KR100273718B1

KR100273718B1 - 신규한 피브린 용해효소 및 그를 포함하는 혈전증 치료제

Info

Publication number: KR100273718B1
Application number: KR1019930010667A
Authority: KR
Inventors: 정광회; 김두식; 문홍모
Original assignee: 허일섭; 주식회사녹십자
Priority date: 1993-06-11
Filing date: 1993-06-11
Publication date: 2000-12-15
Also published as: KR950000871A

Abstract

본 발명은 신규한 피브린 용해요소에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 한국산 살모사(Korean Salmosa Snake; Agkistrodon halys)의 독으로부터 분리한 피브린 용해효소, 정제 방법 및 그의 혈전증 치료제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 한국산 살모사로부터 정제된 피브린 용해활성이 우수함은 물론, 독성이 적었으므로 혈전증 치료제로서 개발될 수 있을 것이다.

Description

신규한 피브린 용해효소 및 그를 포함하는 혈전증 치료제

제1도는 한국산 살모사 독소로 부터의 벤즈아미딘-세파로즈 컬럼을 통한 살모나제 분리를 나타내는 그래프이다.

제2도는 한국산 살모사 독소로 부터의 DEAE-세파로즈 컬럼을 통한 살모나제 분리를 나타내는 그래프이다.

제3도는 세파크릴 S-100 컬럼을 통한 젤 여과 크로마토그래피 패턴을 나타내는 그래프이다.

제4a도는 정제된 살모나제의 SDS-PAGE 패턴을 나타내는 사진이다.

제4b도는 SDS-PAGE에 의한 살모나제의 분자량 결정을 나타내는 그래프이다.

제5도는 HPLC TSK-Gel SW-2000 젤 여과 컬럼에 의한 살모나제의 분자량 결정을 나타내는 그래프이다.

제6도는 정제된 살모나제의 IEF 패턴을 나타내는 사진이다.

제7도는 여러가지 이온의 살모나제 피브린 용해활성에 대한 효과를 나타내는 그래프이다.

제8도는 살모나제 활성에 대한 DFP의 영향을 나타내는 그래프이다.

제9도는 살모나제로 처리한 인간 혈장 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진이다.

제10도는 시간별로 살모나제를 처리한 피브리노겐의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 사진이다.

본 발명은 신규한 피브린 용해효소에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 한국산 살모사(Korean Salmosa Snake; Agkistrodon halys)의 독소로 부터 분리한 피브린 용해요소, 정제 방법 및 그의 혈전층 치료제로서의 용도에 관한 것이다.

혈전증(thrombosis)과 지혈(hemostasis)은 오랫동안 의학적으로 주요한 관심의 대상이 되어왔으며, 혈전층 치료제로서는 그동안 유로키나제, 스트렙토키나제 및 조직형 플라스미노겐 활성화제 등이 주로 연구되고 실용화되어 왔다.

그러나, 최근에는 천연물로 부터 유효성분을 추출하여 실용화하는 노력이 계속되어, 거머리, 지렁이, 흡혈박쥐 및 뱀 독소 등으로 부터 혈전증 치료제로서 사용될 수 있는 물질들이 분리되었다[참조: Roy T. Sawyer, Bio/Technology 9:513(1991); USP 4,568,545; Stephen J. Gardell et al., J. Biol. Chem., 264:17947(1989); J. Meir and K. Stocker, Toxicology, 21:171(1991)].

이러한 차원에서, 사람의 지혈체계(hemostatic system)에 영향을 주는 것으로 알려진 뱀 독소(snake venom)에 대해서도 비교적 자세히 연구되었으며, 지혈에 작용하는 다수의 독소성분이 분리되고 검정되어 왔다. 이들 중 많은 물질들이 진단이나 치료에 실질적인 응용을 할 수 있는 기초연구에 실험도구로서 이용되었으며, 특히, 피브리노펩다이드(fibrinopeptide)를 분해하여 피브리노겐(fibrinogen)을 피브린(fibrin)으로 전환시키는 트롬빈(thrombin)과 유사한 단백질 분해효소가 많이 분리되어, 현재까지 1종의 콜루브리대(Colubridae)로 부터 23종의 비페리대(Viperidae) 뱀독에 이르기까지 자세히 검정되었다[참조: J. Meier and K. Stocker, Toxicology, 21:171(1991)].

