KR100249033B1 - Molecular tagging method of microorganism using dna sequence - Google Patents
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Abstract
본 발명은 DNA 염기 서열을 이용한 미생물에의 표지 부착방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 미생물에의 표지 부착방법은, 원하는 이름표의 영문 문자열에 해당하는 DNA 염기 서열을 제작하는 단계; 제작된 문자열 염기 서열을 리게이션시켜 일련의 문자열을 만드는 단계; 문자열의 양쪽에 PCR(Polymerase Chain Reaction)용 프라이머(primer)를 부착하고 그 바깥쪽에 적당한 벡터와 리게이션할 수 있는 리스트릭션 사이트(restriction site)를 붙이는 단계; 이를 제한 효소로 처리하여 스티키 엔드(sticky end)를 만드는 단계 ; 이를 동일한 제한 효소로 처리된 벡터에 삽입하는 단계; 벡터를 원하는 미생물에 형질전환시키는 단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하여, 생물학적 오염물질의 해당 생물 폐기물에 이름표를 부착하게 하거나 개발한 기관의 영문 명칭을 표지할 수 있게 함으로써 해당 영문 명칭을 알아낼 수 있어 폐기물 등의 책임소재를 밝힐 수 있을 뿐만 아니라, 새로운 유전자를 클로닝한 플라즈마나 벡터를 개발하였을 때에도 이름표를 부착하여 그 소유권을 명시할 수 있어 미생물 이용과 관련된 분쟁의 소지를 미연에 방지할 수 있는 DNA 염기 서열을 이용한 미생물에의 표지 부착방법을 제공한다.The present invention relates to a label attachment method to a microorganism using a DNA base sequence, the label attachment method to a microorganism according to the present invention comprises the steps of preparing a DNA base sequence corresponding to the English character string of the desired name tag; Ligation of the produced string sequence to create a series of strings; Attaching a primer for PCR (Polymerase Chain Reaction) to both sides of the string and attaching a restriction site capable of ligating with a suitable vector on the outside thereof; Treating it with a restriction enzyme to make a sticky end; Inserting it into a vector treated with the same restriction enzyme; Transforming the vector to a desired microorganism, wherein the English name can be determined by attaching a name tag to the biological waste material of the biological contaminant or by labeling the English name of the developed institution. In addition to identifying materials responsible for wastes, and when developing plasmas or vectors cloned with new genes, they can also be labeled with their name tag and their ownership can be prevented. Provided is a label attachment method to a microorganism using a DNA base sequence.
Description
본 발명은 DNA 염기 배열 순서를 이용한 미생물의 분자표지(Molecular tagging)방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 20종의 아미노산을 각각의 알파벳 철자로 사용하고 각 아미노산에 해당되는 DNA 염기 서열을 이용하여 생물 폐기물 등에 영문 이름표를 부착하는 방법 및 이를 이용하여 그 출처를 해석하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of molecular tagging of microorganisms using a DNA sequencing sequence. More specifically, 20 amino acids are used as the alphabetical letters and DNA sequences corresponding to the amino acids are used. The present invention relates to a method of attaching an English name tag to waste, etc., and a method of interpreting the source thereof.
인간 활동의 결과로 생산되는 폐기물에는 여러 종류가 있는바, 그 중에서도 특히 생물 폐기물은 일반 화학 폐기물 등의 무생물 폐기물과는 달리 생명체 특유의 번식력 등으로 인해 향후 운명에 대해 전혀 예측할 수 없어 이를 그대로 방치하는 경우 여러 심각한 문제들이 발생할 수도 있다. 특히 발효나 기타 생물공학적 공정의 결과로 양산되는 생물 폐기물의 경우에는 종종 유전공학적으로 변형된 생물들이 포함되어 있으므로 이들이 기존의 자연환경에 어떠한 영향을 미칠지는 누구도 예상할 수 없으며, 경우에 따라서는 심각한 생물학적 재해의 원인이 될 수 있다. 이런 경우, 원인 제공자가 엄연히 존재함에도 불구하고 그 제공자를 알아낼 방법이 없어 전혀 그 책임을 추궁할 수 없는 등 새로운 형태의 재해가 유발될 수 있다.There are many kinds of wastes produced as a result of human activities. Among them, biological wastes, unlike non-chemical wastes such as general chemical wastes, cannot be predicted for their future fate due to their unique propagation ability. Many serious problems may arise. In particular, biological wastes produced as a result of fermentation or other biotechnological processes often contain genetically modified organisms, so no one can predict how they will affect the existing natural environment, and in some cases serious It can cause biological disasters. In this case, even though the causal provider exists, there is no way to find out the provider, which can lead to a new form of disaster.
