시키는 방법으로 시험한다. 본 발명의 촉매 MAbs 또는 그 단편은 적합하게 정제된 형태로 LPS와, 그 생체외 및 생체내 생활성을 중화시키는 방법으로 반응한다. 본 발명의 촉매 MAbs 또는 그 단편은 적합하게 정제된 형태로 LPS와 함께, 그 생체외 및 생체내 생활성을 중화시키는 방법으로 반응한다.

또한 촉매 MAbs를 당업자에게 잘 알려진 검정에서 갈락토사민 민감화된 및 민감화되지 않은 생쥐 둘다에 대한 LPS 제제의 독성을 감소시키는 그 능력에 대해 시험한다 : 갈락토사민 초회항원자극된 생쥐(62)를 개별적인 촉매 항체로 처리된 증가량의 LPS 및 처리되지 않은 LPS로써 주사하고 상기 생쥐 내 LD₅₀을 3일 기간 후 측정한다. 본 발명의 촉매 MAbs 또는 그 단편을 LPS 제제의 독성을 감소시킨다.

치사 그람-음성 균혈증에 대한 보호를 제공하는 촉매 MAbs의 능력을 표준 생쥐 독성 검정(102)으로 평가했다. 간단히, 연령 6-8달된 암 CF1 생쥐를 경사 구배 반응을 제공하기 위해 희석시킨 이. 콜리의 비루스 배양물로서 주사한다. 촉매 항체에 의해 제공된 예방 보호를 감염 18시간 전에 생쥐를 MAbs로 주사하여 측정한다. 이 방법으로 처리된 생쥐의 LD₅₀을 3일 후 측정한다. 균혈증을 치료하는데 있어 항체의 효능을 시험하기 위해, 상기 실험에서 효과적인 MAbs를 세균 감염 후 투여한다. 본 발명의 촉매 MAbs 또는 그 단편은 그람-음성 균혈증에 대해 보호를 제공한다.

예비-임상학적 동물 연구 후, 그리고나서 사람에서 치료 작용을 위해 MAbs를 시험한다. 항생제 치료 및 집중 보조 간호를 포함하는 통상적인 치료에 대한 보조약으로서 MAbs를 사용한 그람-음성 패혈증의 치료에 대한 두가지 주요한 연구를 실시했다 (6, 7); 이들 연구는 적합한 환자 인구를 포함하는 기준 및 이 질병에 있어 항체 투여 기준 치료를 위한 바람직한 공정성적표를 규정한다. 연구에서 본 발명의 촉매 MAbs 또는 이로부터 유도된 단편('ABZYME^TM'을 사용하는 이들 공정성적표가 후속된다.

선택된 'ABZYMEs^TM'의 최대 내인성 투여량을 이루기 위해 당분야에 잘 알려진 방법에 따라 초기 투여량의 점차적 확대 안정성 및 독성 연구를 실시한다. 그리고나서 효능 시험은 그람-음성 세균 감염을 갖는 것으로 추정되나 의심이 되는 환자에게 정맥내, 근육내 또는 복강내 경로를 통한 'ABZYME^TM'의 투여를 포함한다. 인산염 완충된 염수와 같은 생리학적으로 허용가능한 용액내의 'ABZYME^TM'을 투여하며, 이는 덱스트란 또는 사람 혈청 알부민과 같은 기초 첨가제가 숙주의 체중에 의해 결정되는 투여량으로 추가될 수 있다. 이 투여량은 바람직하게 숙주 체중의 약 0.1mg/kg - 약 40mg/kg 이고 대개 약 1.0mg/kg - 약 10mg/kg이나 상기된 바와 같이 측정된 최대 내인성 투여량을 초과하지 않아야 한다. 감염으로부터 환자의 회복이 이루어질 때까지 치료를 필요한 간격으로 반복한다. 본 발명의 촉매 MAbs 또는 그 단편이 효과적이다.

실시예 77 - 화합물 69의 제조

Ar 대기 하에 건조 DMF (0.2M)내 디올 화합물 4l(1 당량)의 용액에 이미다졸 (4.8 당량) 및 t-부틸디메틸실릴 클로라이드(2.4 당량)을 연속적으로 첨가하고; 출발 물질 (화합물 4l)이 사라질 때까지 혼합물을 실온에서 교반한다. 반응의 완결 후, 혼합물을 에틸 아세테이트 (0.1M)로 희석하고 물로 세척한다. 유기상을 분리하고 건조시켜 용매를 제거하고 플래시 크로마토그래피하여 해당 실릴제거된 화합물을 얻는다.

상기 얻어진 화합물 (1 당량)을 0℃로 냉각된 메탄올(0.2M)에 용해시키고 PTSA (촉매량)을 첨가한다. 출발 물질이 사라질 때까지 (TLC) 그 온도에서 결과 혼합물을 교반한다. 반응의 완결 후, 산을 트리에틸아민으로써 켄칭시키고 용매를 제거하고 플래시 크라마토그래피하여 화합물 69를 얻는다.

실시예 78 - 화합물 70의 제조

Ar 대기하에 0℃에서 트리에틸아민 (3 당량)을 함유하는 건조 디클로로메탄 (0.2M) 내 화합물 69 (1 당량)의 용액에 MsCl (1.2 당량)을 주사기를 통해 적가한다. 히드록시 화합물이 사라질 때까지 혼합물을 그 온도에서 교반한다. 반응의 완결 후, 염화 암모늄 용액(10%)을 첨가하고 유기상을 분리하고 건조시키고 농축시킨다. 용매를 제거하고 플래시 크로마토그래피하여 해당 메실레이트 화합물을 얻는다.

