KR0180989B1 - 신규한 세포주기인자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 분열효모에서 분리한 세포 주기 G1기에서 S기로의 진행을 조절하는 새로운 세포주기인자 CGS1, 그의 아미노산 서열, 그의 유전자 cgs1, 그의 염기서열, 이 유전자를 포함하는 플라스미드 pCGS1와 발현 플라스미드 pnmt-cgsl 및 이들을 이용하여 세포주기인자 CGS1을 제조하는 방법, 그리고 그 세포주기인자의 유전자 cgs1상에 이상이 있는 돌연변이 분열효모 CYJ192 균주에 관한 것으로, 본 발명의 세포주기인자가 과다하게 발현되는 경우 세포 주기의 진행이 억제되는 기능과 관련하여 본 발명의 세포주기인자를 항암제로 사용하고 본 세포주기인자의 유전자에 이상이 있는 돌연변이 CYJ92 균주를 세포 성장을 억제하는 물질을 탐색하는데 이용하고자 하는 것이다.

Description

신규한 세포주기인자

본 발명은 세포 주기의 조절에 관여하는 새로운 세포주기인자 CGS1, 그의 아미노산 서열 그의 유전자 cgs1 그의 염기서열 세포주기인자의 제조방법 및 이의 항암제로의 용도, 그리고 돌연변이 분열효모(schizosaccharomyces pombe) CYJ92 균주및 이 균주를 세포 성장을 억제하는 물질을 탐색하는데 사용하는 용도에 관한 것이다.

더욱 상세하게는 본 발명은 분열효모에서 분리한 세포 주기 G1기에서 S기로의 진행을 조절하는 새로운 세포주기인자 CGS1, 그의 아미노산 서열, 그의 유전자 cgs1, 그의 염기서열, 이 유전자를 포함하는 플라스미드 pCGS1와 발현 플라스미드 pnmt-cgs1 및 이들을 이용하여 세포주기인자 CGS1을 제조하는 방법 그리고 그 세포주기인자의 유전자 cgs1상에 이상이 있는 돌연변이 분열효모 CYJ192균주에 관한 것으로 본 발명의 세포주기인자가 과다하게 발현되는 경우 세포주기의 진행이 억제되는 기능과 관련하여 본 발명의 세포주기인자를 항암제로 사용하고 본 세포주기인자의 유전자에 이상이 있는 돌연변이 CYJ92균주를 세포성장을 억제하는 물질을 탐색하는데 이용하고자 하는 것이다.

인류가 정복해야 할 중요한 질병 중의 하나인 암은 세포 분화상의 결함으로 인하여 세포가 이상적으로 증식을 계속하므로 그 주변의 세포를 파괴하는 특성을 갖는다. 이러한 암은 세포의 성장 및 분화를 조절하는 신호전달체계 (signal transduction pathway)에 관여하는 여러 인자들의 유전적 변이로 발생한다고 알려져 있다.

진핵 세포는 외부에서 세포 성장에 대한 신호를 받으면 신호 전달체계를 통하여 세포 주기에 따라 증식하게 된다. 진핵 세포는 DNA합성(synthesis phase ; S기 라고 함)과 세포 분열 (mitosis phase ; M기 라고 함)의 과정을 주기적으로 거치면서 증식하는데, S기와 M기 사이에는 G1기와 G2기가 있으므로 세포는 G1기 → S기 → G2기 → M기의 주기를 차례로 돌면서 분열한다.

세포 분열이 완결된 후에 세포는 다시 G1기로 들어가는데 이G1기는 세포내 대사가 가장 활발한 시기로 대부분의 세포는 많은 시간을 G1기의 상태로 존재한다. G1기에서 세포는 디플로이드(diploid) 즉 2N상태이고, S기에서 DNA복제가 일어나 2N이 4N(tetraploid) 으로 되며, G2기를 거쳐 짧은 M기 동안 4N이 2N으로 분열하고 다시 G1으로 돌아가게 된다.

정상세포는 G1기에서 외부 신호가 있으면 S기로 진입하여 G2를 거쳐 세포 분열을 일으켜 증식하고, 외부 신호가 없으면 세포 주기의 진행이 중단되어 G1기에서 멈추어진 G0기로 존재한다. 반면, 암세포는 외부 신호와 상관없이 세포 주기를 따라 DNA합성과 세포 분열을 계속하면서 증식한다.

이와 같이 세포 주기가 진행되기 위해서는 각 기마다 세포 주기인자들이 세포내에 존재하여 정확하게 세포 주기가 수행되도록 하여야 한다. 따라서 세포 주기의 진행 과정에서 이들 세포주기인자들의 기능이 저해되면 세포가 비정상적으로 성장하게 되어 암세포로 형질전환 된다.

