KR100263942B1 - 브루셀라병의 예방에 사용될 수 있는 새로운 브루셀라 어보투스 균주 및 그의 제조방법 - Google Patents

브루셀라병의 예방에 사용될 수 있는 새로운 브루셀라 어보투스 균주 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 브루셀라 어보투스 변이 균주, 그의 제조방법 및 이를 브루셀라병의 예방에 사용하는 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 우리 나라 제주지역에 분리하여 리팜피신에 대한 저항성을 강화시킨 새로운 브루셀라 어보투스 변이 균주 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 균주는 브루셀라병을 유발하는 브루셀라 어보투스 균주와 항원성 및 유전자 구조에 차이가 나고 면역성이 탁월하여 가축 (반추류, 돼지 및 개 포함)의 브루셀라병을 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

브루셀라병의 예방에 사용될 수 있는 새로운 브루셀라 어보투스 균주 및 그의 제조방법
본 발명은 브루셀라 어보투스 (Brucella abortus) 변이 균주, 그의 제조방법 및 이를 브루셀라병 (Brucellosis)의 예방에 사용하는 용도에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 우리 나라 제주 지역에 분리하여 항생제에 대한 저항성을 강화시킨 새로운 브루셀라 어보투스 변이 균주 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 변이 균주는 브루셀라병을 유발하는 브루셀라 어보투스 균주와 항원성 및 유전자 구조에 차이가 나고 면역성이 탁월하여 가축 (반추류, 돼지 및 개 포함)의 브루셀라병을 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다.
브루셀라병 (Brucellosis)은 포유동물 특히 소를 포함한 반추동물, 돼지, 말, 산양, 면양, 개, 사슴 등에서 유산 및 불임신을 일으키고, 사람에서는 몰타열 (Malta fever, Melitensis fever)을 포함한 열병 (파상열), 관절염 및 오한을 유발하는 인수 공통의 전염병이다. 브루셀라병은 원인균으로 브루셀라 어보투스 (Brucella abortus), 브루셀라 멜리텐시스 (Brucella melitensis), 브루셀라 수이스 (Brucella suis) 및 브루셀라 카니스 (Brucella canis) 등이 감염되어 유발되는 것으로 보고되어 있다. 이중 브루셀라 어보투스는 소에서 발견되는 병원균으로 양축농가에 피해를 주어 국가 경제적으로 큰 문제가 되고 있다.
우리 나라는 1955년까지 브루셀라병의 비감염 지역이었으나 1956년에 미국에서 도입한 젖소군에서 처음 브루셀라병의 발병이 보고된 이후 1958년에 국립종축장의 돼지에서, 1960년에는 제주 목장에 도입된 소에서 집단 발병한 것으로 보고되었으며 최근에는 전국 각지에서 지속적으로 발병 사례가 발표되고 있다 (농수산부 통계연보, 1956-1994).
브루셀라병을 극복하기 위하여 세계 여러나라에서는 젖소를 대상으로 예방 백신을 접종하거나 이를 진단하여 양성을 보이는 소를 살처분하는 2가지 방식의 정책을 펼쳐오고 있다. 그 동안 우리 나라는 소에서 아직 브루셀라병의 발병율이 낮기 때문에 지금까지는 예방 백신을 접종하기 보다는 이를 검진하여 양성인 소를 도태시키는 방식으로 브루셀라병을 근절하고자 하였다.
실제로 제주도에서는 1985년부터 도내의 전체 축우를 대상으로 일제 검진을 실시한 다음 양성인 소를 살처분하는 집중적인 방역사업을 실시하고 있다. 1996년 한 해만에도 약 600 여두의 소가 브루셀라병 양성으로 진단되어 살처분되었고, 특히 1995년 및 1996년에는 60 여두 규모의 몇 군데 낙농장에서 브루셀라병이 대규모로 발생함으로 젖소가 모두 살처분되고 축산 농민들은 낙농을 포기하면서 다른 종류의 생계 유지 수단으로 전업하는 현상이 일어났다 (전염병 발생보고, 1997). 이러한 현상은 양축 농가 뿐만 아니라 농촌 경제에 큰 피해를 끼치므로 이와 같은 추세가 지속된다면 젖소의 사육 두수가 감소하고 원유의 생산량이 줄어 우유의 공급도 점차로 문제가 될 것이다.
