KR100269671B1 - 면역 검출법을 이용한 hiv의 감염 억제 활성 물질의 검색방법 및 그에 사용되는 변이단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 HIV의 감염 억제 활성 물질을 신속하고 경제적이며 안전하게 검색하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 HIV의 세포막 융합 단백질인 gp41의 기능이 저해되면 HIV 감염이 억제되며, gp41의 기능은 이 단백질 내의 두 나선 구조간의 상호 작용에 의존한다는 특성을 이용하였다. 본 발명의 검색 방법은 gp41의 두 나선 부위인 아미노 말단 나선 부위 및 카복시 말단 나선 부위를 각각 결합시켜 제조한 변이 단백질인 Trx-N 및 GST-C의 상호 작용을 이용하여 면역 검출법에 의해 gp41의 활성 억제 물질을 검색하는 것이다. 이 방법은 검색의 자동화를 가능하게 하여 기존에 알려진 수많은 화합물 또는 천연물질의 HIV 감염 억제 활성을 조사할 수 있으므로 HIV의 치료제 개발에 큰 기여를 할 것이다.
Description
본 발명은 면역 검출법을 이용한 HIV의 감염 억제 활성 물질의 검색 방법에 관한 것으로, 더욱 특별하게는 후천성 면역 결핍증 (AIDS) 치료제 개발을 위하여 HIV의 감염을 수행하는 단백질인 gp41의 작용을 억제하는 물질을 기존의 방법보다 경제적이며, 신속하고, 안전하게 검색하는 방법의 개발에 관한 것이다.
HIV의 감염은 바이러스의 외피막 (envelope membrane)에 존재하는 gp120과 gp41이라는 두 종류의 단백질에 의하여 매개된다. 이중 gp120은 감염될 세포를 인식하여 초기 결합을 유발하고 gp41은 바이러스의 외피막과 감염되는 세포의 세포막간의 융합을 일으킨다.
이들 단백질의 3차 구조는 아직 알려져 있지 않으나, 1차 구조의 분석을 통하여 gp41은 도 1에 도시한 바와 같이 세포막과 상호 작용을 할 수 있는 융합 펩타이드(FP), 아미노 말단의 나선 구조(N-αH), 카복시 말단의 나선 구조(C-αH), 세포막 투과 부위(TM) 그리고 세포질내에 존재하는 부위 등으로 구성되어 있다는 것이 확인되었다. 도 1에서 융합 펩타이드 FP는 검정 사각형으로, 두 나선 부위 N-αH와 C-αH는 회색 사각형으로, 그리고 세포막 투과 부위 TM은 검정사각형으로 표시되어 있다.
gp41의 세포막 외부의 두 나선 구조를 이루는 부위에서 유래된 펩타이드들은 서로 강한 상호 작용으로 결합하여 각 나선이 3개씩 결합한 6개의 나선으로 구성된 매우 안정된 결합체를 이룬다 (참조: Chan et al., Cell 89, 263-273, 1997). 이러한 두 나선 부위간의 상호 작용은 gp41 단백질의 구조적 안정성 또는 기능에 중요한 역할을 할 것으로 추정된다. 따라서, 이들 gp41 단백질의 두 나선 구조간의 상호 작용을 저해하는 물질은 gp41의 작용을 억제하여 HIV의 감염을 방해하여 AIDS 치료제로 이용될 수 있을 것이다.
이러한 억제 활성을 갖는 물질의 예로 gp41의 두 나선 부위에서 유래된 펩타이드들을 들 수 있다 (참조: Wild et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9770-9774, 1994). 이 펩타이드들은 gp41의 두 나선 부위 중 하나에 결합하여 두 나선 부위간의 결합 또는 상호 작용을 저해함으로써 결과적으로 gp41의 기능을 억제하고 HIV의 감염을 저해할 수 있다. 따라서, gp41의 두 나선 부위의 상호 작용을 쉽게 측정하는 방법을 개발하면 이를 이용하여 이들의 상호작용을 억제하는 활성을 갖는 물질, 즉 HIV의 감염을 억제함으로써 AIDS 치료제로 이용될 수 있는 물질을 검색할 수 있을 것이다.