지금까지 비정상적인 암세포로의 전환에 원인이 되는 세포주기인자로는 사이클린(cyclin)이 밝혀져 있다. 이외에도 세포 주기의 진행에 관여하거나 이를 조절하는 인자들이 세포 내에 많이 존재할 것으로 사료되지만 아직까지 소수의 관련 인자들만이 보고 되어 있다. 이러한 세포주기인자는 모든 진핵세포에 공동으로 존재하고 있고 그 기능은 각 세포간에 상호 교환될 수 있는 특징을 가지므로 새로운 세포주기인자 및 그의 유전자 서열을 밟힘에 의하여 암의 발생, 암세포로의 형질전환 및 암세포의 성장과 관련된 기작을 이해하여 새로운 항암제를 개발할 수 있다.

이에 본 발명자들은 암의 치료와 관련하여 세포의 성장을 조절할 수 있는 새로운 세포주기인자를 발견하기 위하여, 분열효모(Schizosaccharomyces pombe)를 이용하여 세포주기인자에 돌연변이가 유발된 균주를 선별하고, 이를 이용하여 세포주기의 진행에 관여하는 새로운 세포주기인자 및 그의 유전자를 찾아 그의 아미노산 서열과 염기서열 등을 밟혔다. 또한 본 발명의 유전자가 과다하게 발현되는 경우 오히려 세포의 성장을 억제하는 것을 발견하고 본 발명의 세포주기인자가 항암제로 이용될 수 있음을 확인하고, 이들 세포주기인자와 이 세포주기인자에 이상이 있는 돌연변이 균주를 이용하여 세포 성장을 억제하는 물질을 탐색할 수 있음을 발견하였다.

본 발명은 세포 주기의 진행과 관련있는 새로운 세포주기인자 CGS1을제공함에 그 목적이 있다. 본 발명은 분열효모(schizosaccharomyces pombe)에서 세포 주기 G1기에서 S기로 진행하는 과정에 관여하는 새로운 세포주기인자 CGS1을 제공한다.

또한 본 발명은 세포 주기의 진행과 관련있는 새로운 세포주기인자CGS1의 아미노산 서열을 제공함에 그 목적이 있다. 본 발명의 세포주기인자 CGS1은 서열번호1의 아미노산 서열을 갖는다. (서열표 1 참조)

또한 본 발명은 세포 주기의 진행과 관련있는 새로운 세포주기인자의 유전자 cgs1을 제공함에 그 목적이 있다. 본 발명은 분열효모 (schizosaccharomyces pombe)로부터 분리한 세포 주기 G1기에서 S기로 진행하는 과정에 관여하는 새로운 세포주기인자의 유전자 cgs1을 제공한다. 본 발명의 세포주인인자 유전자 cgs1에는 이의 게놈 유전자 및 2가지의 cDNA유전자를 포함한다.

또한 본 발명은 세포주기인자의 유전자 cgs1의 염기서열을 제공함에 그 목적이 있다.

본 발명의 세포주기인자 유전자 cgs1은 서열번호 2의 게놈 유전자의 염기서열(서열표 2 참조)을 갖는다. 또한 본 발명의 세포주기인자 유전자는 서열번호 3과 서열번호 4의 cDNA의 염기서열을 갖는다. (서열표 3 및 서열표 4 참조). 본 발명의 cgs1 게놈 유전자의 5′쪽에는 인트론이 존재하고 이 인트론의 조합에 의해 2가지 종류의 cDNA가 만들어진다.

구체적으로 본 발명은 8.5kb의 분열효모의 세포주기인자 유전자를 포함하는 플라스미드를 제공한다. 본 발명의 플라스미드를 pCGS1로 명명하고 이 플라스미드를 대장균에 형질전환하여 그 형질전환체(Escherichia coli DH5α/pCSG1)를 1996년 5월 6일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다. (수탁번호 : KCTC 0245 BP).

또한 본 발명은 cgs1 유전자로부터 세포주기인자를 생산하는 발현 플라스미드를 제공함에 그 목적이 있다. 본 발명에서는 분열효모에서 세포주기인자 CGS1을 생산할 수 있는 발현 플라스미드 pnmt1-CGS1을 제공하는데, 본 발현 플라스미드의 cgs1 유전자는 티아민(thiamine)에 의해 발현이 조절된다.

또한 본 발명은 새로운 세포주기인자 CGS1의 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다. 본 발명의 발현 플라스미드를 숙주 세포에 형질전환시키고 이 숙주 세포를 배양하여 세포 주기인자를 제조할 수 있다.

또한 본 발명은 세포 주기의 진행에 이상이 있는 돌연변이 분열효모(Schizosaccharomyces pombe) 균주를 제공함에 그 목적이 있다. 본 발명의 균주를 스키조사카로마이세스 폼베 CYJ92 (Schizosaccharomyces pombe CYJ92)로 명명하고, 이를 1996년 5월 6일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다. (수탁번호 : KCTC 0246 BP).

