KR100246125B1 - Process for producing medium chain length of poly(beta-hydroxyalkanoate) copolymer - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생분해성 고분자의 일종인 중간 사슬 길이 폴리(베타-하이드록시알카노에이트) [medium-chain length poly(β-hydroxyalkanoate), 이하 " MCL PHA " 라고 약칭함]의 새로운 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 균주를 초기 세포 성장 단계 및 MCL PHA 생산 단계로 나누어 탄소원을 교체하여 순차적으로 배양함으로써 MCL PHA 를 효율적으로 생산하는 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel method for producing a medium chain length poly (β-hydroxyalkanoate) (hereinafter abbreviated as "MCL PHA"), which is a biodegradable polymer, . More particularly, the present invention relates to a method for efficiently producing MCL PHA by sequentially culturing Pseudomonas putida by replacing a carbon source by dividing the Pseudomonas putida strain into an initial cell growth step and an MCL PHA production step.
Description
폴리하이드록시알카노에이트 (polyhydoxyalkanoate)는 슈도모나스(Pseudomonas), 알칼리제네스 (Alcaligenes), 아조토박터 (Azotobacter), 바실러스(Bacillus) 속 미생물 등에서 발견되는 에너지 저장물질의 일종으로서, 배양액에 질소, 인, 황, 산소 등이 고갈되는 등 상기 미생물이 증식하는데 불리한 환경이 될 때 미생물내에 과립상으로 축적된다. 이러한 폴리하이드록시알카노에이트는 생분해성, 생체융화성 및 생체흡수성 등의 특성을 나타내므로, 농업용 고분자 소재(농약 서방제), 의료용 고분자 소재 및 포장용 소재 등으로 유용하게 사용될 수 있다(Anderson and Dawes, E. A., Microbiol. Rev., 1990, 54, 450-472).Polyhydroxyalkanoates (polyhydoxyalkanoate) is Pseudomonas (Pseudomonas), alkali jeneseu (Alcaligenes), azo Sat bakteo (Azotobacter), Bacillus (Bacillus) as a kind of energy-storage material is found for example in microorganisms, a nitrogen in the culture solution, the, Sulfur, oxygen, and the like are depleted, the microorganisms accumulate in the granules in the microorganisms when the environment becomes unfavorable to proliferation. Such polyhydroxyalkanoate exhibits properties such as biodegradability, biocompatibility and bioabsorbability, and thus can be usefully used for agricultural polymer materials (agrochemicals), medical polymer materials and packaging materials (Anderson and Dawes , EA, Microbiol. Rev., 1990, 54, 450-472).
일반적으로 폴리하이드록시알카노에이트는 크게 짧은 사슬 길이 폴리하이드록시알카노에이트 [short-chain-length poly(β-hydroxyalkanoates), 이하 " SCL PHAs " 라고 약칭함]와 중간 사슬길이 폴리하이드록시알카노에이트 (MCL PHAs) 의 두가지 종류로 분류될 수 있다. 이와 같이 생분해성 고분자 물질이 구분되는 것은 이를 생산하는 미생물의 종류, 사용되는 탄소원 및 미생물을 배양하는 조건 등에 따라 미생물내에서 이들이 다양하게 생산되기 때문이다.Generally, polyhydroxyalkanoate is referred to as short-chain-length poly (β-hydroxyalkanoates) (hereinafter abbreviated as "SCL PHAs") and intermediate chain-length polyhydroxyalkano Eight (MCL PHAs). The reason for distinguishing biodegradable polymeric materials is that they are produced in a variety of microorganisms depending on kinds of microorganisms producing the microorganisms, carbon sources used, and conditions for culturing the microorganisms.
구체적으로 SCL PHA 들은 알칼리제네스 유투로푸스(Alkaligenes eutropus), 아조토박터 비네란디(Azotobacter vinelandii), 메틸로트루프(metylotrophs) 등에서 생산되고, 이에 속하는 종류로는 폴리베타하이드록시프로필산 (poly-β-hydroxypropionate), 폴리베타하이드록시부틸산 (poly-β-hydroxybutyrate) 그리고 폴리베타하이드록시발레르산 (poly-β-hydroxyvalerate) 등이 있다. 특히 SCL PHA 들은 화학적으로 합성된 플라스틱의 일종인 폴리프로필렌 등과 그 성질이 유사하여 산업적으로 널리 응용되고 있다.Specifically, the SCL PHAs are produced from Alkaligenes eutropus , Azotobacter vinelandii , and methylotrophs , among which the poly-beta- hydroxypropyl acid (poly-β -hydroxypropionate, poly-beta-hydroxybutyrate and poly-beta-hydroxyvalerate. In particular, SCL PHAs are widely used in industry because they are similar in properties to polypropylene, a kind of chemically synthesized plastics.
