KR100232641B1

KR100232641B1 - Sh2 cytoplasmic protein tyrosine detecting method

Info

Publication number: KR100232641B1
Application number: KR1019960066859A
Authority: KR
Inventors: 한미영; 고우석; 윤선영; 이은경; 정태화; 김재원
Original assignee: 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 1996-12-17
Filing date: 1996-12-17
Publication date: 1999-12-01
Also published as: KR19980048291A

Abstract

본 발명은 사르크 유사부위 2 (Src Homology 2, 이하 " SH2 " 라고 약칭함)에 대한 결합 저해제를 탐색하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 세포 신호전달 과정에서 중요한 역할을 하는 SH2 단백질을 고형상에 부착시키고, 이에 결합하는 방사능이 표지된 인산화펩티드 모티프(motif)를 반응시킨 다음, 고형상에 부착된 방사능을 측정하는 과정으로 구성된 탐색방법에 관한 것으로서, 본 방법은 간편하여 짧은 시간내에 많은 물질을 탐색할 수 있고 비용이 적게 들어 신호전달 과정이 관여하는 질환인 암 등의 진단 및 치료와 관련하여 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a method of searching for a binding inhibitor for Sark Homology 2 (abbreviated as "SH2"). The present invention is a process of attaching the SH2 protein, which plays an important role in cell signaling, reacting a labeled phosphorylated peptide motif (motif) that binds to the solid phase, and then measuring the radioactivity attached to the solid phase. The present invention relates to a configured search method, which can be easily used in connection with diagnosis and treatment of cancer, which is a disease involving a signaling process because it can search a large amount of substances in a short time and is low in cost.

Description

Screening method of SH2 site binding inhibitor using solid phase

도 1은 본 발명의 방법에 따라 고형상에 부착시키는 SH2 부위 단백질의 농도를 증가시킨 다음 인산화펩티드가 결합하는 양상을 그의 방사능을 측정하여 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing the radioactivity of the phosphate peptide binding after increasing the concentration of the SH2 site protein attached to the solid phase according to the method of the present invention.

도 2는 본 발명의 방법에 따라 SH2 부위 단백질을 고형상에 부착시킨 다음 인산화펩티드의 농도를 증가시켜 이들이 결합하는 양상을 그의 방사능을 측정하여 나타낸 그래프이다.Figure 2 is a graph showing the binding of the SH2 site protein in the solid phase in accordance with the method of the present invention and then increasing the concentration of the phosphorylated peptide to measure their radioactivity.

도 3은 본 발명의 방법에 따라 SH2 부위에 특정한 인산화펩티드가 특이적으로 결합하는 양상을 방사능으로 표지된 인산화펩티드의 경쟁적 결합을 이용하여 조사한 그래프이다.Figure 3 is a graph of the specific binding of the specific phosphorylated peptide to the SH2 site in accordance with the method of the present invention using a competitive binding of the radiolabeled phosphorylated peptide.

[발명의상세한설명]Detailed description of the invention

[발명의목적][Objective of the invention]

본 발명은 사르크 유사부위 2 (Src Homology 2, 이하 " SH2 " 라고 약칭함)에 대한 결합 저해제를 탐색하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of searching for a binding inhibitor for Sark Homology 2 (abbreviated as "SH2").

보다 상세하게는, 본 발명은 세포 신호전달 과정에서 중요한 역할을 하는 SH2 부위 단백질을 고형상에 부착시키고, 이에 결합하는 방사능이 표지된 인산화펩티드 모티프(motif)를 반응시킨 다음, 고형상에 부착된 방사능을 측정하는 과정으로 구성된 SH2 부위에 대한 결합 저해제의 탐색방법에 관한 것으로서, 본 방법은 간편하여 짧은 시간내에 많은 물질을 탐색할 수 있고 비용이 적게 들어 세포 신호전달 과정을 조절하는 물질을 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.More specifically, the present invention attaches a SH2 site protein, which plays an important role in cellular signaling, to a solid phase, reacts a radiolabeled phosphorylated peptide motif that binds to the solid phase, and then attaches to the solid phase. The present invention relates to a method of screening a binding inhibitor for a SH2 site consisting of a process for measuring radioactivity. The method is simple and can search a large amount of material in a short time. It can be usefully used.

[발명이속하는기술분야및그분야의종래기술][Technical Field to which the Invention belongs and Conventional Technology in the Field]

암은 바이러스, 화학 물질 또는 방사선 등과 같은 발암원에 의하여 정상세포가 유전적으로 손상되어 세포의 성장과 증식에 관련된 세포 신호전달 경로에 이상이 생김으로써 유발된다. 암으로 전환되는 과정을 분자생물학적으로 살펴보면 첫째, 세포의 성장을 촉진하는 신호전달 체계에 이상이 생겨 이 과정에 필요한 세포내 물질이 활성화되지 못하는 등의 정상적인 신호전달 과정이 방해되거나 둘째, 암 유전자가 활성화되어 세포가 정상적으로 성장할 수 없거나 셋째, 세포 주기에 이상이 생겨 세포의 성장이 조절되지 못하는 등으로 크게 구분될 수 있다.Cancer is caused by genetic damage of normal cells by carcinogens such as viruses, chemicals, or radiation, resulting in abnormal cell signaling pathways involved in cell growth and proliferation. Molecular biological analysis of the process of turning to cancer may impair the normal signaling process, such as an abnormality in the signaling system that promotes cell growth and inactivation of intracellular substances required for this process. Activated cells can not be grown normally, or third, the cell cycle can be largely divided into abnormalities, such as the growth of the cells can not be controlled.

이러한 세포내 신호전달 과정에는 다양한 단백질 인산화효소가 작용하는데, 이들 인산화효소가 활성화되어 그의 기질을 인산화하고 이를 통해 다양한 생리적 반응이 유발되게 된다. 또한 세포가 정상적으로 그의 기능을 나타내기 위해서는 다양한 기관들이 상호적으로 작용하여야 하는데, 이러한 과정에 다양한 성장 인자등이 작용하여 세포 반응을 유발시키고 이를 통해 다양한 단백질들을 세포내에서 생산하게 된다. 세포내 신호전달 과정은 리간드와 수용체의 상호 작용에 의해 시작되고 이후 세포내에 존재하는 다양한 신호전달 단백질들이 상호적으로 작용하여 세포 핵내에 그 신호를 전달하고 결과적으로 특정 유전자를 발현시키게 된다. 상기 과정에서 생산된 각종 단백질들은 세포의 성장, 대사 및 분화 과정을 직접적 또는 간접적으로 조절하게 된다.In this intracellular signaling process, various protein kinases act. These kinases are activated to phosphorylate their substrates, thereby inducing various physiological responses. In addition, in order for a cell to function normally, various organs must interact with each other, and various growth factors, etc., act in this process to induce a cellular response and thereby produce various proteins in the cell. Intracellular signaling processes are initiated by the interaction of ligands with receptors, and then various signaling proteins present in the cell interact with each other to transmit their signals in the cell nucleus and consequently express specific genes. Various proteins produced in the process directly or indirectly regulate the growth, metabolism and differentiation of cells.