또한 본발명은 새로운 세포주기인자 CGS1를 항암제로 사용하는 용도를 제공함에 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 새로운 세포주기인자의 유전자에 이상이 있는 돌연변이 분열효모 균주 CYJ92를 세포 성장을 억제하는 물질을 탐색하는데 사용하는 용도를 제공함에 그 목적이 있다.

제1도는 세포 주기의 진행에 이상이 있는 새로운 분열효모(Schizosaccharomyces pombe) 돌연변이 균주를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

A : 23℃에서의 세포모양

B : 37℃에서의 세포모양

제2도는 본 발명의 분열효모 돌연변이 균주의 DNA 함량을 프로사이토메트리로 측정하여 나타낸것이다.

A : 23℃의 복합배지에서 배양할 때의 DNA 함량

B : 23℃의 질소원이 거의 없는 배지에서 배양할 때의 DNA 함량

C : B 세포를 다시 37℃의 복합배지에서 4시간 동안 배양할 때의 DNA 함량

D : B 세포를 다시 37℃의 복합배지에서 8시간 동안 배양할 때의 DNA 함량

제3도는 본 발명의 분열효모 돌연변이 균주의 37℃에서의 세포 모양(A) 및 플라스미드 pCGS1를 포함한 CYJ92 균주의 37℃에서의 세포 모양(B)을 나타낸 것이다.

제4도는 분열효모 유전자 라이브러리에서 분리한 돌연변이 현상을 복원하는 유전자의 제한효소 지도 및 이 유전자의 최대 크기의 DNA (subclone)를 나타낸 것이다.

B : BamHI ; Pv : Pvu II ; H : Hind III

제5도는 본 발명의 CGS1 유전자를 포함하는 플라스미드 pCGS1의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

제6도는 본 발명의 cgs1 유전자가 세포 성장에 필수적인 유전자임을 유전자 기능 방해 방법(gene disruption) 으로 분석하기 위하여, cgs1 유전자 부위에 다른 유전자를 삽입하는 과정을 나타내는 것이다.

제7도는 본 발명의 cgs1 유전자가 세포 성장에 필수적인 유전자임을 확인하기 위하여 유전자 기능 방해 방법((gene disruption)으로 분석한 4포자 분석방법의 결과를 나타낸 것이다.

제8도는 본 발명의 cgs1 유전자가 효모내에서 발현하는 발현 플라스미드 pnmt1-cgs1의 제조과정을 나타낸 것이다.

제9도는 본 발명의 cgs1 유전자가 효모세포 내에서 과도하게 발현된 경우, 오히려 세포 성장을 억제하는 결과를 발현 풀라스미드 pnmt1-cgs1을 함유하는 야생형 균주 ED665의 성장곡선으로 나타낸 것이다.

□ : 티아민이 있는 배지 ; + : 티아민이 없는 배지

제10도는 본 발명의 cgs1 유전자가 효모세포 내에서 과도하게 발현된 경우, 오히려 세포 성장을 억제하는 결과를 프로사이토메트리에 의한 DNA 함량 분석으로 나타낸 것이다.

검은색 : 티아민이 없는 배지 ; 흰색 : 티아민이 있는 배지

A : 12시간 동안 세포를 배양할 때 ; B : 22시간 동안 세포를 배양할 때

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 세포 주기의 진행에 관여하는 새로운 세포주기인자를 찾기 위하여, 유전적인 분석 체계가 잘 밟혀져 있어 세포주기인자를 발견하는데 유용한 분열효모(Schizosaccharomyces pombe) 등의 균주를 이용할 수 있다. 기본적인 세포주기인자는 모든 진핵세포에 공통적으로 존재하고 있고 그 기능도 각 세포간에 상호 교환될 수 있으므로, 진핵세포중 세포 주기에 관한 연구가 비교적 용이한 분열효모 균주를 사용하는 것이 바람직하다.

우선 본 발명에서는 새로운 세포주기인자와 관련되어 세포 주기의 진행을 억제하는 돌연변이 분열효모(Schizosaccharomyces pombe) 균주를 분리하였다. 분열효모균주의 배양액에 에틸메탄설포네이트(Ethyl-methane sulfonate, EMS)등의 돌연변이원(mutagen)을 처리하여 분열효모에 돌연변이를 유발시킨 다음, 온도 민감성등을 나타내는 돌연변이 균주를 선별한다. 특히 본 발명에서는 23℃에서는 잘 자라나 37℃에서는 잘 자라지 못하는 돌연변이 균주를 선별한다. (Moleno, et al., Methods in Enzymology, vol. 194 : 795-823, 1991) (제1도 참조).

