KR100229113B1 - 티엘아이에스에이 세포 표면 항원 및 그를 암호화하는 재조합 디엔에이 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포유동물 숙주세포내의 일시적 형질발현을 기초로 하여 포유동물의 형질발현 라이브러리로부터 cDNAs를 클로닝하는 간단하고 고도로 효율적인 방법에 관한 것이다.

포유동물의 cDNA 라이브러리의 고도로 효율적인 구성을 할 수 있게하는 새로운 형질발현 벡터에 대하여도 기술되어 있다. 인체 림프구의 세포 표면 항원에 대한 유전자를 클로닝하는데 사용되어온 본 발명의 클로닝 방법은 유전자를 클로닝 하는데 일반적으로 응용하고 있다. 본 발명에 따라 클로닝 된 세포 표면 항원을 정제하고 그의 뉴클레오티드 시퀀스와 아미노산 시퀀스를 결정하였다. 이들 항원은 사람을 포함한 포유동물에서의 면역 중재된 전염병의 진단 및 치료 유용성을 갖는다.

Description

티엘아이에스에이 세포 표면 항원 및 그를 암호화하는 재조합 디엔에이{TLiSa cell surface antigen and a recombinant DNA encoding the same}

본 발명은 계류중인 1988년 2월 25일자 미국 특허 출원 번호 제 160,416호의 일부 계속 출원인, 계류중인 1989년 7월 13일자 미국 특허 출원 번호 제 379,076호의 일부 계속 출원인, 계류중인 1990년 3월 23일자 미국 특허 출원 번호 제 498,809호의 일부 계속 출원이다.

[배경 기술]

재조합 유전학 분야의 기본 수단은 폴리(A)⁺mRNA를 이중 가닥(이하 ds라 함)cDNA로 전환시켜 그것을 클로닝 벡터에 삽입하고 적당한 숙주 세포에서 형질발현시키는 것이다. ds cDNA의 분자 클로닝 방법은 예를들어 Williams, 'The Preparation and Screening of a cDNA Clone Bank' in Willaimson,

ed. Genetic Engineering, Vol, 1, p. 2, Academic Press, New York(1981) ; Maniatis, 'Recombinant DNA', in Prescott, ed., Cell Biology, Academic Press, New York(1980) ; 및 Efstratiadis 등의, 'Cloning of Double-Stranded DNA,' in Stelo 등의 Genetic Engineering, Vol. 1, p. 15, Plenum Press, New york(1979) 문헌에서 검토되어 왔다.

특정 유전자 및 cDNA 클로닝 방법의 성공적인 클로닝에 영향을 미치는 상당한 변수는 조심스럽게 선택되어야 한다. 많은 cDNA클로닝 방법에 있어서, 공통적인 방법은 관심있는 유기체 세포에서 유도된 전체 폴리(A)⁺mRNA로부터 유도된 cDNA 클론의 집합인 'cDNA 라이브러리'의 구성과 관련이 있다.

포유동물의 세포는 30,000 개 이내의 상이한 mRNA 서열을 함유하고, 예를들어 양이 풍부하지 않은 mRNA를 수득하는데 필요한 클론의 수는 훨씬 더 많아야 할 것이다. 람다박테리오 파지, 코스미드 및 바이러스 벡터들을 포함하는 상이한 형질 발현 벡터내의 진핵세포 게놈 DNA 라이브러리를 구성하는 방법은 공지되어 있다. 일반적으로 사용되는 몇몇 방법들은 예를들어, Maniatis 등의, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, New York(1982) 문헌에 기술되어 있다.

일단 게놈 cDNA 라이브러리가 구성되면, 관심있는 특정 인체 유전자를 함유한 세포를 수천의 숙주 세포로부터 분리할 필요가 있다. cDNA라이브러리부터 표적 유전자를 분리하는 많은 상이한 방법들을 계속 변화시키면서 이용하였다. 이러한 방법에는 예를들어, 표적 유전자의 DNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 가지는 표지된 mRNA 단편인 핵산 프로브를 이용하는 방법이 포함된다. 이 방법을 형질 전환된 박테리아 숙주내의 풍부한 mRNA 의 cDNA 클론에 적용하였을 때 이 프로브에 강하게 혼성화하는 군체들은 표적 DNA 서열을 포함하는 것 같다. 그 클론의 확인은 예를 들어 원위치 혼성화/선택법 [Goldberg 등의, Methods Enzymol., 68:206(1979) 문헌 참조], 혼성 저해 번역법 [Paterson 등의, Proceedings of the national Academy of Sciences, 74:4370(1977)문헌 참조] 또는 직접적인 DNA 서열결정법 [Maxam 및 Gilbert, Proceedings of the National Academy of Sciences, 74:560(1977) 및 Maat 및 Smith, Nucleic Acids Res., 5:4537(1978) 문헌 참조] 에 의해 이루어질 수 있다.

그러나, 그러한 방법들은 그 목적이 cDNA 라이브러리로부터 비교적 풍부하지 않은 mRNA를 복제시키려 할때 주된 약점을 갖는다. 예를들어, 직접적인 원위치 군체 혼성화법을 이용하면 200 의 1 부 미만 정도의 초기 라이브러리 집단에 존재하는 mRNA 종에 상보적인 cDNA를 함유한 클론을 검출하기란 매우 어렵다. 결과적으로, 전체 집단내의 mRNA 를 풍부하게 하는 다양한 방법들(예를들어, 크기 분획법, 합성 올리고데옥시뉴클레오티드를 사용하는 방법, 차등 혼성화법 또는 면역정제법)이 개발되었고 풍부하지 않은 mRNA를 복제시킬 때 자주 사용된다. 이러한 방법은 예를 들어, Maniatis 등의 Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 상기 문헌에 기술되어 있다.

다수의 기능성 진핵 단백질은 초기에 그의 N-말단부에서 리더 서열 또는 시그널 서열을 함유한 전구체 분자의 형태로 존재한다. 이들 리더 서열은 세포막에 결합하고 시그널 서열이 시그널 펩티다제 효소에 의해 단백질로부터 절단된 후, 지질 이중층을 통해 잔여 단백질을 끌어당긴다. 이런식으로 단백질이 세포로부터 분비되거나(예를들어, 인슐린, 혈청 알부민, 항체 및 소화관 효소) 그 단백질이 세포막의 외부 표면에 결합된 후(예를들어, 조직적합성 항원)에만 기능을 수행한다.

세포 표면 항원 특성을 가진 포유동물의 T 림프구는 세포 표면에 결합하는 단백질의 부가적인 예이다. 포유동물에서, 성숙한 골수에서 림프구로 유도된 모든 세포는 흉선, 지라, 림프절 및 임파성 집합체를 포함하는 림프 기관에 존재하고 혈액 및 림프계를 통해 활발히 순환하기도 한다. 성숙한 림프구 세포는 흉선-의존(T) 림프구 및 흉선-비의존(B) 림프구의 두 집단으로 나누어질 수 있다. T 림프구는 흉선의 내부로 이동하여 거기에서 분화증식된다.

분화과정 중에 T 림프구는 Thy-1, TLA, gv-1, Ly-1, Ly-2, Ly-3 및 Ly-5를 포함하는 특징적인 세포 표면막 동종항원을 형질발현한다. T 림프구가 성숙함에 따라, T 림프구는 재순환 T 림프구의 전형적인 막 입체형태를 취하면서 TLA 항원 및 Thy-1 항원 중 일부를 상실하고 조직적합성 항원을 얻는다. 이것에 대하여는 예를들어, Mota, 'Activity of Immune Cells,' in Bier 등의, eds., Fundamentals of Immunology, 2d, Ed., Springer-Verlag, Berlin, pp. 35-62(1986) 문헌에 기술되어 있다.

T 림프구는 항체 형성 및 활성도에 간접적으로 관련되어 있으므로 단순 항체 적정 측정보다는 오히려 세포 기능의 복합적인 분석을 필요로 하였다. 이 때문에 부분적으로는 면역적응 개발에 있어서의 그들의 중요성은 비교적 최근까지 인식되지 않았다. 성숙 T 림프구는 T 헬퍼 세포, T 억제 세포 및 T 세포독성 세포를 포함하는 다른 T 림프구 부집단들을 확인하기 위한 표지물 역할을 하는 독특한 유형의 당단백질 표면 항원을 합성하고 형질발현한다. 이들 각각의 부집단은 면역계를 조절함에 있어 매우 중요한 역할을 한다.(Mota 의 상기 문헌 참조).

인체에서 기능성이고 표현형인 이형의 T 림프구가 잘 받아들여진다. 두 개의 주된 부집단인, 세포의 면역성을 중재하는 작동 T 세포 및 헬퍼 T 림프구와 억제 T 림프구를 함유하는 조절 T 세포가 공지되어 있다 : 이들 두 부집단은 세포 표면 항원에 향하고 있는 이형항혈청, 자가항체 및 모노클로날 항체로 한정되어졌다. 예를들어, 형성 초기에는 흉선에서의 인체 림프 세포들이 분화 2의 균주군(CD2)이라 명명된 모노클로날 항체에 강하게 반응하는 T11 이라 명명된 항원을 형질발현하고, 세포 표면 항원 T1 에 대한 모노 클로날 항체 CD5와 약하게 반응한다. 성숙되는 동안, 이들 세포는 T11(CD2)을 상실하고 모노클로날 항체 CD4, CD8 및 CD1으로 한정된 세 개의 새로운 항원을 수득한다. 더욱 성숙되면서, 흉선세포는 모노클로날 항체 CD1 과 반응하는 세포 표면 항원을 형질발현하고 모노클로날 항체 CD3 와 반응하는 T3 항원을 형질발현하는 것을 끝낸 다음 T4(CD4) 또는 T8(CD8) 항원을 형질발현하는 두 부집단으로 분리된다. 면역적응은 이 단계에서 수득되지만 흉선 림프구가 흉선 외부로 이동할때까지 완전히 발달하지는 않는다(Mota 의 상기문헌 참조). 대부분의 흉선과는 대조적으로, 순환 T 림프구는 T1(CD5) 및 T3(CD3) 항원을 형질발현한다. T4(CD4) 항원은 약 55 - 65% 의 말초 T 림프구상에 존재하는 반면에, T8(CD8) 항원은 20 - 30 % 의 말초 T 림프구 상에 존재한다. 이들 두 부집단은 각각 헬퍼 T 세포, 억제 T 세포 및 세포독성 T 세포에 해당한다.

T 림프구 부집단을 구별하는 편리한 방법을 제공하는 것 이외에, 이들 세포 표면 항원은 성숙 T 세포 활성화 및 작동 기능을 위해 중요하다. T 세포 활성화는 T 세포 특이 항원에 T 세포 수용체가 결합하는 이외에 T 세포와 표적 세포 또는 자극 세포 사이의 복합적인 일련의 세포 표면 상호 작용과 관련이 있다.

예를 들어, 인체의 T 세포 적혈구 수용체인 CD2 는 흉선세포 및 T - 림프구를 표적 세포(예를 들어, 적혈구) 및 흉선 상피에 접착하도록 한다. 이것은 인체에서 광범위하게 분포된 표면 항원인 LFA-3 라 명명된 CD2 의 특정 분자 리간드를 통해 발생한다. 이 현상은 오랫동안 양의 적혈구에 대한 항체를 생성하는 인체 세포를 감지, 분석 및 정제하는데 사용되어 왔고, Zaalberg, Nature 202 : 1231(1964)문헌에 의해 처음으로 기술된 E - 로제트 실험의 기초 역할을 한다. CD2/LFA - 3 상호작용은 세포 용해성 표적접합[Shaw 등의 Nature 323 : 262-264(1986) 참조] 및 혼합된 림프구 반응[Martin 등의 J.Immunol. 131 : 180-185(1983)참조]을 중재하는 것으로 나타났다. 항 - CD2 모노클로날 항체는 CD2에 대해 더 폭넓은 면역 조절 역할을 나타내는 항원 - 독립 경로 [Meuer 등의 Cell 36 :897-906(1984) 문헌 참조]를 통해 말초 T - 림프구를 직접적으로 활성화시킬 수 있다.

T 림프구가 세포 - 중재 면역성의 주된 작동인자이고 면역 반응을 조절함에 있어 헬퍼 T 세포 또는 억제 T 세포로서 관련되기도 한다는 인식은 임상 면역학을 의약에 실용적으로 응용하는 것을 증가시키는데 상당히 기여하는 결과를 낳았다. 본 출원의 범위에는 감염증에 대항하는 방어작용, 면역법, 기관이식, 혈액 저장에 의한 질병의 예방 및 면역계의 결함 치료 및 면역학적 메카니즘에 의해 중재된 다양한 질병의 치료를 포함한다. 더구나, 면역학적 기술은 호르몬과 약물측정시 임상 실험실에서 흔히 이용된다. 예를 들어, 임상 면역학은 Weir, ed., Handbook of Experimental Immunology in Four Volumes : Volume 4: Applications of Immunological Methods In Biomedical Sciences. 4th Ed. Blackwell Scientific Publications, Oxford(1986) ; Boguslaski 등의 eds., Clinical Immunochemistry : Principles of Methods and Applications, Little, Brown & Co., Boston(1984) ; Holborow 등의, eds., Immunology in Medicine : A Comprehensive Guide to Clinical Immunology, 2d Ed., Grune & Stratton, London(1983) ; 및 Petersdorf 등의 eds., Harrison's Principles of Interanl Medicine, 10th ed. McGraw - Hill, New York, Publisher, pp. 344-391(1983) 문헌에 기술되어 있다. 분명히, 면역계를 조정하는 단백질을 더욱 완전히 이해하는 것은 임상 면역학에 있어 상당히 가치가 있다.

상기한 바와 같은 포유동물의 단백질을 암호화하는 cDNA를 분리하기 위한 포유동물의 형질발현 라이브러리의 사용은 몇가지 잇점을 제공하였다. 예를 들어, 포유동물의 숙주세포에서 형질발현된 단백질은 기능성이어야 하고 모든 정상적인 번역후 변형을 진행할 것이다. 세포내 막계를 통해 수송되는 단백질은 대체로 완전한 수송 과정을 거쳐야 한다. 또한 포유동물의 형질발현 계는 세포내의 수송 메카니즘과 세포 표면 단백질을 막에 부착시키고 삽입하는 메카니즘을 연구할 수 있게 하였다.

'COS' 세포라 불리우는 포유동물의 일반적인 숙주 세포는, 시미안 바이러스 균주 40 (SV 40) 이라 명명되고 초기 및 후기의 기능성 유전자를 가지지만 기능성 복제 기원이 결여된 돌연변이 바이러스성 벡터로 원숭이의 신장 세포를 감염시킴으로써 형성된다. SV 40 T 항원이 COS 세포내에 존재하기 때문에 SV 40 복제 기원을 포함하는 벡터상에 클로닝된 모든 외부 DNA 는 COS 세포에서 복제될 것이다. 외부 DNA 는 세포성 DNA 에 독립적이고 일시적으로 복제될 것이다.

최근 몇몇 림포킨을 제외하고 cDNA는 COS 세포내 형질 발현에 의해 분리되었으나 [Wong, G.G. 등의 Science 228 ; 810-815(1985) ; Lee, F. 등의 Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 83 : 2061-2065(1986) ; Yokota, T. 등의 Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 83 : 5894-5898(1986) ; Yang, Y. 등의 Cell 47 : 3 - 10 (1986)참조], 일반적으로 포유동물의 형질발현 라이브러리로부터 분리되는 cDNA 는 거의 없다. 이것에 대한 두가지 주요한 이유가 있는 것으로 나타났다. : 첫째로는, 큰 플라즈미드 라이브러리의 구성을 위한 현존 기술(Okayama, H. 등의 Mol. Cell. Biol. 2 : 161 - 170(1982) 문헌 참조]을 터득하기가 어렵고, 파지 클로닝 기술에 의해 얻을 수 있는 라이브러리 크기는 좀처럼 연구되지 않는다는 것이다[Huynh, T. 등의 In : DNA Cloning Vol. I, A Practical Approach, Glover, D.M.(ed.), IRL Press, Oxford(1985), pp. 49-78문헌 참조]. 둘째로는, 현존 벡터들이 예외적으로 특히 COS 세포내에서 높은 수준의 형질발현을 위해 불완전하게 적응된다는 것이다[Wong, G. G. 등의 Science 228 : 810-815(1985) 문헌 참조]. 이들 cDNA 가 특히 형질 발현 라이브러리로부터 분리되기 쉽기 때문에 림포킨 cDNA와 관련하여 보고된 성공은 사용된 방법이 일반적으로 적합함을 시사하는 것은 아니다. 림포킨 생물검정은 매우 민감하고[Wong, G. G. 등의 Science 228 : 810-815(1985); Lee, F. 등의 Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 83 : 2061-2065(1986) ; Yokota, T. 등의 Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 83 : 5894-5898(1986) ; Yang, Y. 등의 Cell 47 : 3-10 (1986) 문헌 참조], mRNA 는 전형적으로 풍부하고 짧다[Wong, G. G. 등의 Science 228 : 810-815(1985) ; Lee, F. 등의 Proceedings of the National Academy of Scinces, USA 83 : 2061-2065(1986); Yokota, T. 등의 Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 83 : 5894-5898(1986); Yang, Y. 등의 Cell 47 : 3-10(1986) 문헌 참조].

그러므로, 포유동물 숙주에서의 형질 발현은 보다 전통적인 클로닝 방법으로 분리된 유전자에 의해 암호화된 단백질을 확인하는 다양한 방법으로서만 이전에 가장 흔히 사용되어 왔다. 예를 들어, Stuve 등의 J. Virol. 61(2) : 327-335(1987) 문헌에서 E. coli JM101 감응 세포를 형질전환 시키는데 사용되는 M13을 기초로한 재조합 파지 벡터를 플라크 혼성화함으로써 헤르페스 단순형 II 균주 333(herpes simplex Type II strain 333)의 당단백질 gB2에 대한 유전자를 클로닝하였다. 그리하여 분리된 클론에 의해 암호화된 단백질의 동질성은 포유동물의 COS 세포와 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 형질감염시킴으로써 입증되었다. 형질 발현은 면역형광법 및 방사능 면역침전법에 의해 입증되었다.

Oshima 등은 인체 태반의 베타-글루쿠로니다제를 암호화하는 유전자에 대한 파지 람다 gt11 cDNA 라이브러리를 선별하기 위해 플라크 혼성화법을 사용하였다[Oshima 등의 Proceedings of the national Academy of Sciences, U.S.A 84 : 685-689(1987)참조]. 분리된 cDNA 클론의 동질성은 SV 40 후 작동자를 이용하여 클로닝된 삽입물로 형질감염시킨 COS-7 세포에 의해 형질발현된 단백질의 면역침전법으로 입증하였다.

