KR100250837B1 - Recombinant adenovirus producing thymidine kinase of herpes simplex virus-1 and its usage - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: Provided is an expression vector for manufacturing recombinant Adenovirus which kills cancer cells or inhibits the growth of the cells and is thus useful for anticancer treatments. CONSTITUTION: An expression vector for manufacturing recombinant Adenovirus is provided by the following steps of: i) cutting plasmid pX1 inserted with BamH1 segment having TK gene of HSV1, with restriction enzymes Bgl II and EcoRI to obtain 1.3kb TK gene and 2.3kb DNA segment; ii) inserting the DNA segment into BamH1 and EcoR1 site of plasmid pCMV having 1.16kb CMV promoter to obtain pCMV/TK plasmid; iii) cutting the plasmid with restriction enzyme Xbal to obtain 3.7kb segment; and iv) inserting the 3.7kb segment into Xbal site of Adenovirus transfer plasmid pXCX2 to manufacture expression vector pX/CMV/TK.

Description

헤르페스 심플렉스 바이러스 타입 1 의 싸이미딘 키나제를 생산하는 재조합아데노바이러스 및 이를 항암 치료에 사용하는 용도Recombinant adenovirus that produces thymidine kinase of herpes simplex virus type 1 and use thereof for anticancer treatment

본 발명은 HSV-1 의 TK 를 생산하는 재조합 아데노바이러스 및 이를 항암 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant adenovirus that produces TK of HSV-1 and its use in anticancer therapy.

구체적으로, 본 발명은 세포를 GCV 에 민감하게 하여 세포내 DNA 중합반응을 종결시키는 것에 관련된 HSV-1 TK 유전자를 포함하는 아데노바이러스 제조용 발현벡터, 이를 이용하여 얻은 세포내에서 HSV-1 TK 를 생산할 수 있는 재조합 아데노바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 아데노바이러스 Ad/TK 는 간암, 자궁암, 폐암 등을 포함한 다양한 항암치료에 유용하게 사용될 수 있다.Specifically, the present invention provides an expression vector for adenovirus production comprising HSV-1 TK gene related to terminating intracellular DNA polymerization by sensitizing GCV cells to produce HSV-1 TK in cells obtained using the same. The present invention relates to a recombinant adenovirus and a method for producing the same, and the adenovirus Ad / TK of the present invention can be usefully used for various anticancer treatments including liver cancer, uterine cancer, lung cancer, and the like.

유전자 요법(gene therapy)은 유전자 이상에 의하여 유발되는 각종 유전병과 암 등을 치료하기 위하여, 질병과 관련이 있는 유전자를 환자의 체내에 직접적으로 주입하고 상기 유전자를 세포내에서 발현시켜 그의 기능을 정상화시키는 방법이다. 이러한 유전자 요법은 특정 유전자를 체내에 주입하여 인체 내에 새로운 기능을 부여할 수 있으므로 치료이외에 각종 질병을 예방하거나 치료 효과를 강화하는데도 널리 이용될 수 있다.Gene therapy is a method of treating various genetic diseases and cancers caused by genetic abnormalities, injecting genes related to the disease directly into the patient's body and expressing the genes in cells to normalize their function. This is how you do it. These gene therapies can be given a new function in the human body by injecting a specific gene in the body and thus can be widely used to prevent various diseases or enhance the therapeutic effect in addition to treatment.

유전자 요법으로 질병을 치료하는데 있어서 가장 중요한 요건은 주입된 유전자가 성공적으로 목표 세포의 핵에 전달되어 이로부터 유전자가 다량으로 발현되는 것이다. 이 때 사용된 유전자는 목표 세포에 도달하여 엔도사이토시스(endocytosis)라는 과정을 거쳐 세포 내부로 들어간 다음 핵내로 전달되어 발현된다. DNA 자체로 이루어진 유전자는 세포를 통과하는 효율이 극히 떨어지므로 리포좀(liposome)과 같은 운반체를 사용하여 유전자를 주입할 수도 있는데 이 경우에는 핵으로 전달되는 과정에 리포좀이 대부분 파괴되어 그 효율이 떨어진다.The most important requirement in treating diseases with gene therapy is that the injected gene is successfully delivered to the nucleus of the target cell, from which a large amount of gene is expressed. The gene used at this time reaches the target cell, enters into the cell through a process called endocytosis, and is then delivered into the nucleus for expression. Genes made of DNA itself are extremely inefficient through the cell, so the gene can be injected using a carrier such as a liposome. In this case, most of the liposomes are destroyed in the process of being delivered to the nucleus, thereby decreasing the efficiency.

하지만, 인체에 감염성이 있는 바이러스를 이용하면 세포내에 외래 유전자를 효과적으로 주입할 수 있으므로 바이러스를 유전자 요법에 응용하는 것이 매우 바람직하다. 구체적으로, 치료에 사용될 수 있는 유전자를 유전자 재조합 방법으로 바이러스 DNA 에 삽입하고 이를 자신의 게놈으로 하는 바이러스를 생체외에서 대량 생산하여 인체에 직접적으로 감염시킴으로써 세포내에 효율적으로 원하는 유전자를 전달하여 발현시킬 수 있다. 특히, 아데노바이러스는 세포의 핵내에 그의 유전자를 전달하는 특별한 기전을 가지고 있어 다른 바이러스 보다 그의 DNA 를 핵내에 전달하는 효율이 높으므로 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있다.However, if a virus infecting the human body is used, the foreign genes can be effectively injected into the cells, so it is highly desirable to apply the virus to gene therapy. Specifically, genes that can be used for treatment can be inserted into viral DNA by genetic recombination and mass production of viruses using their genomes in vitro and directly infected by the human body can efficiently deliver and express desired genes in cells. have. In particular, adenoviruses have a special mechanism for delivering their genes in the nucleus of cells, and thus can be usefully used for gene therapy because they have a higher efficiency of delivering their DNA into the nucleus than other viruses.

