KR100232053B1 - DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 이용한 항산화물질의 분석방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DPPH(1, 1-dipheny1-2-picrylhydrazy1)를 이용한 항산화물질의 분석방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 유리 라디칼(free radical)인 DPPH와 항산화물질을 반응시켜 DPPH의 보라색이 무색으로 변하는 색깔 변화를 관찰함으로써, 동·식물체 및 미생물 등에 존재하는 항산화물질을 신속·간단하면서도 경제적으로 검출 또는 정량하는 분석방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 항산화물질의 탐색, 분리·정제에 이용될 수 있으며, 새로운 항산화물질의 개발 및 연구에도 이용될 수 있다.

Description

DPPH(1, 1-diphenyl-2- picrylhydrazyl)를 이용한 항산화물질의 분석방법

본 발명은 DPPH(1, 1-dipheny1-2-picrylhydrazy1)를 이용한 항산화물질의 분석방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로 본 발명은 유리 라디칼(free radical)인 DPPH와 항산화물질을 반응시켜 DPPH의 짙은 보라색이 무색으로 변하는 색깔 변화를 관찰함으로써, 동·식물체 및 미생물 등에 존재하는 항산화물질을 신속·간단하면서도 경제적으로 검출 또는 정량하는 분석방법에 관한 것이다.

항산화물질은 동, 식물체 및 미생물에 이르기까지 자연계에 널리 분포하는 물질로서, 다양한 구조를 가지고 있으나, 공통적으로는 산소에 의한 유기물의 변성(산화)을 방지하는 성질을 소지한다. 오래 전부터 의약품 및 식품의 산화를 방지하고 보존성을 증가시키는 데에 활용되어 왔던 항산화성 물질은, 최근에 체내 유리 라디칼에 의한 체세포 파괴 방지의 역할이 의학적으로 규명되면서부터 노화 방지 물질로서 새로이 각광받고 있다.

항산화물질의 역할이 그 중요성을 더해감에 따라서, 자연히 그에 대한 관심이 집중되었고, 또한 그에 대한 연구가 활발히 진행됨에 따라 항산화물질의 검출, 추출 및 정량과정이 필연적으로 수반되게 되었다. 종래에는 이와 같은 항산화물질은 주로 시료의 전기전도도와 과산화물의 양을 측정하는 방법에 의해 분석되었으나, 이러한 분석에는 고가의 측정장치가 필요하고, 측정시 상당한 번거로움이 있을 뿐만 아니라, 복잡하며 장시간이 소요된다는 문제점이 있었다. 따라서, 고가의 복잡한 기기를 사용하지 않고서, 신속·간단히 항산화물질을 분석할 수 있는 방법이 절실히 요구되어 왔다.

이에, 본 발명자들은 전술한 특징을 만족시키는 항산화물질의 분석방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 환원물질(reducing substance)의 분석시약으로 사용되어 온 DPPH(1, 1-dipheny1-2-picrylhydrazy1)와 항산화물질을 포함하는 시료를 반응시켰을 때 나타나는 DPPH의 색깔 변화를 육안으로 관찰함으로써, 시료에 존재하는 항산화물질을 신속·간단하면서도 경제적으로 분석할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 DPPH를 이용한 항산화물질의 분석방법을 제공하는 것이다.

제1도는 방아풀잎의 유기용매 추출 및 세파덱스 LH-20 크로마토그래피를 통하여 얻은 100개의 분획중에서 선발한 20개의 대표분획과 DPPH 용액을 반응시킨 결과를 나타내는 사진이다.

제2도는 방아풀잎의 유기용매 추출 및 세파덱스 LH-20 크로마토그래피를 통하여 얻은 100개의 분획중 항산화물질을 함유하는 22번 내지 26번 분획과 DPPH 용액을 반응시킨 결과를 나타내는 사진이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명에서는 고가의 복잡한 기기를 사용하지 않고서 신속하고 간단하게 항산화물질을 검출 또는 정량하는 방법을 개발하였는 바, 이는 짙은 보라색을 띠는 DPPH(1, 1-dipheny1-2-picrylhydrazyl)용액을 검정시약으로 사용하여, DPPH와 항산화 물질이 반응하여 무색으로 변하는 색깔 변화의 정도를 육안으로 또는 분광광도계(spectrophotometer)로 측정하는 방법이다.

전술한 본 방법의 유효성을 검정하기 위한 일실시예로서, 방아풀(배초향 또는 곽향)로부터 항산화물질을 추출하는데 상기 방법을 적용하여, 항산화물질 로즈마린산(rosmarinic acid)을 성공적으로 분리하였다.

즉, 동결건조시킨 방아풀잎의 분말에 5배 내지 10배의 80% MeOH(w/v) 또는 에틸 알코올 원액을 첨가하여 환류냉각추출하고 여과한 다음, 클로로포름과 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 용매 분리(solvent partitioning)하였다. 이어, 에틸아세테이트층을 농축하여 세파덱스 LH-20 컬럼에 주입하고 메탄올로 용출시킨 다음, 얻은 분획과 에틸알코올에 용해된 DPPH를 반응시켜 짙은 보라색이 무색으로 변하는 정도를 조사하여, 강력한 항산화력을 나타내는 분획을 선별하였는데, 분자구조 결정을 통하여 그 분획에 포함된 항산화물질은 로즈마린산으로 동정되었다. 상기에서, DPPH는 짙은 녹색의 고체로서, 에틸알코올에 용해시키면 보라색으로 변하는 분자량 394.3의 유리라디칼이다.