포유동물 세포내의 일시적인 형질발현은 다른 선별 방법에 의해 예전에 분리된 유전자의 동질성을 확인하는 수단으로 사용되어 왔다. Gerald 등의 Journal of General Virology 67 : 2695-2703(1986)문헌을 참조하라. Mackenzie, Journal of Biological Chemistry 261 : 14112-14117(1986) ; Seif 등의 Gene 43 : 1111-1121(1986) ; Orkin 등의 Molecular and Cellular Biology 5(4) : 762-767(1985) 문헌도 참조하라.

이 방법들은 흔히 효과적이지 못하고 지루하며 충분한 길이의 클론 또는 중복된 클론을 확인하기 위해 여러 차례의 선별과정을 필요로 한다. 융합 단백질의 형질 발현에 기초를 둔 선행 선별 방법들은 효과적이지 못하고 다량의 모노클로날 항체를 필요로 한다. 그러한 약점은 효과적이지 않은 형질발현 벡터를 이용함으로써 가중되며, 결국 효과적인 선택을 하기에 부적합한 단백질 형질발현 수준이 된다.

발명의 요약

본 발명은 세포 표면 항원을 암호화하는 cDNA, 분리된 뉴클레오티드 서열 및 그의 암호화된 산물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 세포 표면 항원을 암호화하는 cDNA를 클로닝하는 새롭고 강력한 방법 및 진핵 숙주 세포내에서 고도로 형질발현 되기에 특히 적합한 고효율의 형질발현 벡터에 대한 cDNA 라이브러리를 구성하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 고도의 효율적인 클로닝 방법은 진핵 세포내의 항원의 일시적인 형질발현 및 배양 접시와 같은 항원 코팅 물질에 접착시킴으로써 항원을 형질발현하는 세포를 물리적으로 선택하는 것에 기초를 두고 있다. 본 발명의 방법은 진핵 세포의 세포 표면막에 수송되고 형질발현될 수 있는 모든 단백질의 분리 및 분자 클로닝에 유용하다.

본 발명의 세포 표면 항원을 암호화하는 cDNA를 클로닝하는 방법은 cDNA 라이브러리를 제조하고, 이 cDNA 라이브러리를 진핵 포유동물 세포, 바람직하게는 조직 배양 세포에 도입하고, 이 세포 표면 항원이 형질발현될 수 있는 조건하에서 이들 세포를 배양하고 이 세포 표면 항원에 향해 있는 항체 또는 제 1 항체에 이 세포들을 노출시켜서 세포 표면 항원 - 제 1항체 복합체를 형성하고, 후속적으로 이 세포들을 제 1항체에 향해 있는 제 2 항체로 코팅된 기질에 노출시켜서 세포표면 항원을 형질발현하는 세포들을 세포 표면 항원 - 제 1 항체 - 제 2 항체 복합체의 형성을 통해 기질에 접착하게 하고, 그 접착물을 접착되지 않은 세포로부터 분리하는 것을 포함한다.

본 발명의 클로닝 방법을 이용하여, 다음과 같은 세포 표면 항원을 암호화하는 유전자를 분리하고 분자 클로닝 할 수 있었다. : CD1a, CD1b, CD1c, CD2, CD6, CD7, CD13, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CD26, CD27, CD28, CD31, CDw32a, CDw32b, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRia, FcRib, TliSa 및 Leu8 항원.

본 발명의 방법에 의해 클로닝된 유전자의 뉴클레오티드 서열이 결정되었고 암호화된 단백질의 아미노산 서열이 확인되었다. CD1a, CD1b, CD1c, CD2, CD6, CD7, CD13, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CD26, CD27, CD28, CD31, CDw32a, CDw32b, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRla, FcRIb, TLiSa 및 LEU8을 암호화하는 클로닝된 유전자 또한 본 발명의 당면 과제이다.

일단 항원을 암호화하는 유전자가 본 발명의 방법에 따라 클로닝되면, 그 유전자는 자연계에는 존재하지 않는 실질적인 순수형으로 그의 부분 또는 암호화된 단백질을 생성하기 위해 원핵 또는 진핵 숙주 세포내에서 형질발현될 수 있다. 본 발명의 양상은 실질적으로 순수한 세포 표면 항원들, 특히 CD1a, CD1b, CD1c, CD2, CD6, CD7, CD13, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CD26, CD27, CD28, CD31, CDw32a, CDw32b, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLiSa 및 Leu8 항원 및 그의 기능성 유사체 및 동등물에 관한 것이다.

CD1a, CD1b, CD2, CD7, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CD27, CD28, CDw32a, CDw32b, CD33, CD34, CD40, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLiSa 및 Leu8 항원의 일차 아미노산 서열이 결정되었다. 그리하여 본 발명은 또한 이들 항원의 아미노산 서열 및 이들의 기능성 동등물 및 이들 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.

또한 본 발명은 매우 큰 포유동물의 형질발현 라이브러리를 형성하고 포유동물의 숙주 세포에서 다량의 단백질을 산출하여 효율적인 선택을 하게 하는 효율이 높은 cDNA 형질발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 특별한 유형에서, cDNA 형질발현 벡터는 억제 tRNA 유전자 ; SV 40 기원 ; HIV LTR -60 내지 +80 서열에 융합된 직접적인 초기 인핸서 시퀀서인 인체 시토메가로바이러스 AD 169 로 구성된 키메라 프로모터를 포함하며, 억제 tRNA 유전자와 SV 40 기원 사이에 삽입되어 있는 합성 전사 단위 ; 복제가능한 DNA 서열에 의해 분리되고 XbaI 부위에 의해 측면에 위치한 두 Bst XI 부위를 포함하는 폴리링커 ; 및 SV 40 소형 t 항원 스플라이스 폴리아데닐화 신호 초기 부위를 포함한다.

본 발명의 다른 양상은 HIV LTR -60 내지 +80 서열에 융합된 직접적인 초기 인핸서 시퀀서인 인체 시토메가로바이러스 AD 169로 구성된 키메라 프로모터를 포함하며 cDNA 형질발현 벡터에 사용하기 위한 합성 전사 단위를 포함한다. 본 발명의 cDNA 형질발현 벡터 서열의 작은 크기 및 특정 배열은 COS 세포와 같은 숙주 포유동물 조직 배양 세포내에서 복제가 효율적으로 이루어지게 한다. 더구나, 이 벡터는 짧은 복제가능한 DNA 단편에 의해 분리된 두개의 전환된 Bst XI 부위를 함유하는 폴리링커를 사용하여 매우 효과적인 올리고뉴클레오티드를 바탕으로한 cDNA 삽입 방법을 사용할 수 있게 한다.

본 발명의 또다른 양상은 짧은 복제 가능한 DNA 단편에 의해 분리되는, 각각에 대하여 방향을 바꾼 두 개의 동일한 Bst XI 부위를 포함하는 벡터를 포함한다. 본 발명의 또다른 양상은 위에서 언급한 바와 같은 폴리링커를 포함한다.

본 발명의 다른 양상은 벡터에 삽입하고자 하는 cDNA 단편에 본 발명의 폴리링커의 짧은 복제가능한 DNA 단편과 유사한 말단 서열을 제공하는 합성 DNA 올리고뉴클레오티드를 결합시키고, 그 결과 생기는 cDNA 단편과 합성 DNA 올리고뉴클 레오티드 말단 서열을 이미 짧은 복제가능한 DNA 단편이 제거된 그 벡터의 폴리링커에 삽입시키는 것을 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 바탕으로한 cDNA 삽입 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 따라 cDNA 라이브러리를 제조함에 있어, 대식 세포 및 림프구에 의해 많은 종양 세포들이 대량 침투되어 통상적으로 사용되는 종양 세포주 대신에 상당한 효과를 내기 위해 대식세포 또는 림프구 전사물의 원료로서 사용될 수 있음을 발견해내었다. 그러므로 본 발명의 다른 양상은 본 발명의 방법에 의해 사용될 cDNA 라이브러리를 제조하기 위해 종양 세포, 특히 인체의 종양 세포를 사용 하는 것과 관련이 있다.

본 발명의 강력한 선택 시스템의 다른 잇점은 cDNA 를 직접적으로 삽입할 필요가 없다는 것이다. 본 발명의 방법은 람다 gt10 및 gt11 과 같은 파지 벡터들에 대해 기술된 효과와 같은 라이브러리 구성 효율의 결과가 생기며 본 발명의 방법에 따라 생성된 클론이 조작되기 쉽다는 부가적인 잇점을 갖는다.

본 발명의 면역학적 선택 기술은 비교적 소량의 절대량으로 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있는 항체를 효율적으로 사용하게 한다. 또한 본 발명의 방법은 매우 신속하다. 일반적으로, 세 개 또는 몇몇 사이클의 면역학적 선택 및 구출은 표적 cDNA 클론을 분리하는데 필요하다. 그리하여, 본 발명의 방법은 또한 세포 표면 항원을 암호화 하는 유전자를 클로닝할 때 노동 및 재료를 효율적으로 사용하는 결과가 된다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 방법은 포유동물의 T 림프구와 결합한 세포 표면 항원(예를 들어, 항원 CD1a, CD1b, CD1c, CD2, CD6, CD7, CD13, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CD26, CD27, CD28, CD31, CDw32a, CDw32b, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLiSa 및 Leu8)을 암호화하는 유전자를 성공적으로 클로닝하는데 사용되었다.

본 발명의 정제된 유전자 및 정제된 단백질은 면역 중재 감염증, 질병 및 사람을 포함한 동물의 질환을 진단하고 치료하는 것을 포함하는 면역진단과 면역치료의 적용에 있어 유용하다. 또한 본 발명의 정제된 유전자 및 정제된 단백질은 다른 항체 및 항원을 확인, 분리 및 정제 하는데 사용될 수 있다. 그러한 진단 및 치료 용도는 아직 본 발명의 다른 양상에 포함되지 않는다. 더구나, 본 발명의 실질적으로 순수한 단백질은 치료학적 투여를 위한 의약 또는 제약학적 조성물로서 제조될 수 있다. 더 나아가 본 발명은 그러한 의약 및 제약학적 조성물에 관한 것이다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 세포 표면 항원을 암호화하는 cDNA를 클로닝하기 위한 새로운 방법 및 cDNA 라이브러리를 구성하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 분리된 특정 cDNA 형질발현 벡터 및 그의 구성요소, 뉴클레오티드 서열 또는 유전자, cDNA 단편에 의해 암호화된 실질적으로 순수한 세포 표면 항원에 관한 것이다. 또한 본 발명은 그 분리된 뉴클레오티드 서열 및 암호화된 산물을 이용하는 방법에 관한 것이다.

다음의 상세한 설명은 본 재조합 유전학 분야의 숙련자에게 공지된 다양한 방법학을 참고로 할 것이다. 참고로한 공지된 방법학이 설명된 간행물과 그외의 재료는 본 명세서에서서 그 전체가 참고문헌으로 인용된다. 재조합 DNA 기술의 일반적인 원칙에 따라 설정된 표준 참고 문헌에는 Darnell, J.E. 등의 Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., publisher, New York, N.Y.(1986); Lewin, B.M., Genes II, John Wiley & Sons, publisher, New York, N.Y.(1985); Old, R.W. 등의 Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2d edition, University of California Press, Berkeley, CA(1981); 및 Maniatis, T. 등의 Molecular Cloning : A Laboratroy Manual, Cold Spring Harbor, NY(1982) 문헌이 포함된다. '클로닝'이란 시험관내 재조합 기술을 이용하여 특정 유전자 또는 다른 DNA 서열을 벡터 분자에 삽입하는 것을 의미한다. 원하는 유전자를 성공적으로 클로닝하기 위해, DNA 단편을 형성시키고 그 단편을 벡터 분자와 결합시켜 복합 DNA 분자를 그 분자가 복제할 수 있는 숙주 세포에 도입하고 수용체 숙주 세포들로부터 표적 유전자를 갖는 클론을 선택하는 방법을 사용할 필요가 있다.

'cDNA'란 RNA 의존 DNA 폴리메라제(역전사효소)의 작용에 의해 RNA 주형으로부터 생성된 상보적 또는 복사 DNA 를 의미한다. 그러므로 'cDNA 클론'은 클로닝 벡터에 운반되는, 목적한 RNA 분자에 상보적인 이중 DNA 서열을 의미한다.

'cDNA 라이브러리'란 유기체의 전체 게놈을 함께 포함하는 cDNA 삽입물을 함유한 재조합 DNA 분자의 집합을 의미한다. 그러한 cDNA 라이브러리는 이미 기술된 본 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있는데 예를 들어, Maniatis 등의 Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 상기 문헌에 기술되어 있다.

일반적으로, RNA 는 우선 특정 유전자를 클로닝하고자 하는 유기체 세포의 게놈으로부터 분리된다. 본 발명의 목적을 위해서는 포유동물의 세포주 특히, 인체의 세포주가 바람직하다. 더욱 바람직한 것은 인체 종양 세포주 HPB-ALL 및 인체 림프아세포 세포주 JY 이다.

택일적으로, RNA는 동물의 종양으로부터 유도된 종양세포로부터 분리될 수 있고, 바람직하게는 인체의 종양세포로부터 분리될 수 있다. 그러므로, 라이브러리는 예를들어 인체의 부신 종양으로부터 제조될 수 있으나 그 외의 모든 종양도 사용될 수 있다.

본 발명의 면역선택 클로닝 방법은 세포로부터 특정 유전자를 포함하는 전체 RNA를 추출하고, 그 RNA 로부터 일련의 상보적인 이중 가닥 cDNA 단편을 합성하고 이들 cDNA 단편을 조직 배양물내에서 포유동물 세포에 도입함으로써 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법을 포함한다. 포유동물 세포는 단백질(즉, 세포 표면 항원)을 형질발현하게 하는 조건하에서 보존된다. 그 결과 생성된 세포는 세포표면 항원에 향해 있는 제 1 항체 또는 항체군에 노출된다. 그 결과 세포 표면 항원 - 제 1항체 복합체가 형성된다. 이 복합체는 제 1 항체에 향해 있는 제 2 항체에 코팅되거나 결합된 기질에 노출되어 있다. 세포 표면 항원을 형질 발현시키는 세포는 기질에 부착되어 있다(왜냐하면 세포 표면 항원 - 제 1 항체 - 제 2 항에 복합체가 형성되기 때문이다).

전체 RNA 의 분리

전체 RNA를 분리하는 방법은 구아니디움 티오시아네이트/염화세슘(이하 GuSCN/CsCl 이라 함) 방법에 바람직하다. 더욱 바람직한 것은 부가적인 용량 및 속도를 갖는 GuSCN/CsCl 방법의 GuSCN/LiCl 변형체이다. 간략하게, 목적한 혼합물 각 ㎖ 에 대해 0.5 g 의 GuSCN을 0.58 ㎖ 의 25% LiCl (0.45 마이크론 필터를 통해 여과된 저장액)에서 용해시키고 20 ㎕의 머캅토 에탄올을 첨가하였다. 세포를 조금씩 꺼내어 쓰고 펠릿은 가볍게 쳐서 벽에 분산시키고 5 x 10⁷세포까지 되도록 1 ㎖ 의 용액을 첨가한다. 그 결과 생긴 혼합물을 비점성상태가 될 때까지 폴리트론으로 잘라낸다.

소규모 제조(10⁸미만의 세포)의 경우, 잘라낸 혼합물의 층 2㎖를 1.5 ㎖의 5.7 M CsCl(RNase 없음 ; 1.26 g 의 CsCl을 10 mM EDTA pH 8 의 각 ㎖에 첨가한다)에 가하고, RNase 가 없는 물로 덮어 SW 55 50 K rpm에서 2시간 동안 회전시켰다. 대규모 제조의 경우, 층 25 ㎖를 SW 28 시험관내의 12㎖ CsCl에 가하여, RNase 가 없는 물로 덮고 SW 55 24 K rpm에서 8시간 동안 회전시켰다. 진공 플라스크에 연결시킨 멸균 파스퇴르 피펫으로 내용물을 조심스럽게 흡입한다. CsCl 계면을 일단 지나치면 시험관 벽상의 층이 흘러 내리는 것을 방지하기 위해 피펫 끝으로 시험관 주변의 밴드를 긁어낸다. 남아있는 CsCl 용액을 흡입한다. 펠릿을 물에 흡수시킨다(재용해시키지는 않는다). 1/10 부피의 NaOAc 및 3 부피의 EtOH를 첨가하고 최종 혼합물을 회전시켰다. 필요하다면, 펠릿을 물(예를 들어, 70℃)에 재현탁시킨다. 농도를 1 mg/㎖로 조절하고 냉동시킨다. 작은 RNA(예를들어, 5S)는 가라앉지 않는다. 소량의 세포의 경우, 부피를 줄이고 RNase 가 없는 물로 기울기식으로 GuSCN을 덮는다(RNA 가 묽을 때는 침전법은 효과적이지 못하다).

폴리 A⁺RNA 의 제조

폴리 A⁺RNA는 올리고 dT 선택 방법에 의해 바람직하게 제조할 수 있다. 간략하게, 일회용 폴리프로필렌 컬럼을 5M NaOH로 세척한 다음 RNase 가 없는 물로 수세함으로써 제조한다. 전체 RNA 의 각 밀리그램에 대해 약 0.3 ㎖(최종 패킹 베드)의 올리고 dT 셀롤로오스를 사용한다. 올리고 dT 셀롤로오스는 1 ㎖ 의 0.1 M NaOH 에 약 0.5 ㎖ 의 건조 분말을 재현탁시키고, 그것을 컬럼에 옮기거나 이전에 사용한 컬럼(컬럼은 여러차례 재사용할 수 있다)을 통해 0.1 M NaOH를 여과함으로써 제조한다.

이것은 수배 컬럼부피의 RNase 가 없는 물로 pH 가 중성이 될 때까지 세척하고 2 - 3㎖ 의 적하 완충액으로 수세한다. 컬럼 베드를 4 - 6 ㎖ 의 적하 완충액을 사용하여 15 ㎖ 의 멸균 시험관에 버린다. 전체 RNA를 70 ℃에서 2-3분간 두고, RNase 가 없는 저장액의 LiCl을 첨가하고 (0.5 M 이 되게 함), 15㎖ 의 시험관에서 올리고 dT 셀롤로오스와 혼합하였다. 그런다음 10분동안 와동시키거나 교반한다. 그 결과 생긴 생성물을 컬럼에 쏟고 3㎖의 적하 완충액으로 수세한 다음 3㎖ 의 중간 수세 완충액으로 세척하였다. mRNA 는 1.5㎖ 의 2 mM EDTA, 0.1% SDS로 SW 55 시험관내로 직접 용리하였다 ; 처음 두 방울 또는 세방울은 버렸다.

용리된 mRNA는 1/10 부피의 3M NaOAc를 첨가하고 EtOH 로 시험관을 채움으로써 침전시켰다. 그런다음, 이것을 혼합하고 -20 ℃에서 30분동안 냉각시켜 5 ℃에서 30 분간 50 K rpm 으로 회전시켰다. EtOH을 부어버리고 시험관을 공기중에 건조시켰다. mRNA 펠릿은 50 - 100 ㎕ 의 RNase 가 없는 물에서 재현탁시켰다.