항암 치료에 사용될 수 있는 유전자 요법은 크게 5가지 방식으로 나누어 볼 수 있다(Culver K.W., Blaese R.M., Gene therapy of cancer. Trends in Genetics 1 : 149-151, 1994). 첫째, 사이토카인(cytokine) 유전자를 암세포에 주입하여 암에 대한 면역성과 관련이 있는 T 세포를 자극하는 방식으로 이 때 사이토카인 유전자로는 인터루킨-2, 인터루킨-4, 종양 사멸 인자, 과립구-대식구 콜로니-자극 인자 및 인터페론-γ 등이 유용하게 사용될 수 있다. 둘째, 인체 조직과 적합하지 않은 HLA 유전자를 발현할 수 있는 벡터를 암이 있는 부위에 직접 주입하여 생체에서 면역 반응이 유발되게 하는 방식이 있다. 셋째, 다제내성 (multidrug resistance, MDR) 유전자를 골수의 모세포에 주입하여 발현시킴으로써 화학치료법(chemotherapy)을 높은 농도로 사용하는 경우에도 골수를 효과적으로 보호할 수 있는 방식이 있다. 넷째, 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene)를 세포에 주입하여 발현시키는 방식으로, 이 때 p53 유전자 및 안티센스 k-ras 유전자 등이 사용될 수 있다.Gene therapies that can be used for chemotherapy can be broadly divided into five ways (Culver K.W., Blaese R.M., Gene therapy of cancer.Trends in Genetics 1: 149-151, 1994). First, cytokine genes are injected into cancer cells to stimulate T cells associated with cancer immunity. The cytokine genes are interleukin-2, interleukin-4, tumor killing factor, and granulocyte-macrophage. Colony-stimulating factors, interferon-γ, and the like may be usefully used. Second, there is a method of inducing an immune response in vivo by directly injecting a vector capable of expressing an unsuitable HLA gene into human tissue to a cancerous site. Third, by injecting and expressing a multidrug resistance (MDR) gene into the parental cells of the bone marrow, there is a method that can effectively protect the bone marrow even when a high concentration of chemotherapy is used. Fourth, the tumor suppressor gene (tumor suppressor gene) is injected into the cell to express, in this case, p53 gene and antisense k-ras gene and the like can be used.

다섯째, 세포를 죽이는 자살 유전자(suicide)를 암세포에 직접 주입하여 발현시키는 방식으로, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus)의 싸이미딘 키나제(thymidine kinase)와 뉴클레오타이드 아날로그인 갠사이크로비르를 이용하여 왕성하게 증식하는 암세포의 DNA 합성을 정지시킴으로써 세포의 사멸을 유도할 수 있다. HSV TK 효소는 뉴클레오사이드 동족체 GCV 를 인산화시켜 모노포스페이트 형태로 전환시킨다. GCV 모노포스페이트는 세포가 갖고 있는 효소에 의해 트리포스페이트 형태로 전환되고 이 물질은 세포의 DNA 가 복제될 때 DNA 중합 반응을 종결시켜 세포를 죽게 한다.Fifth, the suicide gene that kills cells is injected directly into cancer cells, and is actively expressed using the thymidine kinase of the herpes simplex virus and the nucleotide analog gancyclovir. By stopping the DNA synthesis of cancer cells that proliferate rapidly, cell death can be induced. HSV TK enzymes phosphorylate the nucleoside homolog GCV and convert it to monophosphate form. GCV monophosphate is converted into triphosphate by an enzyme in the cell, which terminates the DNA polymerization reaction when the cell's DNA is replicated, causing the cell to die.

HSV TK 효소는 세포가 갖고 있는 TK 효소보다 GCV 를 1000 배 이상 효율적으로 인산화 시킨다. 따라서 HSV TK 유전자를 암세포에 도입시킨 후 GCV 로 처리하면 암세포는 빠른 시간내에 죽게 되는 것이다.HSV TK enzymes phosphorylate GCV 1000 times more efficiently than TK enzymes in cells. Therefore, if the HSV TK gene is introduced into cancer cells and treated with GCV, the cancer cells die quickly.

이에 본 발명자들은 유전자 요법(gene therapy)으로 종양을 치료하는 효과적인 방법을 개발하기 위하여, HSV 의 TK 유전자를 아데노바이러스의 E1 유전자 부위에 도입된 아데노바이러스 제조용 발현벡터를 이용하여 인체 세포에서 암세포를 죽일 수 있는 TK 유전자가 도입된 재조합 아데노바이러스를 제조한 다음 이 재조합 아데노바이러스로 감염된 사람의 암세포가 TK 유전자의 발현으로 인하여 GCV 에 민감하게 되어 사멸되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.In order to develop an effective method for treating tumors by gene therapy, the present inventors use an expression vector for adenovirus production to introduce a TK gene of HSV into the E1 gene region of adenovirus to kill cancer cells in human cells. The present invention was completed by preparing a recombinant adenovirus into which the TK gene was introduced, and then confirming that cancer cells of humans infected with the recombinant adenovirus become sensitive to GCV and die due to expression of the TK gene.