건조 DMF (0.2M)내 상기 얻어진 메실레이트 화합물(1 당량)과 나트륨 아지드(3 당량)의 혼합물을 출발 물질이 사라질 때까지 Ar 대기하에 50℃에서 가열한다. 반응의 완결 후, 혼합물을 에틸 아세테이트(0.1M)로 희석하고 물로 세척한다.

유기상을 분리하고 건조시키고 농축시키며 플래시 크로마토그래피하여 아지도 화합물 70을 얻는다.

실시예 79 - 화합물 71의 제조

촉매 (Pd-C, 10%)의 존재하에 에틸 아세테이트 (0.2M) 내 화합물 70(1당량)의 현탁액을 수소 풍선을 사용하여 수소화한다. 반응의 완결(TLC) 후 촉매를 셀라이트 패드를 통해 여과하고 용매를 제거하여 아미노 화합물 71을 얻는다.

실시예 80 - 화합물 73의 제조

PTSA (촉매량)의 존재하에 건조 DMF (0.1M)내 구입가능 락톤 72 (1 당량) 및 2,2-디메톡시 프로판의 용액을 Ar 대기하에 실온에서 교반한다. 반응의 완결(TLC) 후 용매를 진공하에 제거하고 새로운 건조 DMF(0.2M)를 첨가한 후 이미다졸 (4.8 당량) 및 t-부틸디메틸실릴 클로라이드(2.4 당량)를 차례로 첨가한다. 출발 물질이 사라질 때까지 Ar 대기하에 혼합물을 교반한다. 반응의 완결 후, 혼합물을 에틸 아세테이트(0.1M)로 희석하고 물로 세척하고; 유기상을 분리하고 건조시키고 농축시키며 플래시 크로마토그래피하여 화합물 73을 얻는다.

실시예 81 - 화합물 74의 제조

출발물질이 사라질 때까지 벤질 알콜(10 당량)내 화합물 73 (1 당량)의 용액을 환류에서 가열한다. 반응의 완결 후, 벤질 알콜을 진공하에 제거하고 플래시 크로마토그래피 상의 결과되는 혼합물로 히드록시 에스테르 화합물을 얻는다.

트리에틸아민(3 당량)의 존재하에 건조 디클로로메탄(0.2M)내 상기-얻어진 히드록시 에스테르 화합물(1 당량)의 용액에 Ar 대기 하에 주사기를 통해 Ms-Cl (1,2 당량)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 교반한다. 반응의 완결(TLC) 후, 염화 암모늄(10%)용액을 첨가하고 유기층을 분리하고 건조시키고 농축하며, 플래시 크로마토그래피하여 해당 메실레이트 화합물을 얻는다.

건조 아세톤(0.2M)내 메실레이트 화합물(1 당량), 요오드화 나트륨(2 당량)의 용액을 Ar 대기 하에 50℃에서 가열한다. 반응의 완결(TLC) 후, 용매를 제거하고 플래시 크로마토그래피하여 요오도 화합물을 얻는다.

건조 DMF (0.2M)내 상기 얻어진 요오도 화합물(1 당량) 및 나트륨 아지드(3 당량)를 Ar 대기 하에 50℃에서 가열한다. 반응의 완결(TLC) 후, 용액을 에틸 아세테이트(0.1M)로 희석하고 물로 세척한다. 유기상을 분리하고 건조시키고 농축시키며 플래시크로마토그래피하여 아지도 화합물 74을 얻는다.

실시예 82 - 화합물 75의 제조

촉매(Pd-C, 10%)의 존재 하에 에틸 아세테이트(0.2M)내 화합물 74(1 당량)의 현탁액을 수소 대기 하에 교반한다. 반응의 완결 후, 촉매를 여과하고 용매를 제거하고 실릴 락탐을 얻는다.

건조 THF (0.2M)내 실릴 락탐(1 당량)의 용액에 n-테트라부틸암모늄 플루오라이드(THF내 1M 용액, 2.4 당량)의 용액에 Ar 대기 하에 주사기를 통해 첨가한다. 반응의 완결 후, 용액을 에틸 아세테이트로 희석하고 최소량의 물로 세척한다. 유기상을 분리하고 건조시키고 농축시켜 플래시 크로마토그래피하여 화합물 75를 얻는다.

실시예 83 - 화합물 76의 제조

건조 디클로로메탄(0.2M)내 화합물 75 (1 당량), DCC (2.4 당량), DMAP (2.4 당량) 및 산 3(2.4 당량)의 용액을 실온에서 Ar 대기 하에 교반한다. 반응의 완결 후, 불용성 입자를 여과에 의해 분리하고 용매를 제거하고 플래시 크로마토그래피하여 커플링 화합물을 얻는다.

상기 얻어진 화합물(1 당량)을 Ar 대기 하에 실온에서 디클로로메탄(0.2M) 및 트리플루오로아세트산(3 당량)의 용액내에서 교반한다. 반응의 완결 후, 과량의 산은 트리에틸아민으로 중화시킨 후 용매를 진공하에 제거하고 플래시 크로마토그래피하여 디올 화합물을 얻는다.

0℃에서 Ar 대기 하에 건조 DMF (0.2M)내 상기 얻어진 디올(1 당량)의 용액에 연속적으로 이미다졸(2.2 당량) 및 t-부틸디메틸실릴 클로라이드(1.1 당량)를 첨가하고; 혼합물을 상기 온도에서 출발 물질이 사라질 때까지 교반한다. 반응 완결 후, 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 물로 세척하고 건조시키고 농축시키고 플래시 크로마토그래피하여 화합물 76을 얻는다.

실시예 84 - 화합물 77의 제조

건조 디클로로메탄(0.2M)내 화합물 76(1 당량), N,N-디이소프로필아미노 디벤질포스파이트, 테트라졸의 용액을 실온에서 Ar 대기 하에 교반한다. 반응의 완결 후, 혼합물을 0℃로 냉각하고, m-CPBA (1.2 당량)을 첨가하고 혼합물을 반응이 완결될 때까지 교반한다. 반응의 완결 후, 용매를 제거하고 플래시 크로마토그래피하여 화합물 77을 얻는다.