상기에서 선별한 돌연변이 균주들을 각 세포 주기의 이상에 따라 분리하기 위하여, 각 돌연변이 군주를 세포 모양, 핵 모양 및 DNA함량 등을 조사하여 선별한다. (제2도 참조). 그 결과, 각 세포 주기 G1기, S기, G2기 및 M기로의 진행이 특이하게 억제된 돌연변이 분열효모 균주를 분류할 수 있다.

본 발명의 돌연변이 균주 중에서 세포 주기 G1기에서 S기로 진행이 억제되는 균주를 선별하여, 이를 스키조사카로마이세스 폼베 CYJ92 (Schizosaccharomyces pombe CYJ 92)균주로 명명하고, 이를 1996년 5월 6일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다. (수탁번호 : KCTC 0246 BP).

본 발명의 돌연변이 분열효모 CYJ92 균주는 제한 온도인 37℃에서 세포의 모양이 정상보다 3-4배 이상 길며 세포 분열 및 성장이 멈추어진 양상을 보인다. (제3도 참조). 또한 본 균주의 DNA 함량을 프로사이토메트리로 분석하면 G1기에서 S기로 넘어가는 과정에 이상이 있어 G1기의 DNA함량을 가지고 세포 주기가 더 이상 진행되지 못하는 특징을 보여준다.

세포 주기의 진행에 필요한 새로운 세포주기인자의 유전자를 분리하기 위하여, 상기에서 분리한 돌연변이 분열효모 CYJ92 균주 (수탁번호 : KCTC 0246 BP)를 이용한다. 상기에서 분리한 돌연변이 균주를 분열효모 게놈 라이브러리(pWH5-S, pombe genomic library)로 형질전환시켜 세포 주기상의 돌연변이 형질을 나타내지 않는 균주를 선별함으로써 본 발명의 세포주기인자 유전자를 가진 클론을 분리할 수 있다.

본 발명의 세포주기인자 유전자를 포함한 클론의 DNA를 제한 효소를 이용하여 분석하고 이로부터 8.5kb의 분열효모 유전자를 얻어 이를 cgs1으로 명명한다. 본 발명의 cgsl 유전자는 서열번호 2의 DNA 염기서열을 가지고 약 2.8kb의 BamHI-BamHI 조각을 포함한다. (서열표 2 및 제4도 참조). 또한 본 발명의 cgsl 유전자는 408개의 아미노산을 만드는 염기 서열을 포함한다.

본 발명의 cgsl 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCGSl로 명명하고 이를 대장균에 형질전환시켜 그 형질전환체(Escherichia coli DHα/pCGSl)를 1996년 5월6일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다. (수탁번호 : KCTC 0245 BP)(제5도 참조)

본 발명의 cgsl 유전자를 분석하기 위한 cDNA를 분리하기 위하여, λ-ZAP-분열효모 cDNA 라이브러리를 등을 사용한다. 분리한 cDNA는 서열번호 3 및 서열번호 4 등의 염기서열을 가지고, 5′쪽을 제외하고는 분열효모 게놈 라이브러리로부터 얻은 염기서열과 동일하며 5′쪽의 염기서열 중 cDNA 에서 나타나지 않는 부분은 인트론으로 사료된다. (서열표 3 및 서열표 4 참조). 이 인트론의 조합에 의해 여러 가지 종류의 cDNA가 만들어질 수 있다.

본 발명의 세포주기인자 CGSl의 세포 내에서의 기능을 조사하기 위하여, 클론된 cgsl 유전자 부위에 다른 유전자를 삽입하는 유전자 차단방법 (gene disruption) 등을 이용하고 그의 세포 내에서의 영향을 조사한다(제6도 참조). 즉 cgs1 유전자는 대부분 없애고, 그 대신 ura4 유전자를 삽입한 클론 cgsl::ura4를 만들어 분열효모의 게놈상의 한 cgsl 유전자가 cgsl::ura4로 형질전환된 디플로이드(Diploid) 균주를 만든다. 한 cgsl 유전자는 정상이고 다른 한 cgsl 유전자는 cgsl::ura4로 치환된 디프로이드 균주는 감수분열 과정을 거치면서 4개의 포자가 형성되는데, 이를 4포자 분석방법(tetrad analysis)를 통하여 하플로이드(Haploid)균주의 생존 여부를 검토한다(제7도 참조).

그 결과, 야생형 cgsl 유전자가 있는 포자는 자라나 치환된 cgsl:: ura4 유전자가 든 포자는 자라지 못함을 알 수 있다.

따라서 본 발명의 세포주기인자 CGSl을 발현할 수 없으면 균주가 전혀 성장할 수 없고, 세포주기인자의 일부가 변형되었을 때는 세포 주기 Gl기에서 S기로 진행되는 과정이 억제되어 세포의 형태가 길어지는 필수 단백질임을 확인할 수 있다.