본 발명은 세포를 GCV 에 민감하게 하여 세포내 DNA 중합반응을 종결시키는 것에 관련된 HSV-1 TK 유전자를 포함하는 아데노바이러스 제조용 발현 벡터, 이를 이용하여 얻은 세포내에서 HSV-1 TK 를 생산하는 재조합 아데노바이러스 및 그의 제조방법 그리고 이를 항암치료에 사용하는 용도를 제공함에 그 목적이 있다.The present invention provides an expression vector for adenovirus production comprising the HSV-1 TK gene, which is involved in terminating intracellular DNA polymerization by sensitizing cells to GCV, and recombinant adenosine that produces HSV-1 TK in cells obtained using the same. An object of the present invention is to provide a virus, a method for producing the same, and a use thereof for anticancer treatment.

도 1 은 사이토메갈로 바이러스의 초기 발현 유도 프로모터와 헤르페스 심플렉스 바이러스 타입 1 (herpes simplex virus-1: 이하 "HSV-1" 으로 약함)의 싸이미딘 키나제 (thymidine kinase : 이하 "TK" 로 약함) 유전자를 인간 아데노바이러스의 E1 유전자 부위에 도입시키는 재조합 아데노바이러스 Ad/TK 의 제조과정을 나타낸 것이고,Figure 1 shows the early expression induction promoter of cytomegalovirus and thymidine kinase (weakly referred to as "TK") gene of herpes simplex virus type 1 (weakly referred to as "HSV-1"). Shows a process for producing a recombinant adenovirus Ad / TK, which introduces the A1 gene region of human adenovirus,

도 2 는 Ad/TK 바이러스 및 대조 Ad/△E1 바이러스를 간암 세포주 HepG2 에 40 MOI (multiplicity of infection)로 감염시킨 후 갠사이크로비르(gancyclovir : 이하 "GCV"로 약함)로 처리하였을 때 Ad/TK 바이러스로 감염된 HepG2 세포만이 사멸되는 것을 나타낸 것이고,FIG. 2 shows Ad / TK virus and control Ad / ΔE1 virus infected with liver cancer cell line HepG2 at 40 MOI (multiplicity of infection) and then treated with gancyclovir (hereinafter referred to as “GCV”). Only killing HepG2 cells infected with TK virus,

도 3 은 Ad/TK 및 Ad/△E1 바이러스 40 MOI 로 감염시킨 자궁암 세포주 헬라세포를 GCV 로 처리하였을 때 Ad/TK 바이러스로 감염시킨 헬라세포만이 사멸되는 것을 나타낸 것이고,Figure 3 shows that only the cells infected with Ad / TK virus were killed when treated with GCV uterine cancer cell line HeLa cells infected with Ad / TK and Ad / ΔE1 virus 40 MOI,

도 4 는 Ad/TK 바이러스 50 MOI 로 감염시킨 HepG2 세포주를 바이러스로 감염시키지 않은 HepG2 세포주와 함께 섞어주었을 때 감염되지 않은 세포들도 소위 구경꾼 효과(bystander effect)에 의해 사멸되는 것을 나타내는 것이고,4 shows that the uninfected cells are also killed by the so-called bystander effect when the HepG2 cell line infected with Ad / TK virus 50 MOI is mixed with the HepG2 cell line not infected with the virus.

도 5 는 Ad/TK 바이러스 50 MOI 로 감염시킨 헬라세포주를 감염시키지 않은 헬라세포주와 함께 섞어 주었을 때 감염되지 않은 세포들이 구경꾼 효과에 의해 사멸되는 결과를 나타내는 것이다.FIG. 5 shows the result that the uninfected cells were killed by the viewer effect when mixed with a non-infected HeLa cell line infected with Ad / TK virus 50 MOI.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포를 GCV 에 민감하게 하여 세포내 DNA 중합반응을 종결시키는 것에 관련된 HSV-1 TK 유전자를 포함하는 아데노바이러스 제조용 발현 벡터를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an expression vector for adenovirus production comprising the HSV-1 TK gene related to terminating intracellular DNA polymerization by sensitizing cells to GCV.

구체적으로 본 발명은 사이토메가로바이러스 (Cytomegalovirus, 이하 "CMV" 로 약함)의 초기 발현 유도 프로모터에 의해 발현되는 HSV TK 유전자를 포함하고 이들이 E1 유전자 대신에 도입된 아데노바이러스 제조용 발현 벡터 pX/CMV/TK를 제공한다.Specifically, the present invention includes an HSV TK gene expressed by an early expression inducing promoter of cytomegalovirus (hereinafter, referred to as "CMV"), and the expression vector pX / CMV / for preparing adenoviruses introduced in place of the E1 gene. Provide TK.

또한, 본 발명은 세포내에서 TK를 생산하여 항암 유전자 요법에 사용될 수 있는 재조합 아데노바이러스를 제공한다.The present invention also provides a recombinant adenovirus that can be used for anticancer gene therapy by producing TK in cells.

