KR100272933B1

KR100272933B1 - Ｄｎａ함유 제품의 제조방법

Info

Publication number: KR100272933B1
Application number: KR1019990023961A
Authority: KR
Inventors: 임용빈
Original assignee: 김필동; 주식회사스타진
Priority date: 1998-06-24
Filing date: 1999-06-24
Publication date: 2000-11-15
Also published as: KR19990078599A

Abstract

본 발명은 DNA 함유 제품의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 공여자로부터 DNA를 함유하는 시료를 얻는 단계; 상기 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 추출된 DNA를 증폭하는 단계; 증폭된 DNA 함유 용액을, 선택적으로 건조시킨 후, 일정한 형태를 갖는 제품내에 형성된 공간에 주입하고 밀폐하거나, 일정한 형태를 갖지 않는 제품과 혼합하는 단계를 포함하여 이루어지는 DNA 함유 제품의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 의하면 공여자만의 차별화된 캐릭터를 독특하게 표현할 수 있으며, 오랫동안 간직할 수 있는 보존성이 우수한 DNA 함유 제품을 얻을 수 있다.

Description

ＤＮＡ 함유 제품의 제조방법{METHOD OF PREPARING OBJECTS CONTAINING DNA}

DNA는 세포핵 염색체의 기초 물질로서 각종 유전 정보를 보유하고 있어 의학분야 및 생명공학분야의 중요한 연구 대상으로 검토, 분석되고 있다. 그러나, 생명체로부터 분리되는 DNA는 소량에 불과하므로 이를 연구하기 위해서는 DNA 중 어떤 특정 서열을 다량 증폭하는 과정이 필요하며, 이에 이용 가능한 다양한 방법 및 장치들이 공지되어 있다.(Mulis, K. et al, Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 263-273, 1986; 미합중국 특허 제4,683,195호, 제4,683202호, 제4,889,818호, 대한민국 특허 제126,231호 등)

본 발명자들은 DNA가 그 공여자만의 차별화된 캐릭터를 독특하게 표현할 수 있는 물질임을 감안하여, 공여자의 캐릭터를 휴대하고자 하는 수요가 있는 다양한 제품에 DNA를 주입 또는 혼합함으로써, 보존성이 뛰어나고 미관이 유려한 DNA 함유 제품을 얻을 수 있다는 사실을 알아내어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 DNA의 추출, 증폭 등의 기술을 이용하여 악세사리, 음반, 문구류, 향수 등의 여러 제품에 공여자의 특징을 나타내는 DNA를 주입 또는 혼합하여, DNA를 함유하는 제품을 제조하는 방법을 제공하는 데에 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따라 DNA 용액 및 HLA DNA 밴드 스트립를 함유하도록 장식된 열쇠고리 제품을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 다른 실시 형태에 따라 장식된 목걸이 제품을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 또 다른 실시 형태에 따라 장식된 목걸이 제품을 나타낸 것이다.

※도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명

1: 열쇠 고리 2: HLA DNA 밴드 스트립

3: DNA 공여자의 사진 4: 실크인쇄된 싸인

5: DNA 용액 6: 물

10, 20: 목걸이

이를 위하여 본 발명의 일 실시형태에 의하면, 공여자로부터 DNA를 함유하는 시료를 얻는 단계; 상기 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 추출된 DNA를 증폭하는 단계; 증폭된 DNA 함유 용액을, 선택적으로 건조시킨 후, 일정한 형태를 갖는 제품내에 형성된 공간에 주입하고 밀폐하는 단계를 포함하여 이루어지는 DNA 함유 제품의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 다른 실시형태에 의하면, 공여자로부터 DNA를 함유하는 시료를 얻는 단계; 상기 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 추출된 DNA를 증폭하는 단계; 증폭된 DNA 용액을, 선택적으로 건조시킨 후, 일정한 형태를 갖지 않는 제품과 혼합하는 단계를 포함하여 이루어지는 DNA 함유 제품의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 의하면, 공여자로부터 DNA를 함유하는 시료를 얻는 단계; 상기 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 추출된 DNA를 증폭하는 단계; 증폭된 DNA를 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시키는 단계; 전기영동된 DNA를 염색하여 가시화하는 단계; 겔을 건조시켜 필름상으로 만드는 단계; 및 얻어진 필름상의 겔을 일정한 형태를 갖는 제품상에 적용하는 단계를 포함하여 이루어지는 DNA 함유 제품의 제조방법이 제공된다.