기존의 gp41의 기능을 억제하는 물질을 검색하는 방법은 gp120의 수용체가 발현되는 동물 세포를 배양하고 gp120과 gp41의 유전자를 갖는 박시니아(vaccinia) 바이러스 또는 HIV로 감염시킨 후 감염된 세포간의 세포 융합을 일으키는 체계를 이용한다(참조: Nussbaum et al., J. Virol. 68, 5411-5422, 1994). 이때 gp41의 기능에 영향을 줄 것으로 추정되는 물질의 활성은 이 물질이 HIV 또는 박시니아 바이러스에 감염된 세포간의 세포막 융합을 억제하는 효과를 조사함으로써 후보 물질의 활성을 측정한다. 이러한 방법은 다음과 같은 어려움이 있다. 첫째, 이 방법은 복잡하고 까다로우며 유지 비용이 많이 소요되는 동물 세포의 배양을 필요로 한다. 둘째, 살아있는 HIV 또는 박시니아 바이러스를 이용하기 때문에 실험자가 유해한 바이러스에 노출되어 감염될 염려가 있고 이를 방지하기 위한 고가의 특수 시설이 필요하다. 셋째, 세포 배양에 오랜 시간이 소요되고 세포 배양시 처리 단계가 많이 요구되므로 수많은 화합물을 대상으로 gp41 단백질에 대한 억제 활성을 검색하는 것이 불가능하다. 즉, 기존의 gp41의 활성 억제 물질을 검색하는 방법은 고비용과 특수 시설이 요구되며 오랜 검색 시간이 요구된다. 따라서, 기존의 화합물에서 gp41의 활성 억제제를 검색하기 위해서 안전하고, 비용이 적게 들며, 조작이 간단하고 단시간 내에 활성의 측정이 가능한 검색 방법의 개발이 요구되고 있다.
따라서, 본 발명은 종래의 gp41의 활성 억제 물질을 검색하는 방법들이 가지고 있는 문제점들을 감안하여 이루어진 것으로, HIV의 감염 억제 활성 물질을 신속하고 경제적이며 안전하게 검색하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 gp41과 두 변이 단백질 (Trx-N과 GST-C)의 구조도.
도 2는 겔 크로마토그래피법에 의해 Trx-N과 GST-C간의 결합을 측정한 결과를 나타낸 그래프.
도 3은 Trx-N과 GST-C의 결합을 효소를 이용한 면역 검출 방법으로 측정하는 방법을 도시한 도식.
도 4는 본 발명의 면역 검출법의 특이성을 나타낸 그래프.
도 5는 본 발명의 면역 검출법을 이용하여 측정된 HIV 감염 억제 펩타이드의 활성을 나타내는 그래프.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위하여 예의 연구를 계속한 결과, gp41의 두 나선 부위인 아미노 말단 나선 부위 및 카복시 말단 나선 부위를 각각 결합시켜 제조한 변이 단백질인 Trx-N 및 GST-C의 상호 작용을 이용하여 gp41의 활성 억제 물질을 검색할 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 방법은 상기와 같은 변이 단백질을 제조한 후 이들 변이 단백질의 상호 작용을 측정하여 변이 단백질에 gp41의 두 나선 부위간의 상호작용이 존재함을 확인하고, 이러한 상호작용을 갖는 두 개의 변이 단백질을 이용한 면역 검출법을 개발하여 HIV 감염 억제 활성을 갖는 물질을 검색하는 것으로 이루어진다.
이하에서 본 발명의 방법을 상세하게 설명한다.
(1) 변이 단백질의 준비
gp41의 두 나선 부위의 상호 작용을 모방하기 위하여 gp41의 두 나선 부위를 각각 상이한 단백질에 결합시킨 변이 단백질을 다음과 같은 방법으로 준비하였다. 먼저 gp41의 아미노 말단의 나선 부위(아미노산 545-595)에 해당하는 유전자를 HIV의 env 유전자가 있는 플라스미드에 삽입하여 PCR법으로 증폭한다. 증폭된 유전자를 유전자 재조합 기술을 이용하여 티오레독신 (Trx: thioredoxin)이 발현되는 발현 플라스미드 pTrxFus (미국 소재의 인비로겐사(Invirogen) 제품)의 티오레독신의 카복시 말단을 코딩하는 DNA에 연결하여 도 1에 도시한 바와 같은 티오레독신 변이 단백질 (이하 Trx-N이라 칭함)을 발현하는 플라스미드를 준비한다. 동일한 방법으로 gp41의 카복시 말단의 나선 부위 (아미노산 600-668)에 해당하는 유전자를 PCR법으로 증폭하여 글루타치온 트랜스퍼라제 (GST; Glutathione S-transferase; 스웨덴 소재의 파마시아사(Pharmacia) 제품)를 발현하는 플라스미드 pGEX-2T의 GST 단백질의 카복시 말단을 코딩하는 DNA에 연결하여 글루타치온 트랜스퍼라제 변이 단백질 (이하 GST-C이라 칭함)을 만드는 플라스미드를 준비한다. gp41의 각 부위들과 준비된 변이 단백질간의 관계는 도 1에 도시하였다. 두 변이 단백질을 대장균에서 발현시켜 이온 교환 크로마토그래피법 또는 글루타치온이 흡착된 수지를 이용한 크로마토그래피법으로 순수하게 분리한다. 분리된 단백질의 순도는 95% 이상인 것으로 확인되었다.