이외에도 정부에서 우리 나라가 브루셀라병의 음성 지역으로 되게 하기 위하여, 가축 전염병법에 의하여 매년 착우유를 대상으로 검진 사업을 수행하고 있다. 검진 결과가 브루셀라병 양성으로 판정되는 경우 정부는 낙농가의 손해를 경감시키기 위하여 시가의 40 - 100% 를 낙농 농가에 보상하여 주므로 매년 20 - 30억여원씩 사용하여 왔다. 그럼에도 불구하고 브루셀라병은 감소되기보다는 점차로 증가되는 추세에 있으며 이로 인한 국가 예산의 낭비가 심화되고 있다.
현재까지 우리 나라는 브루셀라병의 진단에 있어서 오직 젖소 중 착우유만을 대상으로 검색하고 있어 만약 한우까지 검진하는 경우 년간 살처분되는 소의 두수가 몇 배로 증가될 것이므로 상기와 같은 예방 접종의 필요성이 국가적인 차원에서 강조되어야 한다. 이와 같이 국가 방역 정책이 예방 접종으로 변경된다면 브루셀라병 진단약을 생산하고 그 검진 사업에 소용되는 예산의 일부로서도 전 젖소에 대하여 충분히 예방 접종을 수행할 수 있는 경제적인 이점도 기대할 수 있다.
미국은 브루셀라 어보투스 RB51 균주를 이용한 예방 백신을 개발하여 1996년부터 모든 주에서 이를 예방 접종에 이용하고 있다. 이전에도 브루셀라 어보투스 19 균주를 예방 접종에 이용한 바 있으나 자연 감염된 소와의 구분이 불가능한 문제점이 있어 이의 지속적인 사용 정책을 변경하여 현재는 이 균주를 사용하고 있지 않은 실정이다. 한편 브루셀라 어보투스 RB51 균주는 자연 감염에 의한 유산을 효과적으로 예방할 수 있는데, 이미 쥐, 사슴 그리고 소를 이용한 각종 실험에서 병원성인 브루셀라 어보투스 균주에 대한 방어 능력이 증명되었다. 또한, 상기 균주에 의해 형성된 항체는 브루셀라병에 감염된 젖소를 색출하는데 사용되는 밀크 링 (milk ring) 시험 또는 튜브응집 시험 (Tube Agglutination Test)에서 음성으로 판정되는 장점이 있어 방역 사업에 유리하다.
이에 본 발명자는 우리 나라에서 사육되는 소의 브루셀라병 예방약을 개발하기 위하여, 우리 나라 제주 지역에서 브루셀라병에 대하여 양성으로 판정되어 살처분되는 소로부터 브루셀라 어보투스 균주를 분리하고 이를 항생제를 포함하는 배지에 계대 배양하여 변이를 유발시킴으로 새로운 브루셀라 어보투스 제주 (Brucella abortus jeju) 균주를 얻고 이를 소에 접종하여 그의 항원성이 기존의 병원성 균주와 다르고 면역성이 탁월함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다 .
본 발명은 브루셀라병의 예방에 사용될 수 있는 새로운 브루셀라 어보투스 (Brucella abortus) 변이 균주 및 그의 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다.
도 1 은 본 발명에서 분리한 브루셀라 어보투스 변이 균주의 항원성을 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분석하여 나타낸 것이고,
도 2 는 본 발명에서 분리한 브루셀라 어보투스 변이 균주의 항원성을 웨스턴 블럿으로 분석하여 나타낸 것이고,
도 3 은 본 발명의 브루셀라 어보투스 변이 균주의 게놈 DNA 와 병원성인 브루셀라 어보투스 균주의 게놈 DNA 를 아가로스 젤로 분석하여 나타낸 것이다.