실시예 85 - 화합물 78의 제조

건조 디클로로메탄(0.2M)내 화합물 77의 용액에 트리에틸옥소늄 테트라플루오로보레이트(1 당량, 디클로로메탄내 1M 용액, Meerwein 시약)의 용액을 첨가하고 혼합물을 0℃에서 Ar 대기 하에 1시간 동안 교반한다. 그리고나서 디클로로메탄(0.2M)내 아미노 화합물 7l (1.2 당량)의 용액을 첨가하고 반응이 완결된 때까지 혼합물을 교반한다. 반응의 완결 후, 용매를 제거하고 플래시 크로마토그래피하여 화합물 78을 얻는다.

실시예 86 - 화합물 79의 제조

방법-A : 에틸 아세테이트(0.2M)내 화합물 78 (1 당량)의 현탁액을 촉매(Pd-C, 10%)의 존재 하에 수소 대기 하에 교반한다. 반응의 완결 후, 촉매를 여과하고 용매를 제거하여 수소화된 화합물을 얻는다. 플라스틱 용기 내에서 THF(0.1M)내 수소화된 화합물(1 당량)의 용액을 HF-피리딘과 함께 0℃에서 교반한다. 반응의 완결 후, 용액을 중탄산 나트륨으로 중화시킨다. 유기상을 분리하고 용매를 제거하여 화합물 79를 얻는다.

방법-B : 건조 디클로로메탄(0.2M)내 화합물 78 (1 당량), 트리메틸실릴 요다이드 (2 당량)의 용액을 0℃에서 Ar 대기 하에 교반한다. 반응의 완결 후, 용액을 희석 HCl (5%)로 중화하고 1 시간동안 교반한다. 유기상을 분리하고 용매를 제거하여 화합물 79를 얻는다.

실시예 87 - 일반식(I) 및 (II) 화합물의 발열성

일본 백색 토끼를 1 및 10㎍/kg의 KB-1, BK-3 및 면역원 3D, 및 화합물 79 및 0.001㎍/kg 지질-A를 투여한다. 일반식(I) 및 (II) 화합물은 발열성을 나타내지 않는 반면 지질-A는 발열성을 나타낸다. 이는 일반식(I) 및 (II) 화합물이 지질-A 보다 덜 독성이고 면역 생리학적 활성, 예컨대 B 세포 및 대식세포 활성, Ifn, TNF 유도 활성이 발열성, 치명성 및 Schwartzman 작용과 같은 독성 작용과 별개임을 증명한다.

실시예 88 - 세균 감염에 대항하는 비특이적 보호

세균 감염에 대한 비특이성 저항성을 증가시키기 위한 화합물 BK-1, BK-3, 면역원 3D 및 화합물 79의 능력을 Nakatsuka 일동(103)에 의해 기재된 Pseudomonas aeruginosa 모델로 측정한다(103). 간단히, 본 발명의 화합물을 10⁷-2×10⁸CFU/생쥐의 구배 투여량의 생존 가능한 P. aeruginosa 생물(5E81-1과 같은 임상학적으로 단리된 균주의)로써 복강내 감염시키기 1일 전에 본 발명의 화합물을 다양한 투여량(1-10㎍/생쥐)으로 ICR 생쥐내로 복강내 주사한다. 감염 후 7일간 다수의 생쥐가 생존하고, 이를 최종 결과로서 기록하고, 대조표준 처리된 생쥐(본 발명 화합물의 선행 투여가 없는 P. aeruginosa)는 감염 후 약 3일 안에 죽는다. 본 발명의 화합물은 세균 감염에 대한 비특이적 저항성을 증가시킨다.

실시예 89 - 비루스 공격으로부터의 보호

비루스 감염에 대한 비특이적 저항성을 증가시키는 본 발명의 화합물 BK-1, BK-3, 면역원 3D 및 79의 능력을 Ikeda 일동에 의해 기재된 Vaccinia 비루스 모델(73)에서 측정한다. 간단히, 10⁴pfu의 Vaccinia 비루스로써 정맥내 감염시키기 1일 전에 10-20마리의 4주된 암 ddY 생쥐군을 본 발명의 화합물로 정맥내 투여한다. 비루스 공격 7일 후 1% 플루오레세인 -0.5% 메틸렌 블루로써 염색하여 가시화한 후 생쥐 꼬리상의 Vaccinia 비루스 병변을 센다. 항-비루스 효능을 처리되지 않은 대조표준에 대해 처리된 생쥐의 병변수의 감소로 측정한다. 본 발명 화합물로 처리된 생쥐는 처리되지 않은 대조표준 생쥐에 비해 병변 수의 감소를 나타내므로; 본 발명의 화합물은 항비루스 활성을 나타낸다.

실시예 90 - 항암제

화합물 BK-1, BK-3, 면역원 3D 및 화합물 79의 항암 작용을 당업자에게 잘 알려진 동물 모델, 예컨대 Nakatsuka 일동(104)에 의해 기재된 B16 쥐 흑색종 전이 모델에서 조사한다. 간단히, 10⁵개 B16 흑색종 세포의 정맥내 접종 전에 본 발명의 화합물을 다양한 투여량(0.1-10 ㎍/생쥐)으로 투여 횟수 및 시간을 변화시키면서 생쥐에게 정맥내 주사한다. 생쥐 폐 표면상의 흑색종 전이의 수를 종양 세포의 이식 후 21일에 분할 현미경을 사용하여 센다. 본 발명의 화합물의 효능은 본 발명의 화합물로 처리한 생쥐에 있어 전이의 수 감소로 증명된다.