(2) 변이 단백질의 상호 작용의 측정
상기와 같이 준비된 두 변이 단백질간의 상호 작용의 여부를 크로마토그래피법으로 확인한다. 변형되지 않은 Trx와 GST는 상호 작용이 없으므로 혼합액을 겔 투과 크로마토그래피 (gel permiation chromatography)로 분석하였을 때 두 개의 독립된 피크로 검출되지만 상기 gp41의 두 나선 부위가 각각 포함된 GST-C와 Trx-N의 변이 단백질들을 혼합한 후 겔 크로마토그래피로 분석하였을 때에는 두 변이 단백질이 상호 작용을 하여 크기가 증가된 결합체의 피크가 검출된다 (도 2). 따라서, 이러한 결과는 gp41의 두 나선 부위간의 상호작용이 변형 단백질들에서도 존재함을 보여준다.
(3) 변이 단백질을 이용한 면역 검출법의 개발
상기 준비된 두 변이 단백질의 상호 결합을 이용하여 면역 검출법을 수행한다. 이 면역 검출법은 Trx-N 변이 단백질을 플라스틱 세포 배양 용기의 표면에 흡착시킨 후 GST-C를 첨가하는 단계, Trx-N 단백질에 결합하지 않은 GST-C 단백질을 제거한 후 GST에 선택성이 있는 1차 항체(항-GST Ab)를 첨가하는 단계, GST-C 단백질에 결합하지 않은 1차 항체를 제거한 후 1차 항체를 인식하는 2차 항체(항-Goat Ab)를 첨가하는 단계, 1차 항체에 결합하지 않은 2차 항체를 제거한 후 퍼옥시다제의 기질인 퍼옥사이드 (H2O2)와 OPD(o-페닐렌디아민)를 가하는 단계, 및 상기 2차 항체에 화학적으로 결합된 퍼옥시다제에 의해 산화된 OPD의 발색을 측정하는 단계로 이루어진다.
도 3에 도시한 바와 같이 먼저 Trx-N 변이 단백질을 플라스틱 세포 배양 용기의 표면에 흡착시킨 후 GST-C를 첨가한다. 이때 수용액 상의 GST-C 변이 단백질은 용기 표면에 흡착된 Trx-N 단백질에 결합하게 된다. Trx-N 단백질에 결합하지 않은 GST-C 단백질을 제거한 후 GST에 선택성이 있는 1차 항체(항-GST Ab)를 첨가하여 Trx-N 단백질에 결합한 GST-C 단백질을 인식하게 한다. 이어서, GST-C 단백질에 결합하지 않은 1차 항체를 제거한 후 1차 항체를 인식하는 2차 항체(항-Goat Ab)를 첨가하여 GST-C 단백질에 결합된 1차 항체에 결합시킨다. 1차 항체에 결합하지 않은 2차 항체를 제거한 후 퍼옥시다제의 기질인 퍼옥사이드 (H2O2)와 OPD(o-페닐렌디아민)를 가하여 상기 2차 항체에 화학적으로 결합된 퍼옥시다제에 의해 산화된 OPD의 발색을 측정함으로써 두 변이 단백질의 결합을 측정한다.
(4) 면역 검출법을 이용한 HIV 감염 억제 활성을 갖는 물질의 검색
본 발명의 면역 검출법이 gp41의 기능을 저해하여 HIV의 감염을 억제하는 물질을 검색하는데 이용될 수 있는 가능성을 조사한다.