상기 세포내 작용들은 외부에서 전달된 신호에 의해 매개되는데, 구체적으로이러한 신호들은 수용체 타이로신 인산화효소, G 단백질과의 결합 수용체들, 사이토카인 수용체들, 이온 통로들, 세린-트레오닌 인산화효소 수용체들 그리고 키모카인 수용체 등에 의하여 세포내로 전달된다. 특히 수용체 타이로신 인산화효소에 대해서 많은 연구가 이루어져 지금까지 20여개 종류가 발견되고 그 중 10개가 암세포로 전환되는 과정과 관련이 있는 것으로 보고되었다.The intracellular actions are mediated by externally transmitted signals, specifically these signals are receptor tyrosine kinase, binding receptors with G protein, cytokine receptors, ion channels, serine-threonine kinase receptors, and It is delivered intracellularly by a chemokine receptor or the like. In particular, many studies have been conducted on receptor tyrosine kinase, and more than 20 types have been discovered and 10 of them have been reported to be related to the process of conversion into cancer cells.

구체적으로 라스 육종 바이러스(RSV)의 암 유전자인 src 산물이 단백질 타이로신 인산화효소인 것으로 보고되어, 세포를 계속적으로 증식시키는 암 유전자 산물이 타이로신 인산화효소이고 이들 효소의 활성화에 의해 세포 성장이 조절되는 것으로 확인되었다. 또한 몇몇 정상 성장인자 수용체(growth factor receptor)가 외부에서 오는 신호와 결합하는 경우, 수용체 단백질의 세포막 내부 부위가 단백질 타이로신 인산화효소로서 작용한다고 보고되어 타이로신의 인산화는 세포 성장을 조절하는 신호로서 매우 중요함을 알 수 있다.Specifically, src product, which is a cancer gene of Ras sarcoma virus (RSV), is reported to be a protein tyrosine kinase, and a cancer gene product that continuously proliferates cells is tyrosine kinase and cell growth is regulated by activation of these enzymes. Confirmed. In addition, when some normal growth factor receptors bind to external signals, it is reported that the site inside the cell membrane of the receptor protein acts as a protein tyrosine kinase, so that phosphorylation of tyrosine is very important as a signal to regulate cell growth. It can be seen.

세포 외부에서 전해지는 다양한 신호를 세포 핵내로 전달하는 과정에는 다양한 단백질 및 폴리펩티드 등이 관여한다. 이 신호전달 과정동안 외부 신호를 받는 수용체 (상피세포 성장인자, 혈소판 유래 성장인자 등)는 외부 신호에 의해서 이중 복합체로 변화하면서 타이로신 잔기가 인산화되고 이를 인지하는 세포내 신호전달 단백질들 (포스포리파제 Cγ, Shc, 포스파티딜이노시톨 3-키나제, Grb2 등)이 이들 수용체에 결합하게 된다. 특이하게도 이러한 신호전달 단백질은 인산화된 수용체의 특정 펩티드를 인지할 수 있는 100개 정도의 아미노산으로 구성된 부위를 갖는 는데, 이들 부위는 세포질 내의 타이로신 인산화효소(tyrosine kinase)인 c-Src 산물과 유사하므로 사르크 유사부위(SH2) 라고 불리운다.Various proteins and polypeptides are involved in the process of delivering various signals transmitted from outside the cell into the cell nucleus. Receptors that receive external signals (epithelial growth factor, platelet-derived growth factor, etc.) during this signaling process are transformed into double complexes by external signals, which cause tyrosine residues to be phosphorylated and recognize intracellular signaling proteins (phospholipase). Cγ, Shc, phosphatidylinositol 3-kinase, Grb2, etc.) bind to these receptors. Specifically, these signaling proteins have sites of about 100 amino acids that can recognize specific peptides of phosphorylated receptors, which are similar to the c-Src product, a tyrosine kinase in the cytoplasm. It is called the Sark-like region (SH2).

SH2 부위는 1986년에 처음 발견되었다 (Sadowski, I., Stone, J. C. 와 Pawson, T., 1986., A noncatalytic domain conserved among cytoplasmic protein-tyrosine kinase modifies the kinase function and transforming activity of Fujinami sarcoma virus p130gag-fps., Mol. Cell Biol. 6: 4396-4408). SH2 부위는 인산화된 타이로신 잔기가 포함된 짧은 아미노산 배열을 인식하는 작용을 하는데, 각 신호전달 단백질마다 포함하고 있는 SH2 부위의 종류와 수는 각기 다르다. 이는 표적 단백질에 있는 특이 펩티드를 인식하여 신호전달 단백질들 사이의 상호 작용을 유도하는 분자 스위치로 작용하므로 세포의 증식과 분화에 중요한 역할을 한다. 따라서 세포의 성장과 증식에 관련된 유전 정보가 손상되어 세포 성장에 관한 신호전달 경로에 이상이 생기는 암의 치료 등과 관련하여 신호전달 체계의 초기에 작용하는 인산화된 타이로신 및 SH2 부위를 포함하는 신호전달 단백질 간의 결합을 억제하는 저해제를 개발하려는 많은 연구가 시도되고 있다.The SH2 site was first discovered in 1986 (Sadowski, I., Stone, JC and Pawson, T., 1986., A noncatalytic domain conserved among cytoplasmic protein-tyrosine kinase modifies the kinase function and transforming activity of Fujinami sarcoma virus p130gag- fps., Mol. Cell Biol. 6: 4396-4408). The SH2 site recognizes a short amino acid sequence containing phosphorylated tyrosine residues. The signaling proteins contain different numbers and types of SH2 sites. It plays an important role in the proliferation and differentiation of cells because it acts as a molecular switch that recognizes specific peptides in target proteins and induces interactions between signaling proteins. Thus, signaling proteins containing phosphorylated tyrosine and SH2 sites that act early in the signaling system in the treatment of cancer, where genetic information related to cell growth and proliferation is impaired, resulting in abnormalities in signaling pathways related to cell growth. Many studies have been attempted to develop inhibitors that inhibit the binding of livers.

인산화된 타이로신과 신호전달 단백질 간의 특이적 결합은 인산화된 타이로신 잔기의 바로 근처에 있는 아미노산 잔기와 SH2 부위와의 상호작용으로 설명할 수 있다. SH2 부위를 포함하는 단백질의 특성을 연구하기 위하여 1993년에 Src 단백질의 SH2 부위에 대해 X-선 구조 결정방법이 시도되어 그 구조가 밝혀지고, 이를 통해 SH2 부위가 인산화된 타이로신 잔기를 인식하는 작용 기작이 알려졌다. SH2 부위를 포함하는 단백질의 아미노산 배열은 매우 특이한 것으로 나타나는데, 실제로 인산화된 타이로신 잔기를 포함하는 펩티드 혼합물로부터 Src 단백질의 SH2 부위에 결합하는 가장 적절한 인산화된 펩티드를 골라내어 이것이 pYEEI 단위체임을 규명하였다. pYEEI 단위체는 2개의 극성이면서 비염기성인 아미노산 잔기인 글루타민산과 1개의 커다란 소수성 잔기인 이소로이신으로 구성되어 있다.Specific binding between phosphorylated tyrosine and signaling proteins can be explained by the interaction of the SH2 site with amino acid residues immediately adjacent to the phosphorylated tyrosine residues. In 1993, an X-ray structure determination method for the SH2 site of the Src protein was attempted to study the properties of the protein including the SH2 site, revealing the structure, and thereby recognizing the phosphorylated tyrosine residue in the SH2 site. The mechanism is known. The amino acid sequence of the protein comprising the SH2 site appears to be very specific: from the peptide mixture comprising the phosphorylated tyrosine residues, the most appropriate phosphorylated peptide that binds to the SH2 site of the Src protein was selected and identified as the pYEEI monomer. The pYEEI monomer consists of two polar, nonbasic amino acid residues, glutamic acid and one large hydrophobic residue, isoleucine.