결국, 본 발명의 분석방법은 동·식물체 및 미생물 등에 존재하는 항산화물질을 탐색하고 연구하는데 뿐만 아니라, 산업적으로 이용되는 대량 추출 및 정량을 한층 용이하게 하는 개선된 방법이라 할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

[각종 시료에서의 항산화물질 검출]

대한민국 전라남도 순천 지방, 경기도 화성군 지역 등에서 수집한 향유 외 21종의 식물 잎과 1종의 버섯을 시료로 사용하여, 시료 10g씩을 각각 동결건조시켜 마쇄하고, 7배 부피의 80% 메틸알코올을 첨가하여 12시간 동안 가열 추출하였다. 이 추출액을 여과하여 여액을 농축하고, 10㎖의 물을 가해 조추출액으로 한 다음, 이 조추출액을 다시 물로 10배 희석하여 최종시료액으로 하였다.

전기 최종시료액 100㎕와, 에틸알코올 1L당 1.6mmol DPPH가 용해된 검정시약 20㎖을 충분히 혼합하고 20분간 실온에서 반응시켜, 짙은 보라색이 무색으로 변하는 정도를 육안으로 관찰하였다. 그 결과, 무색으로의 색깔변화가 방아풀에서 아주 강력하게 나타나, 방아풀에는 많은 양의 항산화물질이 존재할 것으로 예측될 수 있었다.

[실시예 2]

[방아풀로부터 항산화물질의 추출]

실시예 1의 결과를 토대로 방아풀로부터 항산화물질을 추출하기 위하여, 전라남도 순천 지방에서 수집한 방아풀잎을 동결건조하여 마쇄하고, 그 분말 30g을 210㎖의 80% 메탄올로 12시간 동안 환류냉각장치에서 추출하고 여과하였다. 이 여액을 농축하고 물을 가하여 수용액 100㎖로 만든 다음, 동량의 클로로포름으로 용매분획하고, 클로로포름층을 제거하고 남은 수용액을 다시 동량의 에틸아세테이트로 용매분획하였다.

이어, 에틸아세테이트층을 농축하여 세파덱스 LH-20 컬럼(길이 50㎝, 내경 2.4㎝)에 주입하고, 분당 0.287㎖의 유속하에서 MeOH로 용출시켜, 처음 용출액 100㎖를 제외하고, 7.1㎖씩 100개의 분획을 얻었다. 이때, 세파덱스 LH-20컬럼은 60g의 세파덱스 LH-20(Pharmacia, USA)을 MeOH 원액으로 12시간 동안 팽윤(swelling)하여 컬럼에 충진시킨 다음, 300㎖의 MeOH로 평형화시킨 컬럼이다.

100개의 분획 중에서 20개의 대표시료를 5배수 번호 즉 5, 10, 15 ……의 번호 순으로 선별하고, 실시예 1에서 사용된 DPPH 용액 20㎖을 첨가하여 색깔이 변하는 정도를 관찰한 결과, 25번 분획에서 강력한 항산화성 반응이 나타났다(참조 : 제2도).

이어, 분석할 분획의 범위를 좁혀서 16번 분획부터 30번 분획까지의 시료에 DPPH 용액을 첨가하여, 항산화력을 나타내는 분획 22번 내지 분획 26번을 확보하였다(참조 : 제2도).

[실시예 3]

[항산화물질의 동정]

실시예 2에서 가장 큰 항산화력을 나타내는 것으로 확인된 분획 23, 24 및 25번 의 순도를 박층크로마토그래피(TLC) 및 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 조사한 결과, 전기 각 분획에는 95% 이상의 고순도 물질이 함유되어 있는 것으로 나타났다. 이어, 이들 분획을 모아서 용매를 휘발시킨 다음, 분자구조를 규명하기 위한 시료로 사용하였다.

이때, 분자구조는 질량 분광법(mass spectroscopy), UV 흡광분석법 및 NMR 분광법에 의해 결정하였다. 분자구조의 분석 결과, 전기 고순도 항산화물질은 탄소수 18개, 수소수 16개 및 산수소 8개로 이루어진 분자량 360의 로즈마린산(rosmarinic acid)으로 밝혀졌으며, 이 항산화물질은 꿀풀과 식물에 고루 분포하는 것으로 알려져 있다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, DPPH의 색 변화를 이용하는 항산화물질의 분석방법은 방아풀을 비롯한 여러가지 식물체, 동물체 및 미생물 등에 존재하는 항산화물질을 신속·간단하면서도 경제적으로 검출 또는 정량할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 항산화물질의 탐색, 분리·정제에 이용될 수 있으며, 새로운 항산화물질의 개발 및 연구에도 이용될 수 있다.

Claims (4)

1. 항산화물질을 포함한 시료와 DPPH(1, 1-dipheny1-2-picrylhydrazyl)를 반응시켜, DPPH의 짙은 보라색이 무색으로 변하는 색깔 변화를 조사하는 단계를 포함하는 항산화물질의 분석방법.
2. 제1항에 있어서, 시료는 식물, 동물 또는 미생물의 추출물인 것을 특징으로 하는 항산화물질의 분석방법.
3. 제1항에 있어서, DPPH(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 에틸알코올에 용해되어 있는 것을 특징으로 하는 항산화물질의 분석방법.
4. 방아풀잎 분말의 메탄올, 클로로포름 및 에틸아세테이트 추출을 연속으로 진행시키고, 에틸아세테이트층을 세파덱스 LH-20 크로마토그래피하는 공정으로 방아풀로부터 항산화물질을 분리하는데 있어서, 제1항의 방법을 이용하여 로즈마린산을 분석하는 방법.

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