HIV 감염을 억제하는 활성을 갖는 물질의 검색은 Trx-N 변이 단백질을 플라스틱 세포 배양 용기의 표면에 흡착시킨 후 GST-C 및 검색 대상 물질을 첨가하는 단계, Trx-N 단백질에 결합하지 않은 GST-C 단백질을 제거한 후 GST에 선택성이 있는 1차 항체(항-GST Ab)를 첨가하는 단계, GST-C 단백질에 결합하지 않은 1차 항체를 제거한 후 1차 항체를 인식하는 2차 항체(항-Goat Ab)를 첨가하는 단계, 1차 항체에 결합하지 않은 2차 항체를 제거한 후 퍼옥시다제의 기질인 퍼옥사이드 (H2O2)와 OPD(o-페닐렌디아민)를 가하는 단계, 상기 2차 항체에 화학적으로 결합된 퍼옥시다제에 의해 산화된 OPD의 발색을 측정하는 단계, 및 검색 대상 물질 비첨가시의 OPD 발색과 상기 측정치를 비교하는 단계로 이루어진다.
gp41의 카복시 말단의 나선 부위의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 매우 효과적인 HIV 감염 억제 활성이 있는 것으로 알려졌다. 이들은 약 1 nM - 1 μM의 농도에서 HIV 감염을 억제하는 활성을 갖는다. 이러한 감염 억제 활성은 이 펩타이드가 gp41의 두 나선 구조간의 상호작용을 방해함으로써 gp41의 안정성을 저하시키거나 세포막 융합에 필요한 gp41의 구조 변화를 억제함으로써 HIV의 감염을 억제한다고 추정된다 (참조: Weissenhorn et al., Nature 387, 426-430, 1997). 이 경우 gp41의 나선 부위에서 유래된 펩타이드는 gp41의 두 나선 부위를 각각 갖는 GST-C와 Trx-N 단백질간의 상호 작용을 억제할 것이며 고안된 면역 검출법으로 그 억제 활성을 쉽게 측정할 수 있을 것이다.
본 발명의 검색 방법은 기존의 방법에 비하여 다음과 같은 장점을 가진다. 첫째, 이 방법은 간단하고 손쉽게 조작할 수 있으며 적은 비용이 소요된다. 둘째, 단백질을 이용하기 때문에 기존의 방법에 이용되는 살아있는 HIV 또는 박시니아 바이러스에 감염될 염려가 없으므로 안전하게 HIV 감염 역제 활성을 측정할 수 있다. 셋째, 다수의 화합물의 gp41 억제 활성을 동시에 측정할 수 있으므로 많은 화합물을 검색할 수 있다. 즉, 기존의 gp41의 활성 억제 물질을 검색하는 방법에 비해 저비용이며, 안전하고 다수의 화합물을 단시간 내에 검색할 수 있다.
또한, 본 발명의 검색 방법은 HIV 이외의 다른 바이러스성 질환에도 응용할 수 있다. 폐렴, 홍역을 일으키는 바이러스는 HIV의 gp41과 같이 세포막 융합을 하는 단백질이 존재하며 이들은 gp41과 유사한 구조와 기작을 갖는 것으로 추정된다 (참조: Lambert et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 93, 2186-2191, 1996). 특히 이러한 단백질의 세포막 외부 부위의 세포막 투과 부위 직전의 나선 부위를 갖는 펩타이드는 바이러스의 감염을 억제하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 명세서에서 기술된 방법의 원리를 이용하여 특정 바이러스의 감염을 억제하는 물질을 검색하는 방법을 개발할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명의 면역 검출법을 이용하여 HIV의 감염 억제 물질의 자동 검색 방법을 개발할 수 있다. 즉, gp41의 두 나선 부위가 포함된 변이 단백질 (Trx-N과 GST-C) 중 한 종류의 단백질에 특정 파장의 빛을 받아 여기된 전자를 방출하는 물질(예를 들면, 337 nm에서 빛을 받아 여기 전자를 방출하는 Eu-트리스비피리딘 크립테이트(Trisbipyridine Cryptate))을 결합시키고, 다른 단백질에는 방출된 전자를 흡수하여 일정 파장의 형광을 방출하는 물질(예를 들면, 665 nm의 형광을 방출하는 알로피코시아닌(Allophycocyanin) KL-665)을 결합시킨다. 