pYEEI 단위체를 가지고 있는 펩티드를 이용하여 Src 단백질의 SH2 부위와 이들 펩티드가 결합된 형태의 구조도 확인되었다. 펩티드 결합 부위는 2개의 나선과 1개의 β병풍 구조로 이루어진 편평한 표면인데, SH2 펩티드 복합체는 마치 2개의 돌출된 플러그 (인산화된 펩티드)가 2개의 움푹 들어간 소켓 (SH2 부위)에 들어가 있는 것과 같은 형태를 나타낸다. 특히 SH2 부위에 있는 2개의 구멍은 특징적인 결합 부위로서, 하나는 이온결합, 수소결합 및 소수성 결합으로 인산화된 타이로신과 결합하고 나머지 하나는 소수성을 갖고 있어서 주로 pYEEI 단위체의 이소로이신과 결합한다. 그러나 SH2 부위와 펩티드간의 플러그 인 소켓 관계는 5-6개의 아미노산 잔기를 초과하지 않는 작은 범위에 국한되어 있으므로 상기와 같이 꼭 들어맞는 결합이 이루어지기 위해서는 수용체의 다양한 결합 부위 및 SH2 부위를 포함하는 단백질 간의 상호 작용이 있는 것으로 보인다.Peptides containing pYEEI monomers were also used to confirm the structure of the SH2 region of the Src protein and the form in which these peptides were bound. The peptide binding site is a flat surface consisting of two helices and one β-fold structure, in which the SH2 peptide complex is like two protruding plugs (phosphorylated peptides) in two recessed sockets (SH2 sites). Indicates. In particular, the two holes in the SH2 site are characteristic binding sites, one of which binds to tyrosine phosphorylated by ionic bonds, hydrogen bonds and hydrophobic bonds, and the other, which is hydrophobic, mainly to the isoleucine of the pYEEI unit. However, since the plug-in socket relationship between the SH2 site and the peptide is limited to a small range not exceeding 5-6 amino acid residues, a protein including various binding sites and SH2 sites of the receptor is required to achieve the above-described binding. There seems to be an interaction between them.

SH2 부위를 포함하는 신호전달 단백질 중에서 Grb2 (growth factor receptor binding protein 2) 단백질은 그 작용이 가장 많이 연구되어 있는데, Grb2 단백질은 발암 유전자 ras 의 산물인 Ras 단백질의 신호 전달계의 상부에 작용하여 Ras 단백질을 활성화시키고 나아가서 하부 신호전달 단백질도 활성화시켜 세포 핵내에서 전사를 조절하는 것으로 알려져 있다. Grb2 단백질의 SH2 부위도 앞에서 언급한 바와 같이 특이한 아미노산 서열을 가지고 있는 인산화된 펩티드(pYXNX)와 결합하며 수용체 중에서 결합력이 가장 높은 (kd = 10 -100nM) 아미노산 서열은 pYVNV 서열인 것으로 나타난다.Among the signaling proteins containing the SH2 site, Grb2 (growth factor receptor binding protein 2) protein has been studied the most, the Grb2 protein acts on the upper part of the signal transduction system of Ras protein, a product of the oncogenic gene ras, Ras protein It is known to regulate transcription in the cell nucleus by activating the protein and further activating the lower signaling protein. The SH2 region of the Grb2 protein also binds to the phosphorylated peptide (pYXNX) with a specific amino acid sequence as mentioned above and the highest binding capacity (kd = 10-100 nM) among the receptors appears to be the pYVNV sequence.

이러한 Grb2 단백질을 이용하여 다양한 신호전달 단백질과 SH2 부위를 포함하는 단백질 간의 결합을 효과적으로 조절할 수 있는 물질을 개발하려는 연구가 다양하게 이루어졌다. 또한 SH2 부위와 신호전달 단백질 간의 결합을 억제하면 그들의 상호 작용을 조절할 수 있으므로 이들의 결합을 억제하는 저해제를 탐색하는 방법 등에 대하여 최근 수년전부터 활발히 연구가 이루어졌다. 하지만 그 성과가 아직까지 뚜렷하게 나타나지 않은 상태이다. 따라서 신호전달 과정을 조절하는 물질 및 그의 탐색방법으로서 보다 간편하고 빠르면서 비용이 적게 드는 방법이 개발되어야 하며 특히 이들 과정을 자동화할 수 있다면 더욱 유용할 것이다.Various studies have been made to develop a substance that can effectively regulate the binding between various signaling proteins and proteins including SH2 sites using Grb2 protein. In addition, the inhibition of the binding between the SH2 site and the signaling protein can regulate their interactions, and thus, active research has been actively conducted in recent years for searching for inhibitors that inhibit these binding. However, the results have not yet been clear. Therefore, a simpler, faster and less expensive method of controlling the signaling process and its search method should be developed, especially if the process can be automated.

지금까지는 상기 결합 저해제를 탐색하기 위하여 주로 효소 면역 측정법( ELISA, enzyme linked immunosorbent assay), 근접섬광 분석법(SPA, scintillation proximity assay) 및 침강법 등이 사용되어 왔다. 이들 방법 중에서 효소 면역 측정법으로 결합 저해제를 탐색하기 위해서는 여러 단계의 반응을 수행하여야 하므로 시간과 노동력이 많이 필요하고 자동화하는 과정이 매우 어렵다. 또한 섬광법을 수행하려면 근접섬광 분석법용(SPA) 비드 및 글루타치온-S-전이효소(GST)에 대한 항체를 사용하여야 하는데, 상기 SPA 비드는 특허 사용료를 미국 에머샴(Amersham)사에 지불해야 하고 GST 에 대한 항체도 그 가격이 비싸므로 많은 시료를 탐색하려면 비용이 많이 든다. 또한, 침강법은 GST-SH2 부위에 대한 융합 단백질을 만들어 이를 친화력이 있는 글루타치온-아가로스 비드에 붙인 다음 이에 [³H]-인산화티로신 펩티드를 반응시키는 방법으로 그의 반응 단계는 복잡하지 않으나 상기 비드에 붙은 비특이적 결합을 세척하는 단계에서 쉽게 손실이 일어나므로 실험 오차가 크고, 본 발명에서 사용한 고형상에 비하여 그 가격이 매우 비싼 단점이 있다.Until now, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), scintillation proximity assay (SPA) and sedimentation method have been mainly used to search for the binding inhibitor. Among these methods, in order to search for binding inhibitors by enzyme immunoassay, it is necessary to carry out several steps of reactions, which requires a lot of time and labor, and is difficult to automate. In addition, the scintillation method requires the use of antibodies for proximity flash assay (SPA) beads and glutathione-S-transferase (GST), which must be paid to Amersham in the United States. Antibodies to GST are also expensive and expensive to search for many samples. In addition, sedimentation is a method of making a fusion protein for the GST-SH2 site, attaching it to an affinity glutathione-agarose bead, and then reacting the [ ³ H] -phosphotyrosine peptide with the reaction step, but the beads are not complicated. The loss occurs easily in the step of washing the non-specific binding attached to the experimental error is large, compared to the solid phase used in the present invention has a very expensive disadvantage.