약 5㎕ 를 MOPS/EDTA/포름알데히드에서 70 ℃로하여 용융시키고 RNase가 없는 1 % 아가로즈 겔 상에 런닝시켜 질을 검사한다.

cDNA 합성

다음으로부터 cDNA 를 합성한다. 바람직한 cDNA 의 합성 방법은 Gubler 및 Hoffman 에 의해 기술된 다양한 방법이 있다.[Gene, 25 : 263-269(1982) 문헌 참조]. 이 방법은 다음과 같이 실시한다 :

a. 첫 번째 가닥 제조

4 ㎍의 mRNA를 준비하고 그것을 30 초간 마이크로퓨즈 시험관내에서 약 100 ℃로 가열하고 얼음에서 식혔다. 부피는 RNAse가 없는 물로 70 ㎕가 되도록 조절하였다.

그런다음 20 ㎕의 RT1 완충액, 2 ㎕의 RNAse 저해제(뵈링거에서 구입, 36 u/㎕), 5 ㎍/㎕ 의 올리고 dT (콜라보래이티브리서치에서 구입, 1㎕,) 및 20 mM dXTP's (울트라퓨어에서 구입, 2.5㎕), 1 M DTT 1 ㎕, 4㎕ 의 RT-LX(라이프사이언스에서 구입, 24 u/㎕)를 첨가하였다. 그 결과 생긴 혼합물을 42℃에서 40분간 항온하였다. 그런 다음 불활성이 되도록 열을 가하였다(70 ℃ 에서 10 분간).

b. 두 번째 가닥 제조

320 ㎕ 의 RNAse가 없는 물, 80 ㎕ 의 RT2 완충액, 5 ㎕ 의 DNA 폴리메라제 I(뵈링거에서 구입, 5 u/㎕), 2㎕ 의 RNAse H (BRL 에서 구입, 2 u/㎕)를 준비한다. 이것을 15 ℃에서 1 시간, 22 ℃에서 1 시간 항온하였다. pH 8.0 의 0.5 M EDTA 20 ㎕ 를 첨가하고, 페놀 추출하고 NaCl 을 0.5 M 의 곧은 폴리아크릴아미드(캐리어) 20 ㎍/㎖ 에 첨가하여 EtOH 침전시키고 EtOH을 시험관에 채운다. 마이크로퓨즈 시험관에서 2 - 3 분간 회전시키고 그런다음 시험관 벽의 높은 곳에 있는 침전물을 제거하기 위해 와동시키고 1 분간 재회전시킨다.

c. 어댑터 제조

침전된 cDNA 를 240 ㎕ 의 TE(10/1)에 재현탁시켰다. 30 ㎕ 의 10 X 저염 완충액, 30 ㎕ 의 10 X 결합 첨가물, 3 ㎕ (2.4 ㎍)의 키나제 처리를 한 12 - 량체 어댑터, 2 ㎕(1.6 ㎍)의 키나제 처리를 한 8-량체 어댑터 및 1 ㎕의 T4 DNA 리가제 (바이오랩스에서 구입, 400 u/㎕ 또는 뵈링거에서 구입, 1 바이스 단위/㎖)를 첨가하였다. 그런다음 15 ℃에서 밤새도록 항온하였다. 위에서 언급한 바와 같이 페놀 추출 및 EtOH 침전시키고(여분의 캐리어 이제 필요없다), 100㎕의 TE 에 재현탁시켰다.

형질발현 벡터에 대한 cDNA 단편의 이용

본 발명의 Bst XI 를 바탕으로한 cDNA 형질발현 벡터(이하 참조)와 함께 사용하기 위해 그 벡터상의 Bst XI 부위에 상응하는 말단 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 단편을 삽입하고자 하는 cDNA 단편에 결합시켰다. 그 결과 생긴 단편을 분획화함으로써 풀을 제조하였다. 바람직한 방법은 다음과 같다 :

20 % 의 KOA, 2 mM 의 EDTA, 1 ㎍/㎖ 의 EthBr 용액과 5 %의 KOAc, 2 mM EDTA, 1 ㎍/㎖ EthBr 용액을 제조한다.

2.6㎖ 의 20% KOAc 용액을 저 기울기 표식을 가진 백챔버에 첨가한다. 용액을 전방 챔버에 흐르게 한 다음 뒤로 기울임으로써 두 개의 챔버를 연결하는 시험관으로부터 공기 방울을 제거한다. 챔버사이의 통로를 막고 2.5㎖의 5% 용액을 전방 챔버에 첨가한다. 이전의 런닝으로 시험관에 액체가 있다면 시험관 끝에 5%의 용액을 런닝시킨 다음, 챔버에 되돌아오게 한다. 장치를 교반판 위에 놓고 가능한한 빨리 움직이는 교반 막대를 고정시키고 두 챔버를 연결하는 마개를 연 다음 전방의 마개를 연다. KOAc 용액을 폴리알로머 SW 55 시험관 바닥에서부터 채운다. 100 ㎕ 의 cDNA 용액으로 기울기를 덮는다. 평형 시험관을 제조하고 50 K rpm 의 약 22 ℃에서 3 시간동안 그 기울기를 회전시킨다. 그 기울기로부터 분획을 수집하기 위해, SW 55 시험관의 바닥에 가까운 버터플라이 인퓨즌 세트(잘라낸 루에르 허브를 가지고 있음)를 가진 SW 55 시험관을 관통시키고 세개의 0.5㎖ 분획을 수집한 다음 0.25㎖ 분획 6개를 마이크로퓨즈 시험관(각각 22 방울 및 11방울)에 넣는다. 곧은 폴리아크릴아미드를 20 ㎍/㎖ 첨가함으로써 분획을 EtOH 침전시키고 EtOH 을 시험관 끝까지 채운다. 시험관을 냉각한 후 그것을 3 분간 마이크로퓨즈에서 회전시킨다.

그런다음 와동시키고 1분간 재회전시킨다. 펠릿을 70 %의 EtOH 로 수세한다(재회전). 완전히 건조시키진 말라. 10 ㎕의 TE 에 각 0.25㎖ 의 분획을 재현탁시킨다.

1 % 의 아가로즈 미니 겔상에 1 ㎕를 런닝시킨다. 처음 세개의 분획을 모으고, 마지막 여섯개의 분획은 1 kb 보다 더 작은 물질을 포함하지 않는다.

억제 tRNA 플라즈미드는 공지된 방법에 의해 증식시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 방법에서 supF 플라즈미드는 제 2의 플라즈미드인 p3 를 포함하는 비억제 숙주에서 선택될 수 있으며 암베르 돌연변이된 암피실린(amp) 및 테트라사이클린(tet) 약물 저항성의 요소를 포함한다(Seed, 1983 문헌참조). PR 1 으로부터 유도된 p3 플라즈미드는 길이가 57 kb이고, 안정하게 유지되는 단일 복사 에피좀이다. 이 플라즈미드의 암피실린 저항성은 고속으로 복귀되므로, 보통 ampr 플라즈미드는 p³- 함유 균주에 사용될 수 없다. tet 에만 저항성인 플라즈미드를 선택하는 것은 대개 amp + tet 저항성인 플라즈미드를 선택하는 것만큼 좋다. 그러나, 염색체 억제 tRNA 돌연변이의 자연발생적 출현은 이 시스템에서 피할수 없는 이면(약 10^-9빈도)을 나타낸다. 자연 발생적인 억제 돌연변이로부터 생긴 군체는 보통 플라즈미드 형질전환으로부터 생기는 군체보다 더 크다. 전형적으로 억제 플라즈미드는 12.5 ㎍/㎖의 amp 와 7.5 ㎍/㎖의 tet를 함유하는 LB 배지에서 선택된다. 대규모의 플라즈미드 제조의 경우, 글리세롤(0.8%)을 함유하는 M9 카사미노산 배지는 탄소원으로 사용될 수 있고, 박테리아는 포화상태로 성장한다.

벡터 DNA 는 공지된 방법에 의해 분리될 수 있다.

다음의 방법은 포화된 세포 1 리터로부터 플라즈미드를 분리하는 바람직한 방법이다 :

1리터의 J6 병에 있는 세포를 4.2 K rpm 으로 25 분간 회전시킨다. pH 8 의 10 mM EDTA 40 ㎖ 에 재현탁시킨다(부드러운 표면에 탁탁 친다). 0.2 M NaOH 80 ㎖, 1 % SDS를 첨가하고 투명하게 점성이 될때까지 돌려준다.

pH 4.7의 5 M KOAc(2.5 M KOAc, 2.5 M HOAc) 40 ㎖를 첨가하고 반점성이 되도록(덩어리 크기가 2 - 3 mm 가 될 때까지)흔들어 준다. 1 리터의 J6병에서 4.2 K rpm 으로 5분간 회전시킨다. 상청액을 올이 성긴 얇은 무명을 통과시켜 250 ㎖ 병에 붓는다. 이소프로필 알콜로 병을 채운다. 그런다음 1 리터의 J6 병에서 4.2 K rpm 으로 하여 5분간 회전시킨다. 병의 액체를 부어버리고 70 %의 EtOH 로 서서히 세척한다(펠릿이 부서지지 않도록 한다). 병을 뒤집어서 미량의 EtOH 을 킴와이프로 제거한다.

3.5 ㎖ 의 트리스 염기 / EDTA 20 mM/ 10 mM 에 재현탁시킨다. 3.75 ㎖ 의 재현탁된 펠릿을 4.5 g 의 CsCl 에 첨가한다. 10 mg/㎖의 EtBr 0.75 ㎖ 를 첨가하고 혼합한다. 그 용액을 VTi 80 시험관에 채운다. 80 rpm 의 속도로 2.5 시간 또는 그 이상의 시간동안 작동시킨다. 가시광선에 의해 나타난 밴드를 1 ㎖ 주사기와 20 또는 그 이하의 게이지를 가진 바늘로 밴드를 추출해낸다. 시험관 윗부분을 잘라내고, 시험관에 대해 약 30 ℃ 의 각도에서 시험관의 위쪽으로 바늘을 삽입(즉, 가능한한 얇게)하고 밴드의 약 3 mm 바로밑 지점에서 바늘을 사선으로 한다. 밴드를 제거한 후, 시험관 내용물을 표백제에 붓는다. 13 ㎖의 사르스테트(Sarstedt)시험관에 추출한 밴드를 둔다. 1 M 의 NaCl 로 포화시킨 n-부탄올을 시험관에 채워서 추출한다. 대량의 DNA 가 수득되면 재추출한다. 5 M NaOH 를 함유하는 트랩내로 부탄올을 빨아들인다(에티디움을 파괴하기 위함). 거의 동일한 부피의 1 M 아세트산 암모늄을 DNA 에 첨가한다(분출병). 약 2 부피의 95 % 에탄올을 첨가한다. 10 K rpm에서 5분간 회전시킨다. J2 - 21. 펠릿을 70 %의 에탄올로 조심스럽게 세척한다. 면봉으로 건조시키거나 동결건조시킨다.

클로닝하기 위해 공지된 방법으로 벡터를 제조헐 수 있다. 바람직한 방법은 100단위 Bst XI(미국 뉴욕 바이로랩스에서 구입)를 가진 200㎕의 반응물에서 20 ㎍의 벡터를 절단하기 시작하여 자동 온도 조절 장치가 부착된 수조(즉, 순환 구조)에서 50℃로 하여 밤새도록 절단하는 것이다. 상기한 바와 같이 SW 55 시험관에서 5 - 20 % 기울기로 2 KOAc 를 제조한다. 절단된 벡터 100 ㎕를 각 시험관에 첨가하고 50 K rpm 에서 22 ℃로 하여 3 시간동안 런닝시킨다. 300 nm 의 자외선에서 시험관을 조사한다. 목적한 백드는 그 시험관 길이의 2/3 정도에 이동해 있을 것이다. 밴드 수단의 앞쪽으로 기울기를 과부하한다. 1 ㎖의 주사기와 20 게이지의 바늘로 밴드를 제거한다. 곧은 폴리아크릴아미드를 첨가하고 3 부피의 EtOH 을 첨가하여 플라즈미드를 침전시킨다. 50 ㎕ 의 TE 에 재현탁시킨다. 일정량의 벡터와 cDNA 의 양을 증가시켜 결합시킨다. 이러한 결합 시도를 기초로하여, 대규모로 결합시키는데 이것은 공지된 방법에 의해 실시될 수 있다. 보통 전체 cDNA 제조시 1 - 2 ㎍ 의 절단 벡터를 필요로 한다.

어댑터는 공지된 방법에 의해 제조될 수 있지만 조(crude) 어댑터를 1㎍/㎕ 의 농도로 재현탁시키고, MgSO₄를 10mM첨가하고, 5부피의 EtOH을 첨가하여 침전시킨다. 70 % 의 EtOH로 세척하고 1㎍/㎕의 농도로 TE 에 재현탁시킨다. 25 ㎕ 의 재현탁된 어댑터를 갖는 키나제에 3 ㎕ 의 10 X 키나제 완충액과 20 단위의 키나제를 첨가하고, 37 ℃에서 밤새도록 항온하였다.

본 발명의 바람직한 방법 중 상기 상세한 설명에서 언급된 완충액의 제조 방법은 본 기술분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 편의상, 바람직한 완충 조성물은 다음과 같다 :

적하 완충액 : 0.5 M LiCl, 10 mM 트리스 pH 7.5, 1 mM

EDTA 0.1 % SDS.

중간 세청 완충액 : 0.15 M LiCl, 10 mM 트리스 pH 7.5,

1 mM EDTA 0.1 % SDS.

Rt 1 완충액 : 0.25 M 트리스 pH 8.8 (42 ℃ 에서는 pH 8.2),

0.25 M KCl, 30mM MgCl₂.

RT 2 완충액 :0.1M 트리스 pH 7.5, 25 mM MgCl2, 0.5 M

KCl, 0.25 mg/㎖ BSA, 50 mM DTT.

10 X 저염 완충액 : 60 mM 트리스 pH 7.5, 60 mM MgCl₂,

50 mM NaCl, 2.5 mg/㎖ BSA, 70 mM Me.

10 X 결합 첨가물 : 1 mM ATP, 20 mM DTT, 1 mg/㎖ BSA,

10mM 스페르미딘.

10 X 키나제 완충액 : 0.5 M 트리스 pH 7.5, 10 mM ATP,

20 mM DTT, 10 mM 스페르미딘, 1 mg/㎖ BSA

100 mM MgCl₂.

'벡터'란 플라즈미드 또는 박테리오파지로부터 파생되며 DNA단편이 삽입되거나 클로닝될 수 있는 DNA 분자를 의미한다. 벡터는 하나 이상의 독특한 제한 부위를 포함하고 클로닝된 서열이 복제될 수 있도록 한정된 숙주 또는 운반 유기체에서 자가복제될 수 있다. 그러므로, 'DNA 형질발현 벡터' 란 부가적인 서열의 DNA 가 자가 요소의 게놈에 삽입된 후 그 숙주의 염색체를 갖는 숙주내에서 독립적으로 복제될 수 있는 모든 자가 요소를 의미한다. 그러한 DNA 형질발현 벡터는 박테리아의 플라즈미드와 파지를 포함한다.

본 발명의 목적을 위해 바람직한 것은 시미안 바이러스 균주 40 (SV40) 으로부터 유도된 것과 같은 바이러스 벡터이다. SV40은 분자량이 28Mdal 이고, 그 바이러스의 전체 게놈을 포함하는 3 Mdal 의 분자량을 갖는 이중가닥 환상 DNA 분자를 포함하는 파포바바이러스이다. 이 단일의 작은, 공유결합 폐환상 DNA 분자의 전체 뉴클레오티드 서열이 결정되었다. Fiers 등의 Nature 273 : 113 - 120(1978) : Reddy 등의 Science 200 :494 - 502(1978) 문헌을 참조하라. SV 40의 바이러스성 DNA 는 대량 수득될 수 있고 다양한 바이러스 기능을 담당하는 게놈 부위는 DNA 의 상세한 물리적 지도에 정확하게 위치하고 있다. Fiers 등의 상기문헌 ; Reddy 등의 상기문헌을 참조하라. SV 40 의 바이러스 게놈은 무성적으로 증식할 수 있거나 세포 염색체의 완전한 부분으로서, 풍부한 정보가 이 게놈의 복제 및 형질 발현시 존재한다.

또한 본 발명의 목적을 위해 바람직한 것은 약 6.5 kb의 폐환상 DNA 게놈을 갖는 M13 이라 명명된 단일 가닥 박테리오 파지 클로닝 운반체이다. 클로닝 운반체로서 M13을 이용할 때의 잇점은 감염된 세포에서 방출된 파지 입자가 클로닝된 DNA 의 상보적인 두 가닥 중 한 가닥과 상동인 단일 가닥 DNA 를 포함하므로 DNA 서열결정 분석을 위한 주형으로 사용될 수 있다는 점이다.

본 발명의 목적을 위해 더욱 더 바람직한 것은 미국 매릴랜드 20852 록크빌레 파크로운 드라이브 12301 에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 기탁된 형질 발현 벡터 piH3, piH3M 및 CDM8 이다. piH3 는 1988년 2월 24일자 ATCC 제 67634 호로 기탁되어 있다. PiH3 은 1998년 2월 24일자 ATCC 제 67633 호로 기탁 되어 있다. CDM 은 1988년 2월 24일자 ATCC 제 67635 호로 기탁되어 있다.

'조직 배양' 이란 세포 구조물 또는 관능기 또는 그 둘다를 더 분화시키고 보존하도록 시험관내에서 동물 조직 세포를 존속 또는 성장시키는 것을 의미한다. '일차 조직 세포' 란 유기체에서 동일한 기능을 수행하는 동종의 세포로 구성된 집단에서 직접 얻어진 것을 말한다. 단백질 가수분해 효소인 트립신으로 그러한 조직 세포를 처리하는 경우를 예로들면, 배양 평판상에 고밀도로 심을 때 잘 자라는 각각의 일차 조직 세포에 그것을 해리시킨다. 조직 배양물내의 일차 조직 세포를 증식시켜 생겨난 세포 배양물은 '이차 세포 배양물'이라 일컫는다. 대부분의 이차 조직 세포는 한정된 횟수만큼 분열한 다음 죽는다. 그러나 몇몇 이차 세포들은 '분리 시기' 를 지나 계속적인 '세포주' 를 형성하도록 비한정적으로 증식될 수 있다. 흔히 세포주는 여분의 염색체를 포함하고 보통 다른 관점에서는 비정상적이기도 하다. 이들 세포의 영속성은 암세포가 공통적으로 갖는 특징이다.