MCL PHA 들은 SCL PHA 보다 세 개 내지 아홉 개 이상의 탄소 원자가 추가된 단량체 조성을 가지고, 알칸(alkane), 1-알켄 (1- alkene) 그리고 탄소수 6개 내지 12개의 알카노에이트(alkanoate) 등을 탄소원으로 이용하여 슈도모나스 올레보란스(Pseudomonas olevolans), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 등의 슈도모나스 속들에 의해서 생산된다. 이러한 MCL PHA 들은 그 잠재적인 사용 범위가 광범위하여 산업적으로 SCL PHA 와 혼합하여 사용되거나 새로운 작용을 갖는 기능성 고분자를 생산하는데 널리 응용될 수 있으므로, MCL PHA 를 고농도로 생산하는 것은 매우 관심이 집중되는 과제이다.MCL PHAs have a monomer composition with three to nine more carbon atoms added than SCL PHA and have alkane, 1-alkene and alkanoate of 6-12 carbon atoms as a carbon source And is produced by Pseudomonas olevolans , Pseudomonas putida , etc., using Pseudomonas sp . Since these MCL PHAs have a wide range of potential use, they can be widely used industrially for mixing with SCL PHA or producing a functional polymer having a new action. Therefore, the production of MCL PHA at a high concentration is a matter of great concern to be.
SCL PHA 에 대해서는 이미 영국의 제네카(Zeneca)사에서 바이오폴(Biopol)이라는 상품명으로 생산되어 판매되고 있지만, MCL PHA 에 대해서는 그 연구가 제한되어 이를 생산하는데 많은 어려움이 있었다. 지금까지 이루어진 MCL PHA 를 생산하는 연구를 살펴보면 다음과 같다. 람세이(Ramsay) 등은 슈도모나스 올레보란스(Pseudomonas oleovolans)를 소듐옥타노에이트(Na-octanoate)를 탄소원으로 이용하여 연속적으로 배양함으로써 세포내에 MCL PHA 가 축적되게 하였다. 이 때 축적률은 13% 정도이었고, 수율은 0.085(g PHA/g 옥타노에이트)로 매우 낮게 나타났다. 이 결과를 통해 탄소원으로 사용된 소듐옥타노에이트가 슈도모나스 균주에서 MCL PHA 를 생산하는데 뿐만 아니라 세포의 성장에도 이용됨을 알 수 있다 (Ramsay 등, Appl. Environ. Microbiol., 1991, 57, 625-629).SCL PHA has already been produced and marketed under the trade name of Biopol in Zeneca, UK, but the research on MCL PHA has been limited and there have been many difficulties in producing it. A study on the production of MCL PHA thus far is as follows. Ramsay et al. Continuously cultured Pseudomonas oleovolans using Na-octanoate as a carbon source to accumulate MCL PHA in the cells. At this time, the accumulation rate was about 13%, and the yield was very low as 0.085 (g PHA / g octanoate). These results show that sodium octanoate used as a carbon source is used not only for producing MCL PHA but also for cell growth in Pseudomonas strains (Ramsay et al., Appl. Environ. Microbiol., 1991, 57, 625-629 ).
또한, 푸르스팅(Preusting) 등은 옥탄을 탄소원으로 이용하여 슈도모나스 올레보란스( Pseudomonas oleovolans)를 고농도로 배양함으로써 세포내에 MCL PHA 에 축적되게 하였으며, 이 때는 축적률이 33% 로, 수율은 12.1g/l 로 나타났다. 또한 윤 등은 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)를 옥타노에이트(octanoate)를 탄소원으로 이용하여 배양함으로써, MCL PHA를 그의 축적률이 53% 이고, 수율이 1.7g/l 가 되도록 생산한 바 있다 [윤 등, Biodegradable Plastics and Polymers (Doi, Y and Fukuda, K. eds.), 1994, 400-409, Elsevier Science Publishing].In addition, Preusting et al. Have used octane as a carbon source to produce Pseudomonas olevenans Pseudomonas oleovolans) was accumulated in MCL PHA by culturing at high concentration. In this case, the accumulation rate was 33% and the yield was 12.1 g / l. In addition, Yun et al.Pseudomonas putida) Was cultivated using octanoate as a carbon source to produce MCL PHA having a degree of accumulation of 53% and a yield of 1.7 g / l (Yoon et al., Biodegradable Plastics and Polymers (Doi, Y and Fukuda, K. eds.), 1994, 400-409, Elsevier Science Publishing].