이에 본 발명자들은 새로운 세포 신호전달 조절제 및 항암제 등으로 사용될 수 있는 SH2 부위에 대한 결합 저해제를 개발하기 위하여, SH2 부위를 포함하는 단백질을 각 공(well)에 부착시킨 다음, 이를 하나씩 떼어내어 SH2 부위에 단백질을 결합시킬 수 있고 이에 결합한 단백질의 양을 방사능 측정용액(scintillation cocktail solution)으로 용이하게 측정할 수 있는 고형상을 이용하면 SH2 부위에 대한 결합 저해제를 간편하고 저렴한 비용으로 짧은 시간내에 다량으로 탐색할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.In order to develop a binding inhibitor for the SH2 site, which can be used as a novel cell signaling regulator and anticancer agent, the present inventors attach a protein containing the SH2 site to each well, and then remove one by one to remove the SH2 site. By using the solid phase which can bind the protein to and easily measure the amount of the bound protein with a scintillation cocktail solution, a large amount of binding inhibitor for the SH2 site can be obtained in a short time at a simple and low cost. The present invention has been completed by discovering that it can be explored.

[발명이이루고자하는기술적과제][Technical Challenges to Invent]

본 발명은 고형상을 이용하여 SH2 부위에 대한 결합 저해제를 탐색하는 새로운 방법을 제공함에 그 목적이 있다.It is an object of the present invention to provide a new method for screening binding inhibitors to SH2 sites using a solid phase.

구체적으로 본 발명은 1) SH2 부위를 포함하는 단백질을 고형상에 부착하는 단계, 2) 방사능이 표지된 티로신 인산화펩티드를 결합시키는 단계, 3) 고형상에 결합된 방사능을 측정하는 단계로 구성되는 SH2 부위에 대한 결합 저해제를 탐색하는 방법을 제공한다.Specifically, the present invention comprises 1) attaching a protein comprising a SH2 site to a solid phase, 2) binding a radiolabeled tyrosine phosphorylated peptide, and 3) measuring radioactivity bound to a solid phase. Provided are methods for searching for inhibitors of binding to the SH2 site.

상기 단계에서 고형상에 부착시키는 SH2 부위를 포함하는 단백질은 그 농도가 3μg/ml 인 것이 바람직하고 이를 4℃ 에서 8시간 동안 반응시키는 것이 바람직하다. 본 발명은 SH2 부위를 포함하는 단백질로서 Grb2 단백질 (growth factor receptor binding protein 2)을 선택하여 사용하지만, 모든 종류의 SH2 부위를 포함하는 단백질을 사용할 수 있으며 이들은 각각 특이적으로 반응한다.The protein containing the SH2 site attached to the solid phase in the step is preferably 3μg / ml concentration and it is preferable to react it at 4 ℃ for 8 hours. Although the present invention selects and uses Grb2 protein (growth factor receptor binding protein 2) as a protein containing an SH2 site, a protein containing all kinds of SH2 sites can be used, and each of them reacts specifically.

또한, 고형상에 부착된 Grb2 단백질과 티로신 인산화펩티드를 반응시키는 단계에서 SH2 결합 저해제로 사용될 수 있는 시료를 함께 넣어 주면 방사능의 차이에 의해 저해제를 용이하게 탐색할 수 있다. 이 때 방사성 인산화펩티드의 농도는 2nM 인 것이 바람직하고 이를 8시간 동안 반응시키는 것이 바람직하다.In addition, when the Grb2 protein attached to the solid phase and the tyrosine phosphorylated peptide are reacted with each other, a sample that can be used as an SH2 binding inhibitor can be easily detected by the difference in radioactivity. At this time, the concentration of the radiophosphorylated peptide is preferably 2 nM and it is preferable to react it for 8 hours.

또한, 본 발명은 Grb2 단백질과 결합하는 방사능이 표지된 티로신 인산화펩티드를 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로 본 발명은 Shc 단백질 또는 CD28 단백질에서 인산화되는 티로신기를 포함하는 SpYVNVK (pY는 인산화된 티로신기를 지칭함) 서열 및 DpYMNMTK 서열을 갖는 티로신 인산화펩티드를 제공한다.It is also an object of the present invention to provide a radiolabeled tyrosine phosphorylated peptide that binds to the Grb2 protein. Specifically, the present invention provides a tyrosine phosphorylated peptide having a SpYVNVK sequence (pY refers to a phosphorylated tyrosine group) sequence and a DpYMNMTK sequence comprising a tyrosine group phosphorylated at Shc protein or CD28 protein.

본 발명의 방법으로 선별한 SH2 부위에 대한 결합 저해제는 세포 신호전달 과정과 관련된 질환의 진단 및 치료 등과 관련된 연구에 유용하게 사용될 수 있다.Binding inhibitors to the SH2 site selected by the method of the present invention can be usefully used in studies related to the diagnosis and treatment of diseases associated with cellular signaling processes.

[발명의구성및작용]Composition and Action of the Invention

본 발명은 고형상을 이용하여 SH2 부위에 대한 결합 저해제를 선별하는 새로운 탐색방법을 제공한다. 본 발명의 탐색방법은 1) SH2 부위를 포함하는 단백질을 고형상에 부착시키는 단계, 2) 방사능이 표지된 티로신 인산화펩티드를 결합시키는 단계 및 3) 고형상에 결합된 방사능을 측정하는 단계로 구성된다.The present invention provides a novel screening method for screening binding inhibitors to SH2 sites using solid phases. The search method of the present invention comprises 1) attaching a protein containing a SH2 site to a solid phase, 2) binding radiolabeled tyrosine phosphorylated peptide, and 3) measuring radioactivity bound to a solid phase. do.

우선, 본 발명은 SH2 부위를 포함하는 단백질로서 Grb2 단백질 (growth factor receptor binding protein 2)을 사용한다. 또한, 고형상에 부착된 Grb2 단백질과 결합하는 티로신 인산화펩티드를 반응시키는 단계에서 SH2 부위에 대한 결합 저해제로 사용될 수 있는 시료를 함께 넣어 주면 저해제를 용이하게 탐색할 수 있다.First, the present invention uses the Grb2 protein (growth factor receptor binding protein 2) as a protein containing the SH2 site. In addition, in the step of reacting a tyrosine phosphorylated peptide that binds to the Grb2 protein attached to a solid phase, a sample that can be used as a binding inhibitor for the SH2 site is put together to easily search for the inhibitor.

본 발명에서 사용한 고형상은 보통 면역 측정법에 사용되는 모듈(상품명 : Maxi Breakapart Immunomodule, Nunc, Denmark)로서, 이를 이용하면 많은 시료를 간편하게 탐색할 수 있을 뿐만 아니라 그 실험 결과도 정확하게 나타나므로 매우 유용하다.The solid phase used in the present invention is a module (trade name: Maxi Breakapart Immunomodule, Nunc, Denmark), which is usually used for immunoassay, and it is very useful because it not only makes it easy to search many samples but also accurately shows the results of the experiment. .