독소에 함유되어 있는 피브린 용해효소는 트롬빈과 유사한 효소들 만큼 활발히 연구되지는 않았으나, 최근에 혈전증과 지혈에 대한 의학적인 관심이 지대해지면서 독소내 피브린 용해효소 또한 상당히 연구되고 있는 실정이며, 현재까지 많은 비페리대와 몇몇 엘라피대(Elapidae)의 독소로부터 다수의 피브린 용해효소를 분리하여 검정하였다.

한국에는 14종의 뱀이 있으며, 그들 중에 아그키스트로돈(Agkistrodon)속의 3종만이 독소를 가지고 있는 것으로 알려져 있으나[참조: K.Y. Nah, Korea J. Surgery, 17:13(1975); H.K. Gloyd, Proc. Biol. Soc. Washington, 85:577(1971)], 한국의 아그키스트로돈 속의 뱀 독소내의 피브린(피브리노겐) 용해성 단백질 분해효소는 아직까지 자세히 연구된 바가 없었다. 한국에서 흔히 '살모사'로 통칭되는 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독소로 부터 분리된 분자량 약 39,200달톤의 피브린 용해효소에 대하여 최근에 보고되었으나[참조: Qian Xia Ohong and MA Liren, Toxicon, 29:1381(1991)], 단지 효소의 물리화학적인 성질만이 연구되었을 뿐, 다른 생물학적 활성에 대해서는 자세히 규명되지 않았다.

본 발명자들은 한국산 살모사의 독소로부터 분리한 피브린 용해효소 (이하, 편의상 '살모나제(salmonase)'라 함)의 성상 및 생물학적 활성이 전기 효소들과는 다르다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서, 본 발명은 한국산 살모사인 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스 종의 독소로 부터 피브린 용해효소, 그를 정제하는 방법 및 그의 혈전증 치료제로서의 용도에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다.

본 발명의 발명자들은 아그키스트로돈 핼리스 브레비카우두스의 독소로 부터 친화성, 이온 교환수지 및 젤 여과 크로마토그래피를 포함하는 정제과정을 통해 피브린 용해 활성을 갖는 분자량이 약 31,000 내지 33,000인 효소(살모나제)를 균일질로 정제하였다. 이 효소에 의한 피브린 응혈(clot)의 용해활성을 조사한 결과, 중성 pH에서는 플라스미노겐(plasminogen) 없이 진행되었으나, 플라스미노겐, 프로트롬빈 및 사람의 혈청 알부민(serum albumin)에 대해서는 단백질 분해기능을 나타내지 않았으며, 플라스민(plasmin)을 사용하여 인공순환계(artificial circulating system)내에서의 혈전용해활성을 조사한 결과도 약 10배의 강한 활성을 나타냄을 확인하였다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 다음의 실시예는 오로지 본 발명을 상술하기 위한 것으로, 본 발명의 요지내에서 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의한 용이한 실시는 모두 본 발명의 범주에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

[실시예 1] 피브린 용해활성의 분석

피브린 용해 활성은 표준 단백질 분해효소로서 플라스민을 사용하는 아스트럽(Astrup)과 물레르쯔(Mullertz)의 변형된 피브린 플레이트 분석법[참조: Astrup, T. and Mullertz, S., Arch. Biochem. Biophys., 40:346(1952)]에 의해 측정되었다. 피브린노겐 용액(0.05M 소디움 바비탈(sodium barbital) 완충용액(pH 7.8) 중에 0.7%(w/v)의 인간 피브리노겐을 포함한 것) 10ml과 트롬빈 용액(0.1M NaCl과 0.25%(w/v) 젤라틴을 함유하는 0.05M 바비탈 나트륨 완충용액(pH 7.8) 중에 100 NIH units/ml를 포함한 것) 0.1ml을 혼합시켜 페트리 디쉬(100×15mm)로 옮겨준 후, 피브린 층을 형성하도록 상온에서 30분간 방치하였다. 그런다음, 시료 10ml를 피브린 층위에 떨어뜨리고 37℃에서 항온처리 하였다. 표준곡선을 작성하기 위해 여러 희석배수에서 표준 플라스민의 투명도(zone clearance)가 사용되었고, 피브린 용해활성은 카제인 용해단위(CU: caseinolytic unit)로 표현되었다.

