KR100197357B1 - A medium for producing microbial cellulose and a producing method of microbial cellulose - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미생물 셀룰로오스(microbial cellulose) 생산용 배지 및 그를 이용한 미생물 셀룰로오스의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 펩톤, 효모추출물, 포도당, 구연산 및 에탄올을 주요 구성성분으로 포함하는 미생물 셀룰로오스 생산용 배지 및 전기 배지에서 미생물 셀룰로오스 생산균주를 정치배양하거나 특정 교반조건하에서 교반배양함으로써, 미생물 셀룰로오스를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 미생물 셀룰로오스 생산용 배지 및 배양방법을 이용하면, 미생물 셀룰로오스의 생산성을 획기적으로 향상시킬 수 있고, 이렇게 제조된 미생물 셀룰로오스는 식물 섬유가 결핍된 식사 또는 적은 식사를 하는 현대인에게서 유발되는 장질환인 변비, 맹장염과 대장암 등이나, 대사성 질환인 비만과 당뇨병 등에 예방 효과가 있어 건강 식품 및 의료용으로 이용될 뿐만 아니라, 산업용 소재로도 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a medium for producing microbial cellulose and a method for producing microbial cellulose using the same. More specifically, the present invention by the micro-cell cellulose production strain in the culture medium and electric medium containing peptone, yeast extract, glucose, citric acid and ethanol as the main constituents in a stationary culture or stirred culture under specific stirring conditions, A method for producing microbial cellulose. By using the medium and culture method for producing microbial cellulose of the present invention, the productivity of microbial cellulose can be significantly improved, and the microbial cellulose thus prepared is a bowel disease caused by modern people who have a diet or lack of dietary fiber. Phosphorus constipation, appendicitis and colorectal cancer, and metabolic diseases such as obesity and diabetes, and preventive effects are not only used for health food and medical, but also can be useful as industrial materials.

Description

미생물 셀룰로오스 생산용 배지 및 그를 이용한 미생물 셀룰로오스의 제조방법Medium for producing microbial cellulose and method for producing microbial cellulose using the same

본 발명은 미생물 셀룰로오스(microbial cellulose) 생산용 배지 및 그를 이용한 미생물 셀룰로오스의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 펩톤, 효모추출물, 포도당, 구연산 및 에탄올을 주요 구성성분으로 포함하는 미생물 셀룰로오스 생산용 배지 및 전기 배지에서 미생물 셀룰로오스 생산균주를 정치배양하거나 특정 교반조건하에서 교반배양함으로써, 미생물 셀룰로오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a medium for producing microbial cellulose and a method for producing microbial cellulose using the same. More specifically, the present invention by the micro-cell cellulose production strain in the culture medium and electric medium containing peptone, yeast extract, glucose, citric acid and ethanol as the main constituents in a stationary culture or stirred culture under specific stirring conditions, A method for producing microbial cellulose.

미생물 셀룰로오스는 다수의 박테리아, 특히 아세토박터 속의 미생물 그 중에서도 아세토박터 자일리넘(Acetobacter xylinum)의 배양에 의해 생산되는, 포도당의 β-1,4 결합에 의해 생성된 중합체이다. 상기 미생물을 정치배양하면, 미세섬유 형태의 미생물 셀룰로오스가 각 균체로부터 분비되고, 각기 다른 균체로부터 분비된 미세섬유는 서로 엇갈려 미세섬유와 균체가 망상구조를 이룬 셀룰로오스의 피막을 형성한다. 이렇게 생산되는 미생물 셀룰로오스는 목재에서 생산되는 셀룰로오스와는 달리 순도가 매우 높아 결정성이 높고, 여러 가지 물리적인 특성이 탁월하여, 의료용 및 산업용 등 광범위한 분야의 소재로 이용되고 있을 뿐만 아니라, 식용으로도 이미 상품화되어 시판되고 있는 실정이다.Microbial cellulose is a polymer produced by β-1,4 binding of glucose, which is produced by the cultivation of a large number of bacteria, in particular the microorganisms of the genus Acetobacter, especially Acetobacter xylinum. When the microorganisms are cultured in a stationary state, microfibrous cellulose in the form of microfibers is secreted from each cell, and the microfibers secreted from different cells are staggered to form a film of cellulose in which the microfibers and the cells have a network structure. Unlike the cellulose produced from wood, the microbial cellulose produced in this way has high purity and high crystallinity, and has various physical properties, and is used as a material for a wide range of fields such as medical and industrial purposes, and also for food. It is already commercialized and marketed.

미생물 셀룰로오스의 생산은 주로 정치배양에 의해 이루어져 왔는데, 이는 공업적으로 생산시설에 대한 설비투자가 많이 요구되고 과다한 인력이 소요되는 등의 많은 문제점을 갖고 있을 뿐만 아니라, 생산성 또한 매우 낮다는 문제점을 가지고 있었다. 이러한 문제점을 해결하려는 한가지 방안으로 교반배양에 의한 미생물 셀룰로오스의 생산법이 보고되고 있으나(참조: 유럽특허출원 제 0279506호), 오히려 정치배양시보다 수율이 낮다는 문제점을 가지고 있었다. 이는 교반에 의해 유발된 유전적 변화를 통하여 생산균주가 비생산균주로 전이하기 때문인 것으로 알려져 있다.The production of microbial cellulose has been mainly carried out by political culture, which not only has many problems such as high facility investment in industrial facilities and excessive manpower, but also low productivity. there was. As one way to solve this problem, a method for producing microbial cellulose by stirring culture has been reported (cf. European Patent Application No. 0279506), but has a problem in that the yield is lower than that during political culture. This is known to be because the production strain is transferred to the non-production strain through the genetic change caused by agitation.