구체적으로 상기 발현 벡터에 의해 형질전환되어 E1 유전자 부위에 CMV 프로모터 및 TK 유전자가 도입된 재조합 아데노바이러스를 제공한다.Specifically, the recombinant vector is transformed with the expression vector to introduce a CMV promoter and a TK gene into the E1 gene region.

본 발명에서 제조한 재조합 아데노바이러스를 인간 재조합 아데노바이러스 Ad/CMV/TK 로 명명하고 이를 1997년 8월 4일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0362 BP). 이 때 상기 재조합 아데노바이러스는 E1 부위에 외래유전자가 도입되어 293 세포주를 제외하고는 세포내에 주입하였을 때 복제가 일어나지 않는다.The recombinant adenovirus prepared in the present invention was named as human recombinant adenovirus Ad / CMV / TK and deposited on August 4, 1997, at the Genetic Bank of Korea Institute of Science and Technology, Biotechnology Research Institute (Accession Number: KCTC 0362 BP). . At this time, when the recombinant adenovirus is introduced into the cell except the 293 cell line with the introduction of a foreign gene in the E1 site does not occur.

또한, 본 발명은 항암 유전자 요법에 사용될 수 있는 상기 아데노바이러스Ad/CMV/TK 를 제조하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing the adenovirus Ad / CMV / TK that can be used for anticancer gene therapy.

구체적으로 본 발명은 상기 아데노바이러스 제조용 발현 벡터를 아데노바이러스가 증식하는데 필요한 유전자를 포함하는 아데노바이러스 모체벡터와 함께 293 세포에 감염시켜 상동재조합에 의해 생성되는 재조합 아데노바이러스를 얻어 이를 동일한 293 세포주에서 증식시킨다.Specifically, the present invention infects 293 cells with the adenovirus parent vector containing the gene required for adenovirus propagation of the expression vector for adenovirus production to obtain a recombinant adenovirus produced by homologous recombination, thereby proliferating them in the same 293 cell line. Let's do it.

또한 본 발명은 상기 재조합 아데노바이러스를 암의 치료에 사용하는 용도를 제공한다. 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 특히 간암, 자궁암 및 폐암 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.The present invention also provides a use of the recombinant adenovirus in the treatment of cancer. The recombinant adenovirus of the present invention can be very useful especially in liver cancer, uterine cancer and lung cancer.

구체적으로, 본 발명은 상기 재조합 아데노바이러스를 인체내에 암이 생긴 부위에 감염시켜 암세포를 사멸시켜 암을 치료하는 항암 유전자 요법을 제공할 수 있다.Specifically, the present invention can provide anti-cancer gene therapy for treating cancer by killing cancer cells by infecting the recombinant adenovirus to a site where cancer occurs in the human body.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 세포내 DNA 중합반응을 종결시키는 것에 관련된 HSV-1 TK 유전자를 세포내에서 생산하는 재조합 아데노바이러스 및 그의 제조방법을 제공한다.The present invention provides a recombinant adenovirus for producing intracellularly produced HSV-1 TK genes involved in terminating intracellular DNA polymerization and a method of making the same.

아데노바이러스(Adenovirus)는 DNA 바이러스로서, 게놈 DNA 의 크기는 약 36kbp 이며 그 게놈에 바이러스가 증식하는데 필수적인 유전자인 E1 유전자 부위와 바이러스가 패키징되는데 필수적인 유전자 등이 포함되어 있다. 이러한 아데노바이러스가 유전자 요법에 이용되기 위해서는 바이러스가 체내에서 스스로 증식하여 온몸에 감염됨으로써 또 다른 질병이 유발되지 않도록 바이러스 증식에 사용되는 유전자를 제거하여야 한다. 따라서, 아데노바이러스 게놈 중에 바이러스가 증식하는데 관여하는 E1 유전자 부위를 제거하면 바이러스가 스스로 정상 세포에서 증식할 수 없어 아데노바이러스를 유전자 요법에 이용할 수 있다.Adenovirus is a DNA virus. The size of genomic DNA is about 36kbp, and the genome contains an E1 gene region, which is essential for virus propagation, and a gene essential for packaging the virus. In order for such adenoviruses to be used for gene therapy, the genes used to propagate the virus must be removed so that the virus multiplies itself in the body and infects the whole body. Therefore, if the E1 gene region involved in virus propagation in the adenovirus genome is removed, the virus cannot propagate itself in normal cells, and thus adenovirus can be used for gene therapy.

본 발명은 세포를 GCV 에 민감하게 하는 HSV-1 TK를 생산할 수 있는 재조합 아데노바이러스를 제조하기 위하여, 아데노바이러스의 게놈 DNA 에서 E1 유전자 부위를 제거하고 그 자리에 CMV 프로모터에 의해 발현되는 HSV TK 유전자를 대신 삽입함으로써 HSV-1 TK 를 생산할 수 있는 아데노바이러스 발현 벡터를 제조한다.In order to produce a recombinant adenovirus capable of producing HSV-1 TK that makes cells sensitive to GCV, the HSV TK gene is removed from the genomic DNA of adenovirus and expressed in place by the CMV promoter. By inserting instead of to prepare an adenovirus expression vector capable of producing HSV-1 TK.

