KR0162168B1

KR0162168B1 - A process for preparing erythritol

Info

Publication number: KR0162168B1
Application number: KR1019960002896A
Authority: KR
Inventors: 박진병; 육철; 김정렬; 박영근
Original assignee: 백운화; 두산인재개발원연구조합
Priority date: 1996-02-07
Filing date: 1996-02-07
Publication date: 1998-11-16
Also published as: KR970062024A

Abstract

트리코스포론속 미생물(기탁번호 : KCCM-10077호)를 포도당 25∼45%, 옥수수침지액 3∼5%를 함유한 액체 배지에 배양하고 정제함을 특징으로 하는 고수율 에리스리톨의 제조방법A method for producing high yield erythritol, characterized in that the microorganism of genus Tricosphoron (Accession No .: KCCM-10077) is cultured and purified in a liquid medium containing 25 to 45% glucose and 3 to 5% corn steep liquor.

Description

Method for preparing erythritol

본 발명은 에리스리톨을 생산하는 신규 미생물 및 이 신규 미생물을 이용하여 에리스리톨을 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel microorganism producing erythritol and a method for producing erythritol using the novel microorganism.

에리스리톨은 일종의 당알코올로 천연 과실이나 청주, 와인, 장유등의 발효식품에 함유되어 있는 천연감미료이다. 감미도는 설탕의 80%로 후미가 없고 산뜻한 맛을 내며 용해시 높은 흡열성(-43cal/g)으로 시원한 청량감을 준다. 또한 저칼로리(0.4kcal/g)이고 비충치 유발성이며 과량 섭취시에도 설사를 유발하지 않은 기능성 감미료이다. 또한 에리스리톨은 내산, 내알칼리, 내열성, 비착색성, 저흡수성, 저수분활성, 저발효성 등의 가공 특성이 우수하여 탁상감미료 뿐만 아니라 초콜렛, 사탕 껌등의 다양한 식품에 이용될 수 있다.Erythritol is a kind of sugar alcohol, which is a natural sweetener contained in fermented foods such as natural fruits, sake, wine, and soy milk. The sweetness is 80% of the sugar and has no aftertaste and has a refreshing taste. When melted, it has a high endotherm (-43cal / g) to give a cool refreshing feeling. It is also a low-calorie (0.4kcal / g), non-caustic and functional sweetener that does not cause diarrhea even when overdose. In addition, erythritol is excellent in processing properties such as acid, alkali, heat resistance, non-coloring property, low water absorption, low water activity, low fermentation property, and can be used in various foods such as chocolate and candy gum as well as tabletop sweeteners.

이러한 에리스리톨의 생산능력을 지닌 미생물로서는 예를 들면, 데바리오마이세스(Debaryomvces)속(미국 특허번호 제2,986,495호), 피키아(Pichia)속(미국 특허 번호 제2,986,495호), 칸디다(Candida)속(안토니반 류벤후크(Antonie van Leeuwenhoek)37(1971) 107-118등), 오레오베이시디움(Aureobasidium)속(일본 특허 공개 소61-31091호)등이 알려져 있다.Examples of microorganisms having the ability to produce erythritol include, for example, the genus Debaryomvces (US Pat. No. 2,986,495), the genus Pichia (US Pat. No. 2,986,495), and the Candida genus ( Antoni van Leeuwenhoek 37 (1971) 107-118, etc., and the genus Aureobasidium (Japanese Patent Laid-Open No. 61-31091) are known.

그러나 이러한 미생물을 통한 에리스리톨의 제조는 현실적으로 여러가지 제약이 따른다.However, the production of erythritol through these microorganisms is subject to various limitations in reality.

더욱 상세하게는 미국 특허번호 제2,986,495호는 피키아속과 데바리오마이세스속의 미생물들을 사용하여 단당류로부터 에리스리톨(erythritol), 글리세롤(glyderol), 아라비톨(arabitol)을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 그러나 이 방법에 의하면 에리스리톨은 부산물로서 단지 소량밖에 얻을 수 없을 뿐만 아니라 분리하여 모으는데 상당한 어려움이 따른다. 미국 특허번호 제3,756,917호는 칸디다속의 미생물들을 사용하여 탄화수소류로부터 에리스리톨을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 그러나 이 방법은 기질의 농도가 기껏해야 20%이하이므로 대단히 비경제적이며, 생산성이 낮다. 또 다른 결점은 원료로 탄화수소를 사용함으로서, 제품중에 잔류할 가능성이 있기 때문에 식품에는 사용할 수 없다는 것이다.More specifically, US Pat. No. 2,986,495 discloses a process for preparing erythritol, glycerol, arabitol from monosaccharides using microorganisms of the genus Pichia and Devariomyses. However, according to this method, erythritol is not only obtained in small amounts as a by-product but also has considerable difficulty in separating and collecting. US Patent No. 3,756,917 discloses a process for preparing erythritol from hydrocarbons using microorganisms of the genus Candida. However, this method is extremely uneconomical and low in productivity because the concentration of the substrate is at most 20% or less. Another drawback is the use of hydrocarbons as a raw material, which can not be used in food because it can remain in the product.

