KR100187883B1 - 슈도모나스속균주sy5(pseudomonassp.strainsy5) - Google Patents

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Abstract

본 발명은 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)에 관한 것으로서, 더욱 상세하기로는 하수처리장의 활성오니로부터 분리된 신균주로 PCB(polychlorinated biphenyl) 분해능이 우수하여 하수처리에 유용한 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)에 관한 것이다.

Description

슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonas sp. strain SY5)
본 발명은 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)에 관한 것으로서, 더욱 상세하기로는 하수처리장의 활성오니로부터 분리된 신균주로 PCB(polychlorinated biphenyl) 분해능이 우수하여 하수처리에 유용한 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)에 관한 것이다.
PCB(polychlorinated biphenyl)는 벤젠고리 두개가 결합된 바이페닐(biphenyl)에 염소원자가 1 ~ 10개 치환되어 있는 화합물로서, 종래에는 PCB를 열매체, 절연유, 기체유 등에 대량으로 사용하였다. PCB는 사용후 하수처리장에 그대로 유입되어 환경파괴 및 생태계의 변화를 야기시키게 되는데 이러한 PCB를 별다른 대책없이 사용하여 오다가 유전정보를 가지고 있는 DNA에 상처를 주는 유전독물이라는 사실이 밝혀진 후로 그 생산과 사용이 중단되었다. 그러나 세계적으로 이미 100만톤의 PCB가 자연계로 방출되었고 폐기처분할 양도 200만톤에 이르고 있으며, 우리나라에도 현재 처리할 PCB가 다량 있는 것으로 알려져 있는 바, 이들의 효율적 분해방법이 절실히 요구되고 있다. PCB를 소각법에 의해 처리하면 디옥신(dioxine), 디벤조퓨란(dibenzofuran) 등의 이차 오염물질이 유발되므로 이의 소각처리는 법적으로 금지되어 있다.
1992년 미국 캘리포니아 대학의 프랑크는 PCB를 효율적으로 분해하는 방법으로서 2차 유독성분을 부생시키는 물리·화학적인 분해방법 보다는 미생물에 의한 분해방법이 안전하다는 연구 결과를 보고한 바 있다. 이로써 PCB를 미생물에 의해 효율적으로 분해하는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 그러나, 고농도의 PCB에 견딜 수 있는 우량 미생물의 결핍 그리고 분해효소의 생성능 저하로 인하여 이를 산업적으로 접근하기에는 많은 어려움이 있었다.
현재까지 알려진 바로는 코린박테리움속 MB1(Corynebacteriumsp.MB1), 알칼리게네스 유트로퍼스 H850(Alcaligenes EutrophusH850) 균주가 PCB분해능이 우수한 것으로 알려져 있으나, 이들 균주는 일반적으로 염소의 치환수가 많은 PCB에 대한 분해능력이 낮고, 아주 한정된 구조의 PCB를 분해할 뿐이다.
환경오염에서 문제가 되는 PCB는 대부분이 다양한 구조를 이루는 염소치환체가 치환되어 있는 경우이다. 따라서, 종래의 PCB 분해균은 환경정화용으로 적용하기에는 적합하지 않다.
본 발명의 발명자들은 PCB분해능이 우수하면서도 고농도의 PCB에 견딜 수 있는 우량 미생물을 분리 동정하고자 노력하였다. 그 결과 하수종말처리장에서 채취한 시료를 적정조건하에서 배양하고, 배양된 미생물로부터 염소치환수가 많은 PCB 또는 이의 유도체에 대한 분해능력을 가진 미생물을 선정하므로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 PCB분해능이 우수하여 하수처리에 유용한 신균주 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)를 제공하는데 그 목적이 있다.
도1은 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)의 전자현미경사진이ek.
도2는 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. Strain SY5)의 PCB 분해 활성을 보여주는 가스크로마토그램으로서,
a)는 미생물이 접종되지 않은 표준시료의 가스크로마토그램이고,