[실시예 2] 효소의 정제

모든 정제 과정은 4 내지 8℃에서 실시하였으며, 정제단계에 있어서 각 분획의 피브린 용해활성은 실시예 1의 피브린 플레이트법에 의해 분석하였다. 한국산 살모사로 부터 추출한 조(crude) 독소 5ml를 20mM Tris·HCl 완충용액(pH 7.5)에 10배 희석한 것을 가지고 효소를 정제하였으며, 벤즈아미딘-세파로즈 크로마토그래피, DEAE-세파로즈(FF) 크로마토그래피 및 세파크릴 S-100 젤 여과 크로마토그래피에 의한 용출과정에 의해, 아그키스트로돈 핼리스의 독소로 부터 피브린 용해효소인 살모나제를 분리하였다.

먼저, 상기 독소용액을 미리 초기 완충용액(starting buffer)으로 평형을 유지시킨 벤즈아미딘-세파로즈(benzamidine-Sepharose) 컬럼(2.5×10cm, Pharmacia-LKB, Sweden)에 부어 25ml/h의 유속으로 용출시켰다[참조: 제 1도]. 첫번째 용출은 1M NaCl을 사용하는 염 농도구배(salt gradient)로 수행하였고, 두번째 용출은 글라이신-HCl 완충용액(pH 3.5)으로 수행하였다. 여기서 활성을 나타낸 분획을 모아 4℃에서 초기 완충용액으로 밤새 투석하였다. 그런다음 수득한 분획을 동일한 완충용액을 사용하여, 유속 40ml/시간으로 DEAE-세파로즈 Fast Flow(2.5×5.0cm, Pharmacia-LKB, Sweden)를 채용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 컬럼에 부착된 단백질은 0 M에서 0.3 M NaCl까지의 선형 농도구배를 사용하여 용출시켰다[참조: 제 2도]. 아울러, 여기서 활성을 나타내는 분획을 모아 한외여과장치(ultrafiltration system, Model 8200, Amicon, USA)로 농축시키고, 동일한 완충용액을 사용하여 유속 6ml/시간으로 세파크릴 S-100(1.0×100cm, Pharmacia-LKB, Sweden) 젤 여과 크로마토그래피를 수행하였다[참조: 제 3도].

상기 단계별 정제과정은 다음 표 1에 요약하여 나타내었다.

상기 표 1에서 보듯이, 정제된 살모나제를 표준 단백질 분해효소로서 플라스민을 사용하여 비활성도를 측정한 결과 388.9 CU/mg로 나타났으며, 본 발명의 정제공정을 통하여 약 117.8배로 정제된 것을 확인하였다.

