KR0173433B1 - Method for immobilizing mold spore inside porous carrier using liquid sporulation culture - Google Patents
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Abstract
본 발명은 곰팡이 포자의 고정화 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 액체 포자형성 배지를 이용하여 다공성 담체인 셀라이트 입자내에 곰팡이 포자를 고정화하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of immobilizing fungal spores. More specifically, the present invention relates to a method for immobilizing fungal spores in celite particles, which are porous carriers, using liquid sporulation medium.
본 발명의 곰팡이 포자의 다공성 담체내 고정화 방법은 (i) 셀라이트 담체를 세척하고 소각하여 휘발성 물질을 제거하고 멸균하고 건조하는 공정; (ii) 균사 및 포자를 형성하는 곰팡이를 액체배지에 접종하고 20내지 30℃, 150 내지 250rpm에서 7내지 15일간 배양하고 균사를 제거하여 포자 현탁액을 수득하는 공정; 및, (iii) 전기 포자 현탁액을 셀라이트 담체에 첨가하고 멸균된 상태에서 고정화하는 공정을 포함한다.The method of immobilizing the porous spores of the fungal spores of the present invention comprises the steps of: (i) washing and incinerating the celite carrier to remove volatiles, sterilize and dry; (ii) inoculating a fungus forming mycelium and spores into a liquid medium, incubating at 20 to 30 ° C. at 150 to 250 rpm for 7 to 15 days, and removing the mycelia to obtain a spore suspension; And, (iii) adding the electric spore suspension to the celite carrier and immobilizing in a sterile state.
본 발명의 고정화 방법은 종래의 곰팡이 포자의 고정화 방법에 비하여, 포자 현탁액 준비에 있어서의 종균배양 시간의 단축, 고정화 과정의 단순화에 의한 오염 기회의 감소 등의 장점을 가진다.The immobilization method of the present invention has advantages such as shortening of the spawn time for preparation of spore suspension and reduction of contamination opportunity by simplification of the immobilization process, compared to the conventional method for immobilization of mold spores.
Description
본 발명은 곰팡이 포자의 고정화 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 액체 포자형성 배지를 이용하여 다공성 담체인 셀라이트 입자내에 곰팡이 포자를 고정화하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of immobilizing fungal spores. More specifically, the present invention relates to a method for immobilizing fungal spores in celite particles, which are porous carriers, using liquid sporulation medium.
일반적으로, 균사를 형성하는 곰팡이 발효의 경우, 고정화 배양이 현탁배양에 비해 많은 장점이 있다. 그러나, 균사형성 세포 특유의 복잡한 가지모양의 균사들은 배양액을 비뉴튼 유체화하여 점도를 매우 높이게 되므로, 물질전달 감소로 인한 산소고갈, 혼합의 비균일성 등 여러 문제점들을 야기시킬 수 있다.In general, in the case of fungal fermentation forming mycelia, immobilized culture has many advantages over suspension culture. However, the complex branched mycelium peculiar to mycelial cells can cause various problems such as oxygen depletion and non-uniformity of mixing due to non-Newtonian fluidization of the culture medium, resulting in very high viscosity.
이때, 고정화 배양은 그 배양액의 특성이 펠렛 형성시 배양액의 유변학적 및 형태학적 특성과 유사하며 낮은 점도로 인한 높은 물질전달 효과를 나타낼 수 있다는 장점을 가지고 있어서, 고농도 세포배양에 많이 이용되고 있으며, 이를 연속공정에 적용하면 세포 재순환이나 회수 공정없이 세포를 재사용 또는 장기간 사용할 수 있는 장점을 가지고 있다.At this time, the immobilized culture has the advantage that the characteristics of the culture medium is similar to the rheological and morphological characteristics of the culture medium during pellet formation and can exhibit a high material transfer effect due to the low viscosity, it is widely used in high concentration cell culture, Applying this to a continuous process has the advantage that cells can be reused or used for a long time without cell recycling or recovery.
