KR100252199B1

KR100252199B1 - Bacillus thuringiensis NR5 gene and recombinant protein expressed therefrom

Info

Publication number: KR100252199B1
Application number: KR1019980000668A
Authority: KR
Inventors: 박승환; 김정일; 최수근; 신병식; 공은미
Original assignee: 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 1998-01-13
Filing date: 1998-01-13
Publication date: 2000-04-15
Also published as: KR19990065395A

Abstract

PURPOSE: Provided is nr5 gene which is isolated from morrisoni, subspecies Bacillus thurigensis and different from traditional Bt toxic protein gene in base sequence and amino acid. And a recombinant protein expressed therefrom is provided, which has insecticidal activity specifically against Plutella xylostella. CONSTITUTION: A toxic protein, nr5 gene isolated from morrisoni, subspecies Bacillus thurigensis is prepared by the following steps of: (a) searching a novel gene from morrisoni, subspecies of Bacillus thurigensis by Southern hybridization and identifying novel gene showing insecticidal activity specially against Plutella xylostella; (b) expressing novel Bacillus thurigensis nr5 gene; and (c) identifying insecticidal activity.

Description

Bacillus thuringiensis nR5 gene and recombinant protein expressed therefrom

본 발명은 신규한 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis, 이하 Bt라 함) nr5 유전자 및 그로부터 발현된 재조합 단백질에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 나비목해충중 배추나 케일등 채소류에 큰 피해를 입히는 배추좀나방에 특이적으로 살충성을 나타내는 신규한 바실러스 츄린겐시스 nr5 유전자 및 그로부터 발현된 재조합 단백질에 관한 것이다.The present invention relates to a novel Bacillus thuringiensis (hereinafter referred to as Bt) nr5 gene and recombinant proteins expressed therefrom. More specifically, the present invention relates to a novel Bacillus thuringiensis nr5 gene and recombinant protein expressed therefrom that are specifically insecticidal to Chinese cabbage moths that cause great damage to vegetables such as Chinese cabbage and kale among butterfly wood pests.

현재까지 인류의 식량증산에 크게 기여해 온 화학 합성 농약은 장기간의 사용과 남용으로 인해 환경오염, 생태계 파괴등 심각한 문제를 야기하고 있으며 매년 농약으로 인한 중독 사망자가 증가하는등 그 피해가 날로 늘어나고 있다. 뿐만 아니라 화학 합성 농약에 대한 저항성을 가진 병원균이나 곤충의 출현으로 인해 더 많은 양의 농약 사용이 불가피하게 되어 그 피해는 더욱 늘어날 전망이다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 무공해 내지 저공해 농약의 개발이 절실히 요구되고 있다.To date, chemical synthetic pesticides, which have contributed greatly to human food production, have caused serious problems such as environmental pollution and destruction of ecosystems due to long-term use and abuse. In addition, the emergence of pathogens and insects resistant to chemical synthetic pesticides, the use of a larger amount of pesticides is inevitable, the damage is expected to increase. In order to overcome this problem, the development of pollution-free or low pollution pesticides are urgently required.

따라서, 미생물을 원체로 한 미생물 농약을 개발하여 사용하고 있는데 이중 인시목(Lepidopteran)이나 모기의 유충등 특정 해충에 대해 병원성이 높으며 공업수준의 배양이 용이한 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)를 원체로한 미생물 농약을 BT제라 하여 유용하게 사용해 오고 있다. Bt는 아포를 형성하는 그람 양성균으로 아포 형성과 함께 특정 곤충에 치사효과가 있는 내독소를 생성한다. 이 독소 단백질을 곤충의 중장내에 있는 단백질 분해 효소에 의해 활성화되어서 특정한 수용체에 결합하여 살충작용을 일으키므로 수용체를 가지고 있지 않은 사람이나 동식물 및 어류등에는 무해하여 자연 생태계에도 안전한 미래형 농약으로 알려져 있다. 현재까지 많은 종류의 Bt 균주가 흙, 죽은 곤충, 먼지, 식물등에서 분리되었으며(Appl. Environ. Microbiol. 57, 311-315) 분리된 균주로부터 많은 수의 독소단백질 유전자가 클로닝되어 알려지고 있는데 이들 독소단백질은 나비목, 파리목, 딱정벌레목등 다양한 곤충에 선택적 독성을 가지는 것으로 알려져 있으며 그들의 아미노산 서열의 상동성에 따라 Cry1에서 Cry18의 Cry 단백질과 Cyt으로 분류된다.Therefore, microbial pesticides have been developed and used. Among them, Bacillus thuringiensis, which is highly pathogenic and easily cultivated at industrial level, is resistant to certain pests such as larvae of rapidopteran and mosquitoes. The microbial pesticides have been used as BT agent. Bt is a gram-positive bacterium that forms follicles and, together with follicle formation, produces endotoxins that have a lethal effect on certain insects. Since this toxin protein is activated by proteolytic enzymes in the insect's mid- and long-term, it binds to specific receptors and causes insecticidal action. To date, many Bt strains have been isolated from soil, dead insects, dust, and plants (Appl. Environ. Microbiol. 57, 311-315). Many toxin protein genes have been cloned from the isolated strains. Proteins are known to have selective toxicity to various insects such as lepidoptera, fly, and beetle, and are classified into Cry1 and Cry18 of Cry1 and Cry18 according to the homology of their amino acid sequences.