[실시예 3] 정제된 효소의 특성

이상의 정제과정으로 부터 수득한 활성분획을 모아 센트리프렙(Centriprep 10, Amicon, USA)으로 농축한 후, 불변성(non-denaturing) 폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 수행하여 활성을 가진 밴드를 확인하였다. SDS-PAGE는 8 내지 25%의 농도구배 폴리아크릴아마이드 젤과 4.5% 적층 젤을 사용하는 램리(Laemmli)의 방법 [참조: Laemmli, U.K., Nature, 227: 680(1970)]에 따라 실시하였다. 시료 10μl를 2×SDS-폴리아크릴아마이드 시료용 완충용액 10μl와 혼합하여 5분간 실온에서 방치한 다음, 이 시료 중 1μl를 폴리아크릴아마이드젤(PhastGel 8-25)에 점적한 후 전자동 전기영동장치(Phastsystem, Pharmacia-LKB, Sweden)로 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 완료된 후 2.5%(v/v) 트리톤(Triton) X-100으로 30분동안 가볍게 흔들어주면서 젤을 씻어주고 물로 세척하였다. 그런다음, 젤을 피브린 플레이트(fibrin plate) 위에 놓고 용해된 부위가 나타날 때까지 37℃, 습하 대기조건에서 적당시간 항온처리하여 밴드와 피브린 용해활성을 대비하였다. 피브린 플레이트는 0.7%(w/v) 사람 피브리노겐 용액 5ml과 트롬빈 5 NIH 단위를 포함하는 낮은 온도에서 용융하는 2%(w/v) 아가로스 5ml을 섞어 응고시킴으로써 제조하였다. 이때, 플라스민 유사활성 분석을 위한 플라스미노겐이 없는 피브리노겐과 플라스미노겐-활성제 활성 분석을 위한 플라스미노겐을 포함하는 피브리노겐을 사용하였다.

제 4 도는 정제된 피브린 용해효소(살모나제)의 분자량을 확인하기 위한 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 패턴(A)과 이를 그래프로 나타낸 것(B)이다. 제 4(a)도에서 제 1레인은 비환원조건에서의 살모나제 밴드이며; 제 2레인을 2-머캡토에탄올로 환원시킨 단백질의 밴드이다. 한편, SDS-PAGE의 표준 분자량 지표(M)는 각각, 미오신(200kd), 인산화효소(97.4kd), 소혈청 알부민(68kd), 오발부민(43kd,) 카보닉 안하이드라제(29kd), β-락토글로블린(18.4kd) 및 리소자임(14.3kd)을 사용하였다. 제 4(a)도에서 보듯이, 정제된 살모나제는 환원조건에서 분자량이 각각 16,000 내지 17,000달톤의 두개 사슬로 전환됨을 확인하였다.

한편, 정제된 피브린 용해효소인 살모나제의 분자량을 HPLC용 TSK-Gel SW-2000 컬럼(7.7×300mm, Toyo Soda, Japan)상에서의 젤 여과법으로 다시 확인한 결과는 31,700달톤으로 확인되었다[참조: 제 5도]. 젤 여과 표준 지표로는 소혈청 알부민, 오발부민, 카이모트립시노겐 A(25kd) 및 리보핵산 가수분해효소 A(13.7kd)를 각각 사용하였다. 이상의 결과로 부터, 본 발명의 피브린 용해효소의 분자량이 약 31,000 내지 33,000달톤임을 알 수 있었다.

또한, 전자동 전기영동장치인 페이스트시스템(Phastsystem, Pharmacia-LKB, Sweden) 내에서 3 내지 9의 pH 농도구배를 갖는 양쪽성 전해질를 포함하는 균일질의 5% 폴리아크릴아마이드를 사용하여 수행한 아이소일레트릭 포커싱(isoelectric focusing: IEF) 결과, pI값이 4.6인 산성 단백질임이 판명되었다[참조: 제 6도]. pI 표준물질로는 염기성 렌즈콩 렉틴(basic lentil lectin, 8.65), 중성 렌즈콩 렉틴(8.45), 산성(acidic) 렌즈콩 렉틴(8.15), 말의 염기성 미오글로빈(7.35), 말의 산성 미오글로빈(6.85), 사람 카보닉 안하이드라제 B(6.55), 소의 카보닉 안하이드라제 B(5.85), β-락토글로블린 A(5.20), 대두 트리신 저해제(4.55) 및 아밀로글루코시다제(3.50) 등을 사용하였다.

아울러, 여러가지 이온의 살모나제 피브린 용해활성에 대한 효과를 알아본 결과, 피브린 용해 활성은 2mM CaCl₂의 존재하에서는 증가하였으나, 2mM ZnCl₂와 10mM EDTA에 의해서는 완전히 저해됨을 확인하였다[참조: 제 7도].