나아가, 본 발명의 또 다른 실시형태에 의하면, 공여자로부터 혈액 시료를 얻는 단계; 상기 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 추출된 DNA를 증폭하는 단계; 증폭된 DNA로 HLA DNA 밴드 스트립을 제조하는 단계; 제조된 HLA DNA 밴드 스트립을 일정한 형태를 갖는 제품상에 적용하는 단계를 포함하여 이루어지는 DNA 함유 제품의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 방법에 사용될 DNA의 공여자는 인간을 포함하여 DNA를 가진 모든 생물이 될 수 있다. DNA 함유 제품의 수요를 감안할 때, 연애인, 스포츠 스타, 종교 지도자, 정치지도자, 작가 등 유명인이 DNA 공여자로 되는 것이 바람직하고, 가족이나 특정 집단의 구성원, 애완 동물 등이 DNA의 공여자가 되는 것도 또한 바람직하다.

DNA 공여자가 인간인 경우, DNA 시료로는 혈액, 체모, 피부조직, 손톱 등 신체의 어떤 부분, 또는 신체에서 얻을 수 있는 모든 DNA 함유 가검물을 사용할 수 있다.

시료 종류에 따라 방법상 약간의 차이가 있기는 하나, 모두 공지의 방법으로 DNA를 추출, 회수할 수 있다.(Buffone 등, Isolation of DNA from biological specimens without extraction with phenol. Cln. Chem. 31: 164-165, 1985) 혈액을 예로 들면, EDTA 혈액과 RBC 용해 완충용액과의 혼합물에 원심분리 등을 실시하고, 얻어진 잔사를 Chelex 수지와 혼합, 끓여 추출할 수 있다.

본 발명에 따라 DNA 함유 제품을 제조할 때 자연 상태의 전체 DNA를 사용할 수도 있지만, 그 양이 소량이므로 증폭하여 사용하는 것이 바람직하다.

DNA 증폭은 단순히 PCR(polymerase chain reaction) 공정에 의하여 행할 수도 있고, PCR(polymerase chain reaction)에 의한 1차 DNA 증폭 및; 1차 증폭된 DNA를 벡터에 삽입하여 재조합 플라스미드를 얻고, 이를 숙주 생물에 도입하여 형질 전환시킨 후, 형질 전환된 숙주 생물을 배양하여, 생성된 재조합 플라스미드를 대량 분리하는 2차 DNA 증폭 과정을 거쳐 행할 수도 있다.

PCR 공정은, 예를 들어 Mulis 등의 방법을 이용하여, 통상의 PCR 기기를 사용하여 실시할 수 있다. 보다 간단하게 유전자 키트(Inno-lipa사제 HLA Genotyping kit)를 사용하여 증폭할 수도 있다.

플라스미드를 이용한 2차 증폭시에는, 먼저 증폭된 DNA를 TA 클로닝 키트(Invitrogen사 제품)를 사용하여 벡터에 클로닝한다. 클로닝 키트를 사용하지 않는 경우에는 다음과 같이 벡터 클로닝할 수 있다. 증폭된 DNA에 T4 DNA 폴리머라아제를 넣되 dNTP는 넣지 않고 15분간 반응시키고, dNTP는 넣고 15분간 반응시켜, DNA를 양 끝에 돌출되어 있는 T와 A(한 쪽에 하나씩 돌출)가 제거된 블런트 말단(blunt end)으로 만든다. 벡터도 SmaI와 같은 블런트 말단 제한 효소로 절단하고, 블런트 말단이 된 상기 DNA를 T4 DNA 리가아제를 사용하여 벡터에 결찰(ligation)하여 제조합 플라스미드를 얻는다.

클로닝된 플라스미드는 적당한 숙주세포에 도입하여 대량 분리할 수 있다. 숙주세포로는 E.콜라이 HB 101, E.콜라이 CSH 41 등을 사용할 수 있으며, 본 발명에 의한 플라스미드가 도입되어 형질 전환된 숙주세포를 LB(Luria broth) 배지 등에서 배양하여, Birnboin & Doly (1979) 등의 방법에 따라 플라스미드를 추출, 분리할 수 있다.