구체적으로 본 발명은 아데노바이러스 제조용 발현 벡터를 유전공학 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 HSV-1 의 TK 유전자를 함유하고 있는 공지의 pX1 플라스미드에서 TK 유전자를 함유하고 있는 약 2.3 kb 의 DNA 절편을 분리하여 CMV 프로모터 하류(downstream)에 연결시킨 후 이들 유전자를 아데노바이러스 E1 유전자 부위에 도입함으로써 제조하였다(도 1 참조). 상기의 방법으로 제조된 본 발명의 아데노바이러스 발현벡터를 pX/CMV/TK 로 명명하였다.Specifically, the present invention provides a DNA fragment of about 2.3 kb containing the TK gene in a known pX1 plasmid containing the TK gene of HSV-1 according to a conventional method known in the field of genetic engineering. After isolation and linking downstream of the CMV promoter, these genes were prepared by introducing them into the adenovirus E1 gene site (see FIG. 1). The adenovirus expression vector of the present invention prepared by the above method was named pX / CMV / TK.

본 발명은 아데노바이러스 제조용 발현 벡터를 이용하여 재조합 아데노바이러스를 얻기 위하여, 재조합 아데노바이러스가 만들어질 수 있는 상동재조합 유도용 세포주를 상기 발현 벡터로 형질전환(transfection)시킨다. 구체적으로 상동재조합 유도용 세포주로 293 세포를 이용하는데, 293 세포는 그의 염색체 DNA 에 아데노바이러스의 E1 유전자 부위를 포함하고 있어 E1 유전자를 계속적으로 발현하고 세포에 E1 단백질을 제공한다.In the present invention, in order to obtain a recombinant adenovirus using an expression vector for producing adenovirus, a homologous recombination induction cell line capable of producing a recombinant adenovirus is transformed with the expression vector. Specifically, 293 cells are used as a cell line for homologous recombination induction, which includes the E1 gene region of the adenovirus in its chromosomal DNA, thereby continuously expressing the E1 gene and providing the E1 protein to the cell.

아데노바이러스의 게놈 DNA 은 크기가 약 36kbp 정도로 매우 커서 이의 유전자를 조작하는데 큰 어려움이 있으므로 아데노바이러스 발현 벡터에는 아데노바이러스 전체 DNA 가 아닌 일부 DNA 만을 포함시킨 다음 아데노바이러스 모체 벡터를 사용하여 이들이 증식하는데 필요한 유전자 및 단백질을 공급한다. 따라서, 본 발명은 아데노바이러스 발현 벡터로부터 세포내에서 TK 를 생산할 수 있는 아데노바이러스 클론를 제조하기 위하여 아데노바이러스 모체 벡터 pJM17 등을 이용한다.The genomic DNA of adenoviruses is very large, about 36 kbps, which makes it difficult to manipulate their genes. Therefore, the adenovirus expression vectors contain only some of the DNA, not the entire adenovirus DNA, and then use the adenovirus parent vector to propagate them. Supply genes and proteins. Accordingly, the present invention uses adenovirus parent vector pJM17 and the like to prepare adenovirus clones capable of producing TK intracellularly from adenovirus expression vectors.

본 발명의 재조합 아데노바이러스를 대량으로 증식시키기 위하여 상기 재조합 아데노바이러스를 293 세포에 감염시킨다. 구체적으로 상기 재조합 아데노바이러스를 바이러스 플락 정제법으로 순수 분리한 후 293 세포에 감염시키면 보통 한 개의 293 세포에서 약 1만개의 아데노바이러스 입자가 만들어지며 이렇게 세포내에 축적된 바이러스는 세포를 물리적으로 파쇄하고 원심 분리함으로써 순수하고 용이하게 정제될 수 있다(도 1 참조).The recombinant adenovirus is infected with 293 cells in order to multiply the recombinant adenovirus of the present invention. Specifically, when the recombinant adenovirus is purely isolated by virus floc purification and then infected with 293 cells, about 10,000 adenovirus particles are usually produced from one 293 cell, and the virus accumulated in the cell physically disrupts the cell. It can be purified purely and easily by centrifugation (see FIG. 1).

상기의 과정으로 제조된 재조합 아데노바이러스를 인간 재조합 아데노바이러스 Ad/CMV/TK 로 명명하고 1997년 8월 4일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0362BP).The recombinant adenovirus prepared by the above process was named as human recombinant adenovirus Ad / CMV / TK and deposited on August 4, 1997, at the Genetic Bank of Korea Institute of Science and Technology, Biotechnology Research Institute (Accession Number: KCTC 0362BP).

본 발명의 재조합 아데노바이러스가 세포사멸에 효과가 있어 종양억제에 유용하게 사용될 수 있는가를 조사하기 위하여, 상기 재조합 아데노바이러스Ad/CMV/TK 를 자궁암세포주인 헬라세포 및 간암세포주인 HepG2 세포에 감염시킨 후 GCV 로 처리한 결과 TK 유전자가 도입된 세포주들만이 GCV 에 의해 사멸되는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조). 따라서 본 발명의 아데노바이러스 Ad/CMV/TK 로 감염된 세포는 세포내에서 TK 유전자가 발현되어 GCV가 인산화됨으로써 왕성한 암세포의 DNA 합성을 정지시킴으로 세포의 사멸이 유도되었다는 것을 알 수 있다.In order to investigate whether the recombinant adenovirus of the present invention has an effect on apoptosis and can be usefully used for tumor suppression, the recombinant adenovirus Ad / CMV / TK is infected with Hep cells of uterine cancer cell lines and HepG2 cells of liver cancer cell lines. As a result of treatment with GCV, only cell lines into which the TK gene was introduced were confirmed to be killed by GCV (see FIGS. 2 and 3). Therefore, it can be seen that cells infected with the adenovirus Ad / CMV / TK of the present invention induced cell death by inhibiting DNA synthesis of vigorous cancer cells by expressing TK gene in the cells and phosphorylating GCV.