살모나제의 피브린 용해활성은 산성 pH쪽으로 갈수록 또한 온도가 높아질수록 급격히 감소하였고, pH 3.0과 70℃에서는 거의 모든 활성을 잃었으며 최적조건은 pH 7.5, 37℃로 나타났다.

[실시예 4] 기질 특이성 및 효능부위의 확인

기질 특이성을 밝히기 위해, 발색성질을 가진(chromogenic) 9종류의 펩타이드 기질 즉, N-Benzoyl-Phe-Val-Arg-para-Nitroanilide, pyro-Glu-Phe-Leu-para-Nitroanilide, Val-Leu-Lys-para-Nitroanilide, Val-Leu-Arg-para-Nitroanilide, pyro-Glu-Gly-Arg-para-Nitroanilide, N-p-Tosyl-Gly-Pro-Lys-para-Nitroanilide, N-p-Tosyl-Gly-Pro-Arg-para-Nitroanilide, N-Benzoyl-Pro-Phe-Arg-para-Nitroanilide, D-Ile-Phe-Lys-para-Nitroanilide, N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-para-Nitroanilide, Na-Benzoyl-D,L-Arg-para-Nitroanilide 및 H-D-Phe-Pipecolyl-Arg-para-Nitroanilide(Sigma, Chemical Co., St. Louis, U.S.A.) 각 0.5mM을 완충용액(20mM Tris-HCl, pH 7.5)에 가하고 정제한 효소(0.2μg/ml)와 함께 37℃에서 반응을 시켰다. 이들 펩타이드 기질의 가수분해 결과산물인 p-니트로아닐리드는 405nm에서 분광광도계로 측정하였다[참조: 표 2].

상기 표 2에서 보듯이, 정제된 효소가 아르기닌과 라이신을 포함하는 발색기질인 D-Phe-Pipecolyl-Arg-pNA만을 강하게 가수분해 시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.

살모나제가 촉매하는 발색기질의 전환 정도는, 정제된 살모나제(0.2μg/ml) 25μl에 0.15M NaCl과 기질 25μl를 포함하는 20mM Tris-HCl(pH 7.5) 200μl를 첨가한 다음 다중채널(multi-channel) 분광광도게(SLT Instruments, model EAR 400, Germany)를 이용하여 405nm에서의 흡광도 변화로 측정하였다.

한편, 효소에 다이이소프로필 플루오로포스페이트(DFP)를 처리하여 화학적인 변화를 유도했을시 피브린 용해활성을 잃는 결과를 얻었다. 이는, 피브린 용해과정에 있어서의 관여할 것으로 예상되는 효능부위(active site)에 대한 정보를 제공하였으며, 이는 상기 발색기질을 이용한 실험결과에서도 일치함을 확인하였다. 제 8 도는 살모나제의 피브린 용해활성에 대한 DFP의 영향을 나타낸 폴리아크릴아마이드 전기영동 결과이다. 제 8 도에서, 제 1레인은 피브리노겐; 제 2레인을 살모나제로 처리한 피브리노겐; 및, 제 3레인은 살모나제와 DFP로 처리한 피브리노겐을 각각 나타낸다. 피브린 용해활성에 대한 DFP의 저해효과는 살모나제가 세린계 단백질 분해효소(serine protease)임을 시사해 주었다.

[실시예 5] 혈장(plasma) 구성성분들에 대한 영향

피브리노겐, 피브린, 알부민, 플라스미노겐 및 프로트롬빈 등과 같은 주요 혈장 단백질들에 살모나제를 첨가하여 37℃에서 한시간 동안 항온처리한 결과, 오로지 피브리노겐과 피브린만이 분해되는 것으로 나타났다[참조: 제 9도]. 제 9 도에서 제 1레인은 피브린; 제 2레인은 살모나제로 처리한 피브린; 제 3레인은 피브리노겐; 제 4레인은 살모나제로 처리한 피브리노겐; 제 5레인은 인간 혈장 알부민; 제 6레인은 살모나제로 처리한 인간 혈장 알부민; 제 7레인은 플라스미노겐; 제 8레인은 살모나제로 처리한 플라스미노겐; 제 9레인은 프로트롬빈; 및, 제 10레인은 살모나제로 처리한 프로트롬빈을 각각 나타낸다. 그리고 살모나제는 Aα사슬은 1분내에 절제하고, Bβ사슬은 좀 느린 절제를 하는 α 및 β 피브리노겐 분해효소임이 밝혀졌다. 이 효소는 3시간 항온처리 후에도 γ사슬에 대해서는 조금도 효과를 나타내지 않았다.