그러나 SCL PHA 가 고농도로 생산될 수 있슴에 비해 상기에서 기술한 바와 같이 MCL PHA를 생산하는 과정은 그 생산량이나 수율면에서 낮고 비효율적임을 알 수 있다. 특히 SCL PHA 의 경우에서와 같이 MCL PHA 를 고농도로 생산하기 위해서는 배양에 사용되는 탄소원을 잘 선택하는 것이 중요하다. 실제로 PHA 를 생산하는데 사용되는 탄소원인 알카노에이트 등은 가격이 비싸고, PHA 를 생산하는 과정외에 세포의 성장에도 이를 이용하며 더불어 세포의 성장을 저해하기도 하는데, 이러한 점이 MCL PHA 의 생산성을 저하시킨다고 보고된 바 있다 (Preusting 등, Biotechnol. Bioeng., 1993, 41, 550-556).However, SCL PHA can be produced at a high concentration. As described above, it can be seen that the process of producing MCL PHA is low and inefficient in terms of the yield and yield. In particular, as in the case of SCL PHA, in order to produce MCL PHA at a high concentration, it is important to select a carbon source for cultivation. In fact, alkanoate, which is the carbon source used to produce PHA, is expensive and uses it not only in the process of producing PHA but also in the growth of cells, and it also inhibits the growth of cells. This fact lowers the productivity of MCL PHA (Preusting et al., Biotechnol. Bioeng., 1993, 41, 550-556).
따라서, 슈도모나스 속 균주를 사용하여 MCL PHA 를 고농도 및 고수율로 생산하기 위해서는 가격이 저렴하면서 세포의 성장에 저해가 적은 탄소원을 사용하는 것이 매우 중요하다.Therefore, in order to produce MCL PHA at a high concentration and a high yield by using Pseudomonas sp. Strain, it is very important to use a carbon source which is inexpensive and has a low inhibition of cell growth.
본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하고자, 윤 등이 사용한 바 있는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 균주 (Biodegradable Plastics and Polymers, 400-409, 1994, Elsevier Science Publishing)를 사용하여 탄수화물과 알카노에이트를 탄소원으로 이용한 2 단계 유가 배양을 수행함으로써, MCL PHA 들을 고농도로 생산하였다. 구체적으로 포도당은 성장에 필요한 탄소원으로, 알카노에이트는 질소원과 산소가 제한된 조건에서 MCL PHA 의 합성에 필요한 탄소원으로 순차적으로 가하여 MCL PHA 를 효율적으로 생산하는 제조방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.In order to solve the above problems, the inventors of the present invention have found that a carbohydrate and an alkanoate can be obtained by using Pseudomonas putida strain (Biodegradable Plastics and Polymers, 400-409, 1994, Elsevier Science Publishing) MCL PHAs were produced at a high concentration by carrying out a second stage oil culture using carbon source. Specifically, the present invention has been completed by developing a method for efficiently producing MCL PHA by sequentially adding glucose as a carbon source necessary for growth and alkanoate as a carbon source necessary for synthesis of MCL PHA under a condition that nitrogen source and oxygen are limited.
본 발명은 미생물을 세포 성장 단계 및 폴리하이드록시알카노에이트 생산 단계로 나누어 탄소원을 순차적으로 교체하여 배양함으로써 중간 사슬 길이 폴리(베타-하이드록시알카노에이트)(MCL PHA)를 생산하는 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다.The present invention relates to a method for producing a medium chain length poly (beta -hydroxyalkanoate) (MCL PHA) by sequentially culturing microorganisms in a cell growth step and a polyhydroxyalkanoate production step, The purpose is to provide.
구체적으로, 본 발명은 1) 초기 세포 성장 단계에서는 세포 성장에 유리한 탄소원만을 사용하고, 2) MCL PHA 생산 단계에서는 공중합체를 생산하는데 이용되는 탄소원만을 사용하여 미생물에서 MCL PHA 를 효율적으로 생산하는 제조방법을 제공한다.Specifically, the present invention relates to a method of producing MCL PHA from a microorganism by using only a carbon source favorable for cell growth in the initial cell growth stage and using only a carbon source used for producing the MCL PHA in the step of producing MCL PHA ≪ / RTI >
또한, 본 발명은 초기 세포 성장 단계에서 세포 성장에 유리한 탄소원 및 소량의 알카노에이트를 이용하고 MCL PHA 생산 단계에서는 공중합체 생산에 사용되는 탄소원만을 순차적으로 이용하여 MCL PHA 를 생산하는 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing MCL PHA by using only a carbon source and a small amount of alkanoate which are advantageous for cell growth in the initial cell growth stage and sequentially using the carbon source used in the production of MCL PHA in the step of producing MCL PHA do.