도 4 는 본 발명의 브루셀라 어보투스 변이 균주를 생산하는 항생제 처리 및 저장 방법을 도식화하여 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 브루셀라병 예방에 사용될 수 있는 새로운 브루셀라 어보투스 변이 균주인 브루셀라 어보투스 제주 (Brucella abortus jeju) 균주 (수탁번호 : KCTC 8855 P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 소에서 분리한 브루셀라 어보투스 균주를 항생제를 첨가한 액체 배지에서 지속적으로 계대 배양한 다음 낮은 온도에서 보관하고 항생제의 농도를 점차로 증가시킨 아가 배지에서 교대로 계대 배양하여 균주의 변이를 유발시키고 이로부터 거친 표면을 가진 콜로니를 선별하는 브루셀라 어보투스 변이 균주의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발병은 상기 과정의 아가 배지에서 브루셀라 어보투스 균주를 48시간 동안 배양한 다음 24시간 동안 0℃ 및/또는 -80℃ 에서 보관하여 균주의 변이 유발을 증가시킨다.
이 때, 항생제로는 리팜피신 (rifampicin) 및/또는 페니실린을 사용하는 것이 바람직하고, 리팜피신의 농도는 50 - 400μg/ml 범위인 것을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 브루셀라 어보투스 변이 균주를 반추류, 돼지 및 개를 포함하는 가축의 브루셀라병 예방에 사용하는 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 브루셀라병의 예방에 사용될 수 있는 항생제에 저항성을 강화시킨 브루셀라 어보투스 변이 균주를 제공한다.
본 발명은 우리 나라 제주 지역에서 브루셀라병에 대해 양성으로 진단되어 살처분되는 소에서 브루셀라 어보투스로 동정된 균주를 분리하여 변이를 유발시킨다. 우선 상기 균주 중에서 항생제에 내성을 나타내는 균주를 선별하여 항생제를 첨가한 액체 배지에서 지속적으로 계대 배양하고 항생제의 농도를 점차로 증가시킨 아가 배지에서 교대로 계대 배양한 다음 거친 표면을 가진 콜로니로부터 브루셀라 어보투스 변이 균주를 얻는다 (도 4 참조).
상기 과정에서 항생제로는 리팜피신 (rifampicin) 및/또는 페니실린을 사용하는 것이 바람직하고, 리팜피신을 사용하는 것은 더욱 바람직하다. 이 때, 리팜피신은 액체 배지에서는 40 - 60μg/ml 범위의 농도로 첨가하는 것이 바람직하고, 아가 배지에서는 40 - 400μg/ml 범위로 농도를 증가시켜 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발병은 상기 과정의 아가 배지에서 브루셀라 어보투스 균주를 48시간 동안 배양한 다음 24시간 동안 0℃에서 보관하는 과정을 20회 반복하여 균주의 변이 유발을 증가시킨다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 -80℃ 이하에서 몇 일 동안 보관하여 다시 아가 배지 및 액체 배지에 접종하는 과정으로 균주의 변이 유발을 신속하게 유도한다. 이 때 5 - 7 일 동안 보관하는 것이 바람직하고, 상기 균주의 배양액에 글리신 (glycine)을 첨가하는 것이 바람직하며 그 양은 배양액과 동량인 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 과정으로 아가 플레이트 상에 형성된 콜로니가 과립상의 약간 흰색을 띄는 노란색이고, 외형 윤곽이 거칠고 건조한 균주를 분리한다.
본 발명은 상기 균주를 브루셀라 어보투스 제주 (Brucella abortus jeju)라고 명명하고, 이를 1997년 11월 20일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 8855 P).
본 발명은 상기 브루셀라 어보투스 변이 균주가 브루셀라병의 예방에 사용될 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 그의 항원성 및 면역성 등을 조사하였다.
실제로 상기 균주를 피하로 예방 접종한 다음 병원성인 브루셀라 어보투스 바이오타입 Ⅰ 균주로 다시 감염시킨 경우에 항체에 대해 모두 음성으로 판정되어 본 발명의 브루셀라 어보투스 변이 균주는 면역성이 강함을 확인하였다.