한편, 미생물 셀룰로오스 생산용 배지에서 탄소원이 차지하는 비중은 매우 커서, 탄소원의 개발에 대하여 중점적인 연구가 이루어지고 있다. 현재까지, 미생물 셀룰로오스의 생산에는 배지 리터당 2% 포도당, 0.5% 펩톤, 0.5% 효모추출물, 0.27% Na2HPO4및 0.115% 구연산으로 구성된 배지(참조: Hestrin and Schramm, J. Gen. Microbiol., 11:123(1954)); 0.5% 펩톤, 0.19% KH2PO4, 0.156% NaH2PO4, 0.18% (NH4)2SO4, 0.02% MgSO4·7H2O, 0.115% 구연산, 1ppm FeCl3·6H2O 및 0.1% 미량원소(trace element)로 구성된 배지(참조: 유럽특허출원 제 0279506호); 2% 펩톤, 0.5% 효모추출물, 0.5% D-글루코스, 0.1% MgSO4·7H2O 및 0.2% 에탄올로 구성된 배지(참조: Masaoka et el., J. Fermon. Bioeng., 75:18-22(1993))가 주로 사용되고 있다. 이들 배지는 포도당을 주탄소원으로 사용하고 있으며, 설탕 등의 이당류, 만니톨 및 구연산 등의 유기산, 그리고 에탄올 등을 사용하고 있으나, 에탄올과 구연산을 동시에 배지의 구성 성분으로 사용하고 있지는 않다. 또한, 상술한 배지 모두는 미생물 셀룰로오스의 생산성을 크게 향상시키지 못하였다.On the other hand, the carbon source in the medium for producing microbial cellulose is very large, the focus of the development of the carbon source has been made. To date, the production of microbial cellulose includes medium consisting of 2% glucose, 0.5% peptone, 0.5% yeast extract, 0.27% Na 2 HPO 4 and 0.115% citric acid per liter (see Hestrin and Schramm, J. Gen. Microbiol., 11: 123 (1954); 0.5% peptone, 0.19% KH 2 PO 4 , 0.156% NaH 2 PO 4 , 0.18% (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.02% MgSO 4 7H 2 O, 0.115% citric acid, 1 ppm FeCl 3 · 6H 2 O and 0.1 Medium consisting of% trace elements (see European Patent Application No. 0279506); Medium consisting of 2% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% D-glucose, 0.1% MgSO 4 .7H 2 O and 0.2% ethanol (Masaoka et el., J. Fermon. Bioeng., 75: 18-22 (1993)). These mediums use glucose as the main carbon source, disaccharides such as sugar, organic acids such as mannitol and citric acid, and ethanol, but ethanol and citric acid are not used simultaneously as constituents of the medium. In addition, all of the above-described media did not significantly improve the productivity of the microbial cellulose.

이에, 본 발명자는 미생물 셀룰로오스의 생산성을 증진시킬 수 있는 배지 및 교반배양법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 펩톤, 효모추출물, 포도당, 구연산 및 에탄올을 주요 구성성분으로 포함하는 신규의 배지에서 미생물 셀룰로오스 생산균주를 배양함으로써, 미생물 셀룰로오스의 생산이 크게 향상됨을 발견하였다. 특히, 구연산과 에탄올의 동시 첨가에 의해서 미생물 셀룰로오스의 생산성이 상승적으로(synergically) 향상됨을 처음으로 규명하였다. 또한, 교반에 의해 야기되는 미생물 셀룰로오스 생산균주의 비생산균주로의 유전적 변화가 교반조건과 교반시 주어지는 무방향성 전단응력에 기인함을 규명하고, 그 유전적 변이를 적게 유발하는 교반조건을 찾아내어, 그 교반조건하에서 미생물 셀룰로오스 생산균주를 배양한 결과, 균주의 미생물 셀룰로오스 생산능이 유지되어 미생물 셀룰로오스의 생산이 크게 향상됨을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have made intensive studies to develop a medium and agitated culture method that can enhance the productivity of microbial cellulose. As a result, microbial cellulose is produced in a novel medium containing peptone, yeast extract, glucose, citric acid and ethanol as main components. By culturing the strain, it was found that the production of microbial cellulose was greatly improved. In particular, it was found for the first time that the productivity of microbial cellulose was synergically improved by the simultaneous addition of citric acid and ethanol. In addition, the genetic change of microbial cellulose-producing strains caused by agitation to non-productive strains was found to be due to the stirring conditions and the non-directional shear stress given upon stirring, and to find the stirring conditions causing less genetic variation. As a result of culturing the microbial cellulose producing strain under the stirring conditions, it was found that the microbial cellulose production capacity of the strain was maintained and the production of the microbial cellulose was greatly improved, thereby completing the present invention.