생쥐 결장 암 모델이 Jeannin 일동(105)에 의해 기재되어 있다. 간단히, BDIX 생쥐를 10⁶Pro b 세포로 복강내 접종시킨다. 14일 후 본 발명 화합물을 사용한 처리를 개시한다 : 화합물을 10mg/kg 체중 이하의 다양한 투여량으로 주사하고 다양한 계획에 따라 5회 이하의 주사를 1주에 2회 실시한다. 죽은 쥐의 복강내 종양 결정의 크기 및 수를 조사함으로써 종양 이시 후 6주에 질병 정도를 모니터링한다. 본 발명의 화합물로 처리된 생쥐는 대조표준 생쥐보다 작고 적은 종양 결절을 나타낸다.

Nakatsuka 일동(78)에 의해 기재된 바와 같은 Meth A 섬유 육종 모델. 7주된 Balb/c 생쥐의 옆구리로 10⁵또는 2×10⁵Meth A 세포를 피내로 투여한다. 본 발명의 화합물을 100㎍/생쥐의 투여량으로 종양 이식 후 7일 및 9일에 정맥내로 또는 성장하는 종양 덩어리내로 직접 주사한다. 종양의 크기를 2-4일 간격으로 측정기로 측정한다. 42주 후 생쥐를 죽이고 종양을 절제하여 하중한다. 또한, 종양이 분해된 생쥐의 수를 기록한다. 본 발명의 화합물로 처리된 생쥐는 보다 작은 종양 또는 분해된 종양을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 화합물은 항암제로서 유용하다.

실시예 91 - 지질-A/LPS의 수용체 길항질

수용체 결합에 대해 경쟁하여 지질-A 또는 LPS의 내독소 효과를 저해하는 화합물 BK-1, BK-3, 면역원 3D 및 화합물 79의 능력을 Quereshi 일동(106)에 의해 기재된 생쥐 모델에서 평가한다. PBS내 화합물(들)로 또는 대조표준으로서 PBS 단독으로 8-12주 연령의 Balb/c 생쥐 군을 주사하고 60분 후 1㎍의 ReLPS를 주사한다. 60분 더 지난 후 동물의 피를 뽑고 Flick 및 Gifford (107)에 의해 기재된 L929 섬유아세포 독성 검정을 사용하여 TNF의 혈청 수준을 측정한다. 본 발명의 화합물은 이 검정에서 TNF 생성 수준을 유의하게 감소시키며, 또한 Golenbock 일동(108)에 의해 기재된 바와 같이 배양중의 사람 단핵 세포에 의한 TNF 생성을 저해하는 그 능력에 대해 시험하면; 본 발명의 화합물은 사람 단핵 세포에서 TNF 생성을 저해한다.

실시예 92 - 일반식(II) 화합물에 대한 항체

실시예 74, 75 및 76에 기재된 절차를 사용하여 화합물 79에 대해 결합 및 촉매 항체를 유도한다. 이들 항체는 BK-1, BK-3, 및 면역원 3D에 대해 유도된 것과 같이 유용하다.

실시예 93 - T-세포 자극 펩티드를 혼입한 리포좀을 사용한 면역화

HEL로 초회 항원 자극시키고, 실시예 74에 요약된 계획에 따라 펩티드 HEL [105-120](합성, 부가적인 C-말단 시스테인 잔기를 가짐)과 함께 각각 리포좀내로 혼입된 면역원 3D ('imm-3D') 및 지질-A로 면역화된 생쥐는 유도 항원에 증가된 IgG 항체 반응을 나타냈다. 이는 지질-A를 사용한 실험에서 가장 잘 나타났다 : 각각 5마리 Balb/c 생쥐의 4개 군을 리포좀내에 혼입된 지질-A 50㎍으로 면역화했다. 생쥐의 반응 첫번째 면역화 하기 10일전 HEL로써 초회 항원 자극하고, 생쥐의 반은 펩티드 HEL [105-120](합성, 부가적인 C-말단 시스테인 잔기를 가짐)을 혼입한 리포좀을 수용했다. 최종 면역화 7일 후에, 혈청 샘플을 취하고 IgG 및 IgM 항-지질-A 항체의 역가를 따로 ELISA에 의해 측정했다. 결과는 하기 표 I에 주어져 있다 :

표 I

군	초회 항원 자극된 반수	리포좀내 펩티드	IgM 역가	IgG 역가
A	+	+	1 : 60,000	1 : 10,000
B	+	-	1 : 6,000	1 : 150
C	-	+	1 : 10,000	1 : 1,000
D	-	-	1 : 15,000	1 : 100

이들 데이타는 고-역가 IgG 반응의 생성이 HEL 초회 항원 자극 및 리포좀 제제에 있어 펩티드의 포함에 좌우됨을 나타낸다. B 및 D 군에 비해 C 군의 10배 증가된 IgG 역가는 아마도 리포좀내 선행 투여량의 펩티드가 나중 면역화를 위한 특이적 T-세포를 초회 항원 자극시켜 T-세포 도움을 결과시키고 결과는 IgM 에서 IgG 동 기준표본 항체로 전환된다.

HEL 초회항원자극 및 리포좀내의 펩티드의 혼입의 결합(A 군)은 또한 IgM 역가를 B-D 군에 비해 4-10배 증가시킨다. 지질-A에 대한 1:60,000의 이 역가가 최고이며, 다량의 지질-A로써 코우팅된 살균 세포를 사용하는 연장된 면역화 제도를 포함하여 시도된 임의의 공정성적표로부터 알 수 있다. 이는 이 유형의 배합이 내독소 또는 그람-음성 패혈증의 해로운 효과로부터 동물을 보호할 수 있는 IgM 반응을 유도하기 위한 백신으로 사용하기에 가장 효과적임을 나타낸다.