또한, 상기 균주로 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 및 웨스턴 블럿 등을 수행하여 그의 항원성을 조사한 결과, 주요 항원 물질이 다양하면서 각 균주간에 차이가 있고, 이러한 양상은 웨스턴 블럿 반응 상에도 두드러짐을 확인하였다 (도 1 및 도 2 의 레인 M 참조).
또한, 본 발명은 브루셀라 어보투스 변이 균주의 유전자도 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 등을 수행하여 분석하였다.
구체적으로, 각 균주의 게놈 DNA 를 주형으로 하고, 시발체 I 및 시발체 Ⅱ 를 사용하여 반응을 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과, 국내에서 분리한 병원성 균주와 비교하여 상기 980bp 크기의 유전자가 본 발명의 변이 균주에는 존재하지 않음을 확인하였다. 이는 브루셀라 진단용 항원 및 자연 감염시에 생기는 항체와 직접적으로 관련이 있을 것으로 추정된다.
상기 결과를 미루어 볼 때, 본 발명의 브루셀라 어보투스 변이 균주는 브루셀라병의 예방 균주로서 충분히 활용될 수 있다.
본 발명은 상기 브루셀라 어보투스 변이 균주로 브루셀라병 예방약을 개발하기 위하여, 감자 추출물을 첨가한 액체 배지를 사용하여 대량 배양하고 이 균주를 단백질 보호제 등을 첨가한 상태에서 냉동 건조시켜 보관한다.
상기 예방약은 소에 예방 접종된 경우 병원성인 브루셀라 어보투스 균주의 항체와는 전혀 다른 새로운 항체의 생산을 유도한다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 브루셀라 어보투스 균주의 분리
본 발명은 브루셀라병의 예방 균주로 사용될 수 있는 브루셀라 어보투스 변이 균주를 얻기 위하여, 우리 나라 제주 지역에서 브루셀라병 양성으로 진단되어 살처분되는 소의 상유방 임파절에서 에왈트의 방법으로 브루셀라 어보투스 균주를 분리하여 사용하였다 (Ewalt, D. R., 1989, J. Vet. Diagn. Invest., 1: 227-230).
구체적으로, 상기 소의 상유방 임파절을 세절하여 분쇄하고 가검 조직을 브루셀라 아가 배지 (박토 펩타민 20g, 박토 덱스트로스 1g, 박토 이스트 추출물 2g, 염화나트륨 5g, 소듐 비설파이트 0.1g, 박토 아가 15g, 1,000ml)에 접종하여 CO2배양기에서 48시간 동안 배양함으로 회백색의 S 형의 콜로니를 하나 선발하였다. 상기 콜로니의 균주가 브루셀라 속 균주임을 생화학적 방법으로 확인한 다음 브루셀라 어보투스 균주로 동정하고 이들 중 브루셀라 어보투스 바이오타입 Ⅰ 및 Ⅱ 로 명명한 균주를 이용하여 본 발명의 변이 균주를 선발하였다.
<실시예 2> 브루셀라 어보투스 균주의 항생제에 대한 저항성 조사
상기 실시예에서 분리한 브루셀라 어보투스 바이오타입 Ⅰ 및 Ⅱ 균주로부터 브루셀라병의 예방 접종에 이용될 수 있는 변이 균주를 선별하기 위하여, 각종 항생물질을 이용하여 저항성 시험을 수행하였다. 그 결과 표 1 에 보는 바와 같이, 상기 균주는 페니실린 및 리팜피신을 첨가한 배지에서 저항성을 나타내면서 증식하고, 특히 리팜피신에는 저항성이 강하여 400μg/ml 의 고농도에도 증식하였다.