또한 본 발명의 세포주기인자가 세포에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 이를 세포내에서 다량으로 발현시킨다. 세포 내에 세포주기인자를 공급하기 위하여, 티아민 (thiamine)에 의해 발현이 조절되는 nmtl 프로모터에 본 발명의 cgsl 유전자를 연결한 발현 플라스미드 pnmtl-cgsl을 제조하고 이를 숙주세포에 형질전환시켜 그 형질전환체에서 본 발명의 세포주기인자를 발현시킨다(제8도 참조).

그 결과, 제9도 및 제10도에서 보는 바와 같이 본 발명의 세포주기인자가 세포내에 발현되면 세포의 성장속도가 현저하게 감소함을 알 수 있다. 특히 이러한 현상은 세포의 성장이 활발한 시기 (log phase cell) 에 두드러지고, 세포의 성장이 늦어 지는 휴지기 (stationery-phase cell) 에는 정상적인 성장 속도로 돌아온다. 따라서 본 세포주기인자가 세포 내에서 과도하게 존재하면 성장이 활발한 세포의 경우 그의 증식이 억제됨을 알 수 있다.

특히 본 발명의 세포주기인자 CGSl 단백질은 세포 성장이 활발히 일어나는 시기에 세포 성장에 대한 억제효과가 크므로 세포 증식이 활발한 암세포의 성장을 억제하는데 유용하게 이용될 수 있다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 분열효모 돌연변이 균주 CYJ92의 분리

세포 주기의 진행에 이상이 있는 돌연변이 균주를 분리하기 위하여, 분열효모(Schizosaccharomyces pombe) 균주를 사용하였다. 균주의 배양액에 돌연변이원 에틸메탄설포네이트 (Ethyl-mathane sulfonate, EMS)를 처리하여 돌연변이를 유발시킴으로 23℃에서는 잘 자라나 37℃에서는 잘 자라지 못하는 온도 민감성 돌연변이 균주를 선별하였다.

분열효모 균주 ED665h^-(ade6-M210, leul-32, ura4-D18)를 복합배지인 YEPD 배지(0.5% 이스트 엑스트렉트, 0.5% 펩톤, 30% 포도당)에서 세포 농도가 A₆₀₀= 1.0 -3.0이 되도록 배양하여 모은 다음 10 mM 인산칼륨 완충용액(potassium phosphate buffer, pH 7.0)에 현탁시켜 2-4 X 10⁸의 세포수가 되도록 조정하였다. 다음 돌연변이원 EMS를 가하여 30℃에서 30-40분간 반응시켰다. 그 후 세포를 모아 10 ml의 5% 티오황산나트륨(sodium thiosulfate)를 가하고 23℃에서 15분간 반응시켜 EMS 작용을 멈추게 하고 세포를 멸균수로 세척하였다. 세포를 다시 YEPD배지에 현탁시켜 희석한 다음 일정량을 YEPD-아가 고형배지에 도말하고 23℃에서 4-6일간 배양하여 세포들이 자라 콜로니를 형성하도록 하였다.

충분히 자란 콜로니들을 플록신 B (phloxin B)가 들어있는 두 개의 YEPD-아가 고형배지에 복제하여 23℃ 및 37℃에서 각각 2-3일간 배양한 다음 23℃에서는 연분홍색으로 잘 자라나 37℃에서는 잘 자라지 못하는 적색을 띠는 콜로니를 선택하여 온도 민감성을 나타내는 돌연변이 분열효모 균주를 선별하였다.

상기에서 선별한 돌연변이 균주의 세포 모양을 관찰하기 위하여, 37℃에서 자라지 못하는 콜로니를 YEPD액체 배지에서 23℃에서 배양하다가 37℃로 온도를 높여 9-12시간 배양한 후 광학현미경으로 세포 모양을 조사하여 이상이 있는 균주를 모두 선별하였다(제1도 참조). 또한 이들을 세포 모양이 야생형보다 길어진 것, 동그랗게 된 것, 크기가 작아진 것 등으로 분류한 다음, 이들 균주의 핵 모양을 DAPI (4′6′- diamidino-2-phenylindole) 염색을 통하여 관찰하고 핵의 모양에 따라서도 균주를 분류하였다. 또한 프로사이토메트리 (flow cytometry) 분석에 의하여 각 균주의 DNA함량을 조사하여 각 세포 주기 Gl기, S기, G2기 및 M기로의 진행이 특이하게 방해를 받고 있는 균주를 분류하였다(제2도 참조).

[실시예 2] G1기에서 S기로의 진행이 억제된 돌연변이 균주의 분리

세포 주기 G1에서 S기로의 진행에 이상이 있는 균주를 분리하기 위하여, 프로사이토메트리를 이용하여 실시예 1에서 선별한 각 균주의 DNA양을 측정하였다.