안토니 반 류벤후크, 37, 107-118(1971)과 어플라이드 마이크로바이올로지(Applied Microbiology), 12, [3]240-246(1964)에서는 모닐리엘라(토룰라)(Monilliella(Torula))속 미생물들을 사용하여 글루코오스로부터 에리스리톨을 제조하는 방법을 서술하고 있다. 이 방법은 글루코오스의 에리스리톨에 대한 변환비가 높고, 배지의 기질 농도를 비교적 높은 수준까지 증가시킬 수 있는 특징이 있으나, 배양시에 거품의 발생이 현저하기 때문에 거품의 제거를 위해서 다량의 잔탄검(xanthane gum)을 사용하여야만 하는 결점이 있다. 일본 특허공개번호 소61-31091호는 오레오베이시디움(Aureobasidium)속의 미생물들을 사용하여 단당류로부터 에리스리톨을 제조하는 방법을 설명하고 있다. 이 방법은 비교적 높은 기질 농도를 갖는 배지를 사용하여 에리스리톨을 제조하는 것을 가능하게 하였으나, 이 방법은 미생물들의 균체증식량에 비하면 에리스리톨의 수율이 만족스럽지 못하였다.Anthony van Leuvenhook, 37, 107-118 (1971) and Applied Microbiology, 12, [3] 240-246 (1964), described the microorganisms of Monilliella (Torula). To describe the preparation of erythritol from glucose. This method is characterized by a high conversion ratio of glucose to erythritol and an increase in the substrate concentration of the medium to a relatively high level. However, since bubbles are prominent during culture, a large amount of xanthane gum is used for removing the bubbles. There is a drawback that must be used. Japanese Patent Laid-Open No. 61-31091 describes a method for producing erythritol from monosaccharides using microorganisms of the genus Aureobasidium. This method made it possible to produce erythritol using a medium having a relatively high substrate concentration, but this method was not satisfactory in yield of erythritol compared to the cell growth of microorganisms.

따라서 본 발명의 목적은 기질 농도가 높은 배지에서도 빠른 속도로 성장하고 높은 수율로 에리스리톨을 생산하며 글리세롤과 같은 부산물 생산이 적고 옥수수 침지액과 같은 산업폐기물에서도 좋은 생육을 보이는 트리코스포론속의 미생물을 선별하여, 이 미생물을 이용하여 에리스리톨을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.Therefore, an object of the present invention is to screen microorganisms of the genus Tricosphoron which grows rapidly in medium with high substrate concentration, produces erythritol in high yield, produces less by-products such as glycerol and shows good growth in industrial waste such as corn steep liquor. It is to provide a method for producing erythritol using this microorganism.

즉, 트리코스포론속 미생물(기탁번호 : KCCM-10077호)를 포도당 25∼45%, 옥수수 침지액 3∼5%를 함유한 액체 배지에 배양하여 고수율로 에리스리톨을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.That is, the present invention provides a method of producing erythritol in high yield by culturing tricosphorone microorganisms (Accession No .: KCCM-10077) in a liquid medium containing 25 to 45% glucose and 3 to 5% corn steep liquor. .

본 발명의 신균주 트리코스포론(Trichosporon)속의 미생물의 분리방법을 살펴보면 다음과 같다.Looking at the separation method of microorganisms in the genus Tricosporon (Trichosporon) of the present invention.

벌집통의 구성물을 35∼45% 포도당과 1.0% 효모추출물로 구성된 액체배지에 현탁한 뒤 28∼32℃에서 3∼4일간 배양하고, 35∼45% 포도당과 1.0% 효모추출물이 포함된 한천배지에 도말하여 28∼32℃에서 3∼4일간 배양하였다. 여기에서 생성된 균총을 각각 15∼25% 포도당과 0.5% 효모추출물, 유레아 0.1%로 구성된 액체 배지에서 4∼6일간 현탁 배양한 후 박막크로마토그래피 및 HPCL를 이용하여 에리스리톨 생산 역가를 측정하고 우수 균주를 선발하였다.The components of the honeycomb are suspended in a liquid medium consisting of 35-45% glucose and 1.0% yeast extract, incubated at 28-32 ° C for 3-4 days, and agar medium containing 35-45% glucose and 1.0% yeast extract. The plate was incubated at 28-32 ° C. for 3-4 days. The resulting flora was suspended in culture for 4 to 6 days in a liquid medium consisting of 15-25% glucose, 0.5% yeast extract and 0.1% urea, and then the erythritol production titre was measured using thin layer chromatography and HPCL. Was selected.