본 발명에 따라 조직 배양 세포로 사용되기에 바람직한 세포주는 'COS' 라 명명된 원숭이 신장 세포주를 포함한다. COS 세포는 바이러스성 DNA 복제의 불완전한 기원을 제외한 기능성 초기 유전자 부위를 포함하는 SV40 DNA 에 의해 형질전환된 세포이다. COS 세포 클론 M6는 특히 본 발명의 방법에 사용되기에 바람직하다. 또한 본 발명의 목적을 위해 바람직한 것은 NIH 3T3 세포가 폴리오마 기원 결실 DNA 로 형질감염된 마우스의 'WOP' 세포이다. cDNA 는 본 기술분야의 공지된 방법에 의해 본 발명의 숙주 조직 배양 세포에 도입될 수 있다. 형질 감염은 예를 들어, 원형질 융합, 구형질 융합 또는 DEAE 덱스트란 방법 [Sussman 등의 Cell. Biol. 4 : 1641 - 1643 (1984) 문헌 참조] 에 의해 실시될 수 있다.

구형질 융합법을 사용한다면, Sandri - Goldrin 등의 Mol. Cell Bio. 1: 743 - 752(1981) 에 근거한 다음의 변형법이 바람직한 방법이다. 예를들어, 간단히 말하자면 여섯번 융합으로 이루어진 한 세트는 육즙에서 100㎖ 의 세포를 필요로 한다. 증식가능한 플라즈미드를 포함하는 세포를 OD 600 = 0.5 가 되도록 LB에서 성장시킨다.

100 ㎍/㎖ 의 스펙티노마이신(또는 150 ㎍/㎖의 클로람페니콜) 을 첨가한다. 10 - 16시간동안 흔들어주면서 37 ℃로 계속 항온한다(스펙티노마이신 또는 클로람페니콜 배지에서 연장 항온하면서 세포를 용해시키기 시작한다).

100 ㎖ 의 배양물(JA 14/GSA 로터, 250 ㎖ 병)을 10,000 rpm 으로 5 분간 회전시킨다. 잘 따뤄내고, 5㎖ 의 차가운 20 % 수크로즈, pH 8.0 의 50 mM 트리스 - 염산으로 병에서 펠릿을 재현탁시킨다. 얼음에서 5분간 항온한다. pH 8.0 의 차가운 0.25 M EDTA 2 ㎖를 첨가하고 37 ℃(수조) 에서 5 분간 항온한다. 얼음 위에 놓고 현미경으로 구형질의 전환 백분율을 검사한다. 유동 후드에서, 20 ㎖ 의 차가운 DME / 10 % 수크로즈 / 10 mM MgCl₂를 천천히 첨가한다(초당 약 2 방울씩 점적). 전일에 60 ㎝ 접시에 평판화한 세포로부터 배지를 제거한다(50 % 융합). 구형질 현탁액 5 ㎖를 각 접시에 첨가한다. 날개달린 버킷이 있는 원심 분리기 내의 시험관 운반체 상부에 접시를 놓는다. 6 개 정도의 접시가 한번에 편리하게 준비될 수 있다. 접시를 다른 접시위에 쌓을 수 있으나 3 개를 쌓으면 상부 접시위에 있는 구형질 층이 자주 찢어지거나 원심분리된 후 분리되므로 바람직하지 못하다. 1000 xg에서 10분간 회전시킨다. 평판 바닥에 대한 반지름을 기초로하여 힘을 계산한다. 접시로부터 유체를 조심스럽게 흡입한다. 1.5 - 2 ㎖ 의 50 %(w/w) PEG 1450 (또는 PEG 1000) / 50 % DME (무혈청)를 접시의 중심에 피펫으로 옮긴다. 필요하다면, PEG 가 접시에 방사상으로 평평하게 펴지도록 피펫 끝 주변을 깨끗하게 한다. PEG를 마지막 접시에 첨가한 후 PEG 용액이 바닥에 모이도록 모든 접시를 막대로 받쳐놓는다. 그런다음 PEG 를 흡입한다. 세포 표면에 잔존하는 PEG 박층은 융합을 촉진하기에 충분하며, 잔존하는 PEG 박층은 세척하기에 용이하고 PEG 원액이 뒤에 남겨지는 경우보다 더 좋은 세포의 생존성이 수득될 수 있다. PEG 용액과 접촉시킨 후 90 내지 120 초(PEG 1000) 또는 120 내지 150 초 (PEG 1450)만에 1.5 ㎖ 의 DME (무혈청)를 접시 중앙에 피펫으로 옮긴다. PEG 층을 DME 로 방사상으로 세척한다. 접시를 비스듬히 기울이고 흡입한다. DME 로 반복 세척한다. 15 ㎍/㎖의 황산 젠타마이신을 함유하는 3 ㎖ 의 DME / 10 % 혈청을 첨가한다. 배양기에서 4 ∼ 6시간 동안 항온한다. 배지와 잔존 박테리아 현탁액을 제거하고 배지를 더 첨가하여 2 - 3일간 항온한다.

PEG를 제거하기 위한 세포층의 과잉 세척은 실질적인 아무런 이득이 없이 많은 세포들만 제거시킨다. 만일 세포를 제 2의 DME 로 몇분간 세척하도록 놔둔다면 대부분의 구형질 층은 자연적으로 생겨날 것이다. 그러나 간단히 세척하고 완전 배지에서 37 ℃ 로 하여 종결시키는 것이 바람직하다.

PEG 용액은 PEG 가 든 신선한 병을 60℃ 로 용융시키고 50㎖의 원심분리 시험관을 이용하여 약 50㎖ 의 분취량을 예비칭량한 병에 부음으로써 편리하게 제조될 수 있다.

분취한 PEG 를 암실에서 5 ℃ 로 저장한다. 신선한 병을 제조하기 위해 분취량을 칭량하고 재용융시키고 동일한 부피의 DME(무혈청)를 첨가한다. 필요하다면, 7.5 % 의 중탄산나트륨 용액으로 pH 를 조절하고 여과 멸균한다. 그 결과 생긴 PEG 용액은 감지할만한 반대의 결과없이 실온에서 3 개월까지 저장될 수 있다.

형질감염된 숙주 세포는 cDNA 클론에 의해 암호화된 단백질을 형질발현시키고 후속적인 면역선택에 이용할 수 있는 절대수의 세포를 증가시키기 위해 본 발명에 따라 배양될 것이다. 본 기술분야의 숙련자는 본 발명의 목적에 알맞은 방법 및 배지를 인지할 수 있을 것이며, 일반적으로 고려되는 세포 유형 및 그외의 변수들을 참작할 수 있을 것이다. 예를들어, COS 세포는 10 % 의 우 혈청 및 황산 젠타마아신을 보충한 둘베코의 변형된 이글 배지(DME)에서 배양될 수 있다. 정상적으로 형질감염된 세포의 일시적인 형질 발현은 48 내지 72 시간내에 후형질감염을 예상할 수 있다. 그러나, 이 시기는 사용된 숙주 세포의 유형 또는 균주와 세포 배양 조건에 따라 변할 것이며 이것은 숙련된 기술자들에게 자명할 것이다.

본 발명의 방법에 따라 클로닝된 유전자의 면역침전, 블로팅 및 cDNA 서열검정은 본 기술분야의 숙련자에게 공지된 편리한 모든 방법으로 실시될 수 있다. 예를들어, Clark 등의 Leukocyte Typing II, Vol. II, pp. 155 - 167(1986) 문헌에 기술된 면역침전 프로토콜이 바람직하다. 본 기술분야의 공지된 서던, 노던 또는 다른 블로트 분석방법이 사용되는데, Hu 등의 [Gene 18 : 271 - 277(1982) 문헌 참조] 방법과 같이 공지된 방법에 의해 제조된 혼성 프로브를 사용 한다. 또한, cDNA 서열 검정은 Sanger 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74 : 5463 -5467(1977) 문헌의 디데옥시뉴클레오티드 방법을 포함하는 공지된 방법에 의해 실시될 수 있다.

본 발명에 따라 사용된 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 이러한 항체는 본 발명의 방법에 의해 목적한 항원 또는 항원을 형질발현하는 세포의 면역선택에 영향을 미치도록 단독으로 또는 다른 폴리클로날 또는 모노클로날 항체와 연합하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 항체 또는 그의 단편을 제조하는 방법은 본 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다.

면역학의 일반 지침을 설정해 놓은 표준 참고 문헌은 Klein, J., Immunology : The Science of Self - Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, publisher, New York(1982) ; Kennett, R. 등의 eds., Monoclonal Antibodies, Hybridoma : A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, publisher, New York(1980) ; Campbell, A., 'Monoclonal Antibody Technology' in Burden, R. 등의 eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Elsevere, publisher, Amsterdam (1984) 문헌을 포함한다.

'항체' 란 예를 들어, Fab 및 F(ab)'₂단편과 같은 항원에 결합할 수 있는 본래의 분자 이외에 그의 단편을 의미한다. 폴리클로날 항체 제제는 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 모든 표준 프로토콜을 이용하여 목적한 항원 또는 그의 단편으로 면역화시킨 후 알맞은 동물 종의 혈액으로부터 직접 유도해낼 수 있다. 이와 유사하게, 모노클로날 항체는 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다[Kohler 등의 Eur. J. Immunol. 6 : 292(1976) 문헌 참조]. 모노클로날 항체는 본 발명의 목적을 위해 바람직하게 사용된다.

본 발명에 따른 면역 선택의 목적을 위해, 표적 세포 표면 항원에 대한 항체에 노출된 조직 배양 숙주 세포는 항원에 대한 항체에 대항하여 항체로 코팅된 기질상에 그 세포들을 분포시킴으로써 표적항원을 형질발현시키지 않는 숙주 세포로부터 분리된다. '패닝' 이란 기술은 본 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있고, 예를들어, Mage 등의 J. Immunol. Meth. 15 : 47 - 56 (1977) 및 Wysocki 와 Sato 의 Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 75 : 2844 - 2848 (1978) 문헌에 의해 기술되어 있다.

본 발명의 방법에 따른 패닝은 다음과 같이 실시될 수 있다 :

a. 항체 - 코팅한 접시. 박테리오로지칼 60 mm 평판, 팔콘 1007 이나 동등물 또는 휘셔 8 - 757 - 12 와 같은 10㎝ 접시를 사용할 수 있다. 양의 항 - 마우스 친화 정제된 항체 [예를들어, 쿠우퍼 바이오메디칼 (카펠) 에서 구입] 는 pH 9.5 의 50 mM 트리스 HCl 에서 10 ㎍/㎖ 로 희석시킨다.

6 ㎝ 접시당 3 ㎖를 첨가하거나 10 ㎝ 접시당 10 ㎖를 첨가한다. 1 시간 반동안 조심스럽게 놔두고 다음 접시로 옮겨 1 시간 반동안 놔둔 다음 세번째 접시에 옮긴다. 0.15 M 의 NaCl 로 평판을 3 x 세척하고 (이 경우에는 세척병이 편리하다) PBS 내의 1 ㎎/㎖ 의 BSA 3 ㎖에서 밤새도록 배양하고, 흡입하여 냉동시킨다.

b. 패닝. 세포는 60 mm 접시에 있을 것이다.

배지를 접시로부터 흡입하고 2 ㎖ 의 PBS / 0.5 mM EDTA / 0.02 % 아지드를 첨가하여 37 ℃에서 30 분간 접시를 배양하여 접시로부터 세포를 떼어낸다. 짧은 파스퇴르 피펫으로 세포를 세개 부수고 각 접시로부터의 세포를 원심분리 시험관에 수집한다. 2.5 (200 xg) 로 (5 분간) 고정시켜 4 분간 회전시킨다. 0.5 ∼ 1.0 ㎖ 의 PBS / EDTA / 아지드 / 5 % FBS 에 세포를 재현탁시키고 항체를 첨가한다. 얼음에서 최소한 30 분간 항온한다. 동일한 부피의 PBS / EDTA / 아지드를 첨가하고 3 ㎖ 의 PBS / EDTA / 아지드 / 2 % 피콜상에 조심스럽게 층을 만들고 2.5 로 고정시켜 4 분간 회전시킨다. 조심스럽게 상청액을 흡입한다. PBS / EDTA / 아지드 0.5 ㎖에 세포를 흡수하고 100 마이크론의 나일론 망(테트코에서 구입)을 통해 피펫으로 옮김으로써 3 ㎖ 의 PBS / EDTA / 아지드 / 5 % FBS 를 함유하는 항체 - 코팅 접시에 분취량을 첨가한다.

많아야 두 60 mm 접시로부터 항체 - 코팅된 하나의 60 mm 평판에 세포를 첨가한다. 1 - 3 시간동안 실온에 놔둔다. 접시에 접착되지 않은 과잉의 세포는 PBS / 5 % 혈청 또는 배지로 조심스럽게 세척하여 제거한다. 보통 3 ㎖ 로 2 회 또는 3 회 세척하면 충분하다.

c. 힐트(Hirt) 상청액. Hirt 의 J. Molec. Biol. 26 : 365 - 369 (1967) 문헌의 바람직한 변형 방법은 다음과 같다 : 0.4 ㎖의 0.6 % SDS, 10 mM EDTA를 패닝된 평판에 첨가한다. 20분간 놔둔다 (평판상에 실제로 세포가 없다면 1 분정도 놔둘 수 있다). 점성의 혼합물을 마이크로퓨즈 시험관에 피펫으로 옮긴다.

0.1 ㎖ 의 5 M NaCl 을 첨가하고 혼합하여 최소한 5 시간 정도 얼음에 놔둔다. 혼합물을 가능한 한 차갑게 놔두는 것은 힐트 상청액의 질을 개선시켜 주는 것 같다. 4 분간 회전시키고 상청액을 조심스럽게 제거하여 페놀 추출하고(첫번째 계면이 깨끗하지 않다면 두 번 실시), 10 ㎍ 의 곧은 폴리아크릴아미드(또는 다른 캐리어)를 첨가하고 EtOH 로 시험관을 꽉 채우고 침전시켜 0.1 ㎖에 재현탁시킨다. 3 부피의 EtOH / NaOAc를 첨가하여 재침전시켜 0.1 ㎖에 현탁시킨다. 3 부피의 EtOH / NaOAc 를 첨가하여 재침전시키고 0.1 ㎖ 에 재현탁시킨다. 이후에 기술될 고율의 프로토콜을 이용하여 MC 1061 / p3 에 바람직하게 형질전환시킨다. DNA 부피가 2 %의 감응세포 분취량을 초과한다면, 형질전환 효율은 나빠질 것이다. 5 %는 2.5 %와 동일한 균체의 수를 나타낸다(효율은 반감된다).

본 발명의 양상을 위해 배양 배지에서 '차단제' 를 사용하는 것이 바람직하다. 비특이 단백질, 단백질 가수 분해 효소 또는 항체가 존재하는 것이 확실한 차단제는 기질 또는 숙주 세포 표면에 존재하는 항체를 파괴하거나 그 항체와 교차 결합하지 않으며 허위양성 또는 허위음성의 결과를 낳는다. 차단제의 선택은 본 발명의 면역선택단계의 특이성을 실질적으로 개선시킬 수 있다. 예를들어, 면역선택 단계에서 사용되는 것과 같은 형 또는 아형 (이소타입) (예를들어, IgG₁, IgG₂A, IgGm 등) 의 많은 비 특이 모노클로날 항체가 차단제로 사용될 수 있다. 차단제 농도(보통 1 - 100 ㎍/㎕)는 원하지 않는 간섭을 억제하는 적당한 민감도를 유지하는 것이 중요하다. 또한 본 기술분야의 숙련자는 배양에 사용되는 완충계가 차단 작용을 최적이 되게하고 비특이적 결합을 감소시키기 위해 선택될 수 있다는 것을 인지할 것이다.

우선 표적 세포 표면 항원을 형질 발현하는 세포에 대해 패닝된 세포 집단을 트립신이 없는 세포 배양 접시(배양된 것)로부터 떼어낸다. 그런다음 세포를 관련 항원족 또는 목적한 항원에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체인 제 1 항체에 노출시켰다. 이 초기 단계에서, 하나의 항체 또는 항체 집단이 사용될 수 있으며 표적 항원의 성질에 의존하는 선택문제, 예상 빈도 및 다른 변수는 본 기술분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 숙주 세포의 표면에서 형질발현된 표적 항원은 항원 - 항체 복합체를 형성할 것이다.

후속적으로 그 세포를 제 2 항체 또는 항체군으로 미리 코팅한 배양 접시, 필터 디스크, 또는 유사물과 같은 기질의 가까이에 병치시킨다. 이 제 2항체는 제 1 항체에 향해 있을 것이고, 예를들어 제 1 항체가 생성되는 동물을 선택하는 문제는 통상의 지식을 가진자가 규정할 것이다. 예를들어, 제 1 항체가 마우스에서 생성된다면 제 2 항체는 염소 또는 양에서 생긴 마우스의 면역글로불린에 향해 있을 것이다. 표적 항원을 형질발현시키는 세포는 항원, 제 1 항체 및 제 2 항체 사이에 형성된 복합체를 경유하여 기질에 접착될 것이다. 그런다음, 접착 세포는 세척하여 접착되지 않은 세포에서 분리할 수 있다. 표적 항원을 암호화하는 DNA는 Hirt 의 J. Molec. Biol. 26 : 365 - 369(1967) 문헌의 방법과 같이 공지된 방법으로 접착 세포로부터 제조한다. 이 DNA는 후속적인 융합 및 선택을 위해 대장균 또는 다른 알맞은 숙주 세포에 형질전환시켜 목적한 정도로 풍부하게 수득한다.

평상의 경우에, 처음 1회의 면역선택은 표적 항원이 속하는 항원족에 공통인 에피토프 또는 에피토프군에 향해 있는 제 1 항체 패널을 사용할 것이다. 이것은 다음번 면역선택을 위한 클론 수를 상당히 축소시키기에 충분할 것이다. 보통 이러한 2 회의 면역선택이 알맞은 것으로 나타났으나 상기한 바와 같이 면역선택의 횟수는 변할 수 있다. 그후에, 1 회의 선택은 표적 항원만을 인지하는 제 1 항체군 또는 하나의 제 1 항체를 사용하여 실시될 수 있다.

'기질' 이란 본 발명에 의한 면역선택시에 항체가 결합할 수 있는 고체 표면을 의미한다. 공지된 적당한 기질은 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 덱스트란, 나일론 및 그외의 재료가 포함된다. 그러한 재료로 코팅되거나 그 재료로부터 형성된 시험관, 구슬, 미량역가 평판, 박테리아 배양접시 및 그 유사물이 사용될 수 있다. 항체는 아미드를 통한 공유 결합 또는 에스테르 결합, 또는 흡수에 의한 공지된 방법에 의해 공유결합적으로 또는 물리적으로 결합될 수 있다. 본 기술분야의 숙련자는 다른 많은 적당한 기질 및 그 기질상의 항체를 고정시키는 방법을 알거나, 전형적인 실험만을 이용하는 기질 및 방법을 확인할 수 있을 것이다.

