KR0163170B1 - 사람 t세포에 대한 선택성 벡터 - Google Patents

사람 t세포에 대한 선택성 벡터

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Abstract

내용 없음

Description

사람 T 세포에 대한 선택성 벡터
제1도는 플라스미드 pSIneo 및 pSIneoH의 작제도이다.
제2도는 헤르페스바이러스 사이미리 SIRneoH14의 유전자 지도이다.
제3도는 헤르페스바이러스 사이미리 SIRneoK의 유전자 지도이다.
본 발명은 사람 T 세포내에서 외래 유전자의 발현을 가능하게하는 선택성 벡터에 관한 것이다.
헤르페스 그룹의 바이러스[헤르페스 심플렉스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 수두/대상포진 바이러스 르페스바이러스 수이스(Herpesvirus suis)]는 용균성 감염시킨 단층 세포배양물에서 이질성 유전자를 성공적으로 발현시키는데 사용되어 왔다. 그러나, 장기간 동안 이들 바이러스에 의해 지속적으로 감염되는 세포주는 없다. 지속성 벡터가 엡스타인-바르 바이러스(EBV)의 게놈으로부터 작제되었지만, 감염된 B 림프구로부터 감염성 세포가 함유되지 않은 바이러스를 수득할 수 없었다.
헤르페스바이러스(H.) 사이미리는 상피 세포내에서 용균적으로 증폭되고 명주원숭이(marmoset)의 T세포를 지속적으로 감염시킨다는 것이 기술된 바 있다.
에이취. 사이미리의 게놈은 약 112kb의 GC 함량이 낮은 독특한 DNA(L-DNA) 영역을 포함하고 있다. 이 게놈은 직렬로 배열되고 각각 길이가 약 1.4kb이며 GC가 풍부한 다양한 수의 비-암호화 반복 단위(H-DNA)에 의해 양쪽 말단이 플랭킹되어 있다. 에이취. 사이미리는 몇몇의 신대륙 영장류에서 급속히 성장하는 T세포 임파종을 유도하고, 시험관내에서 명주원숭이 T림프구가 영구적으로 생장하도록 형질전환시킬 수 있다.
본 발명에 이르러 neo 유전자를 함유하는 재조합 에이취. 사이미리 바이러스가 제네티인(G418)에 의해 원숭이 신장세포주에서 다수 선택될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 본원에서는, 바람직한 선택성 유전자의 예인 neo 유전자가 H-및 L-DNA의 우측 연접(junction)부위내에 삽입되도록 상동성 재조합을 위한 조건을 선택하였다. 이들 재조합체는 에피좀(episome) 형태의 바이러스성 DNA로 사람 T 세포주를 지속적으로 감염시킬 수 있다. 이 바이러스성 게놈은 이종 DNA에 의해 대체될 수 있는 약 30%의 고도로 반복성인 DNA를 함유하기 때문에, 사람 T세포내에서 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 유용하다.
또한, 비-생산(non-producer) 세포인 지속적 감염 세포가 감염성 바이러스 입자를 생산하지 않는다는 것이 상기와 같은 발현 시스템의 잇점으로 간주된다. 출발 균주로서, 에이취, 사이미리의 복제가능한 바-종양원성 변이체를 사용하는 것도 가능하다. 이들 바이러스 균주는 좌측말단 L-DNA가 결실되어 있다[참조 : B. Fleckenstein and R. Desrosiers(1982), The Herpes Viruses, Vol. 1, B. Roizman(ed.). Plenum Publishing Co., New York].
본 발명 이전까지는 에이취. 사이미리가 사람 림프구를 감염시킨다는 사실이 밝혀지지 않았다.
따라서, 본 발명은
a) H- 및 L-DNA의 우측 또는 좌측 연접부위 또는 연접영역에 삽입된 선택 유전자를 갖는 선택성 에이취. 사이미리 재조합체,
b) a)에 기술한 재조합체를 제조하는 방법, 및
c) 사람 T 림프구 중에서 외래 유전자를 발현시키기 위한 이의 용도,
d) 형질전환 가능한 재조합 에이취. 사이미리를 사용하여 외래 유전자를 구성적으로 (constitutively) 발현하는 원숭이 T 세포주의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 특허청구의 범위 및 실시예에서 더 상세히 기술된다.