이때 분리된 균주는 고농도 당액에서도 에리스리톨을 고수율로 생성하는 특성을 보였으며, 이 미생물을 1995년 11월 17일 한국미생물보존협회에 기탁번호 KCCM-10077호로 부다페스트조약에 따른 미생물 국제기탁을 하였다.At this time, the isolated strain showed high yield of erythritol even in high concentration of sugar solution, and the microorganism was deposited with the Korea Microorganism Conservation Association on November 17, 1995 under the accession no.

이하 본 발명의 신균주 트리코스포론속 미생물 KCCM-10077호의 균학적 특성을 살펴보면 다음과 같다.Hereinafter, the microbial characteristics of the mycobacteria strain Tricosphorone microorganism KCCM-10077 are as follows.

[형태학적 특성][Morphological characteristics]

영양세포는 균사 또는 효모같은 단세포 난형으로 다극출아에 의해 번식한다. YPD agar 배지와 포도당 40%, 효모추출물 0.5%, 유레아(urea) 0.1%의 액체 배지에 3일 배양후 관찰한 결과 슈도마이셀리움(Pseudomyclium), 셉테이트 마이셀리움(septate mycelium), 아쓰로스포아(arthropore)는 관찰되나 아스코스포아(ascospore), 바시디오스포아(basidiospore), 텔리오스포아(teliospore)는 관찰되지 않는다.Feeding cells multiply by multipolar emergence in single cell ovates, such as mycelium or yeast. After 3 days incubation in YPD agar medium, 40% glucose, 0.5% yeast extract, and 0.1% urea, Pseudodomyclium, septate mycelium, and Astrophosa arthropore is observed but no ascospore, basidiospore, or teliospore.

[생리학적 성질][Physiological properties]

산소요구성은 호기성이고, 최적생육온도는 35℃이며, 최적생육 pH는 2.5∼3.0이다. 포도당 농도는 45%까지 정상적으로 생육하고, 염농도는 KCL 0.4M 까지 정상적으로 생육한다.Oxygen urine composition is aerobic, optimum growth temperature is 35 ℃, optimum growth pH is 2.5 to 3.0. Glucose concentration grows normally up to 45%, and salt concentration grows normally up to KCL 0.4M.

당 유기산의 동화성을 살펴보면Looking at the assimilation of sugar organic acids

기타 생리학적 성질을 살펴보면Other physiological properties

이하 본 발명에 따른 미생물을 사용한 에리스리톨의 제조방법을 설명한다.Hereinafter, a method of preparing erythritol using a microorganism according to the present invention will be described.

트리코스포론속의 균주를 포도당 25∼45%, 옥수수침지액 3∼5%를 함유한 액체 배지에서 32∼38℃, 0.8∼1.2vvm, 200∼500rpm의 조건으로 50L 발효기에서 배양하면 140∼190g/L로 에리스리톨을 생산하고 부산물인 글리세롤은 균체에 의해 탄소원으로 서서히 소모된다. 발효가 완료된 후 배양액에서 활성탄을 이용하여 색소를 제거하고 농축기를 이용하여 농축한 후 상온에서 결정화시켰다. 이때 생성된 물질의 녹는점은 119℃(meso-erythitol의 녹는점 : 119℃)이었고 HPLC로 분석결과 순도는 99%이상 이었다.Strains of the genus Tricosphoron were cultured in a 50 L fermenter at 32 to 38 ° C, 0.8 to 1.2 vvm, and 200 to 500 rpm in a liquid medium containing 25 to 45% glucose and 3 to 5% corn steep liquor. The production of erythritol with L and by-product glycerol is slowly consumed as a carbon source by the cells. After the fermentation was completed, the pigment was removed from the culture using activated carbon, concentrated using a concentrator and crystallized at room temperature. The melting point of the produced material was 119 ℃ (melting point of meso-erythitol: 119 ℃) and the purity was more than 99% by HPLC.

다음 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.The present invention will be described in more detail with reference to the following examples.