b)는 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. Strain SY5)에 의한 PCB 분해정도를 나타낸 가스크로마토그램이다.
본 발명은 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)을 그 특징으로 한다.
이와같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 PCB분해능이 우수한 신균주 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)에 관한 것으로서, 이 균주의 분리, 동정은 다음과 같다.
- 신균주의 분리 -
하수종말 처리장으로부터 시료를 채취하여 무기배지 10 ㎖가 들어있는 시험관에 100 ㎍ 정도 넣은 후 30 ℃에서 1주일 동안 액체상태로 진탕 배양한다. 이때 탄소원으로는 PCB, 또는 바이페닐과 같이 PCB를 기본 골격으로 하는 PCB유도체를 농도 1%로 사용한다. 1주일 후 균이 자란 시험관을 선별해서 동일배지가 들어있는 시험관에 1% 접종한 후 다시 1주일간 배양한다. 이것을 두번 반복한 후 유기 고체배지에 도말하여 30 ~ 37 ℃에서 3일간 고체상태로 정치 배양한 다음, 생성된 콜로니 위에 2,3-디히드록시바이페닐(2,3-dihydroxybiphenyl)을 포함하는 아세톤 용액을 분무하여 PCB 분해 미생물을 선정한다.
- 신균주의 동정 -
상기에서 분리된 균주를 동정(Bergey's Manual of systematic Bacteriology 9ed.)하였다. 그리고, 동정을 위하여 시험된 항목과 그 결과는 다음 표 1에 나타내었다.
상기 표 1의 결과에 따라 본 발명에서 분리해낸 균주는 슈도모나스속(Pseudomonassp.)에 속하는 것으로 판명된다. 이 균주는 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)로 명명한다.
슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)는 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자원센타에 1996년 10월 9일자로 수탁하였고, 기탁번호 KCTC 8764P를 부여받았다.
이와같은 본 발명을 다음의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다
실시예 1 : 슈도모나스속 균주 SY5의 배양
슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)는 액체배양 및 고체배양이 가능하다.
1) LB배지에서의 액체배양
LB 액체배지(트립톤 10g, 이스트 추출물 5g, NaCl 10g, 이온교환수 1000㎖) 8㎖를 만들어 멸균하여 식힌 다음, 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)를 접종한 후 30 ~ 37℃ 및 150 rpm의 진탕 배양기에서 하룻동안 진탕배양하였다.
2) C-배지에서의 액체배양
C-배지((NH4)2SO45g, K2HPO42g, KH2PO41g, MgSO4·7H2O 0.2g, CaCl210㎎, FeSO4·7H2O 10㎎, NaCl 2g, 이스트 추출물 0.2g, 미량원소용액 2㎖, 이온교환수 1000㎖, pH 7.0; 미량원소용액: MoO31.0㎎, ZnSO4·7H2O 7.0㎎, CuSO4·5H2O 0.5㎎, H3BO31.0㎎, MnSO4·5H2O 1.0㎎, CoCl2·6H2O 1.0㎎, NiSO4·7H2O 1.0㎎, 이온교환수 1000㎖)를 조제하여 시험관 8㎖에 분주하여 멸균시킨 다음 식혀서 바이페닐 또는 p-클로로바이페닐 0.1% 넣고 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)을 접종한 후, 30 ~ 37℃ 및 150 rpm의 진탕 배양기에서 하룻동안 진탕배양하였다.
3) LB 플레이트에서의 고체배양
LB 아가 플레이트(트립톤 10g, 이스트 추출물 5g, NaCl 10g, 아가 15g, 이온교환수 1000㎖)를 조제하여 멸균시킨 다음, 플레이트화하여 식힌 후 플레이트 표면에 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)을 도말하고 30 ~ 37℃ 배양기에서 정치 배양하였다.
실시예 2: 자화능력 시험
탄소원으로서 PCB 대신에 여러 가지 방향족 화합물을 사용하여 본 발명의 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)의 자화능력을 시험하였다.