현재 경제적 측면에서 문제가 되는 주요 해충들은 대부분 나비목에 속해 있어 cry1 계열의 독소단백질 유전자에 대한 연구가 가장 많이 수행되었다. cry1 계열의 유전자들은 다시 아미노산 서열의 상동성에 따라 cry1A 에서 cry1K 까지 분류되고 있으며 이들은 다시 cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ad 및 cry1Ae등으로 세분화 된다. 이들 cry1A-cry1K 유전자들은 다양한 나비목해충에 대해 서로 다른 살충 특이성을 나타낸다. 그러나 지금까지 발견된 이러한 독소단백질로 제어할 수 없는 해충의 종류가 아직 많고, 또한 기존의 BT제에 저항성을 가진 해충이 출현하고 있으며 이를 극복하고자 현재에도 많은 연구자들이 새로운 독소단백질 유전자를 찾거나 살충스펙트럼이 넓은 재조합 균주의 개발을 시도하고 있다.Most of the major pests that are currently problematic in economic terms belong to Lepidoptera, and the most research on the cry1 toxin protein gene has been conducted. The cry1 genes are further divided into cry1A to cry1K according to the homology of amino acid sequences, and they are further divided into cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ad and cry1Ae. These cry1A-cry1K genes show different insecticidal specificities for various lepidopteran pests. However, there are still many kinds of pests that cannot be controlled by these toxin proteins, and many pests are resistant to existing BT agents, and many researchers are looking for new toxin protein genes or pesticides. Attempts have been made to develop a broad spectrum recombinant strain.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 사실에 의거하여 안출한 것으로 배추좀나방등 나비목해충에 특이적으로 살충성을 나타내는 신규한 바실러스 츄린겐시스 nr5 유전자와 그로부터 발현된 재조합 단백질을 제공하는데 그 목적이 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel Bacillus thuringiensis nr5 gene and recombinant protein expressed therefrom, which are specifically designed to be insecticidal to lepidopteran insects such as Chinese cabbage and moths. .

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여 바실러스 츄린겐시스 아종 모리소니(morrisoni)로부터 서던 하이브리다이제이션(Southern hybridization)을 통하여 새로운 유전자를 탐색하여, 이중 배추좀나방에 특이적으로 독성을 나타내는 새로운 유전자를 확인하고 이를 BT의 기존 유전자들과 염기서열을 비교분석하여 신규성을 조사하였다.In order to achieve the above object, the present invention searches for a new gene through Southern hybridization from Bacillus thuringiensis subspecies morrisoni, and shows a new gene that is specifically toxic to double cabbage moth. After confirming and comparing the existing genes and nucleotide sequence of BT it was investigated the novelty.

이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the specific configuration and operation of the present invention will be described with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited only to the following Examples.

도 1은 본 발명의 바실러스 츄린겐시스 nr5 유전자의 DNA 염기서열을 나타낸 그림이다.1 is a diagram showing the DNA sequence of the Bacillus thuringiensis nr5 gene of the present invention.

도 2는 본 발명의 바실러스 츄린겐시스 nr5 유전자의 추정 아미노산 서열을 나타낸 그림이다.Figure 2 is a diagram showing the estimated amino acid sequence of the Bacillus thuringiensis nr5 gene of the present invention.

도 3은 본 발명의 nr5 유전자를 숙주인 대장균내에서 발현시키기 위한 재조합 플라스미드를 나타낸 사진이다.Figure 3 is a photograph showing a recombinant plasmid for expressing the nr5 gene of the present invention in E. coli host.

도 4는 본 발명의 발현된 nr5 단백질을 단백질 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.Figure 4 is a photograph showing the result of confirming the expressed nr5 protein of the present invention by protein electrophoresis.