본 발명은 미생물로 슈도모나스 속 균주를 사용하는 것이 바람직하고, 슈도모나스 푸티다 균주를 사용하는 것은 더욱 바람직하다.It is preferable that the present invention uses a Pseudomonas sp. Strain as a microorganism, and more preferably a Pseudomonas putida strain.
또한, 본 발명은 탄소원으로 초기 세포 성장 단계에서는 탄수화물이 바람직하고, MCL PHA 생산 단계에서는 알카노에이트를 이용하는 것이 바람직하다.In addition, the present invention is preferably a carbon source, and carbohydrates are preferable in the initial cell growth step, and it is preferable to use alkanoate in the MCL PHA production step.
상기 과정 중에 탄수화물로는 세포 성장에 유리한 포도당이 바람직하고, 알카노에이트로는 소듐옥타노에이트가 바람직하다.As the carbohydrate, glucose advantageous for cell growth is preferable. As the alkanoate, sodium octanoate is preferable.
또한, 본 발명의 제조방법 중 MCL PHA 생산 단계에서 질소원과 용존 산소를 제한하는 것이 바람직하다.In addition, it is preferable to limit the nitrogen source and dissolved oxygen in the MCL PHA production step of the production method of the present invention.
본 발명은 미생물을 이용하여 중간 사슬길이 폴리(베타-하이드록시알카노에이트) (MCL PHA)를 생산하는 제조방법을 제공한다.The present invention provides a process for producing intermediate chain length poly (beta-hydroxyalkanoate) (MCL PHA) using microorganisms.
구체적으로, 본 발명은 미생물을 세포 성장 단계 및 폴리하이드록시알카노에이트 생산 단계로 나누어 탄소원을 순차적으로 교체하는 2 단계 유가식 배양으로 MCL PHA 를 제조한다. 즉, 1) 초기 세포 성장 단계에서는 세포 성장에 유리한 탄소원을 사용하여 세포의 성장을 유도하고, 2) MCL PHA 생산 단계에서는 질소원과 용존 산소를 제한하면서 PHA 공중합체를 생산하는데 사용되는 탄소원을 순차적으로 이용함으로써 MCL PHA 를 효율적으로 세포내에 축적시킨다.Specifically, the present invention produces a MCL PHA by a two-step fed-batch culture in which a microorganism is divided into a cell growth step and a polyhydroxyalkanoate production step, and the carbon source is sequentially replaced. In the initial stage of cell growth, a carbon source favorable for cell growth is used to induce cell growth. 2) In the MCL PHA production step, the carbon source used to produce the PHA copolymer while limiting the nitrogen source and dissolved oxygen is sequentially Thereby efficiently accumulating MCL PHA in the cells.
이 때 사용되는 탄소원으로 초기 세포 성장 단계에서는 세포 성장에 유리한 탄수화물이 바람직하고, MCL PHA 생산 단계에서는 알카노에이트를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기에서 탄수화물은 포도당 등이 바람직하고, 알카노에이트는소듐옥타노에이트 등이 바람직하다. 이외에도 모든 종류의 탄수화물이 전자의 과정에 사용될 수 있고, 더불어 모든 종류의 알카노에이트가 후자의 과정에 사용될 수 있다.The carbon source used herein is preferably a carbohydrate which is advantageous for cell growth in the initial cell growth stage, and it is preferable to use alkanoate in the MCL PHA production step. The carbohydrate is preferably glucose or the like, and the alkanoate is preferably sodium octanoate or the like. In addition, all kinds of carbohydrates can be used in the process of electrons, and all kinds of alkanoates can be used in the latter process.
보다 상세하게는 본 발명의 제조방법은 다시 두 가지로 나누어 볼 수 있다. 그 첫 번째 방법은 초기 세포 성장 단계에서 세포 성장에 사용되는 탄소원으로 탄수화물만을 사용하고, MCL PHA 생산 단계에서는 탄소원으로 알카노에이트만을 사용하여 MCL PHA 를 생산하는 제조방법이다. 그리고 두 번째 방법은 초기 세포 성장 단계에서 탄소원으로 탄수화물 및 소량의 알카노에이트를 함께 사용하고, MCL PHA 생산 단계에서는 알카노에이트만 사용하여 MCL PHA 를 생산하는 제조방법이다.More specifically, the manufacturing method of the present invention can be divided into two. The first method is a method for producing MCL PHA by using only carbohydrate as a carbon source for cell growth in the early cell growth stage and using only alkanoate as a carbon source in MCL PHA production step. The second method is a method for producing MCL PHA by using carbohydrate and a small amount of alkanoate as a carbon source in the initial cell growth step and using only alkanoate in the MCL PHA production step.