본 발명은 SH2 부위를 포함하는 단백질인 Grb2 단백질을 얻기 위하여, 글루타치온-S-전이효소(GST)와 융합 단백질 형태로 Grb2 단백질을 생산하는 발현 플라스미드 pGREX2TK-Grb2 를 이용하여 대장균에서 Grb2 단백질을 대량으로 제조한다.The present invention provides a large amount of Grb2 protein in Escherichia coli using the expression plasmid pGREX2TK-Grb2 which produces the Grb2 protein in the form of a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST) to obtain the Grb2 protein, which is a protein containing an SH2 site. Manufacture.

또한 본 발명은 방사능이 표지된 티로신 인산화펩티드를 제조하기 위하여, 지금까지 보고된 연구의 결과를 참조하여 Grb2 단백질과 결합하는 적합한 아미노산 서열을 결정한다. 구체적으로 Grb2 단백질과 결합하는 것으로 보고된 Shc 단백질 및 CD28 단백질에서 인산화되는 티로신기 주위의 아미노산 서열을 조사하여 다음의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 제조한다. Shc 단백질을 이용하여 317번 티로신기를 포함하는 SpYVNVK 서열을 갖는 펩티드를 제조하고, CD28 단백질을 이용하여 191번 티로신기를 포함하는 DpYMNMTK 서열을 갖는 펩티드를 제조한다. 상기 아미노산 서열 모두는 Grb2 단백질의 SH2 부위와 친화력이 높은 pTXNX 모티브인 pYVNV 서열 또는 pYMNM 서열을 포함한다.The present invention also determines suitable amino acid sequences that bind to Grb2 protein with reference to the results of studies reported to date to prepare radiolabeled tyrosine phosphorylated peptides. Specifically, peptides having the following amino acid sequences are prepared by examining the amino acid sequences around tyrosine groups phosphorylated in Shc protein and CD28 protein reported to bind Grb2 protein. Using the Shc protein, a peptide having a SpYVNVK sequence comprising a tyrosine group 317 is prepared, and a peptide having a DpYMNMTK sequence comprising a tyrosine group 191 is prepared using a CD28 protein. All of the above amino acid sequences include a pYVNV sequence or a pYMNM sequence, which is a pTXNX motif with high affinity with the SH2 site of Grb2 protein.

또한 본 발명은 상기 SH2 부위에서의 결합 특이성을 확인하기 위하여, Grb2 단백질과 결합력이 낮은 인산화펩티드를 비교군으로 사용하는데, 구체적으로 혈소판 성장인자 수용체(PDGF)에서 1021번 티로신기를 포함하는 DpYIIPLPDPK 서열을 갖는 펩티드를 사용한다. 또한, 인산화티로신 상호연관 부위 (PID, phosphotyrosine interaction domain)와 결합하는 Neu 단백질에서 1248번 티로신기를 포함하는 PTAENPEpYLGLK 서열을 갖는 펩티드를 선택하여 사용한다.In addition, the present invention uses a Grb2 protein and a low binding phosphorylated peptide as a comparison group to confirm the binding specificity at the SH2 site, specifically, the DpYIIPLPDPK sequence including the tyrosine group 1021 in platelet growth factor receptor (PDGF) Peptides are used. In addition, a peptide having a PTAENPEpYLGLK sequence including the tyrosine group 1248 in a Neu protein that binds to a phosphotyrosine interaction domain (PID) is selected and used.

상기 Grb2 단백질 및 방사능이 표지된 인산화펩티드를 이용하여 SH2 부위 결합 저해제를 탐색하기 위하여, GST-Grb2 융합 단백질을 고형상의 각 공에 넣어 부착시키고 이에 방사성 인산화펩티드 및 저해제로 사용될 수 있는 시료 물질을 가한 다음 방사능의 양을 측정하여 비교할 수 있다.In order to search for SH2 site binding inhibitors using the Grb2 protein and radiolabeled phosphate peptides, GST-Grb2 fusion proteins were placed in solid pores and attached to them to prepare a radioactive phosphate peptide and a sample material. The amount of radioactivity can then be measured and compared.

구체적으로 본 발명은 고형상에 부착시킨 SH2 부위를 포함하는 단백질의 농도 또는 방사성 인산화펩티드의 농도를 변화시킴으로 나타난 방사능 측정 결과를 조사한다. 그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 단백질의 농도가 높아지면서 인산화펩티드가 결합하는 양이 증가하여 방사능 값이 비례적 상관관계를 가지며 증가하는 것을 알 수 있다. 이 때 고형상에 부착시키는 단백질의 농도가 3μg/ml 인 것이 바람직하고, 이를 4℃ 에서 8시간 동안 반응시키는 것이 바람직하다.Specifically, the present invention examines the radioactivity measurement results indicated by changing the concentration of the protein containing the SH2 site attached to the solid state or the concentration of the radiophosphorylated peptide. As a result, as shown in FIG. 1, as the concentration of the protein increases, the amount of phosphate peptide binding increases, indicating that the radioactivity value increases with a proportional correlation. At this time, the concentration of the protein to be attached to the solid phase is preferably 3μg / ml, it is preferable to react it at 4 ℃ for 8 hours.

또한 고형상에 부착시킨 단백질의 농도를 3μg/ml 등으로 고정시킨 다음 다양한 농도의 방사성 인산화펩티드를 반응시킨 결과, 도 2 에서 나타난 바와 같이 방사성 인산화펩티드의 양을 늘려주면 결합하는 양도 증가하는 비례적 상관관계를 나타낸다. 이 때 방사성 인산화펩티드의 농도는 2nM 이 바람직하고, 이를 8시간 동안 반응시키는 것이 바람직하다.In addition, after fixing the concentration of the protein attached to the solid state 3μg / ml and then reacted with various concentrations of radioactive peptides, as shown in Figure 2 increasing the amount of radioactive phosphorylated peptides proportionally increases the amount of binding Correlation. At this time, the concentration of the radiophosphorylated peptide is preferably 2 nM, it is preferable to react for 8 hours.

또한 생체내에는 SH2 부위를 가진 여러 종류의 단백질이 존재하므로 특정 종류의 SH2 부위에 작용하는 특이한 결합 저해제를 탐색하기 위하여 본 발명의 방법의 결합 저해제 탐색방법은 특이성을 가질 필요가 있다. 따라서 본 발명의 탐색방법이 특이성이 있는지를 확인하기 위하여, 모티프의 아미노산 서열이 pYXNX 서열인, SpYVNVK 서열 및 DpYMNMTK 서열, 두 종류의 인산화펩티드, 모티프가 전혀 다른 pYIIP (DpYIIPLPDPK) 서열을 가진 인산화펩티드 그리고 인산화티로신 상호연관 부위(PID)에 결합하는 NXXpY (PTAENPEpYLGLK) 서열을 가지는 인산화펩티드를 본 발명의 방사성 인산화펩티드(SpYVNVK^*)와 함께 각각 넣었을 때 얼마나 결합 반응을 저해하는가를 방사능을 측정하여 분석한다.In addition, since several kinds of proteins having SH2 sites exist in vivo, the binding inhibitor search method of the method of the present invention needs to have specificity in order to search for specific binding inhibitors that act on specific types of SH2 sites. Therefore, to confirm the specificity of the search method of the present invention, the SpYVNVK sequence and the DpYMNMTK sequence, whose amino acid sequence is a pYXNX sequence, two types of phosphorylated peptides, a phosphorylated peptide having a pYIIP (DpYIIPLPDPK) sequence with completely different motifs, and Phosphorylated peptides having an NXXpY (PTAENPEpYLGLK) sequence that binds to the tyrosine tyrosine correlating site (PID) together with the radioactive peptide (SpYVNVK ^* ) of the present invention are analyzed by measuring radioactivity to measure the radioactivity.