동시 실험으로, 생쥐를 HEL을 사용하여 초회 항원 자극 후 리포좀 + HEL [105-120](합성, 부가적인 C-말단 시스테인 잔기를 가짐)내 Imm-3D로써 면역화한다. 결과는 하기 표 II에 주어져 있다.

표 II

동기준표본	IMM-3D에 대한 역가	지질-A에 대한 역가
IgM	1 : 3,000	1 : 3,000
IgG	1 : 10,000	1 : 1,500

그러므로 이 면역화는 Imm-3D에 대한 IgM 반응 보다 높은 역가의 IgG 반응을 결과시켰다. 또한 IgG 항체에 있어 항원 특이성 정도는 Imm-3D에 대해 증가했으며; 지질-A에 대한 역가는 상동 항원에 대해 6-배 낮다. 다른 한편, IgM 반응은 보다 교차-반응성으로 지질-A 및 Imm-3D에 대해 같은 역가를 생성한다.

실시예 94 - BK-3에 결합하는 박테리오파지 발현 라이브러리로부터 단리된 모노클로날 항체 단편

생쥐를 실시예 74에 기재된 바와 같은 BK3-코우팅된 이. 콜리 HB 101 세포로써 면역화했다. 이들 생쥐 두 마리로부터의 비장 세포를 표준 방법에 의한 mRNA의 제조를 위해 사용했다. IgG, IgM의 CH1 도메인 및 CK 도메인내 기초한 프라이머를 사용하여 이 mRNA로부터 cDNA를 합성했다. 그리고나서 당업자에게 알려진 표준 방법학, 및 1992. 2. 24에 출원된 미합중국 출원 일련 번호 제 07/841,648 호에 기재된 바와 같고 본원에 참고('특이적 결합쌍의 원들을 생성하는 방법'으로 표제된 1992. 1. 23에 공개된 PCT 특허 공개 WO 92/01047, 및 PCT 공개 WO 91/17271 및 WO 91/19818을 참고로 하며; 이들 PCT 공개 모두 본원에 참고로 포함됨)로써 이미 기재된 바와 같은 프라이머 셋트를 사용하여 이 초기 cDNA의 PCR 증록을 수행했다. 2개의 fd-파지 발현 라이브러리를 생성했으며, cDNA로부터의 것은 IgM 특이적 프라이머로부터 합성했고 cDNA로부터의 다른 것은 IgG 트이적 프라이머로부터 합성했다. 이들 라이브러리는 각각 1.2×10⁶및 2.8×10⁶개의 독립된 클론들을 함유했다. BK-3에 대해 결합할 수 있는 항체 단편을 발현하는 파지 입자를 BK-3로 코우팅된 고체 표면상의 '패닝(panning)'절차에 의해 선택했다. CHCl₃/MeOH (3:1 비)내 화합물 15 ㎍을 함유하는 용액을 건조도로 증발시켜 35mm 직경 페트리 접시를 BK3으로써 코우팅했다. 비-특이적 결합을 막기 위해 접시를 PBS 내 건조된 우유 3% 용액으로 1시간 동안 항온처리한후 라이브러리로부터의 파지를 그 내에서 실온에서 2-3시간 동안 항온처리했다. PBS/0.1% Twee 20 및 PBS로 세척 후, 특이적 파지를 물내 100mM 트리에틸아민으로 용리시키고, 이 콜리 TG1 세포를 감염시키기 위해 사용했다. 이 절차를 총 3회 반복함으로써 결과 확대된 파지 모집단을 더 선택했다. 3회째 패닝으로부터 단리된 파지 입자를 다시 TG1 세포내에서 확대시킨 후 플레이팅 아웃시키고 단일 클론을 뽑아내 개별적인 세균 배양물을 감염시키기 위해 사용했다. 이들 배양물로부터의 상층액을 BK3 코우팅된 플라스틱 웰에 대한 결합에 대해 당업자에게 잘 알려진 표준 ELISA로 분석했다(파지 상층액 10㎕를 항원 코우팅된 웰과 반응시키고, 결합을 양 항-fd 혈청으로써 감지했다). IgM 라이브러리로부터 분석된 총 156개로부터의 10개 클론은 이 검정에서 BK-3에 대한 강한 결합을 증명했으며; IgG 라이브러리로부터 분석된 240개 중 4개도 유사했다. 따라서, 이들 클론으로부터의 항체는 패혈증을 치료하는데 유용하다. 이들 결합제 중 10개를 더 특성화했다.

이 방법으로 단리된 클론을 유전학적 다양성을 조사했다. 항체연쇄를 코딩하는 삽입물을 PCR에 의해 증폭하고, 종종 항체 유전자 서열을 절단하는 제한 효소 Bst N1으로 생성물을 소화시키고, 결과 단편을 4% 아가로스 겔 상에서 분석했다. 분석은 10개의 명백히 서로 다른 항체 분자가 라이브러리로부터 선택되었음을 나타냈다. 이어지는 서열분석은 3개의 서로다른 Vk 유전자의 사용을 나타냈으며, 하나는 8개 항체에 의해 사용되었고 다른 둘은 각각 한 항체에 의해 사용되었다. 이 방법에 의해 발현된 항체는 결합 및 촉매 활성을 나타내며, 따라서 패혈증을 치료하는데 유용하다. 촉매 활성의 스크리닝은 1992. 2. 24 에 출원된 미합중국 출원 일련번호 제 07/841,648 호에 기재된 바와 같을 수 있다.

대안적으로, 면역화되지 않은 동물 또는 사람으로부터의 비장세포 또는 말초 혈액 임파구를 상기와 같이 구조된 라이브러리 및 면역글로불린 mRNA의 원으로 사용할 수 있다.