증폭된 DNA는 용액 상태로 이를 바로 일정한 형태를 갖는 제품내에 형성된 공간에 주입하고 밀폐하여 DNA 함유 제품을 얻을 수 있다. 혹은 DNA 용액을 건조하여 겔 또는 고체상태로 만든 후 주입하는 것도 가능하다. DNA 용액 또는 건조된 DNA는 시각적 효과를 높이기 위해서 염색하여 제품에 삽입할 수 있다.

예를 들어, DNA 용액은 브로모페놀블루, 페놀 레드 등의 염색시약을 첨가하여 염색할 수 있고, 나아가 글리세롤 등과 혼합하여 제품에 주입할 수 있다.

본 발명에서 일정한 형태를 갖는 제품이란, 고정된 형상과 모양을 가지는 물건을 의미한다. 예를 들어, 인형 등의 완구류, 장식품, 열쇠고리, 목걸이, 귀걸이 등의 악세사리류, CD 등의 음반류, 포장상자, 서적, 필기도구, 필통 등의 도서·문구류, 스포츠용품, 가방류, 의류, 신발류 등이 이에 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제품내 DNA가 주입될 공간은 통상의 방법에 따라 형성될 수 있으며, DNA가 염색된 경우 장식효과를 증대시기키 위해서 DNA가 삽입되는 제품 부분은 투명 재질을 사용하는 것이 바람직하다. 투명 재질에 의하여 의하여 형성되는 모양은 다양하게 선택할 수 있다. 나아가, DNA 함유 제품에 DNA가 함유되어 있음을 특징적으로 나타내는 일반적인 DNA의 이중나선 그림, DNA 공여자의 싸인 및 사진 등을 부가할 수도 있다.

본 발명의 다른 실시형태에 따라, 증폭된 DNA 용액을, 선택적으로 건조시킨 후, 일정한 형태를 갖지 않는 제품과 혼합하여 DNA 함유 제품을 제조하는 것도 가능하다. 본 발명에서 일정한 형태를 갖지 않는 제품이란, 고정된 형상과 모양이 없는 액체, 분말 등을 의미한다. 예를 들어, 향수 등의 화장품류가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 따라, 증폭된 DNA를 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨 후, 염색하여 가시화하고, 겔을 건조시켜 필름상으로 만든 후, 일정한 형태를 갖는 제품상에 적용함으로써 DNA를 함유하는 제품을 얻을 수 있다.

DNA 추출 시료로 혈액시료를 사용한 경우에는 HLA(Human Leukocyte Antigen) DNA 밴드 스트립을 제작하여 일정한 형태를 갖는 제품상에 적용함으로써 DNA를 함유하는 제품을 얻을 수도 있다. HLA DNA 밴드 스트립은 DNA 공여자만이 갖는 특징을 가시화하는 효과가 있다.

HLA DNA 밴드 스트립은 다음과 같이 제작할 수 있다. 혈액 시료에서 추출된 DNA를 PCR을 통하여 증폭하고 예를 들어, Inno-lipa사에서 제공된 키트 스트립과 반응시킨다. 스트립에는 백혈구의 여러 부위를 확인할 수 있는 프로브가 일정한 간격으로 흡착되어 있어, 추출된 DNA에 대응하는 서열을 가진 프로브는 해당 DNA와 염기쌍을 이루어 결합한다. 염기쌍을 이룬 이중 나선 구조의 DNA와 반응하여 발색되는 시약을 첨가하면 결합된 부위가 색을 나타내게 되는데 사람마다 특이적인 DNA 염기 서열을 가지므로 다양한 형태의 스트립 밴드를 볼 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 DNA 함유 제품은, 공여자의 고유 특징물인 DNA를 함유하고 있으므로, 공여자인 유명인, 가족, 연인, 애완동물 등을 기억하는 기념품으로서 의의가 있다. 따라서, 장례용품, 혼수용품, 종교예물 등으로 이용할 수 있다.