바람직한 고정화 방법을 선정하는데 있어서는, 담체가 화학적으로 안정하여 배양액에 용해되거나 균체에 영향을 주기 않는 불활성 물질이어야 하며, 기계적 강도가 높으며 균체와의 결합력이 크고, 높은 세포부하 용량(cell loading capacity)을 가져야 한다는 점이 반드시 고려되어야 한다. 이러한 조건외에도, 담체의 가격이 저렴하고, 고정화 방법이 단순하고 안전해야 한다는 조건등을 추가로 만족시켜야 한다. 한편, 곰팡이류에 대한 고정화 담체로서는 셀룰로스(ECTEOLA-cellulose), 스테인레스 철사구(stainless steel wire ball), 지르코니늄이 코팅된 세라믹(zirconia coated ceramic), 유리고리(glass ring), 규조토 입자 등을 사용할 수 있다. 특히, 좁은 내부기공부피(internal pore volume)를 가지고 규조토 성분의 셀라이트(celite) 담체는 경제성과 적절한 담체 특성 때문에 상당히 매력적인 고정화 담체로 알려져 있다.In selecting the preferred immobilization method, the carrier should be chemically stable and inert material which does not dissolve in the culture medium or affect the cells, and has high mechanical strength, high binding capacity with the cells, and high cell loading capacity. It must be taken into account. In addition to these conditions, it is necessary to further satisfy the condition that the carrier is inexpensive and the immobilization method must be simple and safe. On the other hand, as an immobilization carrier for molds, cellulose (ECTEOLA-cellulose), stainless steel wire balls, zirconium coated ceramics, glass rings, diatomaceous earth particles, etc. may be used. Can be. In particular, a celite carrier of diatomaceous earth component with a narrow internal pore volume is known to be an attractive immobilization carrier due to its economical and suitable carrier properties.
셀라이트내 고정화 방식은 부착 방식이기는 하지만, 곰팡이류의 고정화는 포자의 고정화 후에 균체의 성장에 의해 커져 버린 균체가 작은 기공을 빠져나가지 못하고 갇히는 방식을 취하기 때문에, 흡착(adsorption)과 포괄(entrapment)방식의 중간을 취하는데, 곰팡이 포자는 셀라이트 담체 표면이나 내부의 빈 공간에 고정화 될 수 있다.Although the immobilization method in celite is an attachment method, the immobilization of molds is an adsorption and entrapment method because the cells grown after the immobilization of the spores are trapped without being able to escape the small pores. Taken in the middle of the fungus spores can be immobilized in the void space on or inside the celite carrier.
한편, 고정화에 가장 유리한 미생물의 형태는 미생물 포자(microbial endospore)나 곰팡이 포자라고 보고되어 있다. 그러나, 포자를 얻기 위해서는 고정화를 위한 포자 현탁액을 한천배지에서의 고체배양(solid culture)을 통해 얻는데 (참조: Gbewonyo et al., Biotech. Bioeng., 25:967(1983); Gbewonyo et al., Biotech. Bioeng., 25:2873(1983)), 이 방법에는 고체배양 자체는 물론 고체배양을 위한 종균 배양 등 많은 시간과 노동력을 필요로 하는 번거로운 과정이 필연적으로 수반된다.On the other hand, the most favorable form of microorganisms for immobilization is reported to be microbial endospore or mold spores. However, to obtain spores, spore suspensions for immobilization are obtained through solid culture in agar medium (Gbewonyo et al., Biotech. Bioeng., 25: 967 (1983); Gbewonyo et al., Biotech.Bioeng., 25: 2873 (1983)), this method inevitably involves a cumbersome process that requires a lot of time and labor, including not only the solid culture itself but also the seed culture for the solid culture.
이에, 본 발명자들은 이같은 복잡한 미생물 포자의 고정화 공정을 단순화시키기 위해 예의 연구노력한 결과, 고정화 공정에 있어서 접종으로 이용되는 포자 현탁액을 보다 간단하게 대량의 포자를 얻을 수 있는 액체 복합배지를 개발하여 이용함으로써 고정화 전단계의 준비과정을 획기적으로 개선할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. 아울러, 본 발명에서는 모세관 흡입 현상을 이용한 간편한 무균 고정화 공정을 사용하여, 고정화 공정에서의 문제점으로 인식되어 왔던 무균성 유지에 대한 문제를 해결하였다.Therefore, the present inventors have intensively researched to simplify the immobilization process of such complex microorganisms, and as a result, by developing and using a liquid complex medium that can obtain a large amount of spores more simply by using a spore suspension used for inoculation in the immobilization process. Confirmed that the preparation process of the pre-immobilization step can be significantly improved, the present invention was completed. In addition, the present invention solves the problem of maintaining sterility, which has been recognized as a problem in the immobilization process by using a simple sterile immobilization process using a capillary suction phenomenon.