싸이미딘 키나제와 같은 세포자살 유도 유전자가 주입된 세포를 GCV 로 처리하였을 때 싸이미딘 키나제 유전자가 도입되지 않은 세포도 함께 사멸되는 현상을 소위 구경꾼(bystander) 효과라고 한다(Roy Smythe W. 등 Cancer Research 54 : 2055-2059, 1994).When cells injected with apoptosis inducing genes such as thymidine kinase are treated with GCV, cells that do not have the thymidine kinase gene also die together are called the bystander effect (Roy Smythe W. et al Cancer Research). 54: 2055-2059, 1994).

본 발명에서 제조된 재조합 아데노바이러스가 암 치료에 효과적으로 사용될 수 있는지를 조사하기 위하여, 상기 재조합 아데노바이러스 Ad/CMV/TK 를 헬라세포 및 HepG2 세포에 감염시킨 후 감염시키지 않은 세포들과 다양한 비율로 섞어 준 결과 감염시키지 않은 세포들이 GCV 에 의해 사멸되는 것을 확인하였다(도 4 및 도 5 참조).In order to investigate whether the recombinant adenovirus prepared in the present invention can be effectively used for cancer treatment, the recombinant adenovirus Ad / CMV / TK is infected with HeLa cells and HepG2 cells, and then mixed with the cells that are not infected in various ratios. The results confirmed that uninfected cells were killed by GCV (see FIGS. 4 and 5).

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것으로 본 발명이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. The following examples illustrate the present invention in detail and the present invention is not limited by the examples.

＜실시예 1＞ HSV-1 의 TK 유전자를 포함하는 아데노바이러스 제조용 발현 벡터의 제조<Example 1> Preparation of expression vector for adenovirus production containing the TK gene of HSV-1

HSV1 의 TK 유전자를 함유하고 있는 BamH1 절편이 도입된 공지의 플라스미드 pX1 (Wagner M. J. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 :1441-1445, 1981)을 BglⅡ 및 EcoRI 으로 처리하여 1.3 kb 의 TK 유전자와 AATAA 의 폴리아데닐레이션 신호들을 함유하고 있는 약 2.3 kb 의 DNA 절편을 분리하였다. 상기 DNA 절편을 1.16 kb 의 CMV 프로모터를 함유하고 있는 공지의 플라스미드 pCMV (Boshart, M. 등, Cell 41 :521-530, 1985) 의 BamH1, EcoRI 부위에 도입하여 pCMV/TK 플라스미드를 얻은 다음 다시 상기 플라스미드를 XbaI 으로 처리하여 약 3.7 Kb 의 절편을 분리하고 이를 공지의 아데노바이러스 트란스퍼 플라스미드 pXCX2 (Graham, FL. 등, Molecular Biotechnology 3 :207-220, 1997)의 XbaI 부위에 도입하여 아데노바이러스 제조용 발현벡터 pX/CMV/TK 를 제조하였다(도 1 참조).A well-known plasmid pX1 (Wagner MJ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445, 1981) into which a BamH1 fragment containing the TK gene of HSV1 was introduced was treated with BglII and EcoRI to achieve 1.3 kb of TK. A DNA fragment of about 2.3 kb containing the gene and polyadenylation signals of AATAA was isolated. The DNA fragment was introduced into the BamH1, EcoRI site of a known plasmid pCMV (Boshart, M. et al., Cell 41: 521-530, 1985) containing a 1.16 kb CMV promoter to obtain a pCMV / TK plasmid. The plasmid was treated with XbaI to isolate about 3.7 Kb of fragment and introduced into the XbaI site of the known adenovirus transfer plasmid pXCX2 (Graham, FL. Et al., Molecular Biotechnology 3: 207-220, 1997) for expression of adenovirus production. Vector pX / CMV / TK was prepared (see FIG. 1).

＜실시예 2＞ HSV-1 의 TK 유전자를 세포내에서 생산할 수 있는 재조합 아데노바이러스 (Ad/CMV/TK) 의 제조<Example 2> Preparation of a recombinant adenovirus (Ad / CMV / TK) capable of producing the TK gene of HSV-1 intracellularly

상기 아데노바이러스 발현벡터 pX/CMV/TK 약 2 μg 과 아데노바이러스 모체벡터 pJM17 (McGrory, WJ 등, Virology 163 :614-617, 1988) 3 - 9 μg을 칼슘 포스페이트 방법으로 상동재조합 유도용 세포주인 293 세포주에 함께 형질전환 (cotransfection) 시켜 CMV 프로모터 및 TK 유전자를 함유하는 재조합 아데노바이러스를 제조하였다(도 1 참조). 상기 재조합 아데노바이러스를 인간 재조합 아데노바이러스 Ad/CMV/TK 로 명명하고 1997년 8월 4일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0362 BP ).About 2 μg of the adenovirus expression vector pX / CMV / TK and 3-9 μg of the adenovirus parent vector pJM17 (McGrory, WJ et al., Virology 163: 614-617, 1988) were cell lines for inducing homologous recombination using calcium phosphate. The cell lines were cotransfected together to produce a recombinant adenovirus containing the CMV promoter and the TK gene (see FIG. 1). The recombinant adenovirus was named human recombinant adenovirus Ad / CMV / TK and was deposited on August 4, 1997 to the Gene Bank of Korea Institute of Science and Technology, Biotechnology Research Institute (Accession Number: KCTC 0362 BP).