도 5는 본 발명의 발현된 nr5 단백질을 배추좀나방을 대상으로 살충성 검정을 실시한 결과를 나타낸 사진이다.Figure 5 is a photograph showing the results of the insecticidal assay for the cabbage moth of the expressed nr5 protein of the present invention.

본 발명은 배추좀나방등 나비목해충에 특이적으로 살충성을 나타내는 신규한 유전자를 탐색하는 단계; 신규한 바실러스 츄린겐시스 nr5 유전자의 발현단계; 및 살충성을 검정하는 단계로 구성된다.The present invention comprises the steps of searching for a novel gene exhibiting specific insecticidal insects such as cabbage moth Expression of a novel Bacillus thuringiensis nr5 gene; And assaying for pesticides.

실시예 1. 독소 유전자의 탐색 및 클로닝Example 1. Screening and Cloning of Toxin Genes

국내의 자연계로부터 분리된 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)균주로부터 DNA를 칼만등의 방법(Appl. Environ. Mirobiol. 59, 1131-1137, 1993)으로 분리하고, 이를 여러가지 제한효소로 절단한 후 cry1I 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브를 사용하여 서던 하이브리다이제이션을 수행하였다.DNA was isolated from Bacillus thuringiensis strain isolated from the natural world in Korea by Kalman et al. (Appl. Environ. Mirobiol. 59, 1131-1137, 1993), and then digested with various restriction enzymes and cry1I. Southern hybridization was performed using a probe that specifically binds to the gene.

이때 사용한 프로브는 DNA 단편이며, cry1I 유전자에 특이적으로 결합하는 이 프라이머를 사용하여 바실러스 츄린겐시스 HD1의 DNA로부터 연쇄효소 중합반응(polymerase chain reaction)으로 유전자의 일부를 증폭하고, 이를 다시 디그 DNA 라벨링 키트(DIG-DNA labeling Kit, 베링거 만하임 사)를 이용하여 라벨링한 후 사용하였다. 또한, 대조구로서 기존의 cry1Ia 유전자를 가지고 있는 BT HD1 균주와 cry1Ib 유전자를 가지고 있는 BT BP465(Appl. Environ. Microbiol. 1995, 61: 2402-2407)로부터 분리한 DNA를 사용하였다. 이중 바실러스 츄린겐시스 아종 모리소니로 동정된 분리균 BR30은 기존의 cry1Ia 유전자를 가진 BT HD1 및 cry1Ib 유전자를 가진 BT BP465와 비교하여 다른 크기의 시그날을 나타냈는데, 이는 BR30 균주에 cry1Ia와 상동성이 있는 유전자가 포함되어 있으며 이 유전자의 제한효소 지도가 기존의 cry1Ia 및 cry1Ib 유전자의 제한효소 지도와 다르다는 것을 나타낸다. 따라서, 이 균주로부터 하기와 같은 방법으로 새로운 유전자를 클로닝하였다.The probe used was a DNA fragment, which was used to amplify a portion of the gene by polymerase chain reaction from the DNA of Bacillus thuringiensis HD1 using this primer specifically binding to the cry1I gene. Labeling kit (DIG-DNA labeling Kit, Boehringer Mannheim) was used after labeling. In addition, as a control, DNA isolated from the BT HD1 strain having the cry1Ia gene and BT BP465 (Appl. Environ. Microbiol. 1995, 61: 2402-2407) having the cry1Ib gene was used. The isolate, BR30, identified as Bacillus thuringiensis subspecies Morrisony, showed a different size signal compared to BT HD1 with the cry1Ia gene and BT BP465 with the cry1Ib gene, which showed homology with cry1Ia in the BR30 strain. Genes are present and the restriction map of this gene is different from the restriction maps of the existing cry1Ia and cry1Ib genes. Therefore, a new gene was cloned from this strain by the following method.

우선, BR30으로부터 분리된 DNA를 여러가지 제한효소로 절단한 다음 0.8% 아가로즈를 이용하여 DNA 전기영동한 후 나일론 멤브레인(베링거 만하임 사)으로 DNA를 부착시켜 디그 DNA 라벨링 키트(DIG-DNA labeling Kit, 베링거 만하임 사)를 이용하여 만들어진 위의 프로브를 사용하여 서던 하이브리다이제이션(suthern hybridization)을 수행하였다. 그 결과, 새로운 유전자는 EcoRI으로 절단된 4kb 정도의 DNA 단편 속에 5'말단이 포함되어 있으며 HindⅢ로 절단된 2.5kb 정도의 DNA 단편속에 3' 말단이 포함된다는 사실을 알 수 있었다.First, DNA isolated from BR30 was digested with various restriction enzymes, followed by DNA electrophoresis using 0.8% agarose, followed by DNA attachment using a nylon membrane (Boehringer Mannheim). Southern hybridization was performed using the above probe made using Boehringer Mannheim. As a result, the new gene contained the 5 'end in the 4 kb DNA fragment cut by EcoRI and the 3' end in the 2.5 kb DNA fragment cut by HindIII.