결국, 본 발명의 주된 목적은 액체 포자형성 배지와 무균기법을 이용한 곰팡이 포자의 다공성 담체내 고정화 방법을 제공하는 것이다.After all, the main object of the present invention is to provide a method for immobilizing a fungal spore in a porous carrier using a liquid spore-forming medium and aseptic technique.
제1도는 본 발명의 액체 포자형성 배지를 이용한 무균 고정화 공정의 개략도이다.1 is a schematic of a sterile immobilization process using the liquid sporulation medium of the present invention.
제2도는 본 발명의 곰팡이 포자 고정화 공정을 개략적으로 나타낸 그림이다.2 is a schematic view showing the mold spore immobilization process of the present invention.
제3(a)도는 유출액에서의 톨리포클라디움 인플라툼(Tolypocladium inflatum, ATCC34921)세포의 현미경 사진이다.Figure 3 (a) is a micrograph of the cells of Tolypocladium inflatum (ATCC34921) in the effluent.
제3(b)도는 고정상에서의 톨리포클라디움 인플라툼(Tolupocladium inflatum, ATTCC34921) 세포의 현미경 사진이다.Figure 3 (b) is a micrograph of Tolupocladium inflatum (ATTCC34921) cells in the stationary phase.
이하, 본 발명의 고정화 방법을 공정별로 나누어 설명하기로 한다.Hereinafter, the immobilization method of the present invention will be described by dividing the process.
제1공정: 다공성 담체의 준비First step: preparing a porous carrier
담체로서는 셀라이트를 이용하며, 입자 크기는 기질의 확산저항을 고려해서 가는 체(sieve)를 이용하여 100내지 500㎛ 범위를 선택한다. 이렇게 준비된 셀라이트 입자를 증류수로 여러번 세척하고 500 내지 700℃에서 소각하여 휘발성물질을 제거한 후, 120℃ 이상에서 멸균하고 다시 건조하여 사용한다.Celite is used as the carrier, and the particle size is selected in the range of 100 to 500 mu m using a thin sieve in consideration of the diffusion resistance of the substrate. The celite particles thus prepared are washed several times with distilled water and incinerated at 500 to 700 ° C. to remove volatiles, and then sterilized at 120 ° C. or higher and dried again.
제2공정 : 포자 현탁액 준비Step 2: Prepare Spore Suspension
고정화에 사용하기 위한 다량의 포자 현탁액을 준비하기 위하여 포도당, 효모추출물, 요소, NaNO3, KH2PO4, KCl, MgSO4, FeSO47H2O를 포함하는 액체배지에 대상 미생물을 접종하고, 20 내지 30℃의 온도조건에서, 150 내지 250rpm의 교반속도로 7 내지 15일간 배양한다. 그런다음, 균사를 완전히 제거하고 얻어진 포자 현탁액을 헤모사이토미터로 포자갯수를 확인하면서 107내지 108포자갯수/mL가 되도록 희석한다.To prepare a large amount of spore suspension for use in immobilization, inoculate the target microorganism into a liquid medium containing glucose, yeast extract, urea, NaNO 3 , KH 2 PO 4 , KCl, MgSO 4 , FeSO 4 7H 2 O, Incubate for 7 to 15 days at a stirring speed of 150 to 250rpm at a temperature of 20 to 30 ℃. Then, the hyphae are completely removed and the resulting spore suspension is diluted to 10 7 to 10 8 spore count / mL while checking the spore count with a hemocytometer.
제3공정 : 세포의 고정화Third Step: Immobilization of Cells
제2공정에서 준비된 포자 현탁액을 연동펌프를 이용하여 반응기에 담겨 있는 멸균된 셀라이트 담체에 첨가하고, 무균기법(aseptic technique)을 이용하여 멸균된 상태에서 고정화된다.The spore suspension prepared in the second step is added to the sterilized celite carrier contained in the reactor using a peristaltic pump and immobilized in a sterile state using an aseptic technique.