농도항생제 농도 (μg/ml)
400 100 10 1 0.1
스트렙토마이신 - - - - -
네오마이신 - - - - -
페니실린 - + + + +
리팜피신 + + + + +
테트라사이클린 - - - - -
앰피실린 - - - - -
농도항생제 농도 (μg/ml)
1 5 10 20 50
페니실린 + + + + +
+ : 균주가 증식함; - : 균주가 증식하지 않음
구체적으로 상기 브루셀라 어보투스 균주의 항생제 내성을 조사하기 위하여, 상기 균주를 24시간 동안 배양하고 리팜피신을 흡착시킨 여과지 (디스크: 직경 0.5cm)를 이용한 감수성 실험에서 직경 15mm 이상으로 자라는 균주를 선발하였다. 이를 다시 브루셀라 아가 배지에 배양하여 콜로니의 외형이 거친 것을 선발한 다음 CO2배양기에서 리팜피신에 대한 저항성을 계속적으로 조사하여 이에 감수성이 없는 균주를 브루셀라병 예방 균주의 개발에 이용하였다.
<실시예 3> 브루셀라 어보투스 변이 균주의 생산
본 발명은 상기 실시예에서 분리한 균주로부터 브루셀라병의 예방 접종에 이용될 수 있는 변이 균주를 생산하기 위하여, 상기 균주를 브루셀라 액체 배지 (박토 트립톤 10g, 박토 펩타민 10g, 박토 덱스트로스 1g, 박토 이스트 추출물 2g, 염화나트륨 5g, 소듐 비설파이트 0.1g, 1,000ml)에 리팜피신 (rifampicin, Sigma Co. R3501)을 50μg/ml 농도로 첨가하여 만든 액체 배지에 접종하여 혐기 상태로 10 계대 배양하였다. 이 때 얻은 배양액을 다시 37℃, CO2배양기에서 배양한 다음 37℃에서 48시간 동안 TBSA 아가 배지 (tryptcase soy brith supplemented agar)에 다시 발육시켜 콜로니의 외형이 거친(rough) 균주를 선별하고 이를 계속적으로 계대 배양하였다. 상기 TSBA 배지에는 리팜피신을 저농도 (20μg/ml)로부터 고농도 (250μg/mg)까지 첨가하여 4일 간격으로 CO2배양기에서 각각 교대하면서 배양하고 이를 20 계대 반복하였다. 이와 같은 과정으로 얻은 균주는 -80℃에서 1주일 동안 보관하였다가 다시 접종하는 과정을 반복하여 변이의 유발을 신속하게 유도하였다.
다음 상기 균주를 브루셀라 액체 배지 (박토 트립톤 10g, 박토 펩타민 10g, 박토 덱스트로스 1g, 박토 이스트 추출물 2g, 염화나트륨 5g, 소듐 비설파이트 0.1g, 1,000ml)에 페니실린을 10 U/ml 농도로 첨가한 아가 플레이트에 접종하고 이를 37℃, CO2배양기에서 48시간 동안 10 계대 배양하여 변이를 유발시킨 다음 다시 리팜피신을 고농도 (400μg/ml)로 첨가한 배지에서 배양하여 저항성이 있는 새로운 브루셀라 어보투스 변이 균주를 선별하였다 (도 3 참조).
<실시예 4> 브루셀라 어보투스 제주 균주의 균학적 특성 조사
본 발명은 상기 실시예에서 선별한 변이 균주 중에서 아가 플레이트 상에 형성된 콜로니에 옆광을 비추어 본 결과, 콜로니의 외형 윤곽이 거칠고 건조한 것으로 보이며, 과립상의 약간 흰색을 띄는 노란색의 균주를 얻어 브루셀라 어보투스 제주 (Brucella abortus jeju) 균주라고 명명하였다.
또한, 상기 브루셀라 어보투스 제주 균주는 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)에 염색되는 막대형의 그램 양성 세균으로 주로 에리트리톨 (erythritol)을 함유하는 배지에서 성장하고 이산화탄소가 없어도 성장이 가능하며 반드시 혈액 배지를 필요로 하지는 않는다. 이외에도 우레아제 (urease)에 양성을 나타내고 포도당을 산화 (glucose oxidative)시키며, 리팜피신에 대하여 50μg/ml 농도에서 3일 이내에 콜로니를 형성할 수 있는 저항성을 보이고, 그외 페니실린 및 클록사실린 (cloxacillin) 등에 대하여는 저항성을 나타낸다. 하지만 암피실린, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 스트렙토마이신 및 데옥시사이클린에 대하여는 감수성을 나타낸다.