둘째로, 상기와 같은 사실에 의거하여 BR30 DNA를 EcoRI 및 HindⅢ로 절단하여 플라스미드 pGEM-7Zf(+)의 EcoRI 및 HindⅢ 위치에 각각 연결시킨 후 대장균에 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 원하는 유전자는 콜로니 하이브리다이제이션(Colony hybridization)(The DIG System User's Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim Biochemica, 40-43, 1993)을 통하여 탐색하였으며 이때 사용한 프로브는 상기의 서던 하이브리다이제이션에서 사용한 프로브와 동일한 것이다.Secondly, BR30 DNA was digested with EcoRI and HindIII and linked to the EcoRI and HindIII positions of plasmid pGEM-7Zf (+), respectively, and transformed into E. coli. The desired gene from the transformed Escherichia coli was searched through Colony hybridization (The DIG System User's Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim Biochemica, 40-43, 1993), and the probe used was Southern hybridization. Same as the probe used in

셋째로, 상기와 같은 방법에 의해 두 DNA 단편으로 나뉘어 클로닝된 유전자는 SepI 위치를 이용하여 N 말단과 C 말단을 연결하여 플라스미드 pGNR5를 완성하였다(data not shown). 이 새로운 유전자를 포함한 DNA 단편을 이래이즈 어 베이스 시스템(Erase-a Base System, 프로메가 사)을 이용하여 순차적으로 절단하고 생거의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463, 1977)을 사용하여 염기서열을 밝혔다. 그 결과는 도 1에 나타낸 바와 같다. 또한, 도 2에 나타난 바와 같이 nr5 유전자는 719개의 아미노산을 코딩하고 있으며 단백질의 분자량이 81.4KD로 추정된다. 이 유전자의 시작 코오돈의 7bp 앞에는 전형적인 리보좀 결합0부위가 존재하며 대부분의 cry 유전자에서 발견되는 5개의 블록이 잘 보존되어 있다. 이 새로운 유전자를 기존의 다른 cry1I 유전자의 아미노산 서열과 비교 분석해 본 결과 cry1Ia 및 cry1Ib와 각각 89.6%와 87.1%의 상동성을 보였다.Third, the cloned gene, which was divided into two DNA fragments by the above method, completed the plasmid pGNR5 by connecting the N-terminus and the C-terminus using the SepI position (data not shown). DNA fragments containing this new gene were sequentially cut using the Erase-a Base System (Promega) and the Sanger method (Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463, 1977) was performed. The base sequence was used. The result is as shown in FIG. In addition, as shown in FIG. 2, the nr5 gene encodes 719 amino acids, and the molecular weight of the protein is estimated to be 81.4 KD. There is a typical ribosome binding 0 site 7bp before the start codon of this gene, and the five blocks found in most cry genes are well conserved. The new gene was compared with the amino acid sequence of the other cry1I genes and showed 89.6% and 87.1% homology with cry1Ia and cry1Ib, respectively.

실시예 2. nr5 유전자의 발현Example 2. Expression of the nr5 Gene

대장균에서 nr5 유전자를 발현시키기 위하여 본 발명자들은 강력한 프로모타인 tac 프로모타 뒤에 nr5 유전자를 삽입하였다. 대장균에서는 리보좀 결합부위와 해독개시 코오돈 사이의 거리가 유전자의 발현에 매우 중요하므로 이 거리를 맞추기 위해 먼저 두가지 프라이머, nr5a (5'-TCCCCCGGGATGAAAGAATCAAAA-3')와 nr5b (5'-CCTTTHGGGCCAAAGCTCACC-3')를 이용하여 nr5 유전자의 N말단을 증폭하였다. 이때 프라이머 nr5a는 SmaI 제한효소 인지 부위를 갖도록 설계하였다. 증폭된 DNA 단편은 플라스미드 pGNR5상의 nr5 유전자의 N 말단과 대체시킨후 전체 nr5 유전자를 플라스미드 pKK223-3(파마시아 사)의 SmaI과 PstI 부위에 삽입시켜 플라스미드 pKNR5S를 완성하였는데 그 결과는 도 3에 나타내었다.In order to express the nr5 gene in E. coli, we inserted the nr5 gene after the strong promoter tac promoter. In Escherichia coli, the distance between the ribosome binding site and the initiation codon is very important for gene expression. ) Was amplified N terminal of the nr5 gene. At this time, the primer nr5a was designed to have a SmaI restriction enzyme recognition site. The amplified DNA fragment was replaced with the N terminus of the nr5 gene on the plasmid pGNR5, and the entire nr5 gene was inserted into the SmaI and PstI sites of the plasmid pKK223-3 (Pharmacia) to complete the plasmid pKNR5S. The results are shown in FIG. .