결국, 본 발명의 첫번째 목적은 미생물 셀룰로오스 생산용 신규한 배지를 제공하는 것이다.After all, the first object of the present invention is to provide a novel medium for the production of microbial cellulose.

본 발명의 두번째 목적은 전기 배지에서 미생물 셀룰로오스 생산균주를 정치배양하거나 특정 교반조건하에서 교반배양함으로써, 미생물 셀룰로오스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.It is a second object of the present invention to provide a method for producing microbial cellulose by static culture of the microbial cellulose producing strain in an electric medium or under agitation under specific stirring conditions.

제1도는 질소원인 펩톤 및 효모추출물의 첨가량을 달리하면서 미생물 셀룰로오스의 생산성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.1 is a graph showing the results of measuring the productivity of the microbial cellulose while varying the amount of addition of the peptone and yeast extract which is a nitrogen source.

제2도는 동시에 첨가하는 구연산과 에탄올의 양을 각기 달리하면서 미생물 셀룰로오스의 생산성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.2 is a graph showing the results of measuring the productivity of microbial cellulose while varying the amounts of citric acid and ethanol added at the same time.

제3도는 인산수소나트륨, 인산 2수소칼륨, 황산 마그네슘 및 염화철의 무기 금속이온 첨가량을 달리하면서 미생물 셀룰로오스의 생산성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.3 is a graph showing the results of measuring the productivity of microbial cellulose while varying the amounts of inorganic metal ions added in sodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate and iron chloride.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 본 발명자들은 질소원, 탄소원 및 무기 금속이온에 대한 중점적인 연구를 통하여 미생물 셀룰로오스의 생산성을 증진시킬 수 있는 신규의 배지 조성물을 확립하였다. 특히, 구연산과 에탄올을 동시에 첨가할 경우, 미생물 셀룰로오스의 생산성 상승 효과(synergistic effect)가 나타남을 확인하였다. 결국, 본 발명에서는 정제수 1리터당 펩톤 5 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 10g; 효모추출물 5 내지 20g, 바람직하게는 10 내지 20g; 포도당 5 내지 20g, 바람직하게는 10 내지 20g; 구연산 1 내지 10g, 바람직하게는 5 내지 7g; 에탄올 2 내지 20ml, 바람직하게는 5 내지 10ml; 인산수소나트륨 1 내지 5g, 가장 바람직하게는 1.56g; 인산2수소칼륨 1 내지 5g, 가장 바람직하게는 1.8g; 황산마그네슘 0.01 내지 0.1g, 가장 바람직하게는 0.05g; 및, 염화철 0.001 내지 0.01g, 가장 바람직하게는 0.002g을 포함하는 미생물 셀룰로오스 생산용 배지 조성물이 확립되었다. 이 액체배지에 미생물 셀룰로오스 생산균주를 배양시킨 결과, 종래의 미생물 셀룰로오스 생산용 배지에 비하여 5배 이상의 높은 생산성으로 미생물 셀룰로오스를 제조할 수 있었다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail. The present inventors have established novel media compositions that can enhance the productivity of microbial cellulose through intensive research on nitrogen sources, carbon sources and inorganic metal ions. In particular, when citric acid and ethanol are added at the same time, it was confirmed that the synergistic effect of the microbial cellulose appeared. As a result, in the present invention, 5 to 20 g of peptone, preferably 5 to 10 g, per liter of purified water; Yeast extract 5 to 20 g, preferably 10 to 20 g; 5 to 20 g of glucose, preferably 10 to 20 g; 1-10 g, preferably 5-7 g, citric acid; 2-20 ml of ethanol, preferably 5-10 ml; 1 to 5 g sodium hydrogen phosphate, most preferably 1.56 g; 1 to 5 g of potassium dihydrogen phosphate, most preferably 1.8 g; 0.01 to 0.1 g of magnesium sulfate, most preferably 0.05 g; And 0.001 to 0.01 g of iron chloride, most preferably 0.002 g, has been established. As a result of culturing the microbial cellulose producing strain in this liquid medium, microbial cellulose could be produced at a productivity higher than five times higher than that of the conventional microbial cellulose production medium.

아울러, 상술한 멸균 액체배지에 미생물 셀룰로오스 생산균주의 배양액을 2% 내지 10%(v/v)로 접종하고, 그 배양용액을 배양용기 총용량의 10% 내지 40%(v/v), 바람직하게는 20% 내지 25%(v/v)에 해당하는 양으로 배양용기에 첨가한 다음, 25℃ 내지 35℃, 바람직하게는 28℃ 내지 32℃의 온도에서, 3일 내지 8일간, 바람직하게는 4일 내지 6일간 정치배양하거나, 분당 100회 내지 350회, 바람직하게는 분당 200회 내지 300회로 교반배양함으로써, 종래에 비하여 미생물 셀룰로오스의 생산성을 크게 증진시킬 수 있었다.In addition, the inoculated culture medium of the microbial cellulose production strain in 2% to 10% (v / v) in the above sterile liquid medium, the culture solution 10% to 40% (v / v) of the total volume of the culture vessel, preferably Is added to the culture vessel in an amount corresponding to 20% to 25% (v / v), then at a temperature of 25 ℃ to 35 ℃, preferably 28 ℃ to 32 ℃, 3 to 8 days, preferably By stationary culture for 4 days to 6 days, or stirred culture 100 times to 350 times per minute, preferably 200 times to 300 times per minute, the productivity of microbial cellulose could be greatly improved compared to the conventional method.