이 경우 여기된 전자가 형광 물질을 자극하여 형광이 방출되기 위하여 두 물질들이 가까운 거리 내에 존재하여야 한다. 즉, 두 단백질이 결합체를 형성하는 경우에만 2차 형광이 발생할 수 있다. 따라서, 이러한 여기된 전자를 방출하는 물질과 방출된 전자를 흡수하여 형광을 방출하는 물질을 각각 Trx-N과 GST-C 단백질들에 화학적으로 결합시키고 이들을 혼합하면 두 단백질이 결합하여 전자 여기 물질과 형광 물질이 공간적으로 가까운 거리에 존재하게 된다. 이 결합체에 전자를 여기시키는 파장을 조사하면 형광을 얻게 된다. 한편, 두 변이 단백질의 결합체의 형성을 방해하는 물질이 첨가되면 형광의 발생이 억제된다. 이러한 성질을 이용하여 검색 물질 첨가시의 형광 발생도와 비첨가시의 형광 발생도를 비교하면 수용액 상태에서 결합 억제 물질을 측정할 수 있게 된다. 이러한 방법은 면역 검색법에서와 같은 다단계의 세척과정이 불필요하고 결합 반응과 형광 측정을 수 초 내에서 수행할 수 있으므로 자동화가 가능하여 매우 많은 화합물의 HIV의 감염 억제 활성을 손쉽게 측정할 수 있다.
＜실시예 1＞ Trx-N 코딩 유전자의 제조
gp41의 아미노 말단의 나선 부위 (아미노산 545-595)를 코딩하는 DNA를 HIV의 env 유전자가 존재하는 플라스미드 pENV에 삽입하여 아래의 5' 프라이머와 3' 프라이머를 이용하여 DNA 중합 연쇄 반응(PCR)을 각각 95 ℃, 1분; 55 ℃, 1분; 72 ℃, 1분의 주기로 25회 반복하여 상기 DNA를 합성하였다.
5' 프라이머 :
3' 프라이머 :
증폭된 DNA를 제한 효소 XbaI과 PstI로 절단한 후 T4 DNA 리가제(ligase)를 이용하여 동일한 제한 효소로 절단된 플라스미드 pTrxFus에 연결하여 Trx-N 변이 단백질을 생산하는 발현 벡터 (pTrxN)를 준비하였다. 합성된 DNA의 염기서열과 이 DNA가 플라스미드 pTrxFus에 적절히 연결되었는지의 여부는 플라스미드 pTrxN의 염기서열을 결정하여 확인하였다.
＜실시예 2＞ Trx-N 단백질의 발현 및 정제
Trx-N 변이 단백질의 발현 벡터인 pTrxN을 사용하여 대장균의 일종인 GI724를 형질 전환시키고 37℃ 하에서 발현 배양액(Na2HPO46 g, KH2PO43 g, NaCl 0.5 g, NH4Cl 1 g, 카사미노산 2 g, MgCl20.095 g, 덱스트로스 5 g)을 이용하여 진탕 배양하였다. 600 nm에서의 배양액의 흡광도가 0.6에 도달했을 때 트립토판을 최종 농도 0.5 mM이 되도록 첨가하여 Trx-N 단백질의 발현을 유도하고 5시간 동안 추가 배양한 후 대장균을 원심분리법으로 수거하였다. 이 대장균을 Tris-HCl 완충 용액 (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8.0)으로 현탁시킨 후 12,000 psi의 압력으로 프렌치 프레스(French Press, 미국 소재의 SML 인스트루먼트사(Instrument Inc) 제품)를 통과시켜 세포벽을 파괴하고 발현된 Trx-N을 20% 황산암모늄으로 침전시켜 분리한 후 이를 Q-세파로스(sepharose) 음이온 교환 수지를 이용하여 분리 및 정제하였다. 이렇게 준비된 단백질은 95% 정도의 순도를 가진다.
＜실시예 3＞ GST-C 코딩 유전자의 제조
gp41의 카복시 말단의 나선 부위 (아미노산 600-668)를 코딩하는 DNA를 HIV의 env 유전자가 존재하는 플라스미드 pENV에 삽입하고 아래의 5' 프라이머와 3' 프라이머를 이용하여 DNA 중합 연쇄 반응(PCR)법을 각각 95 ℃, 1분; 55 ℃, 1분; 72 ℃, 1분의 주기로 25회 반복하여 상기 DNA를 합성하였다.