＜실시예 3＞ 재조합 아데노바이러스 Ad/CMV/TK 로 감염된 간암 세포주 HepG2 세포의 GCV에 대한 민감성 조사<Example 3> Sensitivity to GCV of HepG2 cells infected with recombinant adenovirus Ad / CMV / TK

HepG2 세포를 100 mm 접시형 배양기에서 80-90%의 분포도(confluency)를 갖도록 배양한 후 한세포 당 40 MOI 의 Ad/CMV/TK 및 Ad/△E1 바이러스를 각각 실온에서 1 시간 동안 감염시킨 후 1×DMEM 배지로 1 회 세척하고 트립신으로 처리하여 단세포 현탁액을 만든 다음 10% 소태아 혈청을 함유하는 DMEM 배지(DMEM + FBS 10%)를 첨가하여 세포수가 6×104세포수/ml 이 되도록 하였다. 단세포 현탄액 100μl를 96-웰 플레이트(96-well plate) 에 분주하고 24 시간 배양한 후 배지를 제거하고 0.02, 0.2, 2, 20, 200 μM 의 GCV 를 함유하는 DMEM + FBS 10% 배양액을 첨가하고 37℃에서 5 일간 배양하였다.HepG2 cells were cultured in a 100 mm dish incubator with 80-90% confluency, then infected with 40 MOI of Ad / CMV / TK and Ad / ΔE1 virus per cell for 1 hour at room temperature, respectively. Wash once with 1 × DMEM medium, trypsin-treated to make single cell suspension, and add DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (DMEM + FBS 10%) to give 6 × 10 4 cells / ml It was. Dispense 100 μl of single cell suspension into a 96-well plate, incubate for 24 hours, remove the medium, and add DMEM + FBS 10% culture containing 0.02, 0.2, 2, 20, 200 μM of GCV. And incubated at 37 ° C. for 5 days.

생존하는 세포수를 측정하기 위하여 MTT 검정법 (Alley, M.C. 등, Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using microculture tetrazolium assay, Cancer Res. 48 : 589-601, 1988)을 수행하였다. 3-(4, 5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphemyltetrazolium bromide] 를 함유하는 50μl 의 용액을 각각의 웰에 가하고 플레이트를 4 시간 배양한 후 변화된 흡광도를 540nm에서 측정하였다(도 2 참조).MTT assay (Alley, M.C. et al., Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using microculture tetrazolium assay, Cancer Res. 48: 589-601, 1988) was performed to determine viable cell numbers. Containing 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphemyltetrazolium bromide] 50 μl of solution was added to each well and the plate was incubated for 4 hours and the changed absorbance was measured at 540 nm (see FIG. 2).

Ad/CMV/TK 바이러스로 감염된 세포는 GCV 농도에 의존적으로 2μM GCV 농도에서 75%, 20μM 농도에서 50%, 200μM GCV 농도에서 25%의 생존율을 보인 반면 Ad/△E1 바이러스로 감염된 세포나 감염되지 않은 세포는 GCV 농도에 무관하게 생존하였다.Cells infected with Ad / CMV / TK virus showed 75% survival at 2μM GCV concentration, 50% at 20μM concentration and 25% at 200μM GCV concentration, depending on the GCV concentration, while not infected or infected with Ad / ΔE1 virus. Cells that did not survive regardless of GCV concentration.

＜실시예 4＞ 재조합 아데노바이러스 Ad/CMV/TK 로 감염된 헬라세포주의 GCV에 대한 민감성 조사<Example 4> Sensitivity of GCV to HeLa Cell Line Infected with Recombinant Adenovirus Ad / CMV / TK

헬라세포주를 100mm 접시형 배양기에서 80 - 90 % 의 분포도를 갖도록 배양시키고 상기 실시예 3 에서와 동일한 방법으로 Ad/CMV/TK 바이러스를 감염시키고 96-웰 플레이트에 동일한 세포수 (6×103cells)를 분주한 후 24 시간 배양시켰다. 배지를 제거한 후 0.04, 0.4, 4, 40, 400 μM의 GCV를 함유하는 DMEM + 10% FBS 배양액을 가하고 37℃에서 5 일간 배양시킨 후 생존하는 세포수를 MTT 검색법을 이용하여 측정하였다(도 3 참조).The HeLa cell lines were cultured to have a distribution of 80-90% in a 100 mm dish incubator, infected with Ad / CMV / TK virus in the same manner as in Example 3 above, and the same cell number (6 × 10 3 cells) in 96-well plates. ) Was incubated for 24 hours. After removing the medium, DMEM + 10% FBS culture containing 0.04, 0.4, 4, 40, 400 μM of GCV was added and cultured for 5 days at 37 ° C. 3).

Ad/CMV/TK 로 감염된 세포는 GCV 농도에 의존적으로 생존율이 감소한 반면 TK 유전자가 없는 바이러스로 감염시킨 세포나 바이러스로 감염되지 않은 세포의 생존율에는 변화가 없었다.Cells infected with Ad / CMV / TK showed a decreased survival rate depending on GCV concentration, whereas there was no change in the survival rate of cells infected with or without virus.