상기에서, 미생물 셀룰로오스 생산균주는 아세토박터 자일러넘(Acetobacter xylinum)을 포함하는 초산생성균에서 선택되는 하나 이상의 균주를 사용하는 것이 바람직하다.In the above, the microbial cellulose producing strain is preferably used at least one strain selected from acetogenic bacteria including acetobacter xylinum.

상술한 본 발명의 배지에서 정치배양하거나 본 발명의 교반조건에서 교반배양하여, 배지 리터당 최저 4g 이상, 최고 15g 이하의 미생물 셀룰로오스를 제조할 수 있었다. 이는 지금까지 보고된 종래의 미생물 셀룰로오스 최고 생산량이 배지 리터당 5g인 것을 감안한다면, 월등히 우수한 생산량임을 알 수 있다. 특히, 본 발명의 교반배양에 의한 미생물 셀룰로오스의 제조방법은 미생물 셀룰로오스 생산균주가 교반에 의해 비생산균주로 전이되는 유전적 변화를 적게 유발시킴으로써, 균주가 미생물 셀룰로오스 생산능을 유지하므로, 미생물 셀룰로오스가 거의 생산되지 않는 종래의 교반배양법보다 미생물 셀룰로오스의 생산성이 월등히 우수하였다.In the culture medium of the present invention described above or cultured under stirring under the stirring conditions of the present invention, microbial cellulose of at least 4 g or more and at most 15 g or less could be prepared per liter of medium. It can be seen that this is an excellent production given that the highest reported amount of conventional microbial cellulose reported so far is 5 g per liter of medium. In particular, the method for producing microbial cellulose by the agitating culture of the present invention causes the microbial cellulose producing strain to lessen the genetic change that is transferred to the non-producing strain by agitation, so that the microorganism is able to maintain microbial cellulose production capacity. The productivity of microbial cellulose was much better than that of the conventional stirring culture method, which is hardly produced.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples specifically illustrate the present invention, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples.

[실시예 1]Example 1

[미생물 셀룰로오스 생산용 신규의 배지 조성물][New Medium Composition for Microbial Cellulose Production]

미생물 셀룰로오스의 생산성을 증진시킬 수 있는 본 발명의 배지 조성물을 확립하기 위하여, 우선 질소원인 펩톤 및 효모추출물의 첨가량을 달리하면서 아세토박터 자일리넘(Acetobacter xylinum, ATCC 23769)이 생산하는 미생물 셀룰로오스의 생산성을 측정하였다(참조: 제1도). 제1도에서 보듯이, 질소원으로서 배지 리터당 펩톤 5 내지 10g과 효모추출물 10 내지 20g이 포함될 경우, 미생물 셀룰로오스의 생산성이 크게 증가됨을 알 수 있었다.In order to establish the media composition of the present invention that can improve the productivity of microbial cellulose, first, the productivity of the microbial cellulose produced by Acetobacter xylinum (ATCC 23769) while varying the amount of the nitrogen source peptone and yeast extract It was measured (see FIG. 1). As shown in FIG. 1, it can be seen that the productivity of microbial cellulose is greatly increased when 5 to 10 g of peptone and 10 to 20 g of yeast extract are included as a nitrogen source as a nitrogen source.

두번째로, 여러가지 탄소원(포도당, 과당, 만노스, 갈락토스, 락토스, 말토스, 수크로스, 전분, 구연산, 호박산, 에탄올, 글리세롤)에 대한 미생물 셀룰로오스의 생산성을 측정한 결과, 포도당 10 내지 20g을 탄소원으로 이용한 경우의 미생물 셀룰로오스 생산성이 가장 크게 증가됨을 확인하였다. 이어, 전기 포도당에 구연산과 에탄올을 동시에 첨가할 경우, 미생물 셀룰로오스의 생산성 상승효과가 나타남을 확인하였다(참조: 제2도). 제2도에서 보듯이, 배지 리터당 에탄올 5 내지 10ml 및 구연산 5 내지 7g이 포함될 경우, 미생물 셀룰로오스의 생산성이 크게 증가됨을 알 수 있었다.Secondly, as a result of measuring the productivity of microbial cellulose on various carbon sources (glucose, fructose, mannose, galactose, lactose, maltose, sucrose, starch, citric acid, succinic acid, ethanol, glycerol), 10 to 20 g of glucose was used as a carbon source. When used, it was confirmed that the microbial cellulose productivity was greatly increased. Subsequently, when citric acid and ethanol were added to the electric glucose at the same time, it was confirmed that the productivity synergistic effect of the microbial cellulose appeared. As shown in Figure 2, 5 to 10ml of ethanol and 5 to 7g of citric acid per liter medium, it can be seen that the productivity of microbial cellulose is greatly increased.