본 발명에 따라 바람직하게 이용하기 위한 숙주 조직 배양 세포는 패닝에 사용되는 항체가 비감염 세포상의 결정기를 인지하는 상태를 피하도록 선택되어야 한다. 따라서 COS 세포는 특정 표면 항원의 일시적인 형질발현에 바람직한 한편, 더욱 바람직한 것은 마우스의 WOP 세포이다.

쥐의 WOP 세포 중에서 WOP 3027 세포가 더욱 바람직하다. WOP 세포는 쥐의 항체와 쥐의 세포 표면 결정기 사이의 교차 반응이 드물기 때문에, 사실상 모든 항체를 사용할 수 있다.

재조합 DNA 분자의 삽입 크기는 전체 암호화 서열의 수득 가능성을 최대화하도록 선택되어져야 한다. 본 기술분야의 숙련자는 주어진 유전자의 선결된 최적 삽입 크기를 결정하는 다양한 방법을 알 것이다.

벡터 구성 및 cDNA 삽입

포유동물의 조직 배양 세포에서 cDNA를 형질발현시키기에 적합한 벡터는 공지된 방법에 의해 구성할 수 있다.

본 발명의 목적을 위해 바람직한 것은 SV 40 기원을 포함하는 형질발현 벡터이다. 벡터는 자연적으로 유도되거나 합성 전사 기원 및 SV 40 초기 부위 프로모터를 포함할 수 있다. 보다 바람직한 것은 인체의 시토메가로바이러스의 직접적인 초기 인핸서 서열로 구성된 키메라 프로모터이다. 또한, 다양한 '인핸서 서열'은 SV 40 벡터와 함께 사용될 수 있다. 이러한 내용은 예를들어, Banerji 등의 Cell 27 : 299 - 308(1981) ; Levinson 등의 Nature 295 : 568 - 572(1982) ; 및 Conrad 등의 Mol. Cell. Biol. 2 : 949 - 965(1982) 문헌에 기술되어 있다.

본 발명의 벡터로의 cDNA 삽입은 예를들어, 말단 트랜스퍼라제를 가진 단독중합체 말단 부위에 의해 발생할 수 있다. 그러나, cDNA 삽입물에 대해 5' 에 위치한 단독중합체 관은 시험관내 및 생체내 형질발현을 억제시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명의 목적을 위해 바람직한 것은 짧은 복제 가능한 DNA 단편에 의해 분리되는 역위된 동일한 절단부위를 이용하는 것이다. 그러한 역위된 동일한 절단부위는 바람직하게 Bst XI 제한 엔도뉴클레아제를 사용하며, 벡터의 복재가능한 단편과 유사한 말단을 제공하는 cDNA 합성 올리고뉴클레오티드와 병행하여 사용할 수 있다. 이러한 방식으로, cDNA 는 그 자체에는 결합시킬 수 없으나 벡터에는 결합시킬 수 있다. 이것은 cDNA와 벡터 둘다를 가장 효율적으로 사용할 수 있게 한다.

본 발명의 다른 유형은 벡터에 cDNA 를 삽입하는 것을 촉진하기에 충분한 상기의 올리고뉴클레오티드를 바탕으로한 상기 방법이다. 본 발명의 piH3M이 바람직하고 역위된 엔도뉴클레아제 부위를 사용한다. 이 벡터는 복제의 SV 40 기원을 포함할 수 있으나 더욱 바람직한 유형은 M13 기원을 포함한다. M13 기원을 포함하는 벡터는 조절하에 있는 암호화 서열을 COS 세포에서 높은 수준으로 형질발현할 수 있게 한다. 또한 그 플라즈미드내의 크기가 작고 배열이 특별한 서열은 COS 세포에서 높은 수준으로 복제되도록 한다.

'세포 표면 항원' 이란 세포내 막 시스템을 통해 세포 표면으로 수송된 모든 단백질을 의미한다. 그러한 항원은 보통 막의 지질층에 놓여 있는 소수성 아미노산을 함유하는 카르복시 말단 도메인을 통해 세포 표면 막에 접착되어 있고 거기에서 생물학적인 항원 효과를 발휘한다.

T - 림프구와 유사한 항원은 특히 본 발명의 방법에 의한 유전자 클로닝에 적합하다. 그러나, 모든 세포의 세포표면항원은 본 발명의 방법에 따라 클로닝될 수 있다. 더구나 보통 세포 표면상에서 형질발현되지 않은 단백질들은 예를들어, 세포내 항원을 형질발현하는 고정 세포가 풍부해 지도록 형광 세포분석분류장치(FACS)를 이용하는 본 발명의 방법에 따라 클로닝될 수 있다.

'실질적으로 순수하다' 란 본 발명의 모든 항원 또는 그러한 항원을 암호화하는 모든 유전자가 보통 자연적으로 함께 발견되는 다른 오염물이나 다른 항원 또는 유전자가 실질적으로 없으며 자연에서 발견되지 않는 유형으로 존재하는 것을 의미한다. '기능성 유도체' 란 분자의 '단편', '변형체', '유사체' 또는 '화학적 유도체' 를 의미한다. 본 발명의 모든 항원과 같은 분자의 '단편' 은 분자의 모든 폴리펩티드 부분집합을 의미한다. 그러한 분자의 '변형체' 는 전체 분자 또는 그의 단편과 실질적으로 유사한 자연 발생적인 분자를 의미한다. 분자의 '유사체' 는 전체 분자 또는 그의 단편과 실질적으로 유사한 비 - 자연적인 분자를 의미한다.

항원의 단편, 변형체, 유사체 및/또는 화학적 유도체는 두 분자의 아미노산 서열이 실질적으로 유사한, 즉 약 50 % 이상의 상동성을 갖고 두 분자가 유사한 생물학적 활성도를 갖는 경우 단편, 변형체, 유사체, 화학적 유도체 및/ 또는 항원과 '실직적으로 유사하다' 고 말한다.

만일 두 서열이 실질적으로 유사한, 즉, 제 1의 뉴클레오티드 서열이 제 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열과 약 50 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단편, 변형체, 유사체, 화학적 유도체를 암호화하고, 그 제 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단편, 변형체, 유사체, 화학적 유도체 및/또는 항원이 제 1 의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단편, 변형체, 유사체, 화학적 유도체 및/또는 항원의 생물학적 활성도와 유사한 생물학적 활성도를 갖는 경우에 한 뉴클레오티드 서열은 다른 뉴클레오티드 서열과 '실직적으로 유사하다'고 말한다. 그러므로 두개의 분자가 유사한 생물학적 활성도를 가지는 경우에는 그 분자 하나가 다른 분자에서 발견되지 않는 부가적인 아미노산 잔기를 포함하거나 아미노산 잔기의 서열이 동일하지 않은 경우에라도 이 용어가 사용되면 그것들은 변형체로 간주한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 분자가 보통 분자의 부분이 아닌 부가적인 화학적 잔기를 포함할때 그 분자는 다른 분자의 '화학적 유도체'라고 말한다. 그러한 화학적 잔기는 분자의 용해성, 흡수성, 생물학적 반감기등을 개선사킬 수 있다. 그 화학적 잔기는 그 분자의 독성을 감소시키거나 그 분자의 원하지 않는 모든 부작용을 제거 또는 약화시킬 수 있다. 그러한 작용을 중재할 수 있는 화학적 잔기는 예를들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980) 문헌에 기술되어 있다.

이와 유사하게, 본 발명의 모든 항원의 유전자인 '기능성 유도체' 는 뉴클레오티드 서열에서 '실질적으로 유사하다' 고 할 수 있고 유사 활성도를 갖는 분자를 암호화하는 그 유전자의 '단편', '변형체', 또는 '유사체' 를 포함한다는 것을 의미한다.

항원, 단편, 변형체, 유사체, 및/또는 화학적 유도체는 전자가 후자의 생물학적 활성도의 약 25% 이상을 갖는 경우, 다른 항원, 단편, 변형체, 유사체 및/또는 화학적 유도체에 대해 '유사한 생물학적 활성도'를 갖는다고 말한다. 생물학적 활성도는 생명체의 특성인 작용, 기능 또는 과정이다. 또한 생물학적 활성도는 항체 생산을 유도하기 위해 실험동물에 인위적으로 항원, 단편, 변형체, 유사체 및/또는 화학적 유도체를 삽입할 때 생물학적 활성도가 나타나도록 시험관내 또는 비 - 자연계에 대한 생체 과정의 재생, 연장 또는 적응을 포함할 수 있다. 항원, 단편, 변형체, 유사체 및/또는 화학적 유도체는 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성도를 가질 수 있다. 생물학적 활성도는 그 활성도에 대해 특징적인 방법 또는 분석법에 의해 감지되거나 측정될 수 있다. 항원의 생물학적 활성도와 유사한 생물학적 활성도를 가지는 기능성 유도체는 그 활성도에 대한 특징적인 분석법으로 측정되고 본 기술분야의 숙련자에게 공지된 바와 같은 항원 활성도의 약 25% 이상의 생물학적 활성도를 가져야 한다.

본 발명의 방법에 의해 형질발현된 실질적으로 순수한 항원은 방사성 면역측정법(RIAs), 효소 면역 측정법(EIAs) 및 효소결합 면역흡착 검사법(ELISAs)을 포함하는 본 기술분야의 숙련자에게 공지된 면역 진단 분석법에 사용될 수 있다. 가용형의 본 발명의 실질적으로 순수한 단백질은 사람을 포함하는 동물의 면역 관련질병 및 장애를 치료하기 위해 림포카인 및 모노카인 또는 약물을 포함하는 다른 약제 또는 본 발명의 다른 항원과 함께 또는 단독으로 투여할 수 있다. 본 발명의 실질적으로 순수한 단백질로 치료하여 이로울 수 있는 장애의 예로서는 면역 결핍증과 급성 과민증, 천식, 과민성 폐렴, 면역복합체병, 맥관염, 전신성 홍반성 루프스, 류마티스성 관절염, 면역병리학적 신장장애, 급만성 염증, 용혈성 빈혈, 혈소판 장애, 혈장 및 다른 세포 종양, 아밀로이드증, 기생충증, 다발성 경화증, 귈랑 - 바레 증후군, 급성 및 아급성의 근장애성 마비, 중증근 무력증, 내분비 질환 및 조직과 기관 이식 거부를 들 수 있으며 이들 모두는 Petersdorf 등의 eds., Harrison's Principles of Internal Medicine, 상기문헌에 기술되어 있다. 또한 Weir, ed., 상기 문헌 ; Boguslaski 등의 eds., 상기문헌 ; 및 Holborow 등의 eds., 상기문헌도 참조하라.

면역 치료에 사용될 때, 본 발명의 항원은 치료제로 표지되거나 표지되지 않을 수 있다. 면역치료를 위해 본 발명의 항원과 결합될 수 있는 치료제의 예로서는 약물, 방사성 동위원소, 렉틴 및 독소이다.

본 발명의 항원을 투여하기 위한 선량의 범위는 목적한 면역치료 효과를 보일 정도로 크지만 원하지 않는 교차 반응, 과민반응과 같은 부작용을 일으킬 정도로는 크지 않다.

일반적으로 사용 선량은 환자의 나이, 상태, 성별 및 질병의 정도에 따라 달라질 것이다. 또한, 역징후(만일 있다면), 면역 관용 및 그외의 변수도 적정 선량에 영향을 미칠 것이다.

투여는 주사 또는 시간에 따른 점차적인 관류에 의해 비경구 투여될 수 있다. 또한, 정맥내, 피하, 근육내, 복강내 또는 경피 투여될 수 있다.

비경구 투여용 제제는 멸균 수용액 또는 비 - 수용액, 현탁액 및 에멀션을 포함한다. 비 - 수용성 용매의 예로서는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름 및 올레산에틸과 같은 주입가능한 유기 에스테르를 포함한다. 수용성 담체는 물, 알콜용액, 수용액, 에멀션 또는 식염 및 완충배지를 함유하는 현탁액을 포함한다. 비경구 부형제는 염화나트륨용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이티드 링거스(lactated Ringer's) 또는 비휘발성 오일을 포함한다. 정맥내 부형제는 링거 덱스트로스에 기초한 유체 및 영양 보충물, 전해질 보충물 등을 포함한다. 또한 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 및 그 유사물과 같은 방부제 및 그외의 첨가제가 있다. 그러한 제제 및 그의 제조방법은 예를들어, Remington's Pharmaceutical Science, 16th ed., 상기문헌에 기술되어 있다.

또한 본 발명의 항원은 항원 단독으로 또는 림포카인, 모노카인 및 약물, 사람을 포함하는 동물의 치료에 사용되는 의약, 면역관련 지시약과 같은 그외의 약제 또는 다른 항원과 함께 연합하여 의약 또는 제약학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 항원은 단독 투여될 수 있지만, 제약학적 조성물로 투여되는 것이 바람직하다. 본 발명의 제약학적 조성물은 최소한 하나의 항원 또는 제약학적으로 용인가능한 그의 염, 하나 이상의 담체 및 임의의 다른 치료제를 포함한다. '용인가능한'이란 그 약제 또는 담체가 제약학적 조성물의 다른 성분과 양립하고 환자에게 피해를 주지 않는다는 것을 의미한다. 조성물은 구강, 직장, 코, 국소(볼 및 혀를 포함), 질 또는 비경구 투여하기에 적합한 것을 포함한다. 조성물은 편리하게 단위 투여형이고 제약 분야에서 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 그러한 방법은 활성 성분과 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체를 결합시키는 것을 포함한다. 일반적으로 조성물은 액체 담체 또는 미세하게 분쇄한 고체 담체 또는 둘다와 활성 성분을 결합시키고, 필요한 경우 그에 의해 형성된 산물을 성형함으로써 균일하게 제조한다.

본 발명에 따라 경구 투여된 제약학적 조성물은 각각 선결된 양의 활성 성분을 포함하는 캡슐, 카세제 또는 정제를 포함하는 모든 편리한 유형일 수 있다. 또한, 수용성 또는 비수용성 액체 또는 수증유의 액체 에멀션, 또는 유증수의 액체 에멀션내의 용액 또는 현탄액 이외의 분말 또는 과립도 가능한다. 또한 활성 성분은 환괴, 지제 또는 연고로서 제시될 수 있다.

지금까지 기술해온 본 발명은 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않는 다음의 실시예를 참고로하여 더욱 충분히 이해될 것이다.

[실시예]

실시예 I 인체 CD2 항원의 분리, 분자 클로닝 및 구조

cDNA 형질발현 벡터 piH3

COS 세포 형질발현 벡터는 억제자 tRNA유전자와 SV 40 기원 사이에 합성 전사 단위를 삽입함으로써 piSV로부터 구성한다.

[Luttle 등의 Mol. Biol. Med.1 : 473-488(1983)문헌 참조]

그 전사 단위는 HIV LTR - 67 내지 +80 서열에 융합된 인체의 시토메가로바이러스 AD169 직접 초기 인핸서 서열로 구성된 키메라 프로모터로 구성되어 있다. HIV LTR +80 서열로부터 직접적인 하류에는 350 bp 의 스타퍼(stuffer) 에 의해 분리된 두 Bst X1 부위를 포함하는 폴리링커가 삽입되어 있다 : Bst X1 부위 측면에는 삽입물을 삭제하는데 사용할 수도 있는 Xba1 부위가 있다. 폴리링커 하류에는 SV 40 의 작은 t 항원 스플라이스 및 pSV2 로부터 유도된 초기 부위 폴리아데닐화 신호가 있다. 그 형질 발현 벡터의 뉴클레오티드 서열은 제 1 도에 나타나 있다.

cDNA 라이브러리 구성

RNA 는 상기한 구아니디움 티오시아네이트/CsCl 방법에 의해 HPB-ALL 세포로부터 제조할 수 있다. 폴리 A⁺RNA 는 올리고 dt 선택에 의해 전체 RNA 로부터 제조한다. Maniatis 등의 Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 상기문헌을 참조하라. cDNA 는 Gubler 및 Hoffman [Gene 25 : 263-269 (1982) 문헌]의 방법으로 합성한다. Bst XI 어댑터는 cDNA 에 결합하고 그 반응 산물은 SW 55 로터에서 50 k rpm 으로 3 시간 동안 1mM EDTA 를 포함하는 5 ㎖의 20 % 아세트산 칼륨 기울기를 통해 원심분리하여 분획화하였다. 시험관의 만곡부 바로위에 삽입한 주사기 바늘 또는 버터플라이를 통해 수동으로 수집하였다. 개별 분획은 곧은 폴리아크릴아미드를 첨가한 후 에탄올 침전시켜 [Strauss 및 Varshavsky 의 Cell 37 : 889 - 901(1984) 문헌 참조] 20 ㎍/㎖ 가 되게한다. 700 bp보다 큰 cDNA 를 함유하는 분획을 모으고 기울기 정제시킨 Bst X1 절단 piH3 벡터에 결합시킨다.

결합시킨 DNA 는 다음의 프로토콜에 의해 알맞게 제조된 E. coli MC1061/p3 내로 형질전환시킨다:

목적한 균주를 LB 평판상에 줄을 긋는다. 다음날 250 ㎖의 플라스크에 든 20 ㎖ 의 TYM 육즙(제조방법은 아래에 기술되어 있다)에 하나의 군체를 접종한다. 세포를 미드로그(midlog) 단계(OD₆₀₀은 약 0.2-0.8)로 성장시키고 100 ㎖ 의 TYM 육즙을 포함하는 21 개의 플라스크에 쏟고 세포가 0.5-0.9 OD로 성장할때까지 세게 흔든 다음 동일한 용기에서 500 ㎖ 로 다시 희석한다. 세포가 OD₆₀₀0.6으로 성장하였을 때 플라스크를 빙수에 놓고 급속히 냉각되도록 서서히 흔들어 준다. 배양물을 식힐 때 4.2 K rpm에서 15 분간(J6) 회전시킨다. 상청액을 쏟아버리고 얼음상에서 서서히 흔들어주어 약 100 ㎖ 의 차가운 TfB I(하기 참조)에 그 펠릿을 재현탁시킨다. 그런다음 동일한 병에서 4.2 K rpm 으로 하여 8 분간 (J6) 재회전시킨다. 상청액은 쏟아버리고 펠릿은 얼음상에서 서서히 흔들어주어 20㎖의 차가운 TfB II 에 재현탁시킨다. 0.1 내지 0.5 ㎖ 분취량을 예비 냉장시킨 마이크로퓨즈 시험관에 넣고 액화질소에서 냉각시키고 -70 ℃ 에서 저장한다. 형질전환을 위해 분취량을 제거하고 용융될때까지 실온에서 해빙시키고 얼음에 둔다. DNA 를 첨가하고 얼음상에 15 - 30 분간 놔두고 37℃ 에서 5 분간(0.5㎖ 분취량의 경우 6 분간)항온한다. 그런다음 DNA 를 포함하는 현탁액을 LB 에서 1 : 10 으로 희석하고 평판화 또는 항생제 선택을 적용하기 전 90분동안 성장시킨다. 택일적으로, 열 - 진동 형질전환 혼합물은 박층(4-5㎖) 의 무항생제 LB 아가를 평판화하기 직전에 붓는 항생제 평판에 직접적으로 평판화한다.