자화능력을 시험하기 위해 다음 표 2에 나타낸 탄소원을 0.1％ 함유한 C-배지에 본 발명의 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)를 배양하여 본 균주의 자화능력을 조사했다. 즉 본 균주를 각 탄소원을 함유한 배지에 3일간 배양을 하여 흡광도(파장 600㎚)를 측정하고, 배지의 탁도를 지표로 해서 균의 생육상태를 비교하였다. 그 결과는 다음 표 2에 나타내었다.
상기 표 2의 결과에 의하면, 사용한 방향족화합물에 대하여 전부 분해능력을 보였다. PCB가 분해되어갈 때 벤젠환이 개열되고 난 후, 클로로벤젠산을 생성하고 종래의 PCB분해균 대부분은 이들 클로로벤젠산을 분해하지 못하였다. 그러나 본 발명의 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)는 3-클로로벤조산과 4-클로로벤조산을 분해할 수 있다. 따라서 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)는 PCB 완전분해처리에 유용한 균주이다.
실시예 3: 메타 계열 효소에 대한 기질 특이성 시험
슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)을 LB-배지(트립톤 10g, 이스트 추출물 5g, NaCl 10g, 이온교환수 1000㎖) 8㎖에 1일동안 배양한 다. 배양액 1㎖를 이펜돌프 튜브(eppendorf tube)에 담고 7000 rpm에서 5분동안 원심분리한 다음, 상등액을 버리고 생리식염수를 넣고 현탁한다. 7000 rpm에서 5분동안 다시 원심분리한 다음, 상등액을 버리고 생리식염수를 넣고 현탁한다. 그리고 카테콜, 3-메틸카테콜, 4-메틸카테콜, 2,3-디하이드록시 바이페닐 각각이 아세톤에 녹아있는 1M 아세톤 용액에 상기 현탁액 10㎕을 첨가하고 혼합한 후에 실온에서 3분동안 방치하고 용액의 색상 변화를 관찰한다. 용액의 색상이 노랗게 변하면, 이는 각각의 기질의 벤젠고리가 메타(meta)쪽으로 개환(meta ring cleavage)됨을 나타낸다. 그 결과는 다음 표 3에 나타내었다.
상기 표 3의 결과에 의하면, 본 균주의 메타 환개열 효소는 2,3-디하이드록시바이페닐외 나머지 3개의 기질에 대해서도 강한 효소반응을 나타내었다. 따라서, 본 균주의 PCB분해에 관여하는 중심효소인 메타 환개열효소는 기질특이성이 다양함을 알 수 있다.
실시예 4: PCB분해 활성율 비교
기존의 공지된 균주(Alcaligenes EutrophusH850)과 PCB 분해 활성을 비교하기 위하여 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5 )를 pH 7의 인산 완충용액으로 현탁시켜 유기배지에 넣고 30 ~ 37℃ 에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 배양후 20mM 2,3-디하이드록시바이페닐을 포함하는 아세톤용액을 10㎕를 넣었더니 용액의 색상은 노란색으로 변하였는 바, 이로써 PCB분해 균주가 살아있는 겄을 알 수 있었다. 이 균주를 50㎖ 무기배지에 넣고 PCB 시료(Aroclor 1242) 10ppm을 주입하여 2일동안 배양한 후에 PCB 분해율을 측정하였다.
PCB(Aroclor 1242)에 대한 PCB 분해 미생물중 슈도모나스속 균주SY5(Pseudomonassp. strain SY5)의 분해활성을 기체크로마토(GC/ECD)로 분석한 결과는 첨부한 도2에 나타내었는 바, 기존의 공지된 균주인 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes EutrophusH850; Applied and Environmental Microbiology, Volume 53, 1094 ~ 1102, 1987)와 비교하여 우수한 분해능력을 보여주고 있음을 알 수 있다.
그리고, PCB(Aroclor 1242)에 함유되어 있는 여러가지 화합물에 대한 정량분석 결과는 다음 표 4a, 4b 및 4c에 나타내었다.
따라서, 본 발명에 따른 신규 균주인 슈도모나스속 균주(Pseudomonassp. strain SY5)는 PCB분해능이 우수하므로 PCB분해용 미생물로서 매우 유용하다.

Claims (2)

  1. 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5).
  2. 슈도모나스속 균주 SY5(Pseudomonassp. strain SY5)를 이용하여 PCB(polychlorinated biphenyl)가 함유된 하수를 처리하는 방법.
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