살모나제에 의한 피브리노겐의 특이적인 절제양식을 8 내지 25% 농도구배 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 통하여 분석하였다. 특이적인 피브리노겐 절제양식을 인간 피브리노겐 용액에 정제한 살모나제(2μg/ml)를 첨가하여 37℃에서 처리시간을 달리하여 항온처리함으로써 측정하였다[참조: 제 10도]. 제 10 도에서, 숫자는 각각 처리시간(1,2,3,5,10,20,30,40 및 60)을 분(min)으로 나타낸 것이며, 표시된 분자량 지표는 각각 인산화제(97.0kd), 소혈청 알부민(77.0kd), 오발부민(52.5kd), 카보닉 안하이드라제(32.4kd), β-락토글로블린(22.4kd) 및 리소자임(18.2kd)을 나타낸다.

[실시예 6] 혈장에서의 CaCl₂에 의한 피브린 용해 특이성

인체 혈장내에서 정제된 살모나제의 피브리노겐과 피브린에 대한 반응성을 조사하였다. 0.18ml의 사람혈장에 0.02ml의 250mM CaCl₂와 0.02ml의 살모나제를 농도별로 첨가한뒤 37℃에서 30분간 반응시킨 뒤 FDP(fibrinogen/fibrin degradation product)를 SPCI-Prest Kit(Diagnostica stago사, France)를 사용하여 측정하였다[참조: 표 3].

상기 표에서 (+), (++), (+++)는 FDP 형성 정도를 나타내며, (+)의 숫자가 증가할수록 FDP 형성이 증가함을 나타낸다.

상기 표 3에서 보듯이, CaCl₂가 포함된 상태에서는 피브린으로 부터 분해된 FDP가 0.1 내지 10³ng/ml까지 농도에서 측정이 되나, CaCl₂가 없는 경우에서는 FDP가 검출되지 않았다. 즉, CaCl₂가 없는 경우에는 피브린이 형성되지 않으므로 혈장에서는 피브린에 대해서만 선택적으로 작용함을 알 수 있었다.

[실시예 7] 투여량 결정

본 발명의 피브린 용해효소의 혈전증 치료제로서의 가능성을 점검하기 위하여 랫트를 가지고 투여량을 알아보는 약물학적 실험을 수행하였다. 투여량을 결정하기 위하여 챈들러의 고리법(Chandler's loop method)을 이용하여 50% 혈전용해 정도를 알아보았다[참조: Chandler et al., J. Exp. Physiol., XLIV, 377(1959)]. 이 방법은 실험실적(in vitro) 방법이기는 하지만, 체내(in vivo) 시험과 매우 유사한 결과와 양상을 보이므로 혈전용해 활성측정에 널리 사용되고 있는 방법이다.

우선, 건강한 성인으로부터 혈액을 채취한 뒤, 0.1부피의 3.85%(w/v) 구연산 나트륨(sodium citrate) 용액을 첨가하여 응고를 억제한 상태로 4℃에 사용시까지 보관하였다. 그 다음, 내경이 3mm이고 길이가 250mm의 폴리염화비닐 수지(polyvinylchloride resin)로된 튜브에 0.8ml의 상기 혈액과 0.1ml의 3% CaCl₂용액을 혼합하여 집어넣고, 37℃에서 30분간 경사각 60°, 회전속도가 약 17 내지 22rpm 정도로 회전시켜 응고를 야기시켰다. 이때 튜브에 응고된 혈전의 무게는 평균 23.3mg이었다.