그 결과, 도 3 에 나타난 바와 같이 pYXNX 서열을 가지는 인산화펩티드를 사용하여 경쟁적으로 결합 반응을 수행하는 경우, 방사능의 양이 감소하여 결합율이 낮아지나 SH2 부위와 관련이 없는 펩티드인, pYIIP 서열 및 NXXpY 서열을 가지는 펩티드는 결합율에 영향을 주지 않았다. 따라서 본 발명의 방법이 특정 SH2 부위에 작용하는 특이한 결합 저해제를 탐색하는데도 매우 효과적임을 알 수 있다.As a result, when the binding reaction is carried out competitively using a phosphorylated peptide having a pYXNX sequence as shown in Figure 3, the amount of radioactivity is reduced, the binding rate is lower, but the pYIIP sequence is a peptide that is not related to the SH2 site and Peptides with the NXXpY sequence did not affect the binding rate. Therefore, it can be seen that the method of the present invention is also very effective in searching for specific binding inhibitors that act on specific SH2 sites.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.The following examples illustrate the invention and are not intended to limit the scope of the invention.

<실시예 1> GST-Grb2 융합 단백질의 발현 및 정제Example 1 Expression and Purification of GST-Grb2 Fusion Protein

(1-1) GST-Grb2 융합 단백질의 발현(1-1) Expression of GST-Grb2 Fusion Proteins

GST-Grb2 융합 단백질을 생산할 수 있는 발현 플라스미드 pGREX2TK-Grb2 를 대장균에 형질전환시켜 그 형질전환체를 앰피실린(100μg/ml)이 들어있는 LB 배지(Luria-Bertani 배지 : 1리터당 박토-트립톤 10g, 박토-이스트 추출물 5g, 염화나트륨 10g)에 접종하여 37℃에서 16-18시간 정도 진탕 배양하였다. 이를 다시 앰피실린이 포함된 새로운 LB 배지에 100배로 희석하여 접종한 다음, 600nm 파장에서 흡광도가 0.3 이 될 때까지 진탕 배양하였다. 이 때 상기 융합 단백질의 발현을 유도하기 위하여 배지에 1mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고 균주를 3시간 더 배양한 다음 이를 원심분리하였다.An expression plasmid pGREX2TK-Grb2 capable of producing a GST-Grb2 fusion protein was transformed into Escherichia coli, and the transformant was transformed into LB medium containing ampicillin (100 μg / ml) (Luria-Bertani medium: 10 g of bacto-tryptone per liter). , 5 g of bacto-yeast extract, 10 g of sodium chloride) was inoculated and incubated at 37 ° C. for 16-18 hours. This was inoculated again by diluting 100-fold in fresh LB medium containing ampicillin, and then cultured with shaking until the absorbance was 0.3 at 600 nm. At this time, in order to induce the expression of the fusion protein, 1mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) was added to the medium, the strain was further cultured for 3 hours, and then centrifuged.

상기의 과정으로 재조합 단백질의 발현을 유도한 대장균을 회수한 다음, 발현된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 방법 및 GST 단백질에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿 방법을 사용하여 확인하였다.After recovering E. coli induced the expression of recombinant protein in the above process, the expressed protein was confirmed using SDS-polyacrylamide gel electrophoresis method and Western blotting method using an antibody against GST protein.

(1-2) GST-Grb2 융합 단백질의 정제(1-2) Purification of GST-Grb2 Fusion Proteins

상기에서 발현시킨 GST-Grb2 융합 단백질을 정제하기 위하여, 상기 대장균을 10mM 헤미메틸술포닐 플루오라이드가 포함된 인산 완충용액(PBS, phosphate buffered saline)에 현탁시킨 다음 초음파 파쇄기로 파쇄하였다. 다음 세포 파쇄액을 원심분리하여 그의 상등액을 얻고 이를 글루타치온 아가로스 4B 비드(미국 파마시아 바이오텍 제품)에 결합시켰다. 다음 단백질이 결합된 상기 비드에 용출 완충용액 (elution buffer : 10mM 환원된 글루타치온, 50mM 트리스-염산, pH8.0)을 가하여 단백질을 용출시켰다.In order to purify the expressed GST-Grb2 fusion protein, the E. coli was suspended in phosphate buffered saline (PBS) containing 10 mM hemimethylsulfonyl fluoride and then disrupted by an ultrasonic crusher. The cell lysate was then centrifuged to obtain its supernatant and bound to glutathione agarose 4B beads (available from Pharmacia Biotech, USA). Elution buffer (elution buffer: 10 mM reduced glutathione, 50 mM Tris-hydrochloric acid, pH8.0) was added to the beads bound to the protein to elute the protein.

상기와 같은 흡착 크로마토그래피 방법을 이용하여 회수한 융합 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 방법 및 GST 단백질에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿 방법으로 확인하였다.The fusion protein recovered using the adsorption chromatography method as described above was confirmed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis method and Western blot method using an antibody against GST protein.

<실시예 2> 방사능이 표지된 티로신 인산화펩티드의 제조Example 2 Preparation of Radiolabeled Tyrosine Phosphorylated Peptides

(2-1) 인산화펩티드의 서열 결정 및 합성(2-1) Sequence Determination and Synthesis of Phosphorylated Peptides

Grb2 단백질과 결합하는 인산화펩티드의 아미노산 서열을 결정하기 위하여 이제까지 보고된 연구의 결과를 참조하였다. Grb2 단백질과 결합하는 것으로 알려진 Shc 단백질 및 CD28 단백질에서 인산화되는 티로신기 주위의 서열을 살펴보면, Shc 단백질의 경우 317번 티로신기를 포함하는 SpYVNVK (pY는 인산화된 티로신기를 지칭함) 서열을 가지고 CD28 단백질의 경우는 191번 티로신기를 포함하는 DpYMNMTK 서열을 갖는다. 이 서열 모두는 Grb2 단백질의 SH2 부위와 친화력이 높은 pTXNX 모티브로서 각각 pYVNV 서열 또는 pYMNM 서열을 포함한다.Reference was made to the results of the studies reported so far to determine the amino acid sequence of the phosphorylated peptide that binds to Grb2 protein. Looking at the sequence around the tyrosine groups phosphorylated by the Shc protein and CD28 protein known to bind Grb2 protein, the ShC protein has the SpYVNVK sequence containing tyrosine group 317 (pY refers to the phosphorylated tyrosine group) and the CD28 protein. Has the DpYMNMTK sequence comprising the tyrosine group 191. All of these sequences include pYVNV sequences or pYMNM sequences, respectively, as pTXNX motifs having high affinity with the SH2 site of Grb2 protein.