즉, 포자 현탁액을 모세관 현상으로 포자가 각 담체내의 내부 기공으로 효과적으로 스며들게 한 다음, 20 내지 30℃로 온도를 맞추고 0.5 내지 1.5vvm의 유량으로 공기를 공급하면서, 1 내지 3시간 동안 배양하여 포자가 완전히 담체 내에 정착할 수 있게 해준다.In other words, the spore suspension is capillary effect to allow the spores to effectively penetrate the internal pores in each carrier, and then incubated for 1 to 3 hours while adjusting the temperature to 20 to 30 ℃ and supplying air at a flow rate of 0.5 to 1.5vvm Allow to settle completely in the carrier.
그런 다음, 농축된 생산배지와 증류로 최종 셀라이트 농도가 50 내지 70%(v/v)가 되도록 부피를 맞추어 준다.Then, the concentrated production medium and distillation adjust the volume so that the final celite concentration is 50 to 70% (v / v).
한편, 본 발명의 방법에 따라 고정화된 세포는 바람직하게는 20 내지 30℃, pH5 내지 6, 교반 속도는 300 내지 400rpm, 조업부피와 희석속도를 각각 1내지 3L와 0.05 내지 0.2hr-2의 조건으로 조절하여 연속배양할 수 있다. 이때, 배지는 포자고정화에 이용되었던 장치를 이용하며 펌프로 연속공급하며, 세포분리장치와 또 하나의 펌프를 사용함으로써 고정화 세포가 분리·제거된 배양액을 연속적으로 배출시킨다.On the other hand, the cells immobilized according to the method of the present invention preferably 20 to 30 ℃, pH 5 to 6, the stirring speed is 300 to 400rpm, operating volume and dilution rate of 1 to 3L and 0.05 to 0.2hr -2 respectively Can be continuously cultured by adjusting. At this time, the medium is continuously supplied to the pump using the device used for spore fixation, and the culture medium from which the immobilized cells are separated and removed is continuously discharged by using a cell separation device and another pump.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples.
[실시예 1]Example 1
대상균주로서 균사를 형성하는 곰팡이인 톨리포클라디움 인플라툼(Tolypocladium inflatum ATCC34921)을 사용하였고, 톨리포클라디움 인플라툼의 포자(conidiospore)를 고정화하기 위한 담체로서는 셀라이트 R-560(Manville Co., USA)를 이용하였다. 입자크기는 기질의 확산저항을 고려해서 가는 체(sieve)를 이용하여 100 내지 500㎛ 범위를 선택하였다.Tolypocladium inflatum ATCC34921, a fungus that forms mycelia, was used as the target strain, and Celite R-560 (Manville Co. , USA). The particle size was selected in the range of 100 to 500 μm using a thin sieve in consideration of the diffusion resistance of the substrate.
이렇게 준비된 셀라이트 입자를 증류수로 여러번 세척하고 약 600℃에서 소각하여 휘발성 물질을 제거한 후, 121℃에서 멸균하고 다시 건조하여 사용하였다.The celite particles thus prepared were washed several times with distilled water and incinerated at about 600 ° C. to remove volatiles, and then sterilized at 121 ° C. and dried again.
하기표 1의 배지를 이용하여 약 27℃의 온도조건 및 200rpm에서 대상균주를 10일간 배양하면, 약 109내지 1010포자갯수/mL의 포자 현탁액을 얻을 수 있었다. 포자 현탁액으로부터, 균사와 포자는 커리필터(Rock Line co., USA)를 이용하여 매우 효과적으로 분리하였다(제1도, 공정1). 이렇게 준비된 포자 현탁액을 연동펌프를 이용하여 반응기에 담겨 있는 멸균된 셀라이트 담채에 첨가하였다. 이때, 고정화 공정의 매 단계는 무균기법을 이용하여 멸균된 상태에서 이루어졌다.When the target strain was incubated for 10 days at a temperature condition of about 27 ° C. and 200 rpm using the medium of Table 1, a spore suspension of about 10 9 to 10 10 spores / mL was obtained. From the spore suspension, the hyphae and spores were very effectively separated using a Curry filter (Rock Line co., USA) (Figure 1, Process 1). The spore suspension thus prepared was added to the sterilized celite tin in the reactor using a peristaltic pump. At this time, every step of the immobilization process was carried out in a sterilized state using aseptic technique.