상기에서 선별한 균주들을 YEPD 복합배지로 23℃에서 A₆₀₀= 1.5의 세포 농도가 될 때까지 배양한 다음 10-20ml 배양액을 위하여 세포를 모으고, 멸균수로 세번 세척하였다. 이들 세포를 질소원이 아주 적게 포함된 (0.003% NH₄Cl) 최소배지 EMM(Edinberg Minimal Medium, 14.7mM 수소 프탈산 칼륨, 15.5mM Na₂HPO₄, 93.5mM NH₄CL, 2% 포도당, 염, 비타민, 미네랄) 10-20ml에 현탁시키고 23℃에서 24-36시간 동안 배양하여 G1기에서 모든 세포 주기가 멈추도록 하였다.

G1기에서 세포 주기의 진행이 멈추어진 세포들을 다시 모아 동량의 YEPD복합배지에 현탁시키고 온도를 높여 37℃에서 배양하였다. 이 때 본 세포를 2 시간 간격으로 일정량 취하여 핵내의 DNA를 프로피디움 아이오다이드 용액(propidium iodide 0.1mg/ml, 0.03% 트리톤 X-100, 0.1% 시트르산 나트륨)으로 염색하였다. 다시 이들 세포를 모아 3ml의 멸균수에 현탁시키고 에탄올 7ml을 가하여 잘 섞은 다음4℃에서 12-24시간 방치하였다. 다음 5ml의 50mM시트르산 나트륨(pH7.0)으로 상기 세포를 세척하고 다시 1ml의 동일 용액에 현탁시킨 후 RNA 분해효소(RNase A. 0.1mg/ml)을 가하고 37℃에서 2시간 배양하여 RNA를 제거하였다. 이를 프로피디움 아이오다이드 용액 1ml에 현탁시킨 후 FAScan기기를 (Becton Dickison사 제품) 이용하여 세포내 DNA함량을 측정하였다. FAScan 분석에 의하여 온도 민감성을 나타내는 돌연변이 균주 중에서 세포 주기가 각기 G1기, S기, G2기 또는 M기에서 멈추어진 돌연변이 형질을 나타내는 균주의 분리가 가능하였다.

본 과정을 통해 G1기에서 S기로 진행되는 과정이 억제된 돌연변이 형질을 나타내는 분열효모 균주 20개를 선별하고, 그 중 한 균주를 분리하여 스키조사카로마이세스 폼브CYJ92(Schizosaccharomyces pombe CYJ92) 라고 명명하고 , 1996년 5월6일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다. (수탁번호 : KCTC 0246 BP)

본 발명의 돌연변이 분열효모 CYJ92 균주는 제한 온도인 37℃에서는 세포의 형태가 정상인 세포 모양보다 3-4배 이상 길어진 형태로 나타나 세포의 분열 및 성장이 멈추어진 양상을 보였다(제3도 참조). 또한 프로사이토메트리 분석으로 37℃에 있을 때의 DNA양상을 조사해 본 결과 G1기에서 S기로 넘어가는 과정에 이상이 있어 세포 주기가 더 이상 진행되지 못하는 특징을 보여주었다.

[실시예 3] 분열효모 게놈 라이브러리에서 CGS1 유전자의 분리

세포 주기의 진행에 필요한 세포주기인자의 유전자를 분리하기 위하여, 실시예2에서 얻은 돌연변이 분열효모 CYJ92 균주를 이용하였다. 세포 주기 G1/S의 진행이 억제된 온도 민감성 돌연변이 CYJ92 균주를 23℃에서 배양한 다음, 분열효모 유전자 라이브러리 (pWH5-S, pmobe genomic library)로 형질전환하여 37℃에서 돌연변이 형질을 나타내지 않는 균주를 선별하고 이로부터 본 발명의 세포주기인자의 유전자를 분리하였다.

본 발명의 돌연변이 분열효모 CYJ92균주를 23℃에서 EMM 제한배지로 세포 농도가 A₆₀₀= 0.5가 될 때까지 배양하여 원심분리하였다. 세포를 모아 멸균수로 세척한 다음 0.1M 아세트산 리튬(lithium acetate, pH 4.9) 용액으로 세척하고, 이를 원래 세포 배양액의 1/10 부피의 0.1M 아세트산 리튬 용액에 현탁시켜 1 X 10⁹세포 1ml농도가 되도록 하였다. 아세트산 리튬 용액에 현탁된 세포 100μl을 에펜도르프 튜브에 취하여 23℃에서 60분간 배양한 다음 분열효모 게놈 라이브러리 DNA 1μg과 50% PEG 용액(polyethylene glycol 4000) 290μl을 가하였다. 이를 잘 섞어 23℃에서 다시 60분간 배양한 다음 43℃에서 15분간 열을 가하여 DNA가 세포 안으로 들어가도록 하였다. 그후 실온에서 10분간 방치한 다음 세포를 원심분리하여 모으고 10ml의 1/2 YEL배지(0.25% 이스트 엑스트렉트, 1.5% 포도당, 30μg아데닌, 우라실)에 현탁시켜 23℃에서 30-120분간 배양하였다. 세포를 다시 모아 아데닌 및 우라실이 첨가된 EMM 고형배지 플레이트에 10-100㎕을 도말하고 23℃에서 5-7일간 배양하였다. 플레이트에 자란 콜로니들을 다시 플록신 B(phloxin B)가 함유된 두 EMM 배지에 복제하여 23℃ 및 37℃에서 각각 배양하여 23℃는 물론 37℃에서도 연분홍색으로 자라는 콜로니를 선택하였다.