5' 프라이머:
3' 프라이머:
증폭된 DNA를 제한효소 BamHI과 EcoRI로 절단한 후 T4 DNA 리가제 효소를 이용하여 동일한 제한효소로 절단된 플라스미드 pGEX-2T에 연결하여 GST-C 변이 단백질을 생산하는 발현 벡터 pGSTC를 준비하였다. 합성된 DNA의 염기서열과 이 DNA가 플라스미드 pGEX-2T에 적절히 연결되었는지의 여부는 플라스미드 pGSTC의 염기서열을 결정하여 확인하였다.
＜실시예 4＞ GST-C 단백질의 발현 및 정제
GST-C 변이 단백질의 발현 벡터인 pGSTC를 사용하여 대장균의 일종인 DH5α를 형질전환시키고 37℃ 하에서 LB 배양액을 이용하여 진탕배양하였다. 600 nm에서의 배양액의 흡광도가 0.6에 도달했을 때 IPTG(이소프로필-b-티오갈락토시드)를 최종 농도 0.5 mM이 되도록 첨가하여 GST-C 단백질의 발현을 유도하고 3 시간 동안 추가로 배양한 후 대장균을 원심분리법으로 수거하였다. 이 대장균을 Tris-HCl 완충용액 (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8.0)에 현탁시킨 후 12,000 psi의 압력으로 프렌치 프레스를 통과시켜 세포벽을 파괴하고 원심분리하여 발현된 GST-C의 침전체 (inclusion body)를 수거하였다. 이를 8M의 요소 수용액으로 액화시킨 후 과량의 요소를 투석법으로 제거한 후 글루타치온이 결합된 수지를 이용하여 95% 이상의 순도를 갖는 GST-C 단백질을 준비하였다.
＜실시예 5＞ 겔 투과 크로마토그래피법에 의한 변이 단백질간의 결합 현상의 측정
Trx와 GST 단백질 및 변이 단백질 Trx-N와 GST-C를 각각 1 mg/ml 농도로 준비하여 동일한 몰비로 교반하고, 이들 단백질의 혼합액을 겔 투과 크로마토그래피 컬럼 (QHP; 일본 소재의 시마쯔사(Shimatzu) 제품)을 이용하여 HPLC에 의해 분리하였다. 단백질은 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다.
도 2에 도시한 바와 같이, 변형되지 않은 Trx와 GST는 상호 작용이 없으므로 두 개의 독립된 피크로 각각 검출되지만 gp41의 두 나선 부위가 각각 포함된 변이 단백질 GST-C와 Trx-N은 상호 작용을 하여 크기가 증가된 결합체의 피크로 검출되었다. 따라서, 이러한 결과는 gp41의 두 나선 부위간의 상호작용이 변형 단백질들에서도 존재한다는 것을 알 수 있다.
＜실시예 6＞ 면역검출법에 의한 Trx-N과 GST-C 변이 단백질의 상호작용의 측정
50 ㎍/ml의 Trx-N 단백질 (10 mM Tris HCl, pH 8.0) 0.1 ml을 96웰 세포 배양 용기에 도입한 후 상온에서 4시간 또는 4℃에서 12시간 동안 정치시켜 플라스틱 표면에 흡착시켰다.
단백질 수용액을 제거한 후 0.3 ml의 5% 탈지 분유액을 상온에서 1시간 동안 처리한 후 PBST 수용액 (100 mM NaPO4, 150 mM NaCl, pH 7.0, 0.5% Tween 20)으로 6회 세척한 후 0.1 ml의 GST-C 단백질 50 ㎍/ml을 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.
단백질 수용액을 제거한 후 세척액으로 6회 세척한 후 0.1 ml의 GST-C 단백질에 대한 항체(1/2000 희석액)를 가하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.
항체 수용액을 제거한 후 세척액으로 6회 세척한 후 0.1 ml의 2차 항체(1/2000 희석액)를 가하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.
항체 수용액을 제거한 후 세척액으로 6회 세척하고 1 mg/ml의 OPD가 포함된 퍼옥시다제 기질 수용액 (미국 소재의 피어스사(Pierce) 제품) 0.1 ml를 첨가하여 5 내지 10분 동안 반응시킨 후 0.1 ml의 2.5 M 황산을 가하여 반응을 중지시킨 후 수용액의 흡광도를 496 nm에서 측정하였다.