따라서 이러한 경우를 미연에 방지하기 위하여 선진 각국에서는 소위 생물공학 안전 윤리에 대한 관심이 매우 높아지고 있으며 나아가 이를 뒷받침하기 위한 제도적 장치나 규범 혹은 무공해 공법에 대한 연구도 활발히 수행되고 있다.Therefore, in order to prevent such cases, interest in so-called biotechnology safety ethics is increasing in advanced countries, and further, researches on institutional devices, norms, or pollution-free methods to support them are being actively conducted.
한편, 우리나라의 경우에도 생명 공학에 대한 관심의 증가로 인하여 현재 다량의 산업 및 생활 폐기물이 투기되는 해역에 향후 상당한 양의 생물 폐기물이 투기될 가능성이 높아지고 있다. 따라서 생명 공학의 발전에 따라 생명력과 번식력을 유지하고 있는 생물들이 폐기물의 일부로서 환경에 방출될 위험이 매우 높아질 것이다. 설혹 상기 폐기물들이 종래의 살균 절차를 거친다고 하더라도 포자 형성 등의 방법으로 그들이 살아남을 가능성은 항상 존재하고 있으며, 이러한 생물 폐기물에 의한 재해 발생시, 특히 미생물의 경우는 책임 소재라든가 그 대책에서 거의 손을 쓸 수 없는 경우가 발생할 수 있을 것이다. 또한 새로운 유전자의 개발등으로 인해 그 소유에 대한 분쟁도 증가할 수 있을 것이다.On the other hand, in Korea, due to the increased interest in biotechnology, there is a high possibility that a considerable amount of biological waste will be dumped in the future where a large amount of industrial and household waste is dumped. Thus, with the development of biotechnology, there is a very high risk that the living and reproductive organisms will be released into the environment as part of the waste. Even if the wastes go through conventional sterilization procedures, there is always a possibility that they will survive by the formation of spores, and in the event of a disaster caused by such biological wastes, especially in the case of microorganisms, they are hardly responsive. It may happen that you cannot write. In addition, the development of new genes will increase the dispute over ownership.
이에 본 발명은 상기의 우려되는 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 생물학적 오염물질의 해당 생물 폐기물의 책임 소재 등을 밝히거나 새로운 유전자를 클로닝한 플라즈마나 벡터를 개발하였을 때에 그 소유권을 명시할 수 있도록 하여 미생물 이용과 관련된 분쟁의 소지를 미연에 방지하기 위한 DNA 염기 서열을 이용한 미생물에의 분자표지 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.Accordingly, the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, so that the ownership of the biological waste material of the biological contaminants, or the development of a plasma or vector cloning a new gene can be specified so that the ownership can be specified. Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for labeling a microorganism using a DNA base sequence to prevent a dispute related to the use of a microorganism.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 미생물에의 분자표지 방법은, 20종의 아미노산을 각각의 알파벳으로하여 원하는 영문 명칭을 각 아미노산에 해당되는 DNA 염기 서열을 이용하여 미생물에 표지하게 하는 것을 특징으로 한다.A molecular labeling method for a microorganism according to the present invention for achieving the above object is characterized in that the microorganism is labeled using a DNA base sequence corresponding to each amino acid with the desired English name using 20 amino acids as the respective alphabets. It is done.