실시예 95 - 화합물 80의 제조

화합물 5a, b (10 mmol)을 아세톤 50mL에 융해시키고 0℃로 냉각한다. 적색이 남을 때까지 존스 시약을 첨가하고 혼합물을 상기 온도에서 1시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후 아세톤을 진공하에 증발시키고 잔류물을 에틸 아세테이트 (100 mL)에 용해시키고 유기층이 거의 무색이 될 때까지 물(3×50 mL)로 세척한다. 유기층을 무수 MgSO₄상에서 건조시키고 진공하에 농축시킨다. 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 80을 오일로서 얻는다.

실시예 96 - 화합물 81의 제조

메탄올 (0.8ml)내 1M 나트륨 메톡상드를 화합물 80(10mmol) 및 메탄올 30mL의 혼합물에 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한다. 반응의 완결 후, 휘발성 성분을 진공하에 증발시키고 에틸 아세테이트를 용리제로서 사용하여 작은 실리카겔 패드를 통해 잔류물을 여과한다.

PTSA(0.1g)를 상기 트리올 (10mmol), 2,2-디메톡시프로판 (25mmol) 및 메틸렌 클로라이드 50mL의 혼합물에 첨가하고 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한다. 그리고나서 반응 혼합물을 메틸렌 클로라이드 (70mL)로 희석시키고 물(70mL), 5% 중탄산나트륨(30mL) 및 물(50mL)로 세척한다. 유기상을 무수 MgSO₄상에서 건조시키고 진공하에 농축시킨다. 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 아세토니드를 오일로서 얻는다.

0℃로 냉각된 DMF 10mL 내 상기 아세토니드 (10mmol), 이미다졸(22mmol), 및 TBDMS-Cl(11mmol)의 혼합물을 출발 물질이 소비될 때까지 교반한다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (150mL)로 희석시키고 물 (2×50mL) 및 브라인 (50 mL)로 세척하고 무수 MgSO₄상에서 건조시키고 진공하에 농축시킨다. 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 81을 무색 오일로서 얻는다.

실시예 97 - 화합물 82의 제조

벤질 알콜 (50mmol) 내 화합물 81(5mmol)의 용액을 출발 물질이 소비될 때까지 가열한다. 반응의 완결 후 과도한 벤질 알콜을 진공하에 제거한다. 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 히드록시 에스테르를 얻는다.

트리에틸아민 (5.5mmol)을 0℃로 냉각시킨 THF 50mL내 메탄설포닐 클로라이드 (5.5mmol) 및 상기 히드록시 에스테르(5.0mmol)의 혼합물에 첨가한다. 출발 물질이 소비된 후, 혼합물을 물(75mL)과 에틸 아세테이트(3×50mL)사이에 분배시키고 유기상을 브라인(50mL)으로 세척하고 무수 MgSO₄상에서 건조시키고 진공하에 농축시킨다. 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 메탄설포네이트를 무색 고체로서 얻는다.

아세톤(25 mL)내 상기 메탄 설포네이트(5mmol) 및 요오드화 나트륨 (10 mmol)의 혼합물을 환류에서 가열한다. 출발물질을 소비한 후, 용매를 진공하에 제거하고 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 황색 오일로서 얻는다.

DMF 10mL 내 상기 요다이드 (5mmol) 및 나트륨 아지드 (15mmol)의 혼합물을 50℃에서 가열한다. 반응의 완결 후, 혼합물을 물(75mL)과 에틸 아세테이트 (3×50mL)사이에 분배하고 유기상을 브라인(50mL)으로 세척하고 무수 MgSO₄상에서 건조시키고 진공하에 농축시킨다. 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 82를 무색 고체로서 얻는다.

실시예 98 - 화합물 83의 제조

메탄올 25mL 내 화합물 82 (5mmol) 및 5% Pd-C (0.5mmol)의 현탁액을 수소 대기 하에 교반한다. 출발 물질이 소비된 후, 촉매를 여과에 의해 제거하고 진공하에 용매를 증발시켜 화합물 83을 얻는다.

실시예 99 - 화합물 84의 제조

0℃로 냉각시킨 메틸렌 클로라이드 25mL 내 화합물 83(5mmol) 및 트리에틸아민(5mmol)의 용액에 4-니트로벤즈알데히드(5mmol)를 첨가한다. 출발 물질이 소비된 후, 용매를 진공하에 증발시키고 잔류물을 포화 중탄산 나트륨(30mL)과 에테르 (4×80mL) 사이에 분배하고, 유기상을 무수 탄산 칼륨 상에서 건조시키고, 용매를 진공하에 증발시킨다. 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 84를 오일로서 얻는다.

실시예 100 - 화합물 85의 제조

테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드 (THF 내 1M 용액, 12mmol)를 THF 35ㅢ 내 화합물 84(5mmol)의 용액에 실온에서 첨가한다. 출발 물질이 소비된 후, 혼합물을 포화 중탄산나트륨(2×10mL)으로 세척하고 유기상을 에테르(2×20mL)로 추출하고 합한 유기상을 무수 탄산 칼륨 상에서 건조시키고 진공하에 농축시킨다. 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 85를 오일로서 얻는다.

실시예 101 - 화합물 86의 제조

메틸렌 클로라이드 20mL 내 화합물 85(1mmol), EDC(2.2mmol), DMAP(2.2mmol) 및 화합물 3(2.2mmol)의 용액을 출발 물질이 소비될 때까지 실온에서 교반한다. 혼합물을 물(60mL)에 붓고 에틸 아세테이트(3×60mL)로 추출하고 유기상을 브라인(50mL)으로 세척하고 무수 MgSO₄상에서 건조시키고 진공하에 농축시킨다. 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 86을 무색 오일로서 얻는다.