한편, DNA의 성질상, 본 발명에 따라 제조된 제품에 함유된 DNA는 장기간 변화없이 보존될 수 있다. 따라서, 일정 기간이 지난 후 본 발명에 따른 제품에 함유된 DNA와 신원 조회 대상자의 DNA를 비교함으로써, 신원조회 대상자가 본 발명에 따른 제품 제조시 DNA를 제공하였던 공여자와 동일인인지 혹은 일정한 가족 관계에 있는지 여부를 확인하는데도 사용할 수 있다. 이러한 목적으로, 예를 들어, 본 발명의 방법에 따른 DNA를 함유하는 각종 카드를 제작할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위하여 제공하는 것일 뿐, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

<DNA의 추출·입수>

DNA의 공여자로부터 EDTA 코팅된 튜브에 전혈 3ml를 채취하여, 2-8℃로 냉장보관하였다.

멸균된 1.5ml 마이크로원심분리 튜브에 EDTA 혈액 50㎕, RBC 용해 완충용액을 가하고 잘 혼합하였다. 13,000rpm으로 1분간 원심분리하여 침사를 얻었다. 침사를 500㎕ 멸균 증류수로 세척하였다. RBC가 잔존하는 경우, 원심분리 및 세척 과정을 반복하였다. 세척된 침사에 Chelex 수지 200㎕를 넣고 잘 풀어 주었다. 10분간 끓인 후, 원심분리하여 상층액 10㎕를 DNA 증폭에 사용하였다. 10분간 끓인 후 냉장 상태로 식힌 다음 다시 10분간 끓이는 것을 반복할 수 있다.

하기의 조성으로 증폭 혼합물을 준비하였고, 하기 조건에서 PCR 기기(Inno-lipa사 제품, HLA Genotyping kit)를 사용하여 DNA를 증폭시켰다.

I. 증폭 혼합물(총 50㎕)

증폭 완충용액	10㎕(dATP mix 포함)
프라이머 혼합물	10㎕
MgCl₂	10㎕
Taq 효소(5unit/ml)	0.6㎕
추출된 DNA	5.0㎕
ddH₂O	14.4㎕

II. PCR 조건

95℃	5분	1주기
95℃	20초	30 주기
55℃	20초
72℃	30초
72℃	10분	1주기

<전처리>

1. HLA DNA 밴드 스트립 제조

증폭된 DNA로부터 HLA 키트(Inno-lipa사제)를 사용하여 HLA DNA 밴드 스트립을 제조하였다.

2. DNA 삽입물 제조

증폭과정에서 증폭된 DNA를 TA 클로닝 키트(Invitrogen사제)를 이용하여, 벡터에 클로닝한 후, 클로닝된 플라스미드를 대량 분리하였다. 대량분리시 균주로는 E. 콜라이 HB101를 사용하고, 균주 배양 조건은 37℃에서 18시간동안 진탕배양(shaking incubation)하였다. 일반적으로 사용되는 LB(Luria broth) 배지를 제조하여 일차 HB101 세균을 하룻밤 배양한 뒤, 500ml LB에 1/100 희석한 배양 세균을 다시 접종하여 배양하였다. 플라스미드 분리는 다음과 같이 실시하였다(Birnboin & Doly, 1979). 플라스미드 DNA를 갖는 대장균(대장균 HB101)을 37℃에서 18시간동안 배양하고, 플라스미드 분리시약 SolI[50mM 글루코오스, 25mM Tris·Cl(pH 8.0), 10mM EDTA(pH 8.0)], SolⅡ[0.2N NaOH, 1% SDS], SolⅢ[5M 아세트산 칼륨 60ml, 빙초산(glacial acetic acid) 11.5ml, H₂O 28.5ml]를 차례로 첨가한 후, 부드럽게 혼합하고, 14000rpm으로 10분간 원심분리 후, 상층액을 모아 페놀:클로로포름(1:1) 용액을 동량 섞고 강하게 혼합하였다. 이를 다시 원심분리 및 상층액 수집하고, 상기 과정을 2 내지 3회 반복하여 깨끗한 상층액만을 취한 후, 에탄올(100%)을 2배(체적) 첨가하여 10분간 냉동고에 정치하였다. 이를 원심분리 한 후, 상층액을 제거하고 건조시켜, 70% 에탄올 1ml로 1회 세척하고, 건조하여 TE 완충액으로 DNA를 용해시키고 냉동고에 보관 뒤 사용하였다.

분리된 DNA에 글리세롤, 브로모페놀블루를 첨가하였다.