[실시예 1]
플라즈미드 pSIneo 및 pSIneoH의 작제
에이취. 사이미리 DNA를 사용한 상동성 재조합 기술에 의하여 바이러스 유전자가 결실되지 않고 작용성 단위가 차단되지 않는 방법으로 pSIneo 및 pSIneoH를 작제한다.
neo 유전자는 대부분의 진핵세포중에서 제네티신(G148)에 의해 유도되는 해독 플록을 우회시킬 수 있는 포스포트랜스퍼라제(phosphotransferase)를 암호화 한다.
플라즈미디 pSV2 neo[참조 : P.J. Southern and P. Berg(1982) J. Mol. Appl. Genetics, 327-341, Raven Press, New York]는 SV 40 요소 (초기 프로모터/인핸서, T 항원, mRNA 스플라이싱 시그널 및 폴리아데닐화 부위)의 전사 조절하에 있는 neo 유전자를 함유한다. neo 전사단위를 pSV2 neo로부터 절단해내고, 제한 절단 부위 말단을 표준방법에 의해 PvuII로부터 ClaI로 및 EcoRI로부터 Sall 말단으로 전환시킨다.
약 9kb의 길이를 가지고 L-DNA의 우측말단을 형성하는 KpnI/Smal 단편 E의 클로닝은 문헌[참조 : E. Knust et al.(1983) Gene 25, 281-289]에 의해 기술된바 있다.
상기 단편 E를 갖는 클로닝 벡터 pWD7 [pWD11(본원에서는 벡터 3)로 불림]은, pWD7 중의 내부 SalI 부위가 결실되고, 단편 E/pWD7 연접부위의 SmaI 부위가 SalI 부위로 돌연변이되도록 표준방법으로 벡터 5로 전환시킨다. SmaI 또는 SalI 절단부위는 L-DNA 말단으로부터 35개의 뉴클레오티드가 떨어져서 제1의 H 반복단위 내에 있다. 벡터 5를 SalI 및 ClaI로 절단한 다음, neo 유전자를 벡터 5중의 단편 E와 pWD7 사이에 연결시켜 플라즈미드 pSIneo를 수득할 수 있다. 1444개 염기쌍(bp)의 H-DNA 반복단위를 TaqI로 절단한 후, neo 및 pWD7 부위사이에 위치시켜 최종 플라즈미드 pSIneoH를 수득한다. H-DNA 반복단위는 pFG24로부터 TaqI 단편으로써 수득한다[참조 : A.T. Bankier et al. (1985) J. Virol. 55, 133-139]. 상술된 합성단계는 제1도에 요약되어 있다.
[실시예 2]
선형화 pSIneoH DNA를 에이취. 사이미리 비리온 DNA (M-DNA)와 함께 동시형질감염
CsCl 밀도구배로 정제한 M-DNA 0.2㎍ 내지 0.4㎍[참조 : B. Fleckenstein et al. (1975) J. Virol. 15, 398-406]을 KpnI으로 선형화한 pSIneoH 2㎍ 내지 4㎍과 혼합하고, 4시간 후에 20% w/v 글리세롤 쇽을 수행하는 인산칼슘 침전방법 [참조 : F.L. Graham and J. van der Eg(1973) J. Virol. 52, 456-467]으로 올빼미 원숭이 신장 세포주(OMK-637, ATCC CRL 1566) 내에 형질감염시킨다. 세포병변 효과는 최초로 약 6 내지 10일후에 검출가능하고, 그후 2주후에 세포를 완전히 분해시킨다. 높은 자발적인 재조합율에 기인하여, 대개 선택압 없이 재조합 에이취. 사이미리가 수득된다. 재조합체의 수가 더 적을 경우의 성공은 형질감염후 선택압하에 성취되며, 재조합체 수율은 80%까지 증가된다. 써든 블럿(Southern blot)과 병용하여 SalI 및 SmaI를 사용한 제한 분석은 바이러스 플라그의 약 2/3가 온전한 neo 유전자를 함유하는 것으로 나타났다. 9개 클론중 6개는 H-DNA 반복 단위 사이에 삽입된 neo-유전자 또는 pSIneoH DNA를 가지며, 2개의 클론은 H/L 연접부위에 삽입된 neo 서열을 가졌다. 이들 클론 중의 하나인 에이취. 사이미리 SIRneoH 14의 특성이 이의 유전자 지도 형태로 제2도에 도시되어 있다. 모든 에이취. 사이미리 SIRneoH 재조합체는 neo 유전자를 발현하며 상술된 동시형질감염으로부터의 바이러스로 감염된후 적합한 세포, 예를들어 Sg 021에서 선택될 수 있다. Sg 021 세포는 에이취. 사이미리로 지속적으로 감염될 수 있는 IL-2-의존성 명주원숭이는 IL-2-의존성 명주원숭이 T 세포주이다[참조 : R.C. Desrosier et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 2796-2803]. 이러한 경우, neo 유전자의 유전자 용량은 G418의 농도가 증가함에 따라 100㎍/㎖ G418의 경우 약 40에서 750㎍/G418의 경우 약 140으로 증가된다.