포자 현탁액을 담체로 젖기만 할 정도로 첨가하면 모세관 현상으로 포자가 각 담체 내의 내부 기공으로 효과적으로 스며들게 되는데 (제1도, 공정2), 이런 과정 후에 약 27℃로 온도를 맞추어 주고 1vvm의 유량으로 공기를 공급하면서 , 2시간 동안 배양하여 포자가 완전히 담체 내에 정착할 수 있게 해주었다.(제1도, 공정3). 2시간후 농축된 생산 배지와 증류수로 부피를 맞추어 주었다(최종 셀라이트 농도, 60% v/v).When the spore suspension is added to the carrier so that it is only wetted, the capillary effect effectively causes the spores to penetrate into the internal pores in each carrier (FIG. 1, Process 2). After this process, the temperature is adjusted to about 27 ° C. Incubate for 2 hours while feeding to allow the spores to completely settle in the carrier (FIG. 1, process 3). After 2 hours the volume was adjusted to concentrated production medium and distilled water (final celite concentration, 60% v / v).
연속배양은 27℃, pH 5.7, 교반 속도 350rpm의 조건에서 수행하였으며, 조업부피와 희석속도는 각각 2L와 0.1hr-1로 조절하였다.Continuous culture was carried out at 27 ℃, pH 5.7, stirring speed of 350rpm conditions, operating volume and dilution rate was adjusted to 2L and 0.1hr -1 , respectively.
연속배양시에는, 포자고정화(제1도, 공정3)에 이용되었던 장치를 이용하였으며, 펌프로 배지를 연속공급하였다. 또한, 세포분리장치와 또 하나의 펌프를 사용함으로써, 고정화 세포가 분리·제거된 배양액을 연속적으로 배출시킬수 있었다. 전체 고정화 공정을 제2도에 개략적인 그림으로 나타내었다.In continuous culture, the apparatus used for spore fixation (FIG. 1, process 3) was used, and the medium was continuously supplied by a pump. In addition, by using the cell separation device and another pump, the culture medium from which the immobilized cells were separated and removed was continuously discharged. The overall immobilization process is shown schematically in FIG.
제3(a) 내지 3(b)도는 이러한 실제 연속배양 공정 결과 얻어진, 균체가 붙어 있는 셀라이트 입자의 광학현미경 사진이다. 현미경 사진에서 볼 수 있듯이, 담체 밖으로 많은 균사가 뻗어 나와 있고(제3(a)도), 배양액 내에서는 포자와 잘게 잘려진 균사들이 관찰되었다(제3(b)도).3 (a) to 3 (b) are optical micrographs of Celite particles to which cells are attached obtained as a result of the actual continuous culture process. As can be seen from the micrographs, many mycelia extend out of the carrier (Fig. 3 (a)), and spores and chopped mycelia were observed in the culture (Fig. 3 (b)).
이는 균사가 그물처럼 엉겨 있어 배양액의 점도가 매우 높은 현탁배양과 비교할 때, 배양액의 유변학적 특성에 기인한 물질전달속도 증가라는 측면에서 매우 바람직한 현상으로 해석할 수 있었다.This can be interpreted as a very desirable phenomenon in terms of increasing the mass transfer rate due to the rheological properties of the culture medium compared to the suspension culture with a very high viscosity of the culture medium because the mycelia are entangled like a net.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 고정화 전단계의 준비과정이 획기적으로 단순화된 곰팡이 포자의 다공성 담체내 고정화 방법을 제공한다.As described and demonstrated in detail above, the present invention provides a method for immobilizing in a porous carrier of mold spores, which greatly simplified the preparation process before the immobilization step.
본 발명의 고정화 방법은 종래의 곰팡이 포자의 고정화 방법에 비하여, 포자 현탁액 준비에 있어서의 종균배양 시간의 단축, 고정화 과정의 단순화에 의한 오염기회의 감소 등의 장점을 가진다.The immobilization method of the present invention has advantages such as shortening of the spawn time for the preparation of spore suspension and reduction of the contamination opportunity by simplification of the immobilization process, compared to the conventional method for immobilizing spores of the fungus.
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