또한, 본 발명의 제조방법은 중간 사슬 길이 폴리(베타-하이드록시알카노에이트)(MCL PHA)를 생산하는데 적합한 슈도모나스 속 균주를 사용한다. 구체적으로 본 발명은 윤 등이 선별한 바 있는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) BM01 균주를 사용하여 MCL PHA 를 제조한다 [Biodegradable Plastics and Polymers ((Doi, Y and Fukuda, K), 400-409, 1994, Elsevier Science Publishing].Further, the production method of the present invention uses a Pseudomonas sp. Strain suitable for producing medium chain length poly (beta-hydroxy alkanoate) (MCL PHA). Specifically, the present invention produces MCL PHA using Pseudomonas putida BM01 strain selected by Yun et al. (Biodegradable Plastics and Polymers, (Doi, Y and Fukuda, K), 400-409, 1994 , Elsevier Science Publishing].
본 발명은 슈도모나스 푸티다 BM01 균주를 초기 세포 성장 단계에서는 포도당과 그외 영양분이 포함된 배지에서 암모니아수 등으로 pH 를 조절함과 동시에 질소원을 공급하여 적당한 통기량과 교반속도로 배양한다. 이 때 세포 배양액내에 적당한 포도당 농도 및 용존 산소량이 유지되도록 한다. 다음 MCL PHA 생산 단계에서는 탄소원을 알카노에이트로 교체하면서 세포 배양액내 그 농도를 적당히 유지시키고, 질소원을 고갈시키기 위해 4N NaOH/KOH 등으로 pH 를 조절한다. 이 때, 통기량 및 교반속도를 낮게 유지하여 용존 산소를 고갈시키고 MCL PHA 가 원활하게 생산되도록 한다.In the present invention, the pH of the Pseudomonas putida BM01 strain is regulated by using ammonia water or the like in a medium containing glucose and other nutrients in an initial cell growth step, and a nitrogen source is supplied, followed by culturing at a proper aeration rate and stirring speed. At this time, proper glucose concentration and dissolved oxygen amount are maintained in the cell culture fluid. In the next MCL PHA production stage, the carbon source is replaced with alkanoate and the pH is adjusted with 4N NaOH / KOH to deplete the nitrogen source. At this time, the aeration amount and the stirring speed are kept low, so that dissolved oxygen is exhausted and the MCL PHA is smoothly produced.
질소원과 용존 산소가 고갈되고 난 다음 24시간 이내에 축적된 MCL PHA 양은 18.6g/l 에 달하고, 이 때 옥타노에이트를 사용하여 얻어진 PHA 의 축적률은 0.4(g PHA/g 옥타노에이트)를 상회한다. 상기 MCL PHA 들을 함유한 세포를 수확하여 그 조성을 가스 크로마토그래피(gas chromatography)로 조사한다. 상기 방법에 의하여 본 발명에서 얻은 PHA 는 하이드록시헥사노에이트(hydroxyhexanoate), 하이드록시옥타노에이트 (hydroxyoctanoate), 하이드록시데카노에이트(hydroxydecanoate) 등으로 구성되고, 상기 공중합체의 단량체 몰분율은 각각 10-15% 하이드록시헥사노에이트, 82-88% 하이드록시옥타노에이트, 0-6.5% 하이드록시데카노에이트임을 확인한다.The accumulated amount of MCL PHA accumulated within 24 hours after depletion of nitrogen source and dissolved oxygen reached 18.6 g / l, and the accumulation rate of PHA obtained using octanoate was 0.4 (g PHA / g octanoate) do. Cells containing the MCL PHAs are harvested and their composition is examined by gas chromatography. The PHA obtained in the present invention by the above method is composed of hydroxyhexanoate, hydroxyoctanoate, hydroxydecanoate and the like, and the monomer mole fraction of the copolymer is 10 -15% hydroxyhexanoate, 82-88% hydroxyoctanoate, 0-6.5% hydroxydecanoate.
반면, 초기 세포 성장 단계에서도 옥타노에이트를 탄소원으로 사용한 경우는 옥타노에이트로부터 공중합체가 생산되는 수율이 28% (wt/wt) 이하로 매우 낮음을 확인할 수 있다. 이는 옥타노에이트가 초기 세포 성장 단계에서 세포가 증식하는데 주로 사용되었기 때문이다.On the other hand, when octanoate was used as a carbon source in the initial cell growth stage, it was confirmed that the yield of the copolymer from octanoate was 28% (wt / wt) or less. This is because octanoate was mainly used for cell proliferation in the early stage of cell growth.