또한 재조합체 neo 바이러스는 OMK 세포와의 동시배양에 의해 Sg 021 세포로부터 수득된다.
[실시예 3]
pSIneo DNA를 에이취. 사이미리 비리온 DNA와 함께 동시형질감염
neo 유전자를 H/L 연접 부위에 삽입시키는 재조합체의 수율을 증가시키기 위하여, 실시예 2에서와 같은 원리로 동시형질감염을 수행하되 이러한 경우 선형화된 pSIneo DNA로 실시한다. 이러한 형질감염으로부터 수득된 에이취. 사이미리 SIRneoK는, 제3도에 도시된 바와같이, L/H 연접부위 사이에 삽입된 pSIneo DNA내에 neo 서열을 갖는다. neo 유전자의 발현 및 증폭뿐만아니라 감염성 재조합 바이러스의 생산은 실시예 2에 기술된 바와같이 수행한다.
[실시예 4]
재조합 에이취. 사이미리 바이러스를 사용한 사람 T 세포의 지속적 감염
영구적으로 생장하는 사람 T 세포주 JURKAT[참조 : U. Schneider et al.(1977) Int. J. Cancer 19, 626; ATCC CRL 8163]를 에이취. 사이미리 SIRneoH 14로 감염시키고 10% 태아 송아지 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지중의 제네티신의 농도를 증가시키면서 배양한다. neo 유전자는 세포당 에이취. 사이미리 SIRneoH 14 게놈수에 상응하는, 세포당 약 100개의 유전자 용량으로 지속적을 감염된 JURKAT 세포내에 존재한다. 바이러스성 DNA는 세포성 게놈으로 통합 되지는 않으나 에피좀성 DNA로 존재한다. 세포당 재조합 바이러스의 복제수는 세포당 약 100개로 존재한다.
전술한 도면중 제1도에서,
1은 플라즈미드 pSV2 neo를 나타내고,
2는 플라즈미드 pSV2 neo CS를 나타내며,
3은 플라즈미드 pWD11을 나타내고,
4는 플라즈미드 pFG24를 나타내며,
C는 ClaI를 나타내고,
E는 EcoRI를 나타내며,
K는 KpnI를 나타내고,
S는 SalI를 나타내고,
Sm은 SmaI을 나타내며,
T는 TaqI를 나타내며, 빗금친 영역은 에이취. 사이미리 DNA부분(L-DNA의 말단 KpnI-SmaI 단편)이고, 검은 삼각형은 H-DNA 반복단위를 나타낸다.
제2도에서, SIR-NEOH 14의 우측 H-/L-DNA 연접을 도시하였다. H는 HidIII를 나타내고, K는 KpnI를 나타내며, S는 SmaI를 나타내고, Sa는 SalI를 나타내며, A는 바이러스성 결합물의 절단부위를 나타낸다. 숫자는 Kb 단위로 나타낸 DNA의 길이이다.
제3도에서는 제2도를 참조한다.

Claims (5)

  1. neo 유전자가 L-및 H-DNA의 우측 또는 좌측 연접영역에 삽입된 헤르페스바이러스 사이미리(Herpesvirus saimiri) 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 비-종양원성 헤르페스바이러스 사이미리 변이체가 선택된 벡터.
  3. neo 유전자를 L-및 H-DNA의 우측 또는 좌측 연접영역에 연결시킴을 포함하여, 제1항 또는 제2항에 따른 벡터를 제조하는 방법.
  4. neo 유전자를 L-및 H-DNA의 우측 또는 좌측 연접영역에 재조합 기술로 연결 시킴을 포함하여, 제1항 또는 제2항에 따른 벡터를 제조하는 방법.
  5. 원숭이 T세포를 제1항 또는 제2항에 따른 벡터로 형질전환시킴을 포함하여, 원숭이 T세포내에서 외래 유전자를 발현시키는 방법.
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