그런다음, 0.1ml의 효소를 농도별로 집어넣고, 표준시료로 유로키나제를 상용하여 혈전용해 활성을 측정하였다[참조: 표 4].

이상의 결과에서 보듯이 살모나제의 50% 혈전용해도는 약 12μg/ml이었으며, 플라스민은 120μg/ml이었다. 이는 기존에 보고된 지렁이의 최고 활성효소(HH-65)[참조: USP 4,568,548, Mihara et al (1986)]의 50% 혈전용해도 86μg/ml 보다도 약 7.2배가 강한 활성을 보이고 있는 것이다.

[실시예 8] 급성독성

실시예 1에서 정제한 살모나제를 검체로 사용하여 주령이 6 내지 7주된 Balb/c 마우스(수컷: 20±2.0 그램)를 이용하여 급석독성을 조사하였다. 실험동물들은 실온 24±2℃, 습도 65±5%조건에서 고형사료 및 물을 자유롭게 섭취시켰다. 마우스 10마리씩을 단위로 주사기를 이용 생식기에 0.1ml씩 직접 주사한 후 7일간 중독중상 및 생사여부를 기록하였으며, LD₅₀는 베렌스-케바르(Behrens-Karbar)법에 의해 구하였다[참조: 표 5].

살모나제를 정맥에 주사한 급성독성결과 25mg/kg 이상 투여시 전례가 사망하였으며, LD₅₀는 모두 24.6mg/kg으로 나타났다. 상기 시험결과로 부터 알수 있듯이, 본 발명의 살모나제 급성독성은 무시해도 좋을 정도였다. 실제로 50% 혈전용해도는 12μg/ml이며, 이는 약 0.6mg/kg에 해당하므로, 약 40배 이상의 농도를 투여하여야만 50% 치사량이 될 것으로 추정되었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증되었듯이, 한국산 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)로 부터 정제된 본 발명의 피브린 용해효소는 그 피브린 용해활성이 우수함은 물론, 독성은 무시할 수 있을 정도였으므로 혈전증 치료제로서의 응용이 기대되는 유용한 물질임이 판명되었다.

Claims

한국산 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)로부터 분리된 다음과 같은 특징을 가지는 피브린 용해효소:

(i) SDS-플로아크릴아미드 젤 전기영동에 의해 결정된 분자량은 16,000 내지 17,000 달톤이며, 젤 여과 크로마토그래피에 의해 결정된 분자량은 31,000 내지 33,000 달톤이고;

(ii) pI 값이 4.6인 산성 단백질이며;

(iii) 2mM CaCl₂의 존재하에서 활성이 증가하고, 2mM ZnCl₂또는 10mM EDTA에 의해서는 활성이 완전히 저해되고;

(iv) 최대 활성을 나타내는 최적 pH는 7.5이며;

(v) 최대 활성을 나타내는 최적 온도는 37℃이고;

(vi) 아르기닌과 라이신을 포함하는 발색기질인 D-Phe-Pipecolyl-Arg-pNA를 강하게 가수분해시키며;

(vii) 다이이소프로필 플루오로포스페이트(DFP)에 의해 용해활성이 저하되는 세린계 단백질 분해효소이고; 및,

(viii) 알부민, 플라스미노겐 및 프로트롬빈의 혈장단백질을 가수분해하지 않으며서 피브리노겐과 피브린에 대해 친화성을 가진다.
한국산 살모사(Agkistrodon halys)로부터의 독성를 친화성, 이온교환 및 젤 여과 크로마토그래피를 포함하는 공정에 의해 정제하여, 제1항의 피브린 용해효소를 제조하는 방법.
제2항에 있어서,친화성 크로마토그래피는 벤즈아미딘-세파로즈를 수지로 채용하는 방법.
제2항에 있어서, 이온교환 크로마토그래피는 DEAE-세파로즈(FP) EH는 FPLC 모노컬럼을 채용하는 방법.
제2항에 있어서, 젤 여과 크로마토그래피는 세파크릴 S-100을 수지로 채용하는 방법.
제1항의 피브린 용해효소를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 혈전층 치료제 조성물.