또한, 본 발명은 상기 표지된 미생물을 검출하여 이의 염기 서열에 해당하는 아미노산을 번역하여 그 출처를 밝혀내는 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized by detecting the labeled microorganism and translating the amino acid corresponding to its base sequence to find the source.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에 따른 미생물에의 분자표지 방법은, 자연계에 존재하는 20종의 아미노산이 각각 영문자 알파벳 중 20개에 해당하는 부호를 가지고 있는 것에 기초하여 이를 DNA 염기 서열, 즉 아미노산 염기 서열을 문자처럼 사용하여 일련의 단어나 문장을 DNA 염기 서열로 기술하는 것을 포함하여 구성된다. 그러나 기존 아미노산의 알파벳 부호에는 알파벳의 모음들, 즉 알라닌(해당 알파벳 A), 글루타민(해당 알파벳 E) 및 이소루이신(해당 알파벳 I)을 제외한 O와 U는 그에 대응하는 아미노산이 없어 이를 DNA 염기 서열로 표시할 수 없었다. 또한 몇 몇 자음의 경우에도 상기 O, U와 마찬가지로 그에 대응하는 아미노산이 없어 DNA 염기 서열로 표시할 수 없었다.The method for labeling a microorganism according to the present invention uses a DNA base sequence, that is, an amino acid base sequence as a letter, based on the fact that 20 amino acids in nature each have a code corresponding to 20 of the alphabets. And describing a series of words or sentences in a DNA base sequence. However, in the alphabetic code of existing amino acids, O and U, except for the vowels of the alphabet: alanine (corresponding alphabet A), glutamine (corresponding alphabet E), and isoleucine (corresponding alphabet I), do not have a corresponding amino acid, which is a DNA base. It could not be represented by sequence. In addition, in the case of some consonants, there was no amino acid corresponding to O and U, so that it could not be expressed by DNA nucleotide sequence.
따라서 본 발명자는 아래 표 1과 같이 알파벳 26자에 해당하는 아미노산과 이에 해당하는 아미노산이 없는 경우에는 인접 아미노산에 해당하는 코돈(codon)으로 어사인하여 각 알파벳의 코돈을 확정하였다. 결과적으로 하기 표 1의 알파벳에 해당하는 코돈을 사용하여 영문 명칭이라면 아무런 제한없이 다양한 문자를 표현할 수 있다Therefore, the inventors have determined the codons of each alphabet by assigning them to codons corresponding to adjacent amino acids when there are no amino acids corresponding to 26 letters and the corresponding amino acids as shown in Table 1 below. As a result, if the English name using a codon corresponding to the alphabet shown in Table 1 can be expressed without a variety of characters
상기 표 1에서 알 수 있듯이 본 발명에 따른 미생물에의 표지방법에서는, 띄어쓰기를 할 수 있도록 스페이스 코돈(space codon), 문자열이 시작됨을 알리는 스타트 코돈(start codon) 및 문자열의 종료를 알리는 엔딩 코돈(ending codon)을 포함하고 있다. 또한 본 발명에 있어서 각 코돈은 RNA 대신에 DNA 코돈을 사용하였다.As can be seen in Table 1, in the method for labeling microorganisms according to the present invention, a space codon (space codon), a start codon indicating the start of a string and a ending codon (end codon indicating the end of a string) to enable spacing ( ending codon). In the present invention, each codon was a DNA codon instead of RNA.
본 발명에 따른 DNA염기 서열을 이용한 미생물에의 분자 표지 방법은, 원하는 영문 명칭의 문자열에 해당하는 DNA 염기 서열을 제작하는 단계; 상기 문자열 염기 서열을 리게이션시켜 일련의 문자열을 만드는 단계; 상기 문자열의 양쪽에 PCR(Polymerase Chain Reaction)용 프라이머(primer)를 부착하고 그 바깥쪽에 적당한 벡터와 리게이션할 수 있는 리스트릭션 사이트(restriction site)를 붙이는 단계; 이를 제한 효소로 처리하여 스티키 엔드(sticky end)를 만드는 단계 ; 이를 상기 제한 효소와 동일한 제한 효소로 처리된 벡터에 삽입하는 단계; 상기 벡터를 원하는 미생물에 형질전환시키는 단계를 포함하여 구성된다.The molecular labeling method for a microorganism using the DNA base sequence according to the present invention comprises the steps of: preparing a DNA base sequence corresponding to a string of a desired English name; Ligation of the string nucleotide sequences to form a series of strings; Attaching a primer for PCR (Polymerase Chain Reaction) to both sides of the string and attaching a restriction site capable of ligating with a suitable vector on the outside thereof; Treating it with a restriction enzyme to make a sticky end; Inserting it into a vector treated with the same restriction enzyme as the restriction enzyme; Transforming the vector to a desired microorganism.