실시예 102 - 화합물 87의 제조

0℃로 냉각시킨 화합물 86(1mmol) 및 메틸렌 클로라이드 3mL의 혼합물에 트리플루오로아세트산(3mL)을 첨가한다. 30분 후, 온도를 0℃로 유지하면서 트리에틸아민을 천천히 첨가하여 산을 중화시킨다. 그리고나서 혼합물을 포화 중탄산 나트륨(50mL)내에 조심스럽게 붓고 에틸 아세테이트(4×60mL)로 추출하고 유기상을 브라인(50mL)로 세척하고 무수 MgSO₄상에서 건조시키고 진공하에 농축시킨다. 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 디올을 무색 오일로서 얻는다.

0℃로 냉각시킨 DMF 2mL 내 상기 디올 (1mmol), 이미다졸(2.2mmol), 및 TBDMS-Cl(1.1mmol)의 혼합물을 출발 물질이 소비될 때까지 교반한다. 혼합물을 에틸 아세테이트(40mL)로 희석시키고 물(2×10mL) 및 브라인(10mL)으로 세척하고 무수 MgSO₄상에서 건조시키고 진공하에 농축시킨다. 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 실릴 에테르를 무색 오일로서 얻는다.

메틸렌 클로라이드 10mL 내 상기 이차 알콜(1mmol), N,N-디이소프로필아미노 디벤질포스파이트 (2mmol), 및 테트라졸 (2mol)의 용액을 아르곤 대기 하에 실온에서 교반한다. 출발 물질이 소비된 후, 혼합물을 0℃로 냉각시키고 m-CPBA (2mmol)을 첨가한다. 2시간 후, 용매를 진공하에 증발시킨다. 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 87을 무색 오일로서 얻는다.

실시예 103 - 화합물 88의 제조

메틸렌 클로라이드 (1mmol)내 트리에틸옥소늄 테트라플루오로보레이트의 1M 용액을 0℃로 냉각시킨 메틸렌 클로라이드 9mL 내 화합물 87(1mmol)의 용액에 첨가한다. 1시간 후, 메틸렌 클로라이드 4mL 내 화합물 71(1.2mol)의 용액을 첨가한다. 반응의 완결 후, 용매를 진공하에 증발시키고 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 88을 얻는다.

실시예 104 - 화합물 89의 제조

에틸 아세테이트 5mL내 화합물 88(0.1mmol) 및 5% Pd-C(10 중량%)의 현탁액을 수소 대기하에 교반한다. 반응의 완결 후, 촉매를 여과에 의해 제거하고 용매를 진공하에 증발시키고 잔류물을 플라스틱 용기내 아세토니트릴 4.75mL에 용해시킨다. 그리고나서 48% 수성 불화수소산(0.25mL)을 결과 혼합물에 첨가한다. 1시간 후, 휘발 성분을 진공 하에 증발시켜 화합물 89를 고체로서 얻는다.

실시예 105 - 화합물 94의 합성(반응 도식 41 : 제48도)

D-글루코스아민 히드로클로라이드 90으로 출발하여 화합물 94를 합성하고 : 벤질 클로로포름메이트 및 중탄산 나트륨을 사용한 아미노 보호 후 2,2-디메톡시프로판 및 p-톨루엔설폰산 촉매를 사용하여 아세톤화하여 보호된 글루코스아민 91을 얻는다. 환류하에 48시간 동안 아세토니트릴 내 카르보메톡시메틸트리페닐포스포란과 화합물 91의 알도 형태의 반응은 플래시 크로마토그래피에 의해 정제 후 트리페닐포스핀옥사이드가 오염된 C0글리코사이드 92를 얻는다. α 이성질체를 선호하는 3.5:1의 선택성을 갖고 Witting 반응을 진행했다. 포스파민 옥사이드로부터의 더 나은 분리를 얻고 α 및 β 이성질체를 분리하기 위해, 화합물 92의 히드록실을 아세틸화하고 화합물 93을 얻었다. 30% 에틸 아세테이트/헥산을 사용한 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 포스파인 옥사이드 오염물을 분리했다. 2% 메탄올/메틸렌 클로라이드를 사용하여 플래시 크로마토그래피에 의해 α 및 β 이성질체의 분리를 얻었다. 78℃ 에서 메틸렌 클로라이드내 4 당량의 DIBAL-H를 사용한 화합물 93의 환원은 예상된 바와 같이 완전한 아세틸화 제거를 결과시켰으나 메틸 에스테르의 단지 부분적인 환원을 결과시켰으며; 알데히드와 알콜의 혼합물을 결과시켰다. 환원을 결과시키고; 혼합물을 메탄올 내 나트륨 보로하이드리드로 10분간 처리하여 디올 94를 얻었다.

실시예 106 - 화합물 100의 합성 (반응 도식 42; 제49도)

트란스-2-헥센-1-올로부터 출발하여 (R)-3-벤질옥시헥산산, 화합물 100을 합성했다. 에폭사이드 95의 키랄 중심을 도입하기 위해 (-)-디이소프로필 타트레이트를 사용한 뚜렷치 않은 비대칭 에폭사이드화를 이용했다. 에폭사이드를 Red-Al 환원시켜 선택적으로 양호한 수율의 (R)-1,3-헥산디올, 화합물 96을 얻었다. 디올 96의 일차 히드록실을 표준 조건하에 선택적으로 실릴화하여 알콜 97을 얻었다. 나머지 히드록실을 벤질 트리클로로아세트이미데이트 및 촉매 트리플루오로메탄 설폰산을 사용하여 벤질화하여 화합물 98을 얻었다. 일차 히드록실을 산성 메탄올을 사용하여 탈보호하여 알콜 99를 얻었으며, 이를 존스 시약을 사용하여 산 100 으로 산성화했다.