세번째로, 배지 리터당 펩톤 5g, 효모추출물 20g, 포도당 20g, 구연산 5g 및 에탄올 10ml가 포함된 배지에 첨가하는 인산수소나트륨, 인산 2수소칼륨, 황산마그네슘 및 염화철의 양을 달리하면서, 아세토박터 자일리넘이 생산하는 미생물 셀룰로오스의 생산성을 측정하였다(참조: 제3도). 제3도에서, 무기 금속이온의 첨가량은 인산수소나트륨의 경우 좌표축의 수치에 15.6을 곱한 값이며, 인산 2수소칼륨의 경우 좌표축의 수치에 18을 곱한 값이고, 황산마그네슘의 경우 좌표축의 수치에 0.5를 곱한 값이며, 염화철의 경우 좌표축의 수치에 0.02를 곱한 값이다. 제3도에서 보듯이, 배지 리터당 인산수소나트륨 1 내지 5g, 인산2수소칼륨 1 내지 5g, 황산마그네슘 0.01 내지 0.1g 및 염화철 0.001 내지 0.01g이 첨가될 경우, 미생물 셀룰로오스의 생산성이 증가되며, 특히, 인산수소나트륨 1.56g, 인산 2수소칼륨 1.8g, 황산마그네슘 0.05g 및 염화철 0.002g이 첨가되는 경우, 미생물 셀룰로오스의 생산성이 가장 증가됨을 알 수 있었다.Thirdly, acetobacter xyllium was added in varying amounts of sodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate and iron chloride added to the medium containing 5 g of peptone, 20 g of yeast extract, 20 g of glucose, 5 g of citric acid, and 10 ml of ethanol per liter of medium. The productivity of this producing microbial cellulose was measured (see Figure 3). In FIG. 3, the amount of inorganic metal ions added is 15.6 times the value of the coordinate axis for sodium hydrogen phosphate, 18 times the value of the coordinate axis for potassium dihydrogen phosphate, and 18 times the value for the coordinate axis for magnesium sulfate. This value is multiplied by 0.5. In the case of iron chloride, the value on the coordinate axis is multiplied by 0.02. As shown in FIG. 3, the productivity of microbial cellulose is increased when 1 to 5 g of sodium hydrogen phosphate, 1 to 5 g of potassium dihydrogen phosphate, 0.01 to 0.1 g of magnesium sulfate and 0.001 to 0.01 g of iron chloride are added per liter of medium, in particular When the sodium hydrogen phosphate 1.56g, potassium dihydrogen phosphate 1.8g, magnesium sulfate 0.05g and iron chloride 0.002g were added, the productivity of the microbial cellulose was found to increase the most.

[실시예 2]Example 2

[본 발명의 배지 조성물을 이용하는 정치배양에 의한 미생물 셀룰로오스의 제조][Production of Microbial Cellulose by Static Culture Using the Medium Composition of the Present Invention]

정치배양에 의해 미생물 셀룰로오스를 제조하기 위하여, 실시예 1에서 확립된 배지 조성물 즉, 정제수 1리터당 펩톤 10g, 효모추출물 20g, 포도당 20g, 구연산 5g, 에탄올 10ml, 인산수소나트륨 1.56g, 인산2수소칼륨 1.8g, 황산마그네슘 0.05g 및 염화철 0.002g을 포함하는 멸균배지(이하, 편의상 '본 발명의 배지'라 함)에 미생물 셀룰로오스를 생산하는 아세토박터 자일러넘(Acetobacter xylinum, ATCC 23769) 균주를 접종하고, 30℃의 온도에서 6일간 정치배양하여 종균제 혼합물을 제조하였다. 그 결과, 배지 1리터당 8g의 미생물 셀룰로오스를 얻었다.To prepare microbial cellulose by static culture, the medium composition established in Example 1, namely, 10 g of peptone per liter of purified water, 20 g of yeast extract, 20 g of glucose, 5 g of citric acid, 10 ml of ethanol, 1.56 g of sodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate Inoculated with acetobacter xylinum (ATCC 23769), which produces microbial cellulose in a sterile medium (hereinafter, referred to as the medium of the present invention for convenience) containing 1.8 g, 0.05 g magnesium sulfate and 0.002 g iron chloride. Then, the mixture was left to culture at a temperature of 30 ° C. for 6 days to prepare a seed mixture. As a result, 8 g of microbial cellulose was obtained per liter of medium.

[실시예 3]Example 3

[본 발명의 배지 조성물을 이용하는 교반배양에 의한 미생물 셀룰로오스의 제조(I)][Production (I) of microbial cellulose by stirring culture using the medium composition of the present invention]

교반배양에 의해 미생물 셀룰로오스를 제조하기 위하여, 실시예 2에서 수득한 미생물 셀룰로오스와 종균제 혼합물 2.5ml를 본 발명의 배지 50ml에 접종하고, 그 배양용액을 배양용기 총용량의 20%(v/v)에 해당하는 양으로 250ml 플라스크 용기에 첨가한 다음, 분당 150회로 교반하면서 30℃의 온도에서 6일간 배양하였다. 그 결과, 배지 1리터당 8g의 미생물 셀룰로오스를 얻었다.In order to prepare microbial cellulose by stirring culture, 2.5 ml of the microbial cellulose and spawn mixture obtained in Example 2 were inoculated into 50 ml of the medium of the present invention, and the culture solution was 20% (v / v) of the total volume of the culture vessel. It was added to the 250ml flask container in the amount corresponding to, and then incubated for 6 days at a temperature of 30 ℃ while stirring 150 times per minute. As a result, 8 g of microbial cellulose was obtained per liter of medium.