또한, 본 발명은 초기 세포 성장 단계에서 탄소원으로 탄수화물 및 소량의 알카노에이트를 세포 배양액에 첨가하고, MCL PHA 생산 단계에서는 알카노에이트만을 첨가하여 균주를 배양하여 MCL PHA 를 제조한다. 이 때 세포내에 MCL PHA 공중합체가 축적된 양은 36g/l 에 달하고, 세포내 공중합체의 함유량은 65.5% (wt/wt)에 이르며, 옥타노에이트를 사용하여 얻어진 공중합체의 수율도 40% (wt/wt)로 매우 높게 나타난다. 이는 초기 세포 성장 단계에서 옥타노에이트를 포도당과 같이 공급함으로써 MCL PHA 생산 단계에서의 지연 시간이 없어져 최종적으로 축적된 MCL PHA 양도 크게 증가한 것으로 볼 수 있다.The present invention also relates to a method for producing MCL PHA by adding a carbohydrate and a small amount of an alkanoate as a carbon source to a cell culture medium in an initial cell growth step and culturing a strain by adding only alkanoate in the step of producing MCL PHA. At this time, the amount of MCL PHA copolymer accumulated in the cells reached 36 g / l, the content of intracellular copolymer reached 65.5% (wt / wt), and the yield of the copolymer obtained using octanoate was also 40% wt / wt). This suggests that the addition of octanoate to glucose at the early stage of cell growth resulted in a delay in MCL PHA production and a significant increase in MCL PHA accumulation.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.
하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.The following examples illustrate the present invention in detail and are not intended to limit the scope of the present invention.
<실시예 1> 2 단계 유가식 배양에서 MCL PHA 의 생산Example 1 Production of MCL PHA in a 2-step fed-batch culture
본 발명의 중간 사슬길이 폴리(베타-하이드록시알카노에이트) 공중합체를 제조하기 위하여, 용존 산소 분석기와 pH 조절기를 갖춘 5L 발효기(한국 발효기, 한국)를 사용하여 슈도모나스 속 균주를 유가식 배양하였다.In order to prepare the medium chain length poly (beta-hydroxyalkanoate) copolymer of the present invention, Pseudomonas sp. Strain was fed-fed using a 5 L fermenter equipped with a dissolved oxygen analyzer and a pH controller (Korean fermenter, Korea) .
본 발명의 슈도모나스 푸티다 BM01 균주를 영양배지 (1g 효모 추출물, 1.5g 영양배지) 100ml에 접종하여 30℃에서 12시간 동안 배양한 다음 그 배양액을 하기 표 1의 초기 배지 1,900ml에 첨가하였다. 이 때 통기량은 0.5 내지 250 vvm 으로 교반속도는 300 내지 1200rpm 으로 조절하였다. 초기 세포 성장 단계에서는 공급조액 3번으로 포도당과 영양분을 공급하고, 암모니아수(28%)로 pH 를 조절함과 동시에 질소원을 공급하여 세포 농도가 30g/l 정도가 되도록 배양하였다. 이 때 세포 배양액내에 포도당 농도는 10 내지 20g/l 로 유지하였으며, 용존 산소량은 10% 이상으로 유지하였다.The Pseudomonas putida BM01 strain of the present invention was inoculated in 100 ml of a nutrient medium (1 g yeast extract, 1.5 g nutrient medium) and cultured at 30 ° C for 12 hours, and then the culture was added to 1,900 ml of the initial medium shown in Table 1 below. At this time, the aeration amount was 0.5 to 250 vvm and the stirring speed was adjusted to 300 to 1200 rpm. In the initial stage of cell growth, glucose and nutrients were supplied to the feed tank 3, and the pH was adjusted with ammonia water (28%), and a nitrogen source was supplied to the cells to a cell concentration of 30 g / l. At this time, the glucose concentration in the cell culture medium was maintained at 10 to 20 g / l, and the dissolved oxygen amount was maintained at 10% or more.
MCL PHA 생산 단계에서는 공급조액 4번으로 탄소원을 옥타노에이트로 교체하여 세포 배양액내 그 농도가 2.0g/l 이하가 되도록 공급하였다. 이 때 pH 조절을 위해 공급하였던 암모니아 수를 4N NaOH/KOH 로 대체하여 질소원의 고갈을 유도하였고, 통기량은 1.0vvm 으로 하고, 교반속도는 700rpm 으로 하여 용존 산소를 고갈시킴으로써 MCL PHA 가 원활하게 생산되도록 하였다.In the MCL PHA production stage, the carbon source was changed to octanoate by the feed tank liquid No. 4, and the concentration of the carbon source in the cell culture liquid was 2.0 g / l or less. At this time, the ammonia water supplied for the pH control was replaced with 4N NaOH / KOH to induce depletion of the nitrogen source, the aeration amount was set to 1.0 vvm, the stirring speed was 700 rpm, and the dissolved oxygen was depleted, Respectively.