배지 및 완충제 :

TYM : 2 % 의 박토 - 트립톤, 0.5% 의 효모 추출물, 0.1 M

NaCl, 10mM MgSO₄(를 오토클레이브하기 전에 첨가할

수 있다).

TfB I : 30 mM KOAc, 50 mM MnCl₂, 100 mM KCl, 10 mM CaCl₂,

15 % (V/V)글리세롤.

TfB II : 10 mM Na-MOPS, pH 7.0, 75 mM CaCl₂, 10 mM KCl, 15 %

글리세롤.

패닝에 의한 cDNA 클론의 회수

패닝을 위한 생물학적 배양 접시(팔콘 1007)는 그 접시를 PBS 대신에 세척병에 든 0.15 M NaCl 로 세척하고 반응되지 않은 부위를 1㎎/㎖의 BSA를 포함하는 PBS에서 밤새도록 배양하여 차단시키는 것을 제외하고는 친화 정제된 양의 항-마우스 IgG 항체를 Wysocki 및 Sato [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 : 2844 - 2848 (1978) 문헌] 가 기술한 바와 같이 코팅함으로써 제조하였다. 전형적으로, 접시는 PBS/BSA의 흡입 후 대량으로 제조하고 냉동 보관한다. 1회의 선별과정에서 24.6 ㎝ 접시의 50 % 융합 COS 세포를 Sandri - Goldrin 등의 Mol. Cell Biol. 1 : 743 - 752(1981) 문헌에 기술된 방법에 따라 원형질 융합시킴으로써 형질감염시킨다. 72 시간의 후융합을 한 세포는 PBS/1 mM EDTA/0.02 % 아지드화나트륨에서 37 ℃로 하여 30 분간 배양함으로써 분리시킨다. 분리시킨 세포를 한데 모아 원심분리하고, 제조업자에 의해 제시된 농도의 통상적인 시약 뿐만 아니라 1 : 1000 으로 희석된 복수로서의 모노클로날 항체를 포함하는 차가운 PBS/EDTA/5% 우태아혈청에서 재현탁시킨다. 얼음에 1시간 놔둔후 세포를 PBS/EDTA/아지드로 1 : 1 희석하고 2 % 피콜 400을 포함하는 10 ㎖의 PBS/EDTA/아지드에 층을 형성시킨다. 원심분리(400 x g, 5 분)한 후, 상청액을 조심스럽게 흡입하고 펠릿을 소량의 PBS/EDTA/5% FBS 에 재현탁시키고, 세포를 3 ㎖ 의 PBS/EDTA/5% FBS를 포함하는 패닝 평판에 분포시킨다. 그런다음 , 평판을 반드시 Wysocki 및 Sato 의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75 : 2844-2848 (1978) 문헌에서 기술한대로 처리한다. 에피솜 DNA 를 Hirt [J. Molec. Biol. 26 : 365 - 269(1967)문헌] 의 방법에 의해 접착 세포로부터 회수하고 MC 1061/p3내로 형질전환시킨다.

세포주 및 세포 배양물

COS 세포 클론 M6 세포는 10 % 우혈청 및 15 ㎍/㎖ 의 황산 젠타마이신(DME/10% 우혈청)을 보충한 둘베코의 변형된 이글 배지에서 증식시킨다. 세포는 6 ㎝ 의 접시에서 형질감염시키기 전날에 세포를 손상시키는 일 없이 가능한한 조밀하도록 저장 평판으로부터 약 1 :8 의 비로 분할한다. T 세포주는 상기한 바와 같이 젠타마이신을 포함하는 이스코브의 변형된 둘베코 배지(IMDM) 및 뉴시럼(NuSerum)(콜라보래이티브 리서치에서 구입) 또는 10% 우태아혈청에서 성장시킨다.

면역형광 실험을 위한 COS 세포 형질감염

6 ㎝ 접시에서 50 % 융합된 COS 세포를 10 % 뉴시럼(콜라보래이티브 리서치에서 구입). 400 ㎍/㎖ DEAE 덱스트란, 10 μM 이인산 클로로퀸 및 1 ㎍/㎖ DNA 를 포함하는 DME 또는 IMDM 배지로 구성된 칵테일 1.5 ㎖ 의 부피에 형질감염시킨다.

37 ℃ 에서 4 시간(또는 세포의 상태가 안 좋으면 더 빨리) 이 경과한 후, 그 형질감염 혼합물을 제거하고 세포를 PBS 에서 10 % DMSO 로 2 분간 처리한다 [Sussman 및 Milman 의 Cell Biol.4 : 1641-1643(1984)문헌 참조]. 그런다음 세포가 48 내지 72시간동안 DME/10% 우혈청에서 형질발현하게 한다.

면역침전, 노던 및 서던 블로트 분석

T 세포는 락토퍼옥시다제로 처리하여 표지하고 용해시키고, 통상적으로 이용가능한 염소의 항- 마우스 IgG 아가로스 구슬(쿠퍼 바이오메디칼에서 구입)을 이용하여 Clark 및 Einfeld [Leukocyte Typing II, Vol. II, pp. 155-167(1986) 문헌] 의 방법에 따라 면역침전시켰다. COS 세포는 DEAE 덱스트란 방법으로 형질 감염시키고 트립신화하여 희석시킴이 없이 형질 감염후 24 시간 만에 새로운 평판에 통과시켰다. 36 시간 후 세포를 상기한 바와 같이 PBS/EDTA 에 노출시킴으로서 분리하고, 원심분리하고, 락토퍼옥시데이트 방법으로 표지하였다. T 세포 면역침전의 경우, 투명 용해물을 제조하였다. 단, 용해 완충액은 1 mM PMSF를 포함하며 제 1 항체와의 항온은 4 ℃에서 2 시간 동안만 실시한다.

용리 시료는 Laemmli [Nature 227 : 680-685(1970) 문헌] 의 완충계를 이용한 11.25 % 의 불연속 폴리아크릴아미드 겔 상에 분획화하였다.

노던 블로트 분석은 DMSO 를 적하 완충액에서 제거하고, 70 ℃ 에서 5 분간 변성시키고, 겔이 6 %보다는 0.6 % 의 포름알데히드를 포함한다는 점을 제외하고는 실질적으로 Maniatis 등의 Molecular Cloing, a Laboratory Manual(1982) 문헌에 기술된대로 실시하였다. 1㎍/㎖ 의 에티디움 브로마이드를 포함하는 2 부피의 물에서 겔을 염색하고 사진을 찍고 염색액에서 나일론 [진스크린(Gene Screen), 듀폰에서 구입]에 전이시켰다. 전이된 RNA 는 0.22 mW/㎠ 의 유량(254nm 에서 측정)에서 5 분간 사란 랩(Saran Wrap) [Church 및 Gilbert 의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 : 1991-1995 (1984) 문헌 참조] 을 통해 살균력이 있는 램프에 노출시킴으로서 조사(照射)하였다. 서던 블로트 분석은 Reed 및 Mann [Nucl. Acids Res. 13: 7207-7221(1986) 문헌] 이 기술한 바와 같이 나일론(진스크린. 듀폰에서 구입)에 알칼린 전이시킴으로써 실시하였다. 혼성화 프로브는 Hu 및 Messing [Gene 18 :271-277(1992) 문헌] 의 방법에 의해 제조하고 블로트를 M13 mp 19 파지의 10 DNA ㎍ 동등물을 포함하는 SDS/인산염 완충액 [Church 및 Gilbert 의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 : 1991-1995 (1984) 문헌 참조] 에서 예비혼성화하였다.

적혈구 로제팅(Erythrocyte Rosetting)

적혈구는 PBS에서 세번 원심분리하여 총 혈액으로부터 제조하였다. COS 세포는 DEAE 방법에 의해 CD2 또는 다른 표면 항원 형질발현 클론을 가진 6 ㎝의 접시에 형질감염시켰다. 배지를 흡입하고 2 ㎖ 의 PBS/5% FDS/아지드를 각평판에 첨가하여 48 내지 72 시간동안 후형질감염시킨후, PBS 내의 20% 현탁액으로서 적당한 적혈구 시료 0.4 ㎖ 를 첨가하였다. 실온에서 1 시간 후 , 비접착 적혈구를 서서히 세척해내고 평판을 실험하였다.

CD2 항원 결정기를 암호화하는 cDNA 를 다음 방법으로 분리하였다. cDNA 는 인체의 T 세포 종양주 HPB-ALL 에서 추출한 RNA로부터 제조하고 상기한 바와 같은 SV 40 기원을 바탕으로한 형질발현 벡터 piH3 에 삽입시켰다. 약 3 x 10⁵재조합 cDNA 라이브러리를 구성하고, 그 라이브러리를 원형질 융합에 의해 COS 세포에 도입하였다. 3일후 세포를 EDTA 에 노출시켜 분리해내고 CD2 항원 결정기에 향해 있는 세 개(OKT 11, Leu 5b 및 Coulter T11)의 모노클로날 항체의 풀로 처리한다. 항체로 처리한 세포는 친화 정제된 양의 항 - 마우스 IgG 항체로 코팅한 접시에 분포시켜 접착되게 하고 가볍게 세척하여 접착되지 않은 세포로부터 분리하였다. 풍부하게하는 이 방법은 면역학적 문헌에 공지되어 있다. [Mage 등의 J. Immunol. Metohds 15 :47-56(1977) 문헌 참조].

그 결과 생성된 군체를 한데 모으고 COS 세포에 융합시키고 이전과 같이 2회의 패닝을 실시한다. 3회에서, 떼어낸 세포의 부분을 CD2 에 대해 특이적인 세개의 모노클로날 항체 혼합물로 처리하고, Hirt 상청액을 다시 생성시켜 E. coli 에 형질전환시켰다. 8 개의 최종 군체로부터 DNA 를 제조하고 COS 세포에 형질감염시켰다. 3 일 후 , 8 개의 형질감염된 접시중 6 개에서 간접적으로 면역형광에 의해 CD2 항원의 표면 형질발현을 검출하였다. 상응하는 플라즈미드 DNA 의 제한 효소 절단으로 모두 6 개의 분리체내 1.5 kb 의 삽입물을 밝혀냈다.

여섯 개의 클론 중 한 개는 후속 분석을 대량으로 제조하였다. COS 세포에 형질감염시킨 후, 백혈구 분화 항원에 대한 제 3 의 국제 연구 집회에 의해 제공된 항체의 부분적 패널과의 직접적인 면역형광 분석은, 제공된 모든 항체가 피토헤마글루티닌 활성 T 림프구와 반응하지도 못한 한 시료를 제외하고는 양성 반응을 보임을 나타내었다. 시험한 17개의 항체중에서 적어도 8 개의 구별가능한 그룹은 다양한 영장류 림프구와의 반응 유형을 달리함으로써 한정되었다.

[Jonker 및 Nooij 의 Leukocyte Typing II, Vol. I, pp. 373-387(1986)문헌 참조].

cDNA 시퀀스 분석

CD2 cDNA 삽입물은 두 방향으로 M 13 mp 19 [Vieira 및 Messing 의 Gene 19 : 259-268(1982) 문헌 참조] 에 서브클로닝하고, 디데옥시뉴클레오티드 방법에 의해 그 서열을 결정하였다 (제 2 도 참조) [Sanger 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 5463-5467(1977) 문헌 참조]. 전사 해독 프레임은 번역 개시 코돈에 대한 Kozak [Microbiol. Rev. : 1-47 : 45 (1983) 문헌] 의 컨센서스 기준을 만족시키는 ATG 트리플렛으로부터 연장된 360잔기가 관찰되었다(제 1도 참조). 예상되는 아미노산 서열은 훨씬 큰 세포질내 도메인에 있는 소수성 부분을 스패닝 하는 단일막을 가진 막 통합 단백질을 유발한다. N-말단 아미노산 서열과 Heijne [Nucl. Acids Res. 14 : 4683-4690 (1986) 문헌] 에 의해 구성된 서그널 서열 잔기 빈도 매트릭스를 비교하면 성숙한 CD2 펩티드가 19번(Ser) 및 20 번(Lys) 잔기 사이에 있는 전구체 펩티드를 절단시킴으로써 형성됨을 알 수 있었다.

본 서열의 놀랍고도 예상치 못한 특징은 제안된 절단 부위에 대해 가까운 임의의 N-결합 글리코실레이션 부위가 존재한다는 것이다. 최종 폴리펩티드 골격은 질량 21.9 kd의 외부 도메인과 질량 14.6kd 의 세포질 도메인으로 나누어진 38.9kd 의 예상 분자량을 갖는다. 세개의 N-결합 글리코실레이션 부위는 세포외 도메인에 존재한다.

막 스패닝 도메인은 지배적인 소수성을 갖는 26 개의 불변 잔기를 포함한다. 즉각적으로 잇따르는 9 개의 잔기에는 라이신 또는 아르기닌의 염기성 잔기 7개가 있다. 염기성 잔기가 잇따르는 소수성 잔기의 현저한 출현은 카르복시 말단 부분을 갖는 막내외 단백질의 공통적인 조직상의 특징이다. 막내외 도메인의 다른 놀라운 특징은 소수성 잔기(측면 베타 턴에서 흔히 발견된다) 측면에 있는 베타 턴 모티브[Chou 및 Fasman 의 Annual Review of Biochemistry 47 : 251-276 (1978) 문헌 참조] cys-gly-gly-gly 의 출현을 들 수 있다. 이론적으로는 알파 나선구조에 배열된 20 개의 잔기만이 3 nm 의 막이중층을 횡행하는데 필요하고 [Tanford 의 Science 200 : 1012-1018 (1978) 문헌 참조], 14 개의 소수성 잔기 정도가 막 통합 단백질을 삽입 및 방출할 수 있게 하고 [Adams 및 Rose의 cell 41 : 1007-1015 (1985) 문헌 참조], CD2 항원의 막내외 단편은 굴곡 또는 엉클림을 포함할 수 있다

크기가 다소 큰 세포질 도메인은 CD2 가 고유의 효소 활성도를 갖는 가능성을 갖게한다. 세포질 도메인은 매우 풍부하고 높은 회전 가능성을 갖는 세개의 부위를 프롤린에 포함한다

그 아미노산 서열과 NBRF 데이터베이스의 비교에서는 다른 단백질과의 실질적인 유사성을 나타내지 않았다. 특히, T 세포 수용체의 알파 또는 베타 사슬과의 유사성은 관찰되지 않았으며, CD2 가 최초의 T 세포 수용체라는 가능성이 배제되었다 [Milanese 등의 Science 231 : 1118-1122 (1986) 문헌 참조].

세포질면 바로 내부에 있는 단백질은 EGF 수용체 및 부류 I 조직적합성 유전자(class I histocompatibility gene)와 단백질 키나제 C 에 의한 생체내(EGF) 및 시험관내(HLA) 인산화 또는 사이클릭 AMP-의존 단백질 키나제 각각에 대한 공지된 부위내의 동일한 지점에서 발견되는 유형과 세린 잔기가 잇따르는 염기성 단백질의 종류이다. Hunter 등의 Nature 311 : 480-482 (1984) ; Davis 및 Czech 의 Proc. Natl. Acad. Sci. 82 : 1974-1978(1985); Guild 및 Strominger 의 J.Biol. Chem. 259 : 9235-9240 및 13504-13510 (1984) 문헌을 참조하라. 유사한 부위는 인터루킨 2 수용체의 세포질내 도메인에서 발견되고, 단백질 키나제 C 에 의해 생체내에서 인산화된다. Leonard 등의 Nature 311 : 626-631(1984); Nikaido 등의 Nature 311 : 631-635(1984); Shackelford 및 Trowbridge 의 J. Biol. Chem. 259 : 11706- (1984) 문헌을 참조하라.

형질감염된 세포에 의해 형질발현된 CD2 항원의 면역침전

COS 세포를 CD2 형질발현 플라즈미드로 형질감염시키고 형질감염 후 60 시간만에 락토퍼옥시다제 방법으로써 표면을¹²⁵I 로 표지하였다. 세포 용해물을 준비하고 모노클로날 항-CD2 항체 (OKT 11) 또는 외래의 항체 (OKT 4; 항 - CD4) 와 함께 4 ℃에서 2 시간 항온하였다. 세파로스와 결합한 항-마우스 항체를 첨가하고 몇차례 세척한 후, 흡착된 단백질을 용리하고, 피토헤마글루티닌에 의해 활성화된 T 림프구, cDNA 제공주 HPB - ALL 또는 본 실험실에서 생성시킨 장기 T 세포주로부터 유사하게 제조한 면역침전물로 11.25 %의 아크릴아미드겔 전기영동하였다. 오토래디오그래피로 면역 반응 물질의 현저한 밴드는 대조에 의해서가 아니라 항 - CD2 항체에 의해 형질감염된 COS 세포로부터 침전됨을 입증하였다.

COS 세포물질의 산출된 평균 분자량은 51 kd 이며, 이것은 T 아세포 및 T 세포주 물질에 대한 평균 분자량인 54 kd 과 비교된다; HPB -ALL 세포로부터의 항원은 분자량이 약 61 kd인 것으로 밝혀졌다. 크기면에서 관찰된 차이점은 상이한 세포 유형에서 발생하는 상이한 유형의 글리코실화 때문인 것으로 생각된다. 겉보기 분자량이 38 kd 인 소수 밴드는 T 세포 또는 HPB-ALL 세포가 아닌 COS 세포로부터 면역침전된 물질에 존재한다. 이 종의 크기는 오차 이내에서 글리코실화되지 않은 성숙 펩티드의 예상 분자량인 39 kd 과 일치한다.

양의 적혈구 로제트를 형성하는 CD2 형질발현 COS 세포

CD2 형질발현 클론을 형질감염시킨 COS 세포를 1 ㎍/㎖ 농도의 정제된 MT910 (IgG, 카파) 항 - CD2 항체 [Rieber 등의 Leukocyte Typing II, Vol.I, pp. 233-242 (1986) 문헌 참조] 또는 1 ㎍/㎖ 농도의 정제된 MB40.5 [IgG1. 카파 ; Kawata 등의 J Exp. Med. 160 : 633-651 (1984) 문헌 참조] 항체로 1시간 처리한다. MB40.5는 단형성의 HLA-ABC 결정기를 인식하고 아프리카 녹색 원숭이의 조직적합성 항원과 교차 반응한다.; 형질감염 세포에 의해 형질발현된 CD2 항원과 거의 유사할 정도로 풍부한 표면 항원을 인식하는 이소타입-항체를 나타내기 때문에 그것을 선택한다. 양의 적혈구 로제트는 MT910 이 아닌 MB40.5 의 존재하에 관찰된다. 로제트 저해는 OKT 11항체로 관찰되며, 그외의 다양한 대조 항체로는 관찰되지 않았다.