[실시예 4]Example 4

[본 발명의 배지 조성물을 이용하는 교반배양에 의한 미생물 셀룰로오스의 제조(II)][Production of microbial cellulose by stirring culture using the medium composition of the present invention (II)]

교반속도를 분당 250회로 조절하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 미생물 셀룰로오스를 제조하였다. 그 결과, 배지 1리터당 12g의 미생물 셀룰로오스를 얻었다.Microbial cellulose was prepared in the same manner as in Example 3 except that the stirring speed was adjusted to 250 times per minute. As a result, 12 g of microbial cellulose was obtained per liter of medium.

[실시예 5]Example 5

[본 발명의 배지 조성물을 이용하는 교반배양에 의한 미생물 셀룰로오스의 제조(III)][Production of microbial cellulose by stirring culture using the medium composition of the present invention (III)]

교반속도를 분당 350회로 조절하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 미생물 셀룰로오스를 제조하였다. 그 결과, 배지 1리터당 6g의 미생물 셀룰로오스를 얻었다.Microbial cellulose was prepared in the same manner as in Example 3 except that the stirring speed was adjusted to 350 times per minute. As a result, 6 g of microbial cellulose was obtained per liter of medium.

[실시예 6]Example 6

[본 발명의 배지 조성물을 이용하는 교반배양에 의한 미생물 셀룰로오스의 제조(IV)][Production of microbial cellulose by stirring culture using the medium composition of the present invention (IV)]

교반배양에 의해 미생물 셀룰로오스를 제조하기 위하여, 실시예 2에서 수득한 미생물 셀룰로오스와 종균제 혼합물 3.75ml를 본 발명의 배지 75ml에 접종하고, 그 배양용액을 배양용기 총용량의 30%(v/v)에 해당하는 양으로 250ml 플라스크 용기에 첨가한 다음, 분당 250회로 교반하면서 30℃의 온도에서 6일간 배양하였다. 그 결과, 배지 1리터당 9g의 미생물 셀룰로오스를 얻었다.In order to prepare microbial cellulose by stirring culture, 3.75ml of the microbial cellulose and seed mixture obtained in Example 2 was inoculated into 75ml of the medium of the present invention, and the culture solution was 30% (v / v) of the total volume of the culture vessel. It was added to the 250ml flask container in the amount corresponding to, and then incubated for 6 days at a temperature of 30 ℃ with stirring 250 times per minute. As a result, 9 g of microbial cellulose was obtained per liter of medium.

[실시예 7]Example 7

[본 발명의 배지 조성물을 이용하는 교반배양에 의한 미생물 셀룰로오스의 제조(V)][Production (V) of microbial cellulose by stirring culture using the medium composition of the present invention]

교반배양에 의해 미생물 셀룰로오스를 제조하기 위하여, 실시예 2에서 수득한 미생물 셀룰로오스와 종균제 혼합물 5ml를 본 발명의 배지 100ml에 접종하고, 그 배양 용액을 배양용기 총용량의 40%(v/v)에 해당하는 양으로 250ml 플라스크 용기에 첨가한 다음, 분당 250회로 교반하면서 30℃의 온도에서 6일간 배양하였다. 그 결과, 배지 1 리터당 4g의 미생물 셀룰로오스를 얻었다.In order to prepare microbial cellulose by stirring culture, 5 ml of the microbial cellulose and spawn agent mixture obtained in Example 2 were inoculated into 100 ml of the medium of the present invention, and the culture solution was added to 40% (v / v) of the total volume of the culture vessel. Corresponding amounts were added to a 250 ml flask vessel and then incubated for 6 days at a temperature of 30 ° C. while stirring 250 times per minute. As a result, 4 g of microbial cellulose were obtained per liter of medium.

[비교예][Comparative Example]

[종래의 배지 조성물을 이용하는 정치배양에 의한 미생물 셀룰로오스의 제조][Production of Microbial Cellulose by Static Culture Using Conventional Media Composition]

종래의 배지를 이용하는 정치배양에 의해 미생물 셀룰로오스를 제조하기 위하여, 정제수 1리터당 펩톤 20g, 효모추출물 5g, 포도당 5g, 에탄올 2ml 및 황산마그네슘 1g을 포함하는 멸균배지(참조: Masaoka et al., J. Fermen. Bioeng., 75:18-22(1993))에 아세토박터 자일러넘(Acetobacter xylinum, ATCC 23769) 균주를 접종하고, 30℃의 온도에서 6일간 정치배양하여 종균제 혼합물을 제조하였다. 그 결과, 배지 1리터당 0.25g의 미생물 셀룰로오스를 얻었다.In order to prepare microbial cellulose by static culture using a conventional medium, a sterile medium containing 20 g of peptone per liter of purified water, 5 g of yeast extract, 5 g of glucose, 2 ml of ethanol and 1 g of magnesium sulfate (see Masaoka et al., J. Fermen. Bioeng., 75: 18-22 (1993)) was inoculated with acetobacter xylinum (ATCC 23769) strain, and cultured at room temperature for 6 days at 30 ° C. to prepare a seed mixture. As a result, 0.25 g of microbial cellulose was obtained per liter of medium.