실시예 107 - 화합물 107의 제조 (반응 도식 43a, 43b; 제50, 51도)

촉매 수소화에 의해 t-부틸디메틸 실릴 에테르 및 CBZ 기를 제거함에 따라 디올 101의 일차 알콜 관능가를 선택적으로 보호하여 아미노 화합물 102를 얻었다. 산 100과 102의 EDC를 사용한 연속되는 축합으로 화합물 103을 얻었다. 산 100, EDC 및 DMAP를 사용한 103의 부가적 아실화로 완전히 보호된 화합물 104를 얻었다. THF 내 테트라부틸암모늄 플루오라이드를 사용하여 실릴기의 제거를 수행하여 히드록시 화합물 105를 얻었다. DCC 및 DMAP를 사용한 105와 N-CBZ-글리신과의 아실하로 화합물 106을 얻었다. 트리플루오로아세트산을 사용한 106의 산 가수분해에 의해 디올 107을 제조했다.

실시예 108 - 화합물 110 및 112의 제조 (반응 도식 44; 제52도)

산 110 및 112의 합성은 같은 키랄 중간체, 알콜 97로부터 비롯했다. 부틸포스폰 디클로라이드를 DMAP 및 과량의 벤질 알콜과 반응시켰다. 결과 디벤질 에스테르를 클로로포름 내 1.1 당량의 오염화인과 환류하에 반응시켜 모노클로리데이트 108을 얻었다. 화합물 108을 알콜 97 및 염기와 반응시켜 화합물 109를 얻었다. 산성 메탄올을 사용하여 0℃에서 화합물 109를 실릴제거하고 존스 시약을 사용하여 결과 알콜을 산 110으로 산화시켰다. 유사한 방법으로, 부티릴 클로라이드 및 DMAP를 사용하여 알콜 97을 아실화하여 화합물 111을 얻었다. 1,3-아실 이행을 최소화하기 위해 0℃ 에서 TBDMS의 조심스러운 산성 메탄올 분해를 실시하고, 존스 시약을 사용하여 결과 일차 알콜을 산화하여 산 112 를 얻었다.

실시예 109 - 화합물 1D-SC의 제조 (제53도)

1D-SC (제53도)의 합성은 필수적으로 ID의 합성 (도식 27)과 같은 화학적 단계를 따랐다. 두 합성에 있어 차이는 사용된 시약의 유형이었다. 화합물 ID-SC를 위해, 화합물 3(도식 24) 대신에 산 112(도식 44)를 사용했고, 이당류 형성을 위해, 화합물 113(제43도에 도시됨)을 41(도식 25) 보다 107에 커플링했다. 이당류의 아미노기의 아실화를 위해, 4(도식 26) 대신 화합물 110 (도식 41)을 사용했다. 1H NMR 분석에 의해 합성의 확인을 제공했다.

이렇게 해서, 본 발명의 바람직한 구체예에 상세히 기재되었으므로, 본 발명의 정신 또는 범주로부터 벗어나지 않고 이의 다수의 분명한 변화가 가능하므로 첨부된 특허 청구 범위에 의해 규정된 본 발명은 상기-설명에 기재된 특별한 설명에 의해 제한되어서는 안된다.

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Claims (9)

1. 하기 일반식의 화합물 :

   상기식에서 R_a, R_b, R_c, R_d, 및 R_e및 R_f각각은 서로 독립적으로 분지 또는 선형, 치환 또는 비치환 C_1-11알킬, 알켄 또는 알킨기이며 E 는 NH 또는 O 이다.
2. 제 1 항에 있어서, R_a, R_b, R_c, R_d, R_e및 R_f각각은 C₁₁H₂₃인 화합물.
3. 제 2 항에 있어서, E 는 NH 또는 O인 화합물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 화합물 및 적합한 부형제로 구성되는, 그람-음성 세균 감염에 대한 보호 활성을 위한 조성물.
5. 지질-A 또는 LPS 및 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 화합물 둘 다에 결합하는 항체.
6. LPS의 지질-A 부분내 화학적 결합의 가수 분해를 촉매화하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 화합물을 사용하여 유도된 항체.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 화합물을 포함하는 조성물로 동물을 면역화하고,

   상기 동물로부터 항체-생성 임파구를 제거하고

   임파구와 골수종 세포를 융합시켜 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 생산하는 것으로 구성되는 방법에 의해 제조된, 지질 A 또는 LPS 및 상기 화합물에 결합하는 항체.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 화합물을 포함하는 조성물로 동물을 면역화하고,

   상기 동물로부터 비장 세포를 단리하고,

   상기 비장 세포로부터 적어도 하나의 항체의 긴 사슬 및 짧은 사슬 둘 다의 전부 또는 일부를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 단편을 증폭시키고,

   상기 유전자 단편을 재조합 방식으로 비루스 벡터내로 삽입하고,

   유전자 단편으로부터 유도된 단백질을 발현하는 생장가능 비루스 입자의 라이브러리를 생산하고,

   유전자 단편의 발현된 항원 결합 단백질에 의해 결합 및/또는 촉매 활성을 위한 라이브러리를 스크리닝하는 것으로 구성되는, 지질 A 및 상기 화합물에 결합하는 항체를 생산하는 방법.
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 화합물을 포함하는 조성물로 동물을 면역화하고,

   상기 비장 세포로부터 적어도 한 항체의 긴 사슬 및 짧은 사슬 둘 다의 전부 또는 일부를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 단편을 증폭시키고,

   상기 유전자 단편을 재조합 방식으로 비루스 벡터내로 삽입하고,

   유전자 단편으로부터 유도된 단백질을 발현시키는 생장가능 비루스 입자의 라이브러리를 생산하고,

   유전자 단편의 발현된 항원 결합 단백질에 의해 결합 및/또는 촉매 활성을 위한 상기 라이브러리를 스크리닝하는 것으로 구성되는 방법에 의해 생성된, 지질 A 및 상기 화합물에 결합하는 항체.