다른 동물의 적혈구 로제트를 형성하는 형질 감염된 COS 세포

양의 적혈구 이외에도 인체의 T 세포는 마우스 또는 래트의 적혈구가 아닌 말, 돼지, 개, 염소 및 토기의 적혈구 로제트를 형성하는 것으로 알려졌다. Johansen 등의 J. Allergy Clin. Immunol. 54 : 86-94 (1974); Amiot 등의 in, A. Bernard 등 eds., Springer, publisher, New York,N.Y., pp. 281-293(1984) ; Nalet 및 Fournier, Cell. Immunol. 96 :126-136 (1985) 문헌을 참조하라. 인체의 적혈구와 흉선세포 사이의 오토로제트 [Baxley 등 Clin. Exp. Immunol. 15 : 385-393 (1973) 문헌 참조] 또한 보고되었다. CD2 형질발현 클론으로 형질감염시킨 COS세포를 MT910 또는 대조 항체 MB40.5 로 처리하고 상기 종으로부터의 적혈구에 노출시킨다. 로제트는 말, 돼지, 개, 염소, 양, 토끼 및 인체의 적혈구와 함께 관찰되지만 마우스 또는 래트의 적혈구와 함께 관찰되지는 않는다. 로제트 형성은 MB40.5 가 아닌 MT910을 가진 형질감염된 COS세포를 예비처리함으로써 차단한다. 이 실험에서는 보통 말의 적혈구가 밀집 로제트를 형성하고 염소의 적혈구가 다소 빈약한 로제트를 형성하는데, 이것은 아마도 그들의 작은 크기가 세척에 더욱 민감하도록 만들기 때문이라는 점이 주목할만하다. 마우스의 적혈구는 래트의 적혈구가 모든 종류의 감지할만한 결합을 보이지 않는 반면에, 예비처리한 MT910 및 MB40.5 세포이외에 배양접시에 약하게 자발적으로 결합한다.

LFA3 항체에 의해 차단되는 인체 적혈구의 결합

LFA3가 CD2 항체에 대한 표적 구조물이라는 항체 차단 연구를 기초로하여 제안되어왔기 때문에 [Shaw 등의 Nature 323 : 262-264 (1986) 문헌 참조], 로제트 형성을 차단하는 항 - LFA 3항체의 능력이 연구되었다. 형질 감염된 세포는 1 : 1000 으로 희석시킨 복수(ascites)로서 항-LFA3(IgG1, 카파) 또는 LFA3 : G10/B11 및 D10, 항-K14 항원, D6, 항 - Wr^b항원만큼 유력하거나 그보다 더 유력한 인체 적혈구 항원에 향해 있는 4개의 이소타입 비응집 항체 각각의 10 ㎍/㎖ 농도로 2 시간동안 예비처리한 인체의 적혈구에 노출시킨다 [Nichols 등의 Vox Sang, in Press 참조]. 적혈구를 과잉의 LFA3항체가 없도록 세척하지만, 항원 차단력의 가능한 상실을 탈착에 의해 보호하기 위해 대조 항체의 존재하에 로제트를 형성하도록 한다. 로제트 형성은 네 개의 대조 항체의 존재하에 관찰되지만 항-LFA3 로 예비처리한 적혈구와는 함께 관찰되지 않는다.

로제트를 형성하지 않는 다른 T 세포 항원 형질발현 COS 세포

많은 클론은 CD2 를 클로닝하는데 사용하는 것과 같은 형질 발현 기술에 의해 분리되고 항체 반응성, 핵산 제한 및 서열 분석 및 면역침전에 의해 정도를 변화시키는데 특징이 있다. 대표적인 클론은 COS세포에 형질감염되고 로제트 형성을 유지하는 능력을 분석한다. CD1a, CD1b, CD1c, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, 및 CD28 (Tp 44)클론은 인체의 적혈구를 가진 로제트를 형성하지 않았다.

RNA 블로트 분석법

CD2항원을 형질발현하거나 결여된 세포형으로부터 제조한 동일한 양의 전체 PNA 를 변형시킨 아가로즈 겔을 통해 전기영동 하고 나일론에 전이시킨다. CD2 cDNA 삽입물을 포함하는 M13 클론으로부터 제조한 가닥 선택적 프로브와 그 이동시킨 RNA 와의 혼성화 [Hu 및 Messing 의 Gene 17 : 271-277 (1982) 문헌 참조] 로 인해 흉선세포, 활성 T 세포 및 노화된 T 세포 집단으로부터 유도된 RNA 에 존재하는 유력한 1.65 kb 및 1.3 kb의 전사물이 존재함을 알게되었다. cDNA 제공주인 HPB - ALL 로부터 추출한 RNA 에서 보다 작은 양이 발견되고 MOLT4 로부터도 추출된다; 겨우 감지할만한 수준이 HSB-2주로부터의 RNA 에 기록되어 있다. Namalwa (버킷 림프종), U937 (조직구 백혈병), HuT - 78 (성인 T 세포 백혈병), PEER(T 세포 백혈병) 또는 저캣 클론 J3R7 (Jurkat clone J3R7)(T 세포 백혈병)주로부터의 RNA 와는 반응성이 관찰되지 않았다.

반응성의 유형은 CD2 항원이 공지되거나 측정된 형질발현 유형과 상응하는데, Namalwa, *937, HuT - 78, J3R7, PEER 및 HSB - 2 세포주상에는 없거나 검출불가능하며 MOLT4 에는 약하게 존재하고, EPB - ALL 에는 좀더 강하게 존재하고, 활성화된 T 세포에 가장 강하게 존재한다. 또한 흉선세포는 CD2항원을 높은 수준으로 형질발현시키는 것으로 알려져 있다.

cDNA 클론 염기서열의 시험은 1.3 kb 의 RNA 가 cDNA 염기서열의 위치 1085 지점에 있는 규범적인 폴리아데닐화 신호 AATAAA 에 대해 말단부위에 있는 택일적인 3' 말단을 형성함으로써 생긴다고 제안되었다. 이러한 의견을 실험하기 위해, HPB-ALL 및 활성화된 T 세포로부터의 RNA 를 노던 블로트 분석하고 완전한 cDNA 프로브 또는 뉴클레오티드 1131 말단 cDNA 의 3' 부분으로부터 유도된 프로브로 혼성화시킨다. 후자의 프로브가 단지 1.65 kb 의 종과 반응하는 반면에, 전자의 프로브는 제 4 도에서 관찰할 수 있는 반응 유형과 유사하게 나타났다. 그 결과는 1.3 kb 의 전사물을 갖는 제안된 기원과 일치한다.

활성화되고 노화된 T 세포 RNA 제제에서 약 0.75 kb 의 약하게 혼성화하는 전사물이 검출되었다. 이 RNA 의 기원은 현재 알려져 있지 않다.

CD2 유전자의 게놈 구성

태반, 말초 혈액 림프구, T 세포, HeLa 세포 또는 RNA 분석에 사용한 종양주로부터의 게놈 DNA 를 서던 블로트 분석하여 동일한 BamHI 절단 유형을 보였는데, 이것은 성장중에 CD2 유전자의 정상적인 형질발현과는 무관하다는 것을 나타내는 것이다. 유사하게, 큰 게놈의 변형은 실험한 T 세포 종양주가 CD2 항원을 형질발현시키지 못하도록 진행되지 않는다. CD2 서열을 갖는 하나의 파지 재조합체의 불완전한 수집물로 행한 예비 결과 이외에 많은 다른 효소를 가진 전체 게놈 DNA 의 제한 분석으로 그 유전자가 적어도 네 개의 엑손으로 나누어지는 것을 알았다.

d

실시예 2 CD36 의 클로닝, 염기서열 및 형질발현

CD36 을 암호화하는 cDNA 클론을 분리하기 위해, 인체의 태반 cDNA [Simmons 및 Seed (1988) Nature 333 : 568 - 570 문헌 참조] 를 촉진제로서의 DEAE - 덱스트란을 이용하여 COS 세포에 전이시켰다. [실시예 1, 상기문헌 참조]. 후형질감염 48 시간만에 세포를 트립신없이 접시에서 떼어내고, 모노클로날 항 - CD36 항체 5F1 과 함께 항온시키고 [Bernstein 등의 (1982) J. Immunol. 128 : 876 - 881 ; Andrews 등의 (1984) J. Immunol. 128 : 398 - 404 문헌참조] 염소의 항 - 마우스 면역글로불린 항체로 코팅한 접시위에 패닝하였다. 접착되지 않은 세포는 조심스럽게 세척하여 제거하고, 접착된 세포는 용해시키고 그 세포로부터 회수한 에피솜 플라즈미드를 정제하여 E. Coli 에 형질전환 시킨다. 구형질 융합이후에 따르는 유사한 2회의 첨가 이후에, 무작위로 선택한 군체 12 개중 11 개로부터 회수한 플라즈미드 DNA 는 형질감염된 COS 세포에서의 CD36 결정기의 출현을 지시하는 것으로 밝혀졌다.

두 개의 클론을 후속 분석을 위해 무작위로 선택하였다.

약 1.9 kb 의 두 구멍 삽입물과 동일한 제한 효소 단편 유형을 보였다. COS 세포는 모노클로날 항체 5F1 및 F13 과 반응한 클론과 OKM5(미국 뉴저지 라리탄에 소재하는 오르트에서 구입) 로 형질감염시킨다. 항 - CD36 항체 풀로 형질감염시킨 세포를 면역침전시켜 83 kd 의 분자는 형질감염된 COS 세포 및 C32 흑색종 세포상에 존재하고 대조(CD25 로 형질감염된) COS 세포에는 결여되어 있다는 것을 알아내었다. 이량체 CD36 같은 고분자량의 종을 C32 흑색종 세포 용해물로부터가 아닌 형질감염된 COS 세포 용해물로부터 면역침전시켰다. 그 뉴클레오티드 서열은 표 1 에 나타나 있다. 표 1에서, 뉴클레오티드 서열의 번호는 각줄이 시작하는 왼쪽 여백에 나타나 있다. 추론된 아미노산 서열은 암호화하는 뉴클레오티드 트리플렛 각각의 시작 부분 밑의 단일 문자 코드로 나타나 있고 개시 메티오닌은 개시 코돈 위에 숫자 1 로 나타나 있다. 유도된 아미노산 서열내에서 N - 결합 글리코실화된 유력한 부위는 하나의 점선으로 그어져 있다. 추정상의 막내외 도메인은 이중의 점선으로 그어져 있다. 두 개의 컨센서스 폴리아데닐화(AATAAA) 특색이 cDNA 에서 발견되었다 할지라도, 폴리(A) 말단은 없고 만일 그 전사물이 클론에서 관찰되는 것과 같은 대략의 5' 말단을 가진다면, 블로트 혼성화에 의해 관찰된 RNA 종의 어느것도 이 부위에서 폴리아데닐화에 상응할 정도로 짧지 않다. 추정된 개시 코돈은 그 클론내에서 발견된 첫번째 ATG 가 아니지만 이전의 두개는 골격내 종결 코돈이 밀접하게 뒷따른다.

예정된 개시 메티오닌 다음에는 분비성 시그널 서열을 닮은 짧은 소수성 부위가 뒤따르지만, 절단 부위를 분명히 확인할 수는 없었다. 최근 결정된 표 1에서 아미노 말단의 36 아미노산 서열[Tandon 등 J. Biol. Chem. 264 : 7570 - 7575 (1989) 문헌 참조]은 성숙 폴리펩티드가 개시 메티오닌에 즉시 뒤따르는 아미노산 잔기에서 시작된다는 것을 지적해준다. 소수성 부위에 선행하는 하나의 Arg 잔기가 아미노 말단을 막에 부착시키기에 충분한지는 분명하지 않다. 그 결과 생긴 폴리펩티드는 약 53 kd 의 예상 분자량을 가진 471 개의 잔기를 갖는다. 제안된 세포외 도메인 다음에는 막내외 도메인에 상응하는 27 개의 극 소수성 잔기 및 얇은 세포내 도메인에 상응하는 6 개의 잔기(그중 3개는 염기성이다) 가 뒤따른다.

[표 1]

10개의 유력한 N - 결합 글리코실화 부위의 존재는 면역침전에 의해 발견되는 83 kd 의 종과 예상 폴리펩티드 사이의 분자량에서의 불일치를 설명하기에 충분한 것으로 나타났다. 공지된 단백질의 다양한 데이타베이스에 대한 전체 서열의 후속 비교 결과 주요한 상동성은 감지되지 않았다.

그러나 몇몇 내부 구조가 드러났다. 세포외 도메인에서의 모든 시스테인 잔기는 뉴클레오티드 서열 중 937내지 1209잔기에 의해 한정된 도메인으로 극한되어진다. 가이드로서 시스테인을 배치하면 세포외 도메인은 세 개의 단편으로 나누어질 수 있는데, 거기에서 시스테인이 없는 두개의 도메인이 선행하고 시스테인이 풍부한 단편이 뒤따른다. 그러나 이들 단편들의 서열 비교는 존재하는 데이타베이스 내의 다른 분자, 특히 트롬보스폰딘에 대한 중요한 관련성을 전혀 나타내지 않았다.

CD36 단백질은 면역침전에 의해 정제하였다. 신속한 면역 선택 클로닝 방법은 형질감염된 COS 세포의 형질발현에 의존하기 때문에, CD36 cDNA 가 클로닝된 동일한 세포주를 그 형질발현된 단백질의 원료로 사용할 수도 있었다.

C32 흑색종 세포, CD36 으로 형질감염된 COS 세포 및 CD25 (대조) 로 형질감염된 COS 세포는 Na¹²⁵I 로 표면 표지하고, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 0.5% NP - 40 및 0.1 % 도데실황산나트륨을 포함하는 인산 완충 식염수 용액에서 용해시킨다. 항 - CD36 모노클로날 항체를 첨가하고 4 ℃에서 12 시간동안 그 용해물에 흡수되도록 한 후, 염소의 항 - 마우스 면역글로불린 구슬(카펠)을 첨가하고 2 시간동안 혼합하고 Clark 및 Einfeld 의 J. Immunol. 135 : 155 - 167 (1986) 문헌에 기술된 바와 같이 세척한다. 면역친화 컬럼 정제에 의해 형질감염된 COS 세포 용해물로부터 다량의 단백질을 정제된 유형으로 수득할 수도 있다. CD36 에 대한 다른 항체를 CD36 단백질을 이용하여 수득할 수 있으며 이미 기술된 바와 같이 면역원으로서 형질발현되고 / 되거나 정제된다.

CD36 은 열대열원충(Plasmodum falciparum)이 기생하는 적혈구의 세포접착을 위한 결합부위로서 본 발명자와 Ockenhouse, C.D. 등의 (1989) Science 243 : 1469 - 1741 문헌에 의해 확인되었다. 기생충에 감염된 적혈구의 세포접착은 CD36 에 대한 모노클로날 항체에 의해 차단되는 것으로 나타났다. CD36 cDNA 로 형질감염시킨 COS 세포와 감염된 적혈구를 항온할 때 명백한 세포접착을 나타내었다.

열대열원충이 기생하는 적혈구가 말초 혈관상에 접착함으로써 비장 청소율을 회피하는 능력은 열대열말라리아의 병원성에 중요한 역할을 수행하고, 뇌의 작은 관의 폐색을 유발함으로써 뇌 말라리아의 치사 증후에 관여하는 것으로 생각된다. 그러므로, 본 발명의 cDNA 및 정제 단백질은 치료학적 모노클로날 항체를 만들기에 충분한 정제된 CD36 가 제공될 경우에 유용하다.

실시예 3. T 림프구 TLiSA 항원을 암호화하는 cDNA 의 분리 및 클로닝

TLiSA1 을 암호화하는 cDNA 클론은 상기한 바와 같이 COS 세포에 전이시킨 인체의 T - 세포 cDNA 라이브러리로부터 수득하고 본 발명의 신속한 면역선택 클로닝 방법을 실시한다. 모노클로날 항체 ACT - T - SET TLiSA1 (미국 메사츄세츠 캠브릿지 T - 세포 사이언스 코포레이션에서 구입)은 양성 간접 면역형광에 의해, 클로닝된 cDNA 를 형질발현하는 형질감염된 COS 세포를 감자히는데 사용하였다. 그 양성 플라즈미드는 1.7 kb 의 삽입물에 함유되어 있다.

TLiSA 단백질은 실시예 2 에서 기술한 면역침전법으로 분리 하였다. 그 단백질은 겔 전기영동에 의해 측정한 약 50 kd 의 분자량을 가진다.

cDNA 의 뉴클레오티드 서열은 상기한 바와 같은 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결에 의해 결정된다. 표 2 에는 1714 잔기를 가진 뉴클레오티드 서열과 각각의 암호화 트리플렛의 첫번째 뉴클레오티드 아래에 단일 문자 코드로 표시된 추정된 아미노산 서열이 나타나 있다. 추정된 개시 메티오닌을 암호화하는 ATG 다음에는 분비성 시그널 서열과 일치하는 짧은 소수성 부위가 오고, 반드시 절단되는 부위는 전사 해독 프레임내의 19 잔기이다. 그 결과 생기는 폴리펩티드는, 더 이상 가공되지 않는다면, 약 36 kd 의 예상 분자량을 갖는 317개의 잔기를 가진다.

제안된 세포외 도메인 다음에는 세포내 도메인에 상응하는 25 개의 극 소수성 잔기가 따른다 (표 2 에 이중선으로 나타나 있다). 9 개의 유력한 N - 결합 글리코실화 부위의 존재는(표 2 에서 하나의 점선으로 나타나 있다) 예상된 폴리펩티드와 면역침전에 의해 발견된 50 kd 의 종 사이의 분자량의 차이를 설명하기에 충분한 것으로 나타났다.

TliSA 는 T - 세포가 IL - 2 유도에 의해 세포 융해형으로 분화되는 것을 중재하는데 관계한다. TLiSA 에 대한 항체는 IL - 2 에 의해 자극된 T 세포 분화를 방지하고 치료시 IL - 2 의 역효과를 조절하는데 유용하다.

[표 2]

실시예 4. T 림프구 - 특이적 CD27 항원을 암호화하는 cDNA

의 분리 및 분자 클로닝

CD27을 암호화하는 cDNA 클론은 COS 세포에 전이시킨 인체 T 림프구 cDNA 로부터 수득하였고 본 발명의 방법에 의해 면역 선택하였다. 구아니디움 티오시아네이트를 이용하는 1 ㎍/㎖ 의 피토헤마글루티닌(PHA)을 포함하는 배지에서 4 일간 배양한 후 1 유닛의 혈액으로부터 유도된 단핵 세포에서 RNA 를 추출하였다. 전체 RNA 는 폴리 - A 로 선택하였다. cDNA 를 제조하고, CDM 8 내로 클로닝 하여 COS 세포에 형질감염시키고 CD27 cDNA 를 Seed 및 Aruffo 의 Proc. Natl. Acad. Sci. 84 : 8573 - 8577 (1987) ; 및 Aruffo 및 Seed 의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 3365 - 3369 (1987) 문헌에서 기술된 바와 같이 제공된 모노클로날 항체 OKT 18a 및 CLB - 9F4 로 면역선택하였다. 그 벡터는 1.2kb 의 cDNA 삽입물을 함유하였다.

cDNA 의 뉴클레오티드 서열은 상기문헌에 기술된 바와 같이 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결에 의해 결정하였다.