[실시예 8]Example 8

[균주의 미생물 셀룰로오스 생산능 판정][Determination of Microbial Cellulose Production Capacity of Strains]

상기한 실시예 2 내지 7에서 6일간 배양된 균주가 미생물 셀룰로오스의 생산능력을 갖고 있는지 알아보기 위하여, 하기와 같은 방법을 사용하였다. 정제수 1리터당 펩톤 10g, 효모추출물 20g, 포도당 20g, 구연산 5g, 에탄올 10ml, 인산수소나트륨 1.56g, 인산2수소칼륨 1.8g, 황산마그네슘 0.05g, 염화철 0.002g, 한천 15g 및 형광발색제인 캘코플리워 100mg을 포함하는 멸균 한천평판 배지에, 실시예 2 내지 7에서 6일 동안 배양된 배양상등액 각 1ml를 분산도말하여, 30℃의 온도에서 4일간 배양하였다. 4일 경과후, 평판에 형성된 균의 군락을 장파장 자외선으로 조사한 다음, 형광발색하는 미생물 셀룰로오스 생산균주와 형광발색하지 않는 미생물 셀룰로오스 비생산균주를 구분하였다.In order to find out whether the strains cultured for 6 days in Examples 2 to 7 have a production capacity of microbial cellulose, the following method was used. 10 g of peptone per liter of purified water, 20 g of yeast extract, 20 g of glucose, 5 g of citric acid, 10 ml of ethanol, 1.56 g of sodium hydrogen phosphate, 1.8 g of potassium dihydrogen phosphate, 0.05 g of magnesium sulfate, 0.002 g of iron chloride, 15 g of agar and calcofleur In sterile agar plate medium containing 100mg, each 1ml of the culture supernatant cultured for 6 days in Examples 2 to 7 was dispersed and spread, and incubated at 30 ° C. for 4 days. After 4 days, the colonies of microorganisms formed on the plate were irradiated with long-wavelength ultraviolet rays, and the microbial cellulose-producing strains which fluoresced were distinguished from the non-microbial cellulose-producing strains which did not fluoresce.

그 결과, 실시예 2 내지 5의 경우에는 한천평판위에 생성된 균주 군락의 99% 이상이 형광을 발색하는 생산균주로 나타났고, 실시예 6의 경우에는 균주 군락의 50% 이상이 생산균주로 나타났으며, 실시예 7의 경우에는 균주 군락의 10% 미만이 생산균주로 나타났다. 따라서, 본 발명의 교반조건은 미생물 셀룰로오스 생산균주가 비생산균주로 전이되는 유전적 변화를 적게 유발시켜, 균주가 미생물 셀룰로오스 생산능을 유지할 수 있도록 함을 알 수 있었다.As a result, in Examples 2 to 5, more than 99% of the strains generated on the agar plate were produced as fluorescence-producing strains, and in Example 6, more than 50% of the strains were as production strains. In the case of Example 7, less than 10% of the population of strains were produced strains. Therefore, it was found that the stirring condition of the present invention causes less genetic change of the microbial cellulose producing strain to be transferred to the non-producing strain, so that the strain can maintain the microbial cellulose producing ability.

이상의 실시예 및 비교예를 통하여, 본 발명의 배지는 종래 배지보다 미생물 셀룰로오스의 생산성이 높으며(실시예 2 및 비교예 비교), 또한 본 발명의 배지에서 아세토박터 자일러넘을 정치배양하거나, 본 발명에서 선정된 교반조건하에서 교반배양함으로써, 미생물 셀룰로오스의 생산량을 매우 증진시킬 수 있음을 알 수 있었다.Through the above examples and comparative examples, the medium of the present invention has a higher productivity of the microbial cellulose than the conventional medium (compare Example 2 and Comparative Example), and also cultures acetobacter xylanum in the medium of the present invention, or the present invention. By stirring the culture under the agitation conditions selected in, it was found that the production of microbial cellulose can be greatly improved.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 미생물 셀룰로오스 생산용 배지 및 배양방법을 이용하면, 미생물 셀룰로오스의 생산성을 획기적으로 향상시킬 수 있고, 이렇게 제조된 미생물 셀룰로오스는 식물 섬유가 결핍된 식사 또는 적은 식사를 하는 현대인에게서 유발되는 장질환인 변비, 맹장염과 대장암 등이나, 대사성 질환인 비만과 당뇨병 등에 예방 효과가 있어 건강 식품 및 의료용으로 이용될 뿐만 아니라, 산업용 소재로도 유용하게 사용될 수 있다.As described and demonstrated in detail above, by using the medium and culture method for producing microbial cellulose of the present invention, the productivity of microbial cellulose can be dramatically improved, and the microbial cellulose thus prepared is a meal or a small meal that lacks plant fiber. To prevent constipation, appendicitis and colorectal cancer, and other metabolic diseases such as obesity and diabetes, which are caused by modern people to be used as a health food and medical, as well as industrial materials can be useful.