이들 균주로부터 플라스미드 DNA를 팬타스(Fantes)의 방법(Experiments with fission yeast, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor, New York, 1994)에 따라 분리하여 이를 다시 대장균 내에 형질전환시키고 앰피실린 저항성으로 균주를 선별하였다. 이로부터 분열효모 DNA를 가진 플라스미드 DNA 를 알칼리 용해방법으로 분리하였다. 분리한 플라스미드의 구조를 제한효소를 이용하여 분석한 결과, 8.5kb의 분열효모 유전자가 있는 클론을 얻어 cgs1으로 명명하였다.

상기에서 얻은 플라스미드 pCGS1의 8.5kb효모 유전자를 다시 나누어 클로닝하고 분열효모 CYJ92 균주의 돌연변이 형질을 보완하는 최소의 DNA를 분석한 결과, 약2.8kb의 BamHI - BamHI 조각이 중요한 부위임을 확인할 수 있었다(제4도 참조).

본 발명의 플라스미드 pCGS1로 대장균을 형질전환시켜 그 형질전환체(Escherichia coli DH5α/pCGS1)를 1996년 5월 6일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0245 BP).

[실시예 4] 분열효모 cDNA 라이브러리에서 CGS1 유전자의 분리

본 발명의 세포주기인자 유전자 cgs1을 분석하기 위한 cDNA를 분리하기 위하여, λ-ZAP-분열효모 cDNA라이브러리를 이용하였다.

실시예 3에서 얻은 2.8kb BamHI-BamHI DNA 탐침을 이용하여 λ-ZAP-분열효모 라이브러리로부터 플라크 혼성화(plaque hybridization; Maniatis, et al., 1889, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York) 방법으로 cgs1 유전자의 cDNA들을 분리하였다.

분리한 cDNA의 염기서열을 분석하여 게놈 유전자 서열과 비교한 결과, 서열표 3 및 서열표 4에서 보는 바와 같이 5′쪽을 제외하고는 분열효모 게놈 라이브러리로부터 얻은 염기서열과 같은 아미노산을 만드는 서열을 가진것으로 나타났다. 또한 본 유전자는 408개 이상의 아미노산을 만드는 염기서열을 가지고 있으며 5′쪽에 인트론을 포함하고 있는 것으로 분석되었다.

[실시예 5] cgs1 유전자의 기능 분석

세포 주기 G1기에서 S기로의 진행에 이상이 있는 분열효모 CJY92 균주를 이용하여 본 돌연변이 형질을 보완하는 cgs1유전자의 세포 내에서의 기능을 조사하였다.

클론된 cgs1유전자의 아미노산의 서열을 방해하는 ura4유전자를 삽입하는 유전자 차단방법(gene disruption)을 이용하여 cgs1 유전자로부터 단백질이 제대로 생성되지 못하도록 하고 이의 세포 내에서의 영향을 조사하였다. (제6도 참조). cgs1유전자의 아미노산의 해독 부위를 대부분 없애고, 그 대신 ura4유전자를 삽입한 클론 cgs1::ura4를 만들어 분열효모의 게놈상의 한 cgs1유전자가 cgs1::ura4로 형질전환된 디플로이드(Diploid) 균주를 만들었다. 한 cgs1 유전자는 정상이고 다른 한 cgs1 유전자는 cgs1::ura4로 치환된 디플로이드 균주는 감수분열 과정을 거치면서 4개의 포자가 형성된다. 이렇게 형성된 4개의 포자를 4포자 분석방법(tetrad analysis)를 통하여 하프로이드의 생존 여부를 검토한 결과 cgs1 유전자가 야생형으로 있는 포자는 자랄 수 있으나 cgs1::ura4 유전자가 든 포자는 자라지 못하므로 cgs1유전자가 기능을 나타내지 못하는(disrupted) 하플로이드 균주는 성장하지 못함을 알 수 있었다 (제7도 참조).

따라서 본 발명의 cgs1 유전자는 그 기능이 전부 없을 때는 균주가 전혀 성장할 수 없고, 그 유전자의 일부가 변형되었을 때는 세포 주기 G1기에서 S기로 진행되는 과정이 억제되어 세포의 형태가 길어지는 필수 유전자임을 알 수 있었다.