이렇게 고안된 면역 검출방법이 선택적으로 gp41의 두 나선 부위의 결합을 측정할 수 있는지의 여부를 확인하기 위하여 흡착된 Trx-N 단백질에 어떠한 단백질도 처리하지 않은 경우, GST 단백질을 처리한 경우, 및 GST-C 단백질을 처리한 경우 각각에 대하여 1차 항체 및 퍼옥시다제가 결합된 2차 항체에 의한 발색 반응의 여부를 조사하였다. 도 4에 도시된 바와 같이 GST-C를 처리한 경우에만 (GST-C) 발색 반응이 일어나고 GST를 처리하였을 때는(GST) 단백질을 전혀 첨가하지 않은 경우(None)와 마찬가지로 발색되지 않았다. 이러한 결과는 고안된 면역 검출 방법에서의 발색이 변이 단백질에 존재하는 gp41의 두 나선 부위간의 상호 작용에 기인함을 보여준다.
＜실시예 7＞ C51 펩타이드의 준비
HIV의 gp41 유전자를 포함하는 플라스미드 pLTRENV로부터 gp41의 세포막 외부(extracellular) 부위를 코딩하는 DNA를 PCR법으로 증폭한 후 이를 대장균에서의 단백질 발현 벡터인 pET21a (미국 소재의 노바겐 인크(Novagen Inc.) 제품)에 삽입하였다.
준비된 발현 벡터를 사용하여 대장균의 일종인 BL21(DE3)을 형질 전환시킨 후 목적 단백질을 발현시키고 불용성의 침전물 형태로 단백질을 수거한 후 이를 8 M의 요소 수용액으로 액화시키고 과량의 요소를 투석법으로 제거한 후 음이온 교환 수지를 이용하여 95% 이상의 순도를 갖는 단백질 (gp41-ex)을 준비하였다.
정제된 단백질을 단백질 분해효소인 트립신으로 처리한 후, 생성된 펩타이드들에서 gp41의 아미노산 618-660에 해당하는 C51 펩타이드를 C18 컬럼과 HPLC를 이용하여 분리하였다. 또한, C51의 변이 펩타이드는 특정 아미노산이 변이된 gp41-ex 단백질에 대하여 단백질 분해효소인 트립신의 처리과정을 실시한 후 야생형(wild type) C51 펩타이드의 분리 방법과 같은 방법으로 준비되었다.
＜실시예 8＞ C51의 억제 활성 측정
실시예 7에서 제조한 gp41의 카복시 말단의 펩타이드 (C51)를 사용하여 그의 농도 변화에 따른 면역 검출법의 발색 정도를 조사하였다. 상기 면역 검출법에서 GST-C 및 C51을 Trx-N 변이 단백질이 흡착된 플라스틱 용기에 동시에 첨가하고, C51 비첨가시의 OPD 발색과 C51 첨가 후의 OPD 발색을 비교함으로써 C51의 억제 활성을 조사하였다. 도 5에 도시한 바와 같이, 이 펩타이드는 그 농도에 비례하여 GST-C 단백질과 표면에 흡착된 Trx-N 사이의 결합을 억제하는 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 특히, 이 펩타이드는 1 μg/ml의 농도에서 50%의 억제율을 보이는 것으로 나타나 매우 효과적인 억제 물질임을 알 수 있다. 또한, 이 펩타이드는 1 μg/ml의 농도에서 HIV의 표면 단백질을 매개로 하는 세포 융합을 90% 억제하는 활성을 보인다. 따라서, 고안된 면역 검출방법은 HIV의 감염을 매개하는 gp41 단백질의 기능을 억제함으로써 이 바이러스의 감염을 억제하는 물질의 검색에 이용될 수 있다.