<후처리>

안쪽 부분이 오목한 지름 5cm, 두께 0.5cm의 원형 아크릴판 두 개(한 개는 액체 주입부 및 고리 연결부를 갖는다)를 통상의 방법으로 제조하여, 도 1에서와 같은 배치로 HLA DNA 밴드 스트립(측면 부착), DNA 공여자의 사진 및 실크인쇄된 싸인을 넣은 후, 아크릴 양면을 스프레이 강력 접착하였다. 액체 주입부를 통해 전처리 과정에서 제조된 DNA 용액을 가득 채우고, 이를 막았다. 양면이 같은 모양으로 되도록 제작하며, 전체 두께는 1cm로 하였다. 고리 연결부에 열쇠고리를 끼워 악세사리를 완성하였다.

실시예 2

<DNA의 추출·입수>

DNA의 공여자의 머리카락의 모근 부위를 5mm 크기로 절단하였다. 절단된 모근을 1.5ml 튜브에 넣고 DNA를 제외한 기타 세포 파쇄물을 제거하기 위하여 200㎕의 수지(chelex resin)를 넣은 후, 10분간 끓였다. 이어, 12,000rpm에서 원심분리하여 분리된 상층액을 DNA 증폭에 사용하였다.

하기의 조성으로 증폭 혼합물을 준비하였고, 하기 조건에서 PCR 반응시켜 DNA를 증폭시켰다.

I. 증폭 혼합물(총 50㎕)

증폭 완충용액[Tris·Cl(pH 9.0),AMS, BSA, MgCl₂]	5㎕
프라이머 혼합물[D17S695, D21S11,NerR, hTPO]	4㎕
dNTP	1㎕
Taq 효소(5unit/ml)	0.6㎕
추출된 DNA	5.0㎕
ddH₂O	34.4㎕

II. PCR 조건

<전처리>

1. DNA 함유 폴리아크릴아미드겔 필름의 제조

10% 폴리아크릴아미드 겔을 준비하여 증폭된 DNA를 로딩하였다. 200V의 전류를 인가하여 겔상의 DNA를 전기영동시켰다. 전기영동이 완료되면, 겔을 0.4% 질산은 수용액에 30분 침지시켜 DNA를 염색하였다. 염색 후 겔의 상하면에 셀로판지를 놓고 건조시켜, 빳빳한 필름상의 DNA 함유 겔(두께 1mm, 길이 3cm)을 얻었다.

2. DNA 삽입물 제조

상기 증폭과정에서 얻어진 DNA 용액에 글리세롤, 페놀레드를 첨가하여 DNA 삽입물을 제조하였다.

<후처리>

HLA DNA 밴드 스트립 대신 상기 제조된 DNA 함유 폴리아크릴아미드겔 필름을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 DNA를 함유하는 열쇠고리 장식품을 제조하였다.

Claims

공여자로부터 DNA를 함유하는 시료를 얻는 단계;

상기 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;

추출된 DNA를 증폭하는 단계;

증폭된 DNA를 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시키는 단계;

전기영동된 DNA를 염색하여 가시화하는 단계;

겔을 건조시켜 필름상으로 만드는 단계; 및

얻어진 필름상의 겔을 일정한 형태를 갖는 제품상에 적용하는 단계를 포함하여 이루어지며, 상기 제품이 완구, 악세사리, 장식품, 음반류, 도서문구류, 포장상자, 스포츠용품, 신발, 가방, 의류, 카드, 사진, 기념품, 예술품, 장례용품, 혼수용품 또는 종교예물에 속하는 제품임을 특징으로 하는 DNA 함유 제품의 제조방법.
공여자로부터 혈액 시료를 얻는 단계;

상기 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;

추출된 DNA를 증폭하는 단계;

증폭된 DNA로 HLA DNA 밴드 스트립을 제조하는 단계;

제조된 HLA DNA 밴드 스트립을 일정한 형태를 갖는 제품상에 적용하는 단계를 포함하여 이루어지며, 상기 제품이 완구, 악세사리, 장식품, 음반류, 도서문구류, 포장상자, 스포츠용품, 신발, 가방, 의류, 카드, 사진, 기념품, 예술품, 장례용품, 혼수용품 또는 종교예물에 속하는 제품임을 특징으로 하는 DNA 함유 제품의 제조방법.