본 발명은 상기 브루셀라 어보투스 제주를 1997년 11월 20일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 8855 P).
<실시예 5> 브루셀라병 예방약의 생산
본 발명은 상기 브루셀라 어보투스 제주 균주를 사용하여 브루셀라 예방약을 개발하기 위하여, 브루셀라 영양 배지 (박토 트립톤 10g, 박토 펩타민 10g, 박토 덱스트로스 1g, 박토 이스트 추출물 2g, 염화나트륨 5g, 소듐 비설파이트 0.1g, 1,000ml)에 감자 추출물을 5% 첨가하여 대형 배양조 (20 L)에서 72시간 동안 배양하여 상기 균주의 생산 수율을 높였다. 다음 상기 과정에서 얻은 균주를 단백질 보호제 (락토스 74.62g, KH2PO40.517g, K2HPO40.854g, 소듐 L-글루타메이트 10g, 젤라틴 5g, 증류수 1,000ml)을 첨가한 상태에서 냉동 건조시켜 예방약을 생산하였다. 냉동 건조한 예방약은 -4℃에서 보관하면 1년 이상 보관될 수 있다.
상기 예방약을 소에 예방 접종한 다음 매월 채혈하여 항체의 형성을 조사하였다. 그 결과 표 3 에 보는 바와 같이 브루셀라 어보투스 1119-3 균주를 이용한 TAT 항원에서 항체가 나타나지 않았다.
브루셀라 어보투스 제주 균주를 이용한 브루셀라병 예방 효과 시험
진단 방법 항체가 측정 (역가)
예방 접종전 1개월 2개월 도전 시험 3개월 4개월
TAT - _ - 1 : 20 -
CFT - - - 1 : 4 -
도트 블럿(dot ELISA) - + + + +
* 도전 균주량 : 국내에서 분리한 브루셀라 어보투스 균주 9 × 1010CFU
<실시예 6> 브루셀라 어보투스 변이 균주의 면역성 확인
본 발명은 상기 브루셀라 어보투스 변이 균주의 면역성을 확인하기 위하여, 야외 젖소 10두 (5개월령)에게 상기에서 생산한 균주 10 × 109개 정도를 피하로 예방 접종하였다. 4주가 경과한 다음 이와 같이 예방 접종한 소에게 국내에서 분리된 브루셀라 어보투스 바이오타입 Ⅰ 균주 (도전 균주) 9 × 1010개 정도를 안와 점막으로 다시 접종하여 체내에 항체가 형성되는지 여부를 관찰하였다. 이 때 공인 진단방법인 PAT (Plate Agglutination Test) 및 TAT (Tube Agglutination Test)를 이용하였다. 그 결과 표 4 에 보는 바와 같이, 도전 균주에 의한 항체는 입증할 수 없고 모두 음성으로 판정되어 본 발명의 브루셀라 어보투스 변이 균주가 강한 면역성을 나타냄을 확인하였다.
예방 접종 검사 방법 결과
예방 접종 전 TAT, CFT, PAT 음성
예방 접종 1개월 경과 TAT, CFT, PAT 음성
예방 접종 2개월 경과 TAT, CFT, PAT, 웨스턴 블럿 음성
예방 접종 3개월 경과 TAT, CFT, PAT, 웨스턴 블럿 음성
<실시예 7> 브루셀라 어보투스 변이 균주의 항원성 분석
본 발명은 국내에서 분리한 브루셀라 속 균주의 항원성을 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 및 웨스턴 블럿 등을 이용하여 분석하였다.