Claims (6)

정제수 1리터당 펩톤 5 내지 20g, 효모추출물 5 내지 20g, 포도당 5 내지 20g, 구연산 1 내지 10g, 에탄올 2 내지 20ml, 인산수소나트륨 1 내지 5g, 인산2수소칼륨 1 내지 5g, 황산마그네슘 0.01 내지 0.1g 및 염화철 0.001 내지 0.01g을 포함하는 미생물 셀룰로오스 생산용 액체배지.5 to 20 g of peptone per liter of purified water, 5 to 20 g of yeast extract, 5 to 20 g of glucose, 1 to 10 g of citric acid, 2 to 20 ml of ethanol, 1 to 5 g of sodium hydrogen phosphate, 1 to 5 g of potassium dihydrogen phosphate, 0.01 to 0.1 g of magnesium sulfate And 0.001 to 0.01 g of iron chloride. 정제수 1리터당 펩톤 5 내지 20g, 효모추출물 5 내지 20g, 포도당 5 내지 20g, 구연산 1 내지 10g, 에탄올 2 내지 20ml, 인산수소나트륨 1 내지 5g, 인산2수소칼륨 1 내지 5g, 황산마그네슘 0.01 내지 0.1g 및 염화철 0.001 내지 0.01g을 포함하는 멸균 액체배지에, 미생물 셀룰로오스 생산균주의 배양액을 2% 내지 10%(v/v)로 접종하고, 그 배양용액을 배양용기 총용량의 10% 내지 40%(v/v)에 해당하는 양으로 배양용기에 첨가한 다음, 25℃ 내지 35℃의 온도에서 3일 내지 8일간 정치배양하거나 분당 100회 내지 350회로 교반배양하는 공정을 포함하는 미생물 셀룰로오스의 제조방법.5 to 20 g of peptone per liter of purified water, 5 to 20 g of yeast extract, 5 to 20 g of glucose, 1 to 10 g of citric acid, 2 to 20 ml of ethanol, 1 to 5 g of sodium hydrogen phosphate, 1 to 5 g of potassium dihydrogen phosphate, 0.01 to 0.1 g of magnesium sulfate And inoculated in a sterile liquid medium containing 0.001 to 0.01 g of iron chloride at 2% to 10% (v / v) of the culture solution of the microbial cellulose producing strain, and the culture solution is 10% to 40% (v) of the total volume of the culture vessel. / v) is added to the culture vessel in an amount corresponding to, the method for producing microbial cellulose comprising the step of static culture or stirred culture at 100 to 350 times per minute for 3 to 8 days at a temperature of 25 ℃ to 35 ℃. 제2항에 있어서, 미생물 셀룰로오스 생산균주는 아세토박터 자일러넘(Acetobacter xylinum)을 포함하는 초산생성균에서 선택되는 하나 이상의 균주인 것을 특징으로 하는 미생물 셀룰로오스의 제조방법.The method for producing microbial cellulose according to claim 2, wherein the microbial cellulose producing strain is at least one strain selected from acetogenic bacteria including Acetobacter xylinum. 제2항에 있어서, 액체배지는 정제수 1리터당 펩톤 5 내지 10g, 효모추출물 10 내지 20g, 포도당 10 내지 20g, 구연산 5 내지 7g, 에탄올 5 내지 10ml, 인산수소나트륨 1.56g, 인산2수소칼륨 1.8g, 황산 마그네슘 0.05g 및 염화철 0.002g을 포함하는 배지인 것을 특징으로 하는 미생물 셀룰로오스의 제조방법.The liquid medium according to claim 2, wherein the liquid medium is 5 to 10 g of peptone per liter of purified water, 10 to 20 g of yeast extract, 10 to 20 g of glucose, 5 to 7 g of citric acid, 5 to 10 ml of ethanol, 1.56 g of sodium hydrogen phosphate, and 1.8 g of potassium dihydrogen phosphate. And 0.05 g of magnesium sulfate and 0.002 g of iron chloride. 제2항에 있어서, 액체배지 및 미생물 셀룰로오스 생산균주의 배양액으로 구성된 배양용액을 배양용기 총용량의 20% 내지 25%(v/v)에 해당하는 양으로 배양용기에 첨가한 다음, 28℃ 내지 32℃의 온도에서 4일 내지 6일간 배양하는 것을 특징으로 하는 미생물 셀룰로오스의 제조방법.According to claim 2, wherein the culture solution consisting of the culture medium of the liquid medium and microbial cellulose production strain is added to the culture vessel in an amount corresponding to 20% to 25% (v / v) of the total volume of the culture vessel, and then 28 ℃ to 32 Method for producing microbial cellulose, which is incubated at a temperature of 4 days to 6 days. 제2항에 있어서, 교반속도는 분당 200회 내지 300회인 것을 특징으로 하는 미생물 셀룰로오스의 제조방법.The method of claim 2, wherein the stirring speed is a method for producing microbial cellulose, characterized in that 200 to 300 times per minute.
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