1203 개 잔기의 서열 및 추정된 아미노산 서열은 표 3 에 나타나 있다. 개시 메티오닌은 개시 코돈 위에 숫자 1 로 나타나 있다. 추정된 CD27 폴리펩티드는 유형 1 의 막 통합 단백질의 전형적인 특징을 말해준다. 그것은 분비성 시그널 서열과 일치하는 20 개의 아미노산으로된 소수성 부위로 시작한다. 이 소수성 부위 다음에는 171 잔기의 세포외 도메인, 20 잔기의 소수성 막 스패닝 도메인(이중선으로 나타나 있다) 및 양하전된 정지 전이 서열로 시작하는 49 아미노산의 세포질 도메인이 뒤따른다. 폴리(A) 말단은 없다.

추정된 CD27 아미노산 서열은 제 6 도에 기술되어 있는 B 림프구 및 암 항원 CD40 에 대해 전체 길이에 걸쳐 매우 상동이다. 또한 CD27 은 세포외 도메인 및 트랜스 막 도메인에 걸쳐 신경 성장 인자에 대한 수용체(NGFR) 에 매우 상동이다 [Stamenkovie 등의 EMBO J. 8 : 1403 - 1410(1989) ; Johnson 등의 Cell 47 : 545 - 554 (1989) 문헌 참조].

[표 3]

이들 세 단백질내에서 발견되는 대부분의 보존된 구조적 특색은 세포외 부위내 시스테인 또는 히스티딘의 풍요성에 있다. 이것은 이 구조물을 아연 이온에 결합시키는데 사용하는 단백질에서 나타나는 배열과 유사한 두개 또는 네개의 개재 아미노산 잔기에 의해 분리된 쌍에서 흔히 발견된다.

시스테인과 히스티딘이 풍부한 부위 다음에는 생화학적으로 확인된 0 - 결합 글리칸이 NGFR 에 첨가된 부위라고 제안되었던 세린, 트레오닌 및 프롤린이 풍부한 막 근접 도메인이 뒤따른다 [Johnson 등의(1989), 상기문헌 ; Grob 등의 J. Biol. Chem. 260 : 8044 - 8049 (1985) 문헌참조].

항 - CD27 항체로 형질감염된 COS 세포를 면역침전시킨 후 겔 전기영동시킴으로써 환원시키지 않았을때의 110 kd 의 종과 환원제의 존재하에 55 kd 의 단일 밴드의 존재를 밝혔다. 이것은 형질감염된 COS 세포상에서, CD27은 T 림프구로부터 침전된 유형과 유사한 55 kd 의 단량체를 포함하는 이황화 결합된 동종이량체라는 것을 지적해준다 [Bigler 등의 J. Immunol. 141 : 21 - 28 (1988); Stockinger 등의 Leukocyte Typing II, Vol. I : 513 - 529 (1986) ; Van Lier 등의 Eur. J. Immunol. 18 : 811 - 816 (1987) 문헌 참조].

CD27 은 T 림프구 활성 항원이다. 그 구조는 그것이 림포킨 또는 성장인자에 대한 수용체 기능을 할 수 있음을 시사한다. CD27 의 인식은 T 세포의 증식을 야기하고 그 T 세포의 보조자 기능과 효과기 기능을 위해 필요한 특정 유전자의 형질발현을 증가시킨다. T 세포상에서의 CD27 의 형질발현은 피토헤마글루티닌(PHA) 또는 항 - CD3 모노클로날 항체에 의한 자극을 두배 내지 다섯배로 증가시키고, 최소한 하나의 CD 27 모노클로날 항체를 첨가하여 PHA 에 의해 자극된 T 세포의 증식을 증대시킬 수 있다 [Bigler 및 Chiorazzi 의 Leukocyte Typing II, Vol. I : 503 - 512 (1986) ; Van Lier 의 (1987) 문헌 참조]. CD27 에 대해 양성인 T 세포는 IgM 합성을 위해 B 세포를 돕고, 알맞게 자극되었을 때 IL - 2 를 분비하는 것으로 밝혀졌다 [Van Lier 등의. Eur. J. Immunol. 18 : 811 - 816 (1988) 문헌참조].

항원 제시 세포와 CD27 양성 T 세포의 결합을 방해하는 능력, 또는 림프구 세포이외의 표면상에서 그러한 결합이 일어나게하는 능력은 진단과 치료에 있어 유용할 수 있다. 예를 들어, CD27의 융합 단백질과 기질에 고정된 수용체 리간드는 체액내의 특정 항원의 존재를 감지하는데 유용할 것이다. 가용성 CD27 융합 단백질은 예를 들어 특정한 자가면역 질병에서 원하지 않는 T 세포 증식을 막는데 유용할 것이다.

실시예 5 CD53 항원을 암호화하는 cDNA 의 분리 및 분자 클로닝

항체 MEM - 53 [Hadam, M.R. 의 (1989) Leucocyte Typing IV. Knapp. B. 등(eds.) Oxford Univ. Press, p. 674 참조 ], HD 77, HI 29 HI 36 및 63 - 5A3 에 의해 인식된 항원인 CD53 은 극히 제한적이긴 하지만 조혈 생성 계통의 핵 세포들 중에서 광범위하게 분포된 당단백질이다[Stevanova, I. 등의 (1989) Leucocyte Typing IV. Knapp. B. 등(eds.) Oxpord Univ, Press, p. 678 참조]. CD53 은 단구와 대식세포, 과립구, 수지상 돌기세포, 파골 세포와 조골 세포 및 분화의 모든 단계에 있는 T 및 B 세포에 의해 형질발현된다.

CD53 을 암호화하는 cDNA 클론을 수득하기 위해, 말초 혈액 림프구로부터 cDNA 라이브러리를 구성하고 전골수구 종양 세포주 HL 60 을 상기문헌에 기술되어 있는 바와 같은 DEAE - 텍스트란 방법에 의해 COS 세포에 형질감염시켰다. 감염후 48 시간만에 그 세포를 한데모으고, 모노클로날 항체 MEM - 53과 함께 항온하여 Seed 및 Aruffo 의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 3365-3369 (1987) 문헌과 Aruffo 및 Seed 의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 8573-8577 (1987) 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 패닝하였다. 구형질 융합 이후에 후속적으로 2 회 강화시킨 다음, 하나의 군체 분리체로부터 회수한 플라즈미드 DNA 를 COS 세포에 형질 감염시키고 면역형광에 의해 CD53 의 형질발현 정도를 기록하였다.

여덟개의 형질감염물 중 두개는 양성인데, 그 각각은 약 1.5 kb 의 삽입물을 가지고 있다. 그중 하나의 클론으로 형질감염시킨 COS 세포를 각각의 항체 MEM - 53, HI 29, HI 36 및 63 - 5A3 와 반응시켰다.

비교를 목적으로 말초 혈액 림프구와 형질감염된 COS 세포로부터 CD53 를 분리하기 위해, 그 림프구와 형질감염된 COS 세포는 락토퍼옥시다제 및 H₂O₂를 이용하여¹²⁵I 로 표면표지하고, 1 % NP40, 150 mM 염화나트륨, 5 mM 염화마그네슘, 5 mM 염화칼륨, 20 mM 요오드아세트아미드 및 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드를 함유하는 pH8.0, 50 mM 트리스-염산의 용해 완충액에 용해시킨다. 그 세포를 용해 완충액에서 2.5 x 10⁷세포/㎖ 의 농도로 45분간 가용화한 다음 12,000 g 에서 원심분리한다. 염소의 항 - 마우스 면역글로불린 구슬(미국 펜실바니아 멜번에 소재하는 카펠에서 구입)로 안정성을 미리 확인한 후, 면역침전은 Schneider 등 [J. Biol. Chem. 257 : 10766 (1982) 문헌] 에 의해 기술된 바와 같이 모노클로날 항체 MEM 53 또는 63-5A3 과 단백질 A - 세파로스 CL - 4B (미국 미주리 세인트루이스에 소재하는 시그마에서 구입) 를 가지고 실시하였다.

면역침전물은 SDS 표본 완충액내에서 용리되고 도데실황산나트륨을 함유하는 12.5 % 의 아크릴아미드 겔 상에서 분석 하였다.

34 kd 내지 42 kd 의 질량 범위에 있는 방사성 요오드화된 단백질의 넓은 밴드는 MEM - 53 또는 63 - 5A3 모노클로날 항체와 함께 말초 혈액 림프구로부터 수득되며, 36 kd 내지 46 kd 에 연장되어 있는 CD53 에 의해 형질감염된 COS 세포로부터 수득한 밴드와 비교할 만하다. 형질감염된 COS 세포로부터 회수한 세포 표면 단백질은 보통 cDNA 클론이 기원된 세포상에서 발견되는 분자량보다 낮거나 같은 분자량을 보이기 때문에 전형적이지 못하다[Aruffo 및 Seed 의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 3365 - 3369 (1987) 문헌 참조]. 약 15 kd 의 집단은 엔도글리코시다제 F (N - 글리카나제)로 절단하면 당단백질로부터 방출되는 반면에 뉴라미니다제 및 0 - 글리카나제로 처리하면 겉보기 분자량에 영향을 미치지 않는다 [Hadam, M.R, (1989) Leucocyte Typing IV, Knapp, B. 등 (eds.) Oxford Univ. Press, p. 674 ; Stevanova 등의 Leucocyte Typing IV, Knapp, B. 등 (eds.) Oxford Univ. Press, p. 678 문헌참조] 글리코실화되지 않은 전구체인 20 kd 의 부가적인 흐릿한 밴드는 형질감염된 COS 세포의 면역침전물에서 감지되지만, 말초 혈액 림프구의 면역침전물에는 존재하지 않았다.

몇몇 효소로 절단한 T 세포주 PEER 로부터의 게놈 DNA 의 블로트 혼성화는 하나의 복제 유전자와 일치하는 유형을 밝혀내었다. RNA 블로트 분석은 B, T 및 골수 세포 주와 말초 혈액 림프구로부터 유도된 1.8 kb 의 하나의 mRNA 를 밝혀내었다. 형질발현 수준은 CD53 mRNA 를 거의 갖지 않은 THP1 세포주를 제외한 다른 세포주에서 비교할만하다. CD53 전사물이 배양 세포주에서 보다는 말초 혈액 림프구에서 더욱 풍부한데, 이것은 이들 세포중에서 CD53 의 더 높은 표면 형질발현과 일치한다.

CD53 cDNA 의 뉴클레오티드 서열은 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 상기문헌에 기술된 바와 같은 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결에 의해 결정하였다. CD53 삽입물의 서열은 1452 개의 뉴클레오티드로 구성되어 있고 (표 4), 두 개의 중첩하는 AATAAA 모티프(단일선으로 나타나 있다) 에 근접하여 종결한다. 3' 의 비암호화 서열은 ATTTA 서열의 세가지 예를 포함하는데(인용 부호로 나타나 있다), 그것은 mRNA 의 불안정성을 나타내는 것이다 [Shaw 및 Kamen 의 Cell 46 : 659 (1986) 문헌참조]. 잔기 74 에서 시작하는 전사 해독 프레임은 24,340 kd 의 예상 분자량을 가진 219 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화한다. 예상된 폴리펩티드는 그것이 네 개의 주된 소수성 단편(이중선으로 나타나 있다) 을 가지고 있으며, 이들 중 세 개는 그 분자의 아미노 말단 가까이에 근접하게 된다는 점에서 이례적이다. 첫 번째 소수성 단편은 시그널 서열 또는 단순한 트랜스막 알파 나선에 대해 비전형적으로 길고, 중간에 위치한 세개의 시스테인 잔기와 글리신을 포함한다. 시스테인과 글리신은 시그널 절단 부위 바로 앞에 위치하는 것으로 밝혀졌는데 [Heijne 의 Nucleic Acids Res. 14 : 4683 (1986) 문헌 참조], 이것은 성숙 단백질의 아미노 말단이 첫 번째 소수성 도메인 중간에서 시작된다는 것을 시사하는 것이다. 이러한 견해를 지지하는 것은, 아래에서 논의된 관련 유형 III 의 막 통합 단백질인 ME491 의 폴리펩티드 골격의 크기가 시그널 펩티드를 절단한 결과로서 cDNA 염기서열로부터 예상된 크기보다 더 작다는 사실을 발견함으로써 제공된다. 세번째와 네 번째의 소수성 단편 사이에 위치한, N-결합 글리칸을 첨가하기 위한 두 개의 유력한 부위만이 있기 때문에, 그 카르복시 말단은 두 번째와 세번째의 소수성 단편 사이에 있는 짧은 친수성 부분이외에 그 세포 내부에 놓여 있어야 한다. 만일 그 아미노 말단이 가공되지 않는다면, 그 역시 세포내에 남아 있어야 한다.

CD53은 다음과 같은 세 개의 다른 막 단백질과 관련된 유형 III의 막 통합 단백질이다 : 종양의 진행과 깊은 관련이 있으며, 형질발현이 증가된 흑색종 단백질인 ME491 항원[Hotta 등의, Cancer Res. 48 : 2955(1988) 문헌참조];

B 세포 결합에 특이적이진 않지만 주로 B 세포상에서 형질 발현되고 광범위하게 글리코실화된 항원인 CD37 [Schwartz 등 J. Immun. 140 : 905 (1988) 참조]; 및 조혈 결합의 세포상에서 폭넓게 형질발현된 글리코실화되지 않은 항원인 S5.7[Pressano 등 Cancer Res. 43 : 4812 (1983) 문헌참조].

또한, CD53 은 락토오스가 박테리아 세포에 운반하는 유형 III 의 막 통합 단백질인 E. coli lac Y 퍼미아제와 간접적으로 관련이 있다. 말초 혈액 림프구내의 CD53 전사물은 PHA 에 의한 유사분열 자극후 보급면에서 증가하는데, 이것은 그 단백질이 세포 증식을 위해 필수적인 인자를 수송하는 것과 관련이 있음을 제시해주는 것이다.

조혈계내에서 광범위한 반응성을 갖는 분자들 중 CD53 은 현재 조혈 세포에 대해 가장 엄밀한 제한을 할 뿐만 아니라 가장 광범위한 반응성을 지닌다. 항 - CD53 항체는 조혈 신생물을 확인하는 유용한 도구이며 예를들어, 비장 또는 골수의 일차 배양물에서와 같은 형태학적으로 불완전하게 한정된 세포를 확인하는데 도움을 줄 수 있다.

[표 4a]

[표 4b]

상당물

본 기술분야의 숙련자는 본원에서 언급된 본 발명의 특이 형태에 대한 많은 상당물을 일상의 실험만을 이용하여 인식하거나 평가할 수 있을 것이다. 그러한 상당물을 본 발명의 범위내에 포함하고자 한다.

발명이 이루고자 하는 기술적 과제 누락

제 1도는 piH3 형질발현 벡터의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다. 뉴클레오티드 1-589는 pMB 1 기원(pBR 322 유래)으로부터 유도된다 ; 뉴클레오티드 590-597은 SacII 링커(ACCGCGT)로부터 유도된다;

뉴클레오티드 598-799 는 합성 티로신 억제 tRNA 유전자(supF 유전자)로부터 유도된다;

뉴클레오티드 800-947 은 ASV LTR 단편의 잔존물로부터 유도된다. (Pvu II 내지 MIu 1) ; 뉴클레오티드 948-1500은 인체의 시토메가로바이러스 AD 169 인핸서로부터 유도된다 ; 뉴클레오티드 1501-1650은 HIV TATA 및 tat - 반응요소들로부터 유도된다 ; 뉴클레오티드 1651 - 1716 은 piLNXAN 폴리링커로부터 유도된다.(Hind Ⅲ 내지 Xba); 뉴클레오티드 1717-2569는 스플라이스와 폴리-부가 신호를 위해 pSV 로부터 유도된다 ; 뉴클레오티드 2570-2917 은 SV40 의 복제 기원으로부터 유도된다.(pvu II 내지 Hind Ⅲ) ; 및 뉴클레오티드 2918-2922는 폴리링커로부터의 R1 부위의 잔여물인 piVX 로부터 유도된다.

제 2도는 CD2 cDNA 삽입물의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다. 뉴클레오티드 숫자는 오른쪽에 괄호로 표시하고 아미노산 숫자는 왼쪽에 표시하였다. 아스파라긴-연관 탄수화물 (CHO)을 부가하기에 가능한 부위의 위치가 예상되는 트랜스막(TM) 서열과 함께 나타나 있다. 아미노산 서열은 분비 시그널 서열의 계획된 절단 부위로부터 번호를 매겼다.

제 3도는 CDM8 형질발현 벡터의 제한 지도를 나타낸 도면이다. CDM8 벡터는 마우스와 원숭이 세포에서 고효율의 형질발현을 위해 선택된 돌연변이 폴리오마바이러스 초기 부위의 삭제된 전환물을 포함한다.

실질적으로 인체의 면역결핍성 프로모터 부위 전체는 인체의 시토메가로바이러스의 직접적인 초기 프로모터와 기원이 같은 서열로 대체되었고, 진핵 프로모터 및 cDNA 삽입 부위 사이의 박테리오파지 T7 프로모터의 함유물에 의해 대체되었다. 화살표는 전사 방향을 나타낸다.

제 4도는 piH3M 벡터의 제한 지도를 나타낸 도면이다. 전사의 방향은 화살표로 나타내었다. Bst XI 클로닝 부위 측면에 있는 제한 엔도뉴클레아제 부위가 나타나 있다.

제 5도는 piH3M 벡터의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다. 7개의 단편이 존재한다. 잔기 1-587 은 pBR322 의 복제 기원으로부터 유도된 것이고 잔기 588-1182 는 M13 기원에서, 잔기 1183-1384 는 supF 유전자로부터, 1385-2238 은 키메라 시토메가로바이러스/인체 면역결핍 바이러스 프로모터로부터, 2239-2647 은 복제가능한 단편으로부터, 2648-3547 은 플라즈미드 pSV2(스플라이스 및 폴리아데닐화 신호)로부터, 3548-3900 은 SV 40 바이러스 기원에서 유도되었다.

제 6도는 CD40의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다.

발명의 구성 및 작용 누락

발명의 효과 누락

Claims (2)

1. 표 2 에 제시된 뉴클레오티드 서열을 함유하는, TLiSa 세포 표면 항원을 암호화하는 재조합 DNA.
2. 표 2 의 아미노산 서열을 갖는 실질적으로 순수한 TLiSa 단백질.