도 1 에 보는 바와 같이, 브루셀라 어보투스 균주의 주요 항원 물질은 각 균주들 모두 6, 10, 14, 16, 18, 19, 20, 21.6, 23, 26.8, 33, 50, 60, 70, 76, 80KD 등의 크기에서 다양하게 나타나므로 각 균주간의 차이를 입증할 수 있으며, 이들 균주 중에서 몇 개는 항생제를 이용하여 변이 균주를 개발하는데 이용할 수 있는데, 실제로 본 발명의 변이 균주는 항원 구조가 매우 다르므로 예방 균주로서 활용될 수 있다. 또한, 상기에서 브루셀라병 양성 혈청 및 음성 혈청을 이용하여 웨스턴 블럿을 수행하면 도 2 에 보는 바와 같이 국내 분리 균주에서 15, 17, 25KD 등의 항원 항체 반응대에서 반응이 나타나지만 상기 변이 균주는 이들 항원, 항체 반응에서 매우 큰 차이를 나타내고 있었다.
<실시예 8> 브루셀라 어보투스 변이 균주의 유전자 분석
본 발명은 브루셀라 어보투스 변이 균주의 유전자를 분석하기 위하여, 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다.
구체적으로, 각 균주의 게놈 DNA 를 주형으로 하고, 시발체 I (5'-CGGCCACTGT-3') 및 시발체 Ⅱ (5'-CGGCCCCGGT-3')를 사용하여 94℃ 에서 2분, 36℃ 에서 30초, 72℃ 에서 1분 동안 중합효소 반응을 수행한 다음 94℃ 에서 30초, 36℃ 에서 30초, 72℃ 에서 1분 동안 반응을 39회 반복하여 수행하고 그 생성물을 아가로스 젤 전기영동하였다. 그 결과, 980bp 크기의 유전자가 국내에서 분리한 병원성 균주와 비교하여 상기 변이 균주에는 없는 것이 관찰되었다. 이를 통해 상기 980bp 크기의 유전자가 브루셀라 진단용 항원으로 자연 감염시에 생기는 항체와 직접적으로 관련이 있을 것으로 추정되었다.
상기에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 브루셀라 어보투스 제주 균주는 기존의 병원성인 브루셀라 속 균주와는 그 항원성이 매우 다르고 면역성이 탁월하여 반추류, 돼지 및 개 등을 포함하는 가축의 브루셀라병을 예방하는데 널리 사용될 수 있다. 따라서 브루셀라 어보투스 변이 균주는 지금까지 브루셀라병을 진단하여 양성인 소를 살처분하는 방역 정책을 효과적으로 대체할 수 있는 우수한 예방약을 개발하는데 이용되어 국가 경제에 크게 기여할 것이다.

Claims (5)

  1. 항생제에 대한 저항성을 강화시킨 균주로서, 브루셀라병의 예방에 사용될 수 있는 브루셀라 어보투스 제주(Brucella abortus jeju) 변이균주(수탁번호 : KCTC 8855P).
  2. 소에서 분리한 브루셀라 어보투스 균주를 항생제를 첨가한 액체 배지에서 지속적으로 계대 배양한 다음 낮은 온도에서 보관하면서 항생제의 농도를 점차로 증가시킨 아가 배지에서 교대로 계대 배양하여 균주의 변이를 유발시키고 이로부터 거친 표면을 가진 콜로니를 선별하는 제 1항의 브루셀라 어보투스 변이 균주의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서, 아가 배지에서 브루셀라 어보투스 균주를 48시간 배양한 다음 24시간 동안 낮은 온도에서 보관하는 과정을 교대하여 균주의 변이 유발을 증가시키는 제조방법.
  4. 제 2항에 있어서, 항생제로는 리팜피신 (rifampicin) 및 페니실린 (penicillin)을 사용하는 것이 바람직하고, 리팜피신의 농도는 50 - 400μg/ml 범위인 것을 사용하는 제조방법.
  5. 제 1항의 브루셀라 어보투스 변이 균주를 반추류, 돼지 및 개를 포함하는 가축 브루셀라병의 예방약.
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