따라서 간암 세포주의 경우와 유사하게 본 발명의 Ad/CMV/TK 로 감염된 헬라세포는 세포내에서 TK 유전자가 발현되어 GCV가 인산화됨으로써 왕성한 암세포의 DNA 합성을 정지시킴으로 세포의 사멸이 유도되었다는 것을 알 수 있다.Therefore, similar to the case of liver cancer cell line, HeLa cells infected with Ad / CMV / TK of the present invention, the expression of the TK gene in the cell GCV phosphorylated by stopping the synthesis of vigorous cancer cells, it can be seen that the death of cells was induced. have.

＜실시예 5＞ 재조합 아데노바이러스 Ad/CMV/TK 로 감염된 세포주의 구경꾼 효과 (bystander effect) 조사<Example 5> Examination of the bystander effect of cell lines infected with recombinant adenovirus Ad / CMV / TK

본 발명에서 제조된 Ad/CMV/TK 가 구경꾼 효과를 나타내는지를 알아보기 위하여, HepG2 세포를 50 MOI 의 Ad/CMV/TK 로 바이러스 감염시킨 후 감염된 세포와 감염되지 않은 세포를 1:0, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:5, 1:10, 1:20, 1:100, 0:1의 비율로 섞어주어 전체 세포수가 96-웰 플레이트에 2×104/웰 이 되도록 가하고 24 시간 동안 배양시킨 후 배양액을 제거하고 20 μM GCV를 함유하는 DMEM + 10% FBS를 가하여 5 일간 배양시켰다.In order to determine whether the Ad / CMV / TK prepared in the present invention has a viewer effect, after infecting HepG2 cells with 50 MOI of Ad / CMV / TK, the infected and uninfected cells were 1: 0, 3: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 5, 1:10, 1:20, 1: 100, 0: 1 2 × 10 4 / well was added and incubated for 24 hours, and then the culture medium was removed and incubated for 5 days by adding DMEM + 10% FBS containing 20 μM GCV.

생존하는 세포수를 MTT 검색법을 수행하여 측정하였다(도 4 참조). 그 결과 감염된 HepG2 세포와 감염되지 않은 HepG2 세포의 비율이 1:10 이었을 때에도 GCV 에 의한 세포 사멸이 관찰되었다.Viable cell numbers were measured by performing MTT screening (see FIG. 4). As a result, cell death by GCV was observed even when the ratio of infected HepG2 cells to uninfected HepG2 cells was 1:10.

상기와 같은 Ad/CMV/TK 및 GCV 에 의한 구경꾼 효과는 헬라세포를 이용하여 동일한 실험을 하였을 때에도 관찰되었다 (도 5 참조).The viewer effect by Ad / CMV / TK and GCV as described above was observed even when the same experiment was performed using HeLa cells (see FIG. 5).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 암세포를 사멸시키거나 성장을 억제시키는데 탁월한 효과를 나타냄을 확인할 수 있어 앞으로 암환자에게 직접 사용되는 항암 유전자 요법으로 기대가 매우 크다.As described above, the recombinant adenovirus of the present invention can be seen to exhibit an excellent effect in killing cancer cells or inhibiting growth, and thus is expected to be very anticancer gene therapy used directly in cancer patients in the future.

Claims (6)

바이러스의 증식에 관여하는 E1 유전자를 포함하지 않고 세포내에서 헤르페스 심플렉스 바이러스-1 의 싸이미딘 키나제를 생산할 수 있는 아데노바이러스 발현 벡터.An adenovirus expression vector capable of producing the thymidine kinase of herpes simplex virus-1 in a cell without including the E1 gene involved in virus propagation. 제 1항에 있어서, 싸이미딘 키나제가 사이토메가로바이러스의 초기 발현 프로모터에 의해 발현되는 아데노바이러스 발현 벡터 pX/CMV/TK.The adenovirus expression vector pX / CMV / TK of claim 1, wherein the thymidine kinase is expressed by the initial expression promoter of cytomegalovirus. 제 1항의 아데노바이러스 발현 벡터를 293 세포에서 증식시켜 얻은 항암유전자 요법에 사용될 수 있는 인간 재조합 아데노바이러스 Ad/CMV/TK (수탁번호 : KCTC 0362 BP).Human recombinant adenovirus Ad / CMV / TK (Accession No .: KCTC 0362 BP) which can be used for anticancer gene therapy obtained by propagating the adenovirus expression vector of claim 1 in 293 cells. 제 1항의 아데노바이러스 발현 벡터를 아데노바이러스 모체 벡터 pJM17 와 함께 293 세포에 감염시켜 분리하는 제 3항의 인간 재조합 아데노바이러스의 제조방법.The method for producing a human recombinant adenovirus of claim 3, wherein the adenovirus expression vector of claim 1 is isolated by infecting 293 cells with the adenovirus parent vector pJM17. 제 3항의 인간 재조합 아데노바이러스를 암을 치료하는데 사용하는 용도.Use of the human recombinant adenovirus of claim 3 for the treatment of cancer. 제 3항의 인간 재조합 아데노바이러스를 암이 생긴 부위에 감염시켜 암을 치료하는 항암 유전자 요법.An anticancer gene therapy for treating cancer by infecting the human recombinant adenovirus of claim 3 with a cancerous site.
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