또한, 본 발명은 상기 결합의 특이성을 확인하기 위하여 Grb2 단백질과 결합력이 낮은 인산화펩티드를 비교군으로 사용하였다. 구체적으로 혈소판 성장인자 수용체(PDGF)에서 1021번 티로신기를 포함하는 아미노산 서열인 DpYIIPLPDPK 를 선택하였다. 이 모티브는 신호전달 과정의 주요 단백질인 포스포리파제 Cγ 의 SH2 부위와 친화력이 높다고 보고되어 있다. 또한, 인산화티로신 상호연관 부위 (PID, phosphotyrosine interaction domain)와 결합하는 Neu 단백질에서 1248번 티로신기를 포함하는 아미노산 서열인 PTAENPEpYLGLK 도 선택하여 사용하는데, 이는 SH2 부위와 마찬가지로 인산화된 티로신기를 인식하여 결합하지만 그 결합 특이성을 결정하는 아미노산 서열이 N-말단 쪽이며 특히 티로신기에서 N-말단 쪽으로 세 번째에 위치하는 아미노산인 아스파라긴산(NXXpY)이 매우 중요하다고 알려져 있다. 이들 인산화펩티드들은 모두 제네카-캠브리지 리서치 바이오케미칼 (Zeneca-Cambridge Research Biochemicals, Wilmington, DE, USA)사에 주문하여 제조하였다.In addition, in the present invention, Grb2 protein and low phosphorylated peptide were used as a comparison group to confirm specificity of the binding. Specifically, DpYIIPLPDPK, an amino acid sequence including tyrosine group 1021, was selected from the platelet growth factor receptor (PDGF). This motif has been reported to have a high affinity for the SH2 site of phospholipase Cγ, a major protein in signaling. In addition, PTAENPEpYLGLK, an amino acid sequence comprising tyrosine group 1248 in the Neu protein that binds to the phosphotyrosine interaction domain (PID), is selected and used, which recognizes and binds to phosphorylated tyrosine groups as well as the SH2 site. Aspartic acid (NXXpY), the amino acid sequence determining the binding specificity at the N-terminus and the third amino acid at the N-terminus in the tyrosine group, is known to be very important. All of these phosphorylated peptides were prepared by ordering from Genca-Cambridge Research Biochemicals, Wilmington, DE, USA.

(2-2) 인산화펩티드에 대한 방사능 표지(2-2) Radioactivity Labeling for Phosphorylated Peptides

상기 인산화펩티드에 방사능을 표지하기 위하여, 석시니미딜 프로피오네이트(N-[propionate-2,3-³H], 17nmol, NEN 제품)를 질소하에서 수분을 증발시켜 이에 무수 디메틸술폭사이드에 녹인 인산화펩티드 (SpYVNVK, 40nmoles) 20μl 을 가하였다. 그 반응물에 4-메틸모포린 2μl 을 가하여 pH 를 염기성으로 맞춘 다음 실온에서 밤새도록 반응시켰다. 이렇게 하여 C-말단의 라이신이 방사성 동위원소로 표지된 인산화펩티드를 제조하고, 이를 역상 HPLC 에서 아세토니트릴을 30분간 10% 에서 40% 까지 변화시켜 주면서 분리·정제하여 방사성 인산화펩티드 분획을 모으고 이를 (SpYVNVK^*) 다음 실험에 이용하였다.In order to label the phosphorylated peptide, succinimidyl propionate (N- [propionate-2,3- ³ H], 17 nmol, manufactured by NEN) was evaporated under nitrogen to evaporate water and dissolved in anhydrous dimethyl sulfoxide. 20 μl of peptide (SpYVNVK, 40 nmoles) was added. 2 μl of 4-methylmorpholine was added to the reaction to make the pH basic and to react overnight at room temperature. In this way, C-terminal lysine to prepare a radioisotope-labeled phosphorylated peptide, which was separated and purified by reverse acetonitrile changing from 10% to 40% of acetonitrile for 30 minutes to collect the radiophosphorylated peptide fraction and SpYVNVK ^* ) was used for the next experiment.

<실시예 3> 고형상을 이용한 SH2 부위와 인산화펩티드의 결합 탐색Example 3 Binding of SH2 Site to Phosphorylated Peptide Using Solid Form

GST-Grb2 융합 단백질을 부착 완충용액 (15mM Na₂CO₃, 35mM NaHCO₃, pH9.6)에 제시된 농도대로 희석한 다음 (100μl 당 30ng, 100ng, 300ng, 1000ng) 고형상의 각 공에 100μl 씩 넣어 주고 4℃ 에서 8시간 동안 방치하여 단백질을 부착시켰다. 다음 각 공으로부터 부착된 많은 단백질을 제거하고 인산 완충용액으로 세척한 다음 소혈청 알부민(30mg/ml) 100μl 를 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켜 비특이적 결합을 억제하였다. 이와 같은 방법으로 GST-Grb2 단백질을 부착시킨 고형상에 방사성 인산화펩티드 (Shc 단백질의 pYVNV 모티프, SpYVNVK^*)를 가하여 (0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 pmoles), 4℃ 에서 8시간 동안 반응시켰다.Dilute the GST-Grb2 fusion protein to the concentrations indicated in the attachment buffer (15 mM Na ₂ CO ₃ , 35 mM NaHCO ₃ , pH9.6) (30 ng per 100 μl, 100 ng, 300 ng, 1000 ng) and then 100 μl into each solid ball. The mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 8 hours to attach proteins. Next, many proteins attached from each ball were removed, washed with phosphate buffer, and then 100 μl of bovine serum albumin (30 mg / ml) was added and reacted at room temperature for 2 hours to inhibit nonspecific binding. In this way, a radiophosphorylated peptide (pYVNV motif of the Shc protein, SpYVNVK ^* ) was added to the solid to which the GST-Grb2 protein was attached (0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 pmoles) at 4 ° C. for 8 hours. Reacted.

상기 고형상에 부착시킨 SH2 부위 단백질의 농도 및 방사성 인산화펩티드의 농도에 따라 각각 방사능을 측정하여 그 결과를 확인하였다.Radioactivity was measured according to the concentration of the SH2 site protein and the radiophosphorylated peptide attached to the solid phase, respectively, and the results were confirmed.

(3-1) 단백질의 농도에 따른 결과(3-1) Results according to protein concentration

GST-Grb2 단백질을 농도별 (100μl 당 30ng, 100ng, 1000ng)로 사용하여 고형상에 부착시킨 다음 소혈청 알부민으로 비특이적 결합을 억제하고 여기에 방사성 인산화펩티드를 각각 2pmole 씩 가하여 반응시켰다. 방사능을 측정하여 인산화펩티 등의 결합 정도를 확인한 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 단백질의 농도가 높아지면서 인산화펩티드의 결합이 늘어나서 방사능 값이 비례적 상관관계를 가지며 증가하는 것을 알 수 있다.GST-Grb2 protein was used at different concentrations (30 ng per 100 μl, 100 ng, 1000 ng) to attach to the solid phase, and then non-specific binding was inhibited with bovine serum albumin, and the radiophosphorylated peptide was added thereto by 2 pmole. As a result of confirming the binding degree of the phosphorylated peptide and the like by measuring the radioactivity, it can be seen that as the concentration of the protein increases as shown in FIG. 1, the binding of the phosphorylated peptide increases and the radioactivity value increases with a proportional correlation.