＜실시예 9＞ C51의 억제 활성의 자동 검색
337 nm에서 빛을 받아 여기 전자를 방출하는 Eu-트리스비피리딘 크립테이트(Trisbipyridine Cryptate)를 화학적으로 Trx-N에 결합시키고, 상기 방출된 여기 전자를 흡수하여 파장 665 nm의 형광을 방출하는 알로피코시아닌 (Allophycocyanin KL-665)을 화학적으로 GST-C에 결합시켰다. 이와 같이 제조된 물질들을 검색 대상 물질인 C51 펩타이드와 혼합한 후에 형광 발생 정도를 형광 측정계로 측정하였다. 또한, 동일한 방법으로 검색 대상 물질을 첨가하지 않은 상태에서의 형광 발생 정도를 측정하여 상기 형광 발생 정도와 비교하였다. 그 결과, C51 펩타이드는 C51 비첨가시보다 형광의 발생을 상당히 억제하였고, 이것은 상기 전자 방출 물질과 형광 방출 물질 사이에 전자를 충분히 이동시킬 수 있는 정도의 결합이 상기 Trx-N과 GST-C 사이에 형성되지 않았기 때문이며, 이것은 C51 펩타이드가 상기 펩티드 사이의 상호결합을 방해하였음을 의미한다. 이와 같이, 본 실시예의 방법을 사용하면 HIV 감염 억제 활성 물질을 수용액 상태에서 간편하게 검색할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 HIV 활성 억제 물질의 검색 방법을 이용하면 종래의 방법들에 비해 HIV의 감염 억제 활성 물질을 신속하고 경제적이며 안전하게 검색할 수 있다.
Claims (4)
- Trx-N 변이 단백질을 플라스틱 세포 배양 용기의 표면에 흡착시킨 후 GST-C를 첨가하는 단계,Trx-N 단백질에 결합하지 않은 GST-C 단백질을 제거한 후 GST에 선택성이 있는 1차 항체(항-GST Ab)를 첨가하는 단계,GST-C 단백질에 결합하지 않은 1차 항체를 제거한 후 1차 항체를 인식하는 2차 항체(항-Goat Ab)를 첨가하는 단계,1차 항체에 결합하지 않은 2차 항체를 제거한 후 퍼옥시다제의 기질인 퍼옥사이드 (H2O2)와 OPD(o-페닐렌디아민)를 가하는 단계, 및상기 2차 항체에 화학적으로 결합된 퍼옥시다제에 의해 산화된 OPD의 발색을 측정하는 단계로 이루어지는, Trx-N 단백질과 GST-C 단백질의 결합도를 측정하는 면역 검출 방법.
- Trx-N 변이 단백질을 플라스틱 세포 배양 용기의 표면에 흡착시킨 후 GST-C 및 검색 대상 물질을 첨가하는 단계,Trx-N 단백질에 결합하지 않은 GST-C 단백질을 제거한 후 GST에 선택성이 있는 1차 항체(항-GST Ab)를 첨가하는 단계,GST-C 단백질에 결합하지 않은 1차 항체를 제거한 후 1차 항체를 인식하는 2차 항체(항-Goat Ab)를 첨가하는 단계,1차 항체에 결합하지 않은 2차 항체를 제거한 후 퍼옥시다제의 기질인 퍼옥사이드 (H2O2)와 OPD(o-페닐렌디아민)를 가하는 단계,상기 2차 항체에 화학적으로 결합된 퍼옥시다제에 의해 산화된 OPD의 발색을 측정하는 단계, 및검색 대상 물질 비첨가시의 OPD 발색과 상기 측정치를 비교하는 단계로 이루어지는, gp41의 활성을 억제하는 물질의 검색 방법.
- 일정 파장에서 빛을 받아 여기 전자를 방출하는 물질을 화학적으로 Trx-N(또는 GST-C)에 결합시키는 단계,상기 방출된 여기 전자를 흡수하여 일정 파장의 형광을 방출하는 물질을 화학적으로 GST-C(또는 Trx-N)에 결합시키는 단계,이들 화합물을 검색 대상 화합물과 함께 혼합하는 단계, 상기 전자를 여기시키는 파장의 광을 조사하여 발생하는 형광의 정도를 측정하는 단계, 및검색 대상 물질 비첨가시의 발생 형광 정도와 상기 측정치를 비교하는 단계로 이루어지는, gp41의 활성을 억제하는 물질의 자동 검색 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 여기 전자 방출 물질이 337 nm에서 빛을 받아 여기 전자를 방출하는 Eu-트리스비피리딘 크립테이트(Trisbipyridine Cryptate)이고, 상기 형광 방출 물질이 665 nm의 형광을 방출하는 알로피코시아닌(Allophycocyanin) KL-665인 방법.
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