또한, 플라스미드 pKNR5S를 함유한 대장균의 전체 단백질을 단백질 전기영동으로 확인한 결과 도 4에서 보는 바와 같이 약 81kD 정도의 독소 단백질 밴드를 확인하였는데 이는 nr5 유전자가 대장균 내에서 높은 수준으로 발현이 되었음을 나타낸다. 플라스미드 pKNR5S가 도입된 형질전환된 대장균을 한국과학기술원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 11월 26일자로 기탁번호 KCTC 8854P로 기탁하였다.In addition, as a result of protein electrophoresis of the whole protein of E. coli containing plasmid pKNR5S, a toxin protein band of about 81 kD was confirmed as shown in FIG. 4, indicating that the nr5 gene was expressed at high levels in E. coli. The transformed Escherichia coli with the plasmid pKNR5S was deposited in the Korean Institute of Science and Technology Gene Bank of Korea Institute of Science and Technology under the accession number KCTC 8854P as of November 26, 1997.

실시예 3. Nr5 독소 단백질의 살충성 검정Example 3. Insecticidal Assay of Nr5 Toxin Protein

대장균에서 발현된 Nr5 독소단백질은 배추좀나방을 대상으로 살충성 검정을 실시하였는데 살충성 검정은 신 등의 방법(Appl. Environ. Microbiol. 61, 2402-2407, 1995)에 따라 수행하고 배추잎을 먹이로 사용하였다. 실험결과, 도 5에서 보는 바와 같이 대장균에서 발현된 Nr5 독소단백질은 배추좀나방에 대해 살충성이 있음을 확인할 수 있었다.Nr5 toxin protein expressed in Escherichia coli was carried out in the insecticidal assay of Chinese cabbage moth. The insecticidal assay was performed according to the method of Shin et al. (Appl. Environ. Microbiol. 61, 2402-2407, 1995) Used as food. As a result, as shown in FIG. 5, the Nr5 toxin protein expressed in Escherichia coli was found to be insecticidal against the cabbage moth.

이상 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명의 바실러스 츄린겐시스 아종 모리소니로부터 분리한 독소단백질 nr5 유전자는 기존의 Bt 독소단백질 유전자와 염기서열 및 아미노산서열이 상이한 신규한 유전자이며, 이로부터 발현된 단백질은 배추좀나방에 대해서 살충활성을 가지고 있어 배추좀나방 및 다른 나비목해충의 제어에 뛰어난 효과가 있어 생물농약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.As described through the above examples, the toxin protein nr5 gene isolated from the Bacillus thuringiensis subspecies mori sony of the present invention is a novel gene having a different base sequence and amino acid sequence from the existing Bt toxin protein gene, and a protein expressed therefrom. Has insecticidal activity against Chinese cabbage moth and has an excellent effect on the control of Chinese cabbage moth and other butterfly wood pests and is a very useful invention in the biopesticide industry.

Claims

A toxin protein nr5 gene having the following nucleotide sequence isolated from Bacillus thuringiensis subspecies Morrison.

The nr5 gene of claim 1, wherein the nr5 gene is isolated from Bacillus thuringiensis subspecies Morrison, having a coding region extending from base 501 to 2660 in the base sequence of the gene.

The nr5 gene having the following amino acid sequence isolated from Bacillus thuringiensis subspecies mori sony.

Lepidoptera toxic recombinant protein expressed by the nr5 gene isolated from Bacillus thuringiensis subspecies Morrisony.

5. The lepidopteran protein of claim 4, wherein the recombinant protein has insecticidal properties against cabbage myth moths.

Plasmid pKNR5S by inserting the nr5 gene into the SmaI and PstI sites of plasmid pKK223-3.

E. coli strain (KCTC 8854P), which is transformed with a recombinant plasmid carrying the nr5 gene.

An insecticide composition comprising agriculturally available receptors and a pure culture of Escherichia coli, or a lenothymotoxic protein produced by E. coli.

A control method of lepidoptera insects, characterized in that the insecticide effective amount of lepidoptera toxic protein is sprayed on the host plant of the lepidoptera insects.

10. The method of claim 9, wherein the lepidopteran toxic protein is contained in Escherichia coli.