(3-2) 방사성 인산화펩티드의 농도에 따른 결과(3-2) Results of Concentration of Radioactive Phosphorylated Peptides

고형상에 부착시킨 단백질의 농도를 300ng/100μl 로 고정시킨 다음 다양한 농도의 방사성 인산화펩티드를 반응시켜 고형상에서 나타나는 방사능을 측정함으로써 그의 결합 정도를 분석하였다 (도 2 참조). 상기의 결과와 같이 방사성 인산화펩티드의 양을 늘려주면 결합 정도가 증가하였으며, 이 때도 이들은 비례적 상관관계를 나타냈다.The degree of binding was analyzed by fixing the concentration of the protein attached to the solid phase to 300ng / 100μl and then reacting various concentrations of radioactive phosphate peptide to measure the radioactivity appearing in the solid phase (see FIG. 2). As shown in the above results, increasing the amount of radiophosphorylated peptide increased the degree of binding, and even then they showed a proportional correlation.

(3-3) 결합 특이성에 대한 실험(3-3) Experiment for binding specificity

생체내에는 SH2 부위를 가진 여러 종류의 단백질이 존재하므로 특정 종류의 SH2 부위에 작용하는 특정 결합 저해제를 탐색하기 위해서는 본 발명의 방법에서 사용하는 결합 저해제를 탐색하는 과정에 특이성이 있어야 한다. 따라서 본 발명은 이를 확인하기 위하여 모티프의 아미노산 서열이 pYXNX 서열인, SpYVNVK 서열 및 DpYMNMTK 서열, 두 종류의 인산화펩티드, 모티프가 전혀 다른 pYIIP 서열인DpYIIPLPDPK 서열을 가진 인산화펩티드 그리고 PTB 에 결합하는 NXXpY 서열인 PTAENPEpYLGLK 서열을 가지는 인산화펩티드를 방사성 인산화펩티드(SpYVNVK^*)와 함께 각각 넣었을 때 얼마나 결합 반응을 저해하는가를 방사능을 측정하여 분석하였다. 이는 다음과 같은 방법으로 계산하였다 (수학식 1 참조).Since there are several kinds of proteins having SH2 sites in vivo, in order to search for a specific binding inhibitor that acts on a specific type of SH2 site, there must be specificity in the process of searching for a binding inhibitor used in the method of the present invention. Therefore, the present invention provides a SpYVNVK sequence and a DpYMNMTK sequence, two types of phosphorylated peptides, a phosphorylated peptide having a different pYIIP sequence, a DpYIIPLPDPK sequence whose motif is a pYXNX sequence, and a NXXpY sequence that binds to PTB. When the phosphorylated peptide having the PTAENPEpYLGLK sequence was added with the radioactive phosphorylated peptide (SpYVNVK ^* ), it was analyzed by measuring the radioactivity to determine the binding reaction. This was calculated by the following method (see Equation 1).

[수학식 1][Equation 1]

도 3 에 나타난 바와 같이 pYXNX 서열을 가지는 인산화펩티드를 방사성 인산화펩티드와 같이 넣어 반응시킨 경우, 이 두가지 펩티드가 서로 경쟁적으로 GST-Grb2 단백질과 결합하여 방사능의 양이 감소하므로 결합율이 낮아지는 반면 나머지 두 종류의 펩티드인, pYIIP 서열 및 NXXpY 서열을 넣어 반응시킨 경우는 결합율이 변화하지 않았다. 따라서 본 발명의 방법이 특정 SH2 부위에 작용하는 결합 저해제를 탐색하는데 있어서도 매우 효과적임을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 3, when the phosphorylated peptide having the pYXNX sequence was reacted with the radioactive phosphorylated peptide, the two peptides competitively bind to the GST-Grb2 protein to reduce the amount of radioactivity, thereby decreasing the binding rate while remaining. When two kinds of peptides, pYIIP sequence and NXXpY sequence, were reacted, the binding rate did not change. Therefore, the method of the present invention was found to be very effective in the search for a binding inhibitor acting on a specific SH2 site.

[발명의효과][Effects of the Invention]

본 발명의 방법을 이용하면 SH2 부위에 결합하는 세포 신호전달 단백질의 양을 정확하고 용이하게 측정할 수 있어 SH2 부위에 대한 결합 저해제를 탐색하는데 매우 유용하다. 본 발명의 방법은 기존의 효소 면역 측정법 및 침강법 등과 비교하여 표 1에 보는 바와 같이 그 과정이 간편하고 저렴한 비용으로 짧은 시간내에 다량으로 저해제를 탐색할 수 있다.The method of the present invention can be used to accurately and easily measure the amount of cellular signaling protein that binds to the SH2 site, which is very useful for screening binding inhibitors to the SH2 site. Compared with the conventional enzyme immunoassay and sedimentation method, the method of the present invention can search for inhibitors in a large amount within a short time at a low cost and a simple process.

효소 면역 측정법Enzyme Immunoassay 침강법Sedimentation 고형상을 이용하는 방법How to use solid state 고형상에 단백질을 부착비특이적 결합 억제실온 세척티로신 인산화펩티드 반응세척티로신인산화 항체 결합세척 2차 항체-효소 결합세척기질에 의한 발색 반응흡광도 측정Attachment of proteins to solid phase Nonspecific binding inhibition Room temperature washing Tyrosine phosphorylation Peptide reaction washing Tyrosine phosphorylation Antibody binding washing Color reaction response measurement by secondary antibody-enzyme binding washing substrate 글루타치온-아가로스 비드 에 GST / Grb2 단백질 부 착세척방사성 인산화펩티드 반응세척방사능 측정Determination of Washing Radioactivity with GST / Grb2 Protein Attached to Glutathione-Agarose Beads 고형상에 단백질 부착세척방사성 인산화펩티드 반응방사성 측정Determination of Reactive Radioactivity of Washing Radioactive Phosphorylated Peptides on Protein Solids

따라서, 본 발명의 방법을 이용하면 세포 신호전달 과정에 작용하는 효과적인 조절제를 개발할 수 있으므로 암을 포함하여 신호전달 과정과 관련이 있는 질환을 진단하고 치료하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the method of the present invention can be used to diagnose and treat diseases associated with signaling processes, including cancer, since it is possible to develop effective regulators that act on cellular signaling processes.

Claims

1) attaching a protein comprising a sarcoma homology 2 (SH2) site to a solid phase,

2) binding the tyrosine phosphorylated peptide by adding a radiolabeled tyrosine phosphorylated peptide together with the binding inhibitor to be searched,

3) A method of searching for a binding inhibitor for the SH2 site comprising the step of measuring the radioactivity bound to a solid phase using only the case of adding tyrosine phosphorylated peptide as a control.

The method according to claim 1, wherein the protein comprising the SH2 site of step 1) is reacted at 4 ° C. for 8 hours at a concentration of 3 μg / ml.

The method of claim 1 or 2, wherein the protein comprising the SH2 site is a growth factor receptor bound protein 2 (Grb2) protein.

The method according to claim 1, wherein the radiolabeled phosphorylated peptide of step 2) is reacted at a concentration of 2 nM for 8 hours.

The method of claim 1 or 4, wherein the phosphorylated peptide has a SpYVNVK sequence derived from a src homology and collagen protein (Shc) protein.

The method of claim 1 or 4, wherein the phosphorylated peptide has a DpYMNMTK sequence derived from a cluster of differentiation 28 (CD28) protein.