한편, 본 발명에 있어서 상기 프라이머의 염기 서열은, 공통적으로 지정된 것을 사용하거나 공인 기관에 등록하도록 하는 것이 책임 소재를 밝히는 데에 바람직하다.On the other hand, in the present invention, the base sequence of the primer is preferably used to identify the responsible material to use a commonly designated one or to register it with an authorized institution.
상기 과정을 간략화하면 다음과 같다.The above process is simplified as follows.
즉, 영문 명칭 결정→ 코돈으로 번역→ 해당 염기 서열 합성→ PCR용 프라이머 부착→ 리스트릭션 사이트 부착→ 벡터로 삽입→ 형질전환의 단계를 거쳐 완성된다.In other words, it is completed through the steps of English name determination → translation into codons → synthesis of the base sequence → attachment of PCR primers → attachment of a reactivity site → insertion into a vector → transformation.
상기 단계 중 해당 DNA 염기 서열을 합성하는 단계 및 PCR 용 프라이머를 제작하는 단계는 이를 전문적으로 제작하여 공급하는 것이 보편화되어 있으므로 원하는 염기 서열의 스트랜드를 쉽게 얻을 수 있다.Synthesis of the corresponding DNA base sequence and the step of preparing the primer for PCR is a universal production of this professionally supplied, it is easy to obtain a strand of the desired base sequence.
상기의 일련의 과정을 거쳐 영문 명칭이 표지된 생물을 얻을 수 있다. 따라서 이와같이 이름표가 부착된 미생물을 오염지역 등 해수에서 추출하여 이미 알고있는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭한 다음 염기 서열을 결정한 후 이를 아미노산 순서로 번역하면 그대로 명칭등이 결정되기에 그 출처를 파악하는 것이 용이하게 된다.Through the above-described process, the organisms labeled with the English name can be obtained. Therefore, microorganisms with name tags are extracted from contaminated areas, such as seawater, amplified using PCR primers already known, and the base sequence is determined and translated into amino acid order. It becomes easy.
또한 본 발명에 따른 미생물에의 표지방법은, 폐수중의 생물종 검출에 뿐만 아니라 새로운 유전자나 유용한 유전자를 클로닝한 플라즈마나 새로운 벡터를 개발하였을 때 리스트릭션 사이트 이외의 곳에 이름표를 부착하는데 사용함으로써 소유권을 명시해 놓을 수 있다.In addition, the labeling method for microorganisms according to the present invention can be used not only for detecting species in wastewater but also for attaching name tags to the non-listing site when developing new vectors or plasma cloning new or useful genes. You can specify.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 하기 실시예에 국한되지 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
실시예Example
우선 하기 1 내지 4의 문자에 해당하는 DNA 코돈에 따라 DNA 염기 서열을 합성하였다. 그런 다음 상기 DNA 염기 서열을 통상의 방법에 따라 센스 스트랜드(sense strand)와 안티센스 스트랜드(antisense strand)의 더블 스트랜드(double strand)로 합성하고 이를 순서대로 DNA 리가아제(ligase)를 이용하여 연결하였다.First, DNA nucleotide sequences were synthesized according to DNA codons corresponding to the letters 1 to 4 below. Then, the DNA base sequence was synthesized into a double strand of a sense strand and an antisense strand according to a conventional method, and linked in sequence using a DNA ligase.