[실시예 1]Example 1

옥수수침지액 4%와 포도당 30∼45%가 포함된 50ml의 배지를 250ml의 삼각 플라스크에 넣고 120℃로 15분간 멸균하였다. 냉각시킨 후 포도당 40%, 효모추출물 1.0%와 한천 2%를 포함하는 사면 배지에 배양된 균주를 접종한 후 35℃ 배양기에서 200rpm으로 5∼8일간 배양하였다. 결과를 표1에 나타낸다.50 ml of medium containing 4% corn steep liquor and 30-45% glucose was placed in a 250 ml Erlenmeyer flask and sterilized at 120 ° C. for 15 minutes. After cooling, the inoculated strains were cultured in a slope medium containing 40% glucose, 1.0% yeast extract, and 2% agar, and then incubated at 200 rpm in a 35 ° C. incubator for 5-8 days. The results are shown in Table 1.

[실시예 2]Example 2

(1)종균 배양액의 제조(1) Preparation of spawn culture

트리코스포론속 균주를 포도당 40%, 효모추출물 1.0%와 한천 2%를 포함하는 사면배지에 접종하고 35℃에서 3일 동안 정치배양하였다. 그 다음 상기와 같이 배양한 균체를 포도당 30%와 옥수수침지액 4%가 포함된 50ml의 배지가 들어있는 250ml 삼각플라스크에 1백금이 이식하고 35℃에서 2일 동안 배양하였다.Tricosporon strains were inoculated into a slope medium containing 40% glucose, 1.0% yeast extract and 2% agar, and incubated at 35 ℃ for 3 days. Then, the cells were cultured as described above, and then platinum was implanted into a 250 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of medium containing 30% of glucose and 4% of corn steep liquor and incubated at 35 ° C. for 2 days.

(2)본 배양(2) this culture

30%의 포도당과 4%의 옥수수침지액이 포함된 3L의 배지가 들어있는 5L 발효기를 120℃로 15분간 멸균하였다. 냉각시킨 후 위에서 배양한 종균배양액 200ml를 첨가한 후 35℃에서 1vvm으로 공기를 주입하면서 500rpm으로 3.5일간 배양하였다. 그 결과 에리스리톨은 146g/L로 생산되었고 글리세롤은 미량 검출되었다.A 5L fermenter containing 3L of medium containing 30% glucose and 4% corn steep liquor was sterilized at 120 ° C. for 15 minutes. After cooling, 200 ml of the culture medium spawned in the above was added, followed by incubation at 500 rpm for 3.5 days while injecting air at 1 vvm at 35 ° C. As a result, erythritol was produced at 146 g / L and trace amounts of glycerol were detected.

[실시예 3]Example 3

31%의 포도당과 4%의 옥수수침지액을 포함하는 50L 용량의 발효조에 넣고 120℃로 15분간 증기 멸균시킨 후 실시예 2의 방법에 따라 제조한 7%의 종균배양액을 가하였다. 그후 35℃에서 1vvm으로 공기를 주입하면서 400rpm으로 약 3일간 배양하였다. 배양 종료후 포도당은 모두 소모되었고 에리스리톨이 153g/L로 생산되었다.Into a 50L fermentation tank containing 31% glucose and 4% corn steep liquor was steam sterilized at 120 ℃ for 15 minutes, and 7% seed culture was prepared according to the method of Example 2. Then incubated at 400rpm for about 3 days while injecting air at 1vvm at 35 ℃. Glucose was consumed after the incubation and erythritol was produced at 153 g / L.

Claims

A process for producing high yield erythritol, characterized by culturing and purifying tricosphorone microorganisms (Accession No .: KCCM-10077) in a liquid medium containing 25 to 45% glucose and 3 to 5% corn steep liquor.

The method of claim 1, wherein the incubation temperature is 32 to 38 ℃, the air injection speed is 0.8 to 1.2vvm, the stirring conditions are 200 to 500rpm manufacturing method of high yield erythritol.

Tricosphorone microorganism producing erythritol in high yield (Accession No .: KCCM-10077)

The components of the honeycomb are suspended in a liquid medium consisting of 35-45% glucose and 1.0% yeast extract, incubated at 28-32 ° C for 3-4 days, and agar medium containing 35-45% glucose and 1.0% yeast extract. The microflora produced by incubating at 28-32 ° C. for 3-4 days was suspended for 4-6 days in a liquid medium consisting of 15-25% glucose, 0.5% yeast extract, and 0.1% urea, respectively. Separation method of trichosphorone microorganisms (Accession No .: KCCM-10077) of claim 3, characterized by measuring the erythritol production titre using HPLC and selecting the excellent strain.