질소원과 산소가 고갈되고 난 다음 24시간 이내에 MCL PHA 가 축적된 양은 18.6g/l 에 달하였으며, 이 때 옥타노에이트를 사용하여 얻어진 PHA 의 축적률은 0.4(g PHA/g 옥타노에이트)를 상회하였다. 상기 MCL PHA 들을 함유한 세포를 수확하여 그 조성을 가스 크로마토그래피(gas chromatography)로 조사하였다. 상기 방법에 의하여 본 발명에서 얻은 PHA 는 하이드록시헥사노에이트(hydroxyhexanoate), 하이드록시옥타노에이트 (hydroxyoctanoate), 하이드록시데카노에이트(hydroxydecanoate) 등으로 구성되고, 상기 공중합체의 단량체 몰분율은 각각 10-15% 하이드록시헥사노에이트, 82-88% 하이드록시옥타노에이트, 0-6.5% 하이드록시데카노에이트임을 확인하였다.The accumulated amount of MCL PHA was 18.6 g / l within 24 hours after depletion of nitrogen source and oxygen, and the accumulation rate of PHA obtained using octanoate was 0.4 (g PHA / g octanoate) Respectively. Cells containing the MCL PHAs were harvested and their composition was examined by gas chromatography. The PHA obtained in the present invention by the above method is composed of hydroxyhexanoate, hydroxyoctanoate, hydroxydecanoate and the like, and the monomer mole fraction of the copolymer is 10 -15% hydroxyhexanoate, 82-88% hydroxyoctanoate, 0-6.5% hydroxydecanoate.
* 상기 표 1에서 미량 원소액은 0.1N 염산 1L 당 붕산 0.3g, 염화코발트 0.2g, 황산아연 0.1g, 염화망간 30mg, 황산몰리브덴나트륨 30mg, 염화니켈 20mg 및 황산구리 10mg을 함유하는 용액이다.In Table 1, the trace elemental solution is a solution containing 0.3 g of boric acid, 0.2 g of cobalt chloride, 0.1 g of zinc sulfate, 30 mg of manganese chloride, 30 mg of sodium molybdate sulfate, 20 mg of nickel chloride and 10 mg of copper sulfate per liter of 0.1 N hydrochloric acid.
비교예 1 2 단계 유가식 배양에서 MCL PHA 의 생산Comparative Example 1 Production of MCL PHA in a two-step fed-batch culture
실시예 1는 초기 세포 성장 단계에서 포도당을 탄소원으로 사용한 반면, 본 비교예에서는 초기 세포 성장 단계에서도 옥타노에이트를 사용하였고, 나머지 과정은 실시예 1의 방법과 동일하게 수행하였다.Example 1 used glucose as a carbon source in the initial cell growth stage, while octanoate was also used in the initial cell growth stage in this comparative example, and the rest of the procedure was performed in the same manner as in Example 1.
초기 세포 성장 단계에서 공급조액 1 과 공급조액 2를 사용하여 탄소원으로 옥타노에이트를 공급하고 질소원으로 황산암모늄을 공급하여, 세포 배양액내 그들의 농도가 각각 10g/l 및 3g/l 이하가 되도록 조절한 다음 세포의 농도가 30g/l 정도가 될 때까지 배양하였다.In the initial cell growth stage, octanoate was supplied as a carbon source using Feed Tank 1 and Feed Tank 2 and ammonium sulfate was supplied as a nitrogen source to adjust their concentrations in the cell culture to 10 g / l and 3 g / l, respectively The cells were cultured until the concentration of the cells reached about 30 g / l.
MCL PHA 생산 단계는 실시예 1의 방법과 동일한 조건으로 수행하였다. 그 결과, 35시간 동안 배양한 다음 세포내에 축적된 MCL PHA 의 양은 25g/l 에 달하였으며, 이 때 세포내에 함유된 공중합체의 양은 60% (g PHA/g 건조세포중량)이었다. 상기 공중합체의 단량체 몰분율은 실시예 1과 유사하게 하이드록시옥타노에이트가 80% 이상이었으며 나머지는 하이드록시헥사노에이트와 하이드록시데카노에이트로 구성되었다.The MCL PHA production step was performed under the same conditions as in Example 1. As a result, the amount of MCL PHA accumulated in the cells after incubation for 35 hours reached 25 g / l, and the amount of the copolymer contained in the cells was 60% (g PHA / g dry cell weight). Similar to Example 1, the monomer mole fraction of the copolymer was 80% or more of hydroxy octanoate and the remainder consisted of hydroxyhexanoate and hydroxy decanoate.