1.KORDI1.KORDI
5′-AAGAACCGTGATATT-3′(SENSE CODON)5'-AAGAACCGTGATATT-3 '(SENSE CODON)
3′-TTCTTGGCACTATAA-5′(ANTISENSE CODON)3'-TTCTTGGCACTATAA-5 '(ANTISENSE CODON)
2. GHIIONG2. GHIIONG
5′-GGTCATCATAACAATGGT-3′(SENSE CODON)5'-GGTCATCATAACAATGGT-3 '(SENSE CODON)
3′-CCAGTAGTATTGTTACCA-5′(ANTISENSE CODON)3'-CCAGTAGTATTGTTACCA-5 '(ANTISENSE CODON)
3. KWCHO3. KWCHO
5′-AAGTGGTGTCATAAC-3′(SENSE CODON)5'-AAGTGGTGTCATAAC-3 '(SENSE CODON)
3′-TTCACCACAGTATTG-5′(ANTISENSE CODON)3'-TTCACCACAGTATTG-5 '(ANTISENSE CODON)
4. KWCHO KORDI4. KWCHO KORDI
5′-AAG-TGG-TGT-CAT-AAC-CCC-AAG-AAC-CGT-GAT-ATT-3′5′-AAG-TGG-TGT-CAT-AAC-CCC-AAG-AAC-CGT-GAT-ATT-3 ′
3′-TTC-ACC-ACA-GTA-TTG-GGG-TTC-TTG-GCA-CTA-TAA-5′3′-TTC-ACC-ACA-GTA-TTG-GGG-TTC-TTG-GCA-CTA-TAA-5 ′
이렇게 얻어진 이름표의 양쪽에 PCR용 프라이머를 부착하였다. 상기 프라이머의 양쪽 바깥쪽으로는 제한효소의 인식 염기 서열을 부착(본 실시예에서는 제한 효소로 EcoRI을 사용하였으므로 이 효소의 인지 염기서열은 5′-GAATTC-3′인바, PCR 용 프라이머의 양쪽 끝에 이 서열을 덧붙임)한 후 제한 효소로 끊어 스티키 엔드(sticky end)를 만들었다. 그런 다음 동일한 제한 효소인 EcoRI로 처리된 pUC119 벡터에 삽입하였다. 상기 벡터를 이용하여 대상 미생물을 형질 전화시켜 원하는 이름표가 부착된 미생물을 얻었다.PCR primers were attached to both sides of the thus obtained name tag. Recognition nucleotide sequences of restriction enzymes were attached to both outer sides of the primers (in this example, EcoRI was used as a restriction enzyme, so the recognition nucleotide sequence of this enzyme is 5′-GAATTC-3 ′, so that both ends of the PCR primer Sequence was added) and then cleaved with restriction enzymes to create a sticky end. It was then inserted into the pUC119 vector treated with the same restriction enzyme EcoRI. The vector was used to transform the target microorganism to obtain a microorganism having a desired name tag.
또한 역으로 상기 이름표가 부착된 미생물을 검출하여 알고 있는 프라이머를 사용하여 증폭하여 염기 서열을 결정한 후 이를 아미노산 순서로 번역하여 동일한 이름을 얻었다.On the contrary, the microorganisms attached with the name tag were detected and amplified using a known primer to determine the nucleotide sequence, which was then translated into amino acid sequence to obtain the same name.
이상에서 설명한 바와 같이 본 발명에 따른 DNA 염기 서열을 이용한 미생물에의 표지방법은, 생물학적 오염물질의 해당 생물 폐기물에 출처 등의 영문 명칭을 표지하여 배출하게 함으로써 폐수 중의 미생물을 검출하여 DNA 염기 서열을 번역함으로써 해당 영문 명칭을 알아낼 수 있게 되어 폐기물 등의 책임 소재를 밝힐 수 있을 뿐만 아니라 새로운 유전자를 클로닝한 플라즈마나 벡터를 개발하였을 때 이름표를 부착하여 그 소유권을 명시할 수 있어 미생물 이용과 관련된 분쟁의 소지를 미연에 방지할 수 있다.As described above, the method for labeling microorganisms using the DNA base sequence according to the present invention detects the microorganisms in the wastewater by labeling and discharging the biological names of the biological contaminants to the biological wastes by labeling the DNA names. By translating the name in English, it is possible to identify the material responsible for waste, etc., as well as identifying the ownership by attaching a name tag when developing a plasma or vector cloned with a new gene. Possession can be prevented beforehand.
Claims (1)
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