[실시예 6] cgs1 유전자의 과다 발현에 의한 세포 성장의 억제

본 발명의 유전자가 세포 내에서 과도하게 발현될 때의 효과를 조사하기 위하여 , 티아민(thiamine)에 의해 발현이 조절되는 nmt1프로모터에 본 발명의 cgs1유전자를 연결한 플라스미드 pnmt1-cgs1을 제조하고, 이 플라스미드를 분열효모에 넣어 발현시켰다.

nmt1 프로모터가 있는 플라스미드 pREP1의 Sal I 부위에 PCR방법에 의해 증폭한 cgs1유전자를 삽입하여 발현 플라스미드 pnmt1-cgs1을 제조하였다(제8도 참조). 본 플라스미드 DNA를 cgs1유전자가 야생형으로 존재하는 하플로이드 균주ED665h^-(ade6^-, leul^-, ura4^-)에 넣어 형질전환시킨 다음 이균주를 티아민이 있는 EMM배지(200μM 티아민 + EMM)에서 세포 농도가 A =0.2 되도록 배양하였다. 그 후 세포를 원심분리하여 모은 다음 티아민이 없는 EMM 배지에 옮겨 30℃에서 12시간 정도 동안 A = 0.1이 되도록 배양하고 20분 간격으로 일정량의 세포를 취하여 세포성장 속도를 관찰하였다. cgs1유전자가 티아민이 없는 배지에서 발현되기 시작하는 12시간이 지난 후부터 세포의 성장속도가 현저하게 감소하였다(제9도 및 제10도 참조). 성장속도가 감소하는 현상은 세포 성장이 활발히 일어나고 있는 시기(log phase cell)에 더욱 두드러지게 나타나고, 세포의 성장이 늦어지는 휴지기(stationery-phase cell)에는 정상적인 성장속도로 돌아와 별 차이가 나타나지 않았다.

그러므로 cgs1유전자가 과도하게 생산되는 세포에서는 세포 성장이 활발한 세포의 경우 세포성장을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다. 또한 세포 내의 핵의 모양을 DAPI형광 염색으로 관찰한 결과, 정상세포보다 핵의 DNA의 양이 늘어났음을 나타내고 있으며, 프로사이토메트리로 분석한 결과 DNA의 양이 4배 이상 증가됐음을 알 수 있었다.

세포 주기의 진행에 필요한 새로운 세포주기인자 유전자를 분열효모로부터 분리하고 그의 기능을 분석하였다. 세포 주기인자는 거의 모든 세포에서 그 기능이 공통적이므로 본 발명의 세포주기인자 및 그의 유전자를 이용하여 사람 세포 등에서 유사한 새로운 세포주기인자를 발견할 수 있다.

또한, 본 발명의 유전자가 과도하게 발현되는 경우 세포의 성장이 저해되는 현상을 이용하여, 세포의 성장이 빠르게 진행되는 암세포 등에서 그의 발현을 유도함에 의하여 암의 치료에 이용할 수 있다. 따라서 본 발명의 세포주기인자는 앞으로 항암제로도 개발하여 사용할 수 있다.

또한, 세포 주인 G1기에서 S기로의 진행에 이상이 있는 본 발명의 돌연변이 분열효모 CYJ92 균주를 이용하여 세포 성장을 억제하는 물질을 탐색하는데 이용할 수 있다.

[서열목록]

서열번호 : 1

서열의 길이 : 408

서열의 형 : 아미노산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 단백질

[서열목록]

서열번호 : 2

서열의 길이 : 2266

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : genomic DNA

[서열목록]

서열번호 : 3

서열의 길이 : 1527

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : cDNA

[서열목록]

서열번호 : 4

서열의 길이 : 1585

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : cDNA

Claims (6)

1. 분열효모(Schizosaccharomyces pombe)로부터 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 세포 주기 G1기에서 S기로의 진행에 관여하는 새로운 세포 주기인자 CGS1.
2. 제1항의 세포주기인자 CGS1을 암호하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 제5도의 플라스미드 pCGS1.
3. 제2항의 플라스미드 pCGS1으로 대장균을 형질전환시킨 형질전환체 DH5α/pCGS1(수탁번호 : KCTC 0245 BP).
4. 분열효모 균주에서 세포주기인자 CGS1 발현이 티아민에 의해 조절되는 제8도의 발현 플라스미드 pnmt1-cgs1.
5. 제4항의 발현 플라스미드 pnmt1-cgs1로 숙주세포에 형질전환시킨 후 이를 배양하는 것을 특징으로 하는 제 1항의 세포주기인자 CGS1의 제조방법.
6. 제1항의 세포주기인자 CGS1에 돌연변이가 일어나 세포 주기 G1기에서 S기로의 진행에 이상이 있는 돌연변이 분열효모 균주 CYJ92(수탁번호 : KCTC 0246 BP).