상기 과정에서 옥타노에이트로부터 공중합체가 생산되는 수율이 28% (wt/wt) 이하로 매우 낮음을 확인하였다. 이는 옥타노에이트가 초기 세포 성장 단계에서 세포가 증식하는데 주로 사용되었기 때문이다.In the above procedure, it was confirmed that the yield of the copolymer from octanoate was 28% (wt / wt) or less. This is because octanoate was mainly used for cell proliferation in the early stage of cell growth.
실시예 2 2 단계 유가식 배양에서 MCL PHA 의 생산Example 2 Production of MCL PHA in a two-step fed-batch culture
실시예 1 의 과정과 동일하게 초기 세포 성장 단계에서 표 1의 공급조액 3번으로 포도당을 세포 배양액내 농도가 10 내지 20g/l 되도록 조절하면서 공급하고, 다시 공급조액 1으로 옥타노에이트를 시간당 10ml 씩 세포 배양액에 첨가하였다. 40시간 동안 배양한 다음 세포내에 MCL PHA 공중합체가 축적된 양은 36g/l에 달하였으며, 이 때 세포내 공중합체의 함유량은 65.5% (wt/wt)이었다. 또한 옥타노에이트를 사용하여 얻어진 공중합체의 수율도 40% (wt/wt)로 매우 높았고, 초기 세포 성장 단계에서 공급조액 1으로 옥타노에이트를 포도당과 같이 공급함으로써 MCL PHA 생산 단계에서의 지연 시간이 없어져 최종적으로 축적된 PHA 양도 크게 증가하였다.In the same manner as in Example 1, in the initial cell growth step, glucose was supplied to the feed tank 3 of Table 1 while the concentration in the cell culture medium was adjusted to 10 to 20 g / l, and then 10 ml of octanoate Was added to the cell culture medium. After incubation for 40 hours, the amount of MCL PHA copolymer accumulated in the cells reached 36 g / l, and the intracellular copolymer content was 65.5% (wt / wt). In addition, the yield of the copolymer obtained using octanoate was also very high at 40% (wt / wt). In addition, octanoate was supplied to the feed tank 1 in the initial cell growth stage as glucose, And the amount of accumulated PHA finally increased.
본 발명은 슈도모나스 푸티다 균주를 2 단계로 초기 세포 성장 단계에서는 가격이 저렴하고 세포 성장에 유리한 탄소원을 사용하고, MCL PHA 생산 단계에서는 질소원과 용존 산소를 고갈시키면서 알카노에이트를 탄소원으로 사용하여 배양함으로써 60% 이상의 높은 수율로 고농도의 MCL PHA 공중합체를 경제적으로 생산할 수 있다.The present invention relates to a method for producing MCL PHA comprising the steps of: (1) culturing a Pseudomonas putida strain in two steps, using a carbon source which is inexpensive in initial cell growth stage and favorable for cell growth, , It is possible to economically produce a high concentration MCL PHA copolymer with a high yield of 60% or more.
또한, 상기의 초기 세포 성장 단계에서 알카노에이트를 세포 성장을 저해하지 않을 정도로 소량 공급하면 2 단계 배양에서 탄소원을 교체함으로써 생기는 세포의 적응 시간을 줄일 수 있어서 MCL PHA 의 생산을 더욱 극대화시킬 수 있다.In addition, when the alkanoate is supplied in such a small amount as not to inhibit the cell growth in the initial cell growth step, the adaptation time of the cell caused by the carbon source change in the two-step culture can be reduced, thereby maximizing the production of MCL PHA .
본 발명은 생분해성 고분자의 일종인 중간 사슬 길이 폴리(베타-하이드록시알카노에이트) [medium-chain length poly(β-hydroxyalkanoate), 이하 " MCL PHA " 라고 약칭함]의 새로운 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel method for producing a medium chain length poly (β-hydroxyalkanoate) (hereinafter abbreviated as "MCL PHA"), which is a biodegradable polymer, .
보다 상세하게는, 본 발명은 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 균주를 초기 세포 성장 단계 및 MCL PHA 생산 단계로 나누어 탄소원을 교체하여 순차적으로 배양함으로써 MCL PHA 를 효율적으로 생산하는 제조방법에 관한 것이다.More particularly, the present invention relates to a method for efficiently producing MCL PHA by sequentially culturing Pseudomonas putida by replacing a carbon source by dividing the Pseudomonas putida strain into an initial cell growth step and an MCL PHA production step.
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