KR0141779B1 - (h2n)2co measuring bio-sensor and manufactofactoring method - Google Patents
(h2n)2co measuring bio-sensor and manufactofactoring methodInfo
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Abstract
본 발명은 요소측정용 바이오센서 및 그 제조방법에 관한 것으로, 요가수분해효소 반응결과 생성되는 암모늄이온과 바이카보네이트 이온을 측정하기 위한 전극을 한 기판위에 구현한 멀티일렉트로드형으로 상기 두 개의 이온을 두 개의 전극을 이용해 동시에 차동방식으로 측정함으로써 감도를 향상시킬 수 있으며, 다른 간섭물질의 영향을 배제할 수 있고, 효소고정화를 포함하여 바이오센서를 제조하는 모든 프로세스를 후막형 고제전극소자를 만드는 프로세스에 포함시킬 수 있으므로 요소센서의 소형화 및 양산에 유리하므로 이를 활용하면 휴대용 요소측정기, 병원 임상용 자동분석기들에 널리 사용할 수 있으며, 또한 효소막이 건조된 상태로 바이오센서를보관할 수 있기 때문에 건조포장 후 측정시에만 시료와 반응시킴으로써 센서의 보광성을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.The present invention relates to a biosensor for measuring urea and a method of manufacturing the same. Sensitivity can be improved by measuring differentially with two electrodes simultaneously, eliminating the influence of other interferences, and all processes for manufacturing biosensors, including enzyme immobilization, are used to make thick film solid-state electrode devices. As it can be included, it is advantageous for miniaturization and mass production of urea sensor. Therefore, it can be widely used in portable urea meter and automatic clinical analyzer for hospital. Also, the biosensor can be stored with the enzyme membrane dried. Reactivity of the sensor by reacting with the sample only There is an effect that can be improved.
Description
제1도는 본 발명에 의한 일실시예의 요소측정용 바이오센서의 구성도.1 is a block diagram of a biosensor for measuring urea according to an embodiment of the present invention.
제2도는 제1도 요소측정용 바이오센서의 수직단면도.2 is a vertical cross-sectional view of the biosensor for measuring element 1.
제3도는 본 발명에 의한 요소측정용 바이오센서의 감도측정회로도.3 is a sensitivity measurement circuit diagram of a biosensor for measuring urea according to the present invention.
제4도는 본 발명에 의한 요소측정용 바이오센서의 출력파형도.4 is an output waveform diagram of the biosensor for measuring urea according to the present invention.
제5도는 본 발명에 의한 요소측정용 바이소센서의 요소농도의 변화에 따른 전압을 나타낸 그래프.5 is a graph showing the voltage according to the change of the urea concentration of the urea sensor for measuring urea according to the present invention.
제6도는 본 발명에 의한 다른 실시예의 요소측정용 바이오센서의 수직단면도.6 is a vertical cross-sectional view of a biosensor for measuring urea according to another embodiment of the present invention.
*도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명* Explanation of symbols for the main parts of the drawings
1:기판2:전도성라인1: Substrate 2: Conductive Line
3,3',4,4':이온선택성전극5:기준전극3,3 ', 4,4': ion selective electrode 5: reference electrode
6:절연층7:효소고정화층6: insulation layer 7: enzyme fixation layer
8:외부막9:단백질층8: outer membrane 9: protein layer
본 발명은 요소(尿素, (H2N)2CO) 측정용 바이오센서(biosensor)에 관한 것으로, 특히 일회용으로의 제조가 용이하고 감도특성을 향상시키기 위한 요소측정용 바이오센서 및 그 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a biosensor for measuring urea (尿 素, (H 2 N) 2 CO), in particular, easy to manufacture in a single-use, and for the urea measurement biosensor for improving the sensitivity characteristics and a manufacturing method thereof It is about.
일반적으로 요소는 포유류의 간장(肝臟)에서의 요소사이클에 의한 각종 아미노산의 대사산물인 질소성분으로부터 합성되고 신장(腎臟)을 통해 분비되어 혈중 및 소변중의 포함된 양이 변호하며, 이것은 신장기능의 이상을 판별할 수 있으므로 그 측정이 매우 중요하며 현대에 들어와서는 요소 측정용 바이오센서를 사용하여 혈액이나 소변중에 함유된 요소의 양을 전기화학적 측정법을 이용해 정량적으로 측정한다.In general, urea is synthesized from nitrogen, a metabolite of various amino acids by the urea cycle in the mammalian liver, and secreted through the kidneys to represent the amounts contained in the blood and urine. As it is possible to determine the abnormality, the measurement is very important. In modern times, the urea measurement biosensor is used to measure the amount of urea in blood or urine quantitatively by electrochemical measurement.
상기 요소 측정용 바이오센서는 주로 요소가수분해효소(urease)를 전극표면에 막(membrane) 형태로 고정시켜 다음과 같은 반응식(1,2,3)에 의한 효소반응결과 생성되는 전극활성물질인 암모늄이온(NH4 +) 및 H+이온을 측정하기 위하여 각각 암모늄 이온 선택성 전극과, pH전극, 이온선택성 전계효과 트랜지스터(ISFET:Ion Selective Field Effect Transistor) 등의 소자를 이용하도록 개발되었다.The biosensor for measuring urea is ammonium, an electrode active material produced as a result of the enzymatic reaction according to the following reaction equation (1, 2, 3) by fixing urease in the form of a membrane (membrane) on the electrode surface. In order to measure ions (NH 4 + ) and H + ions, it was developed to use devices such as an ammonium ion selective electrode, a pH electrode, and an ion selective field effect transistor (ISFET).
또한 최근에 들어서는 전도도가 변하는 것을 이용하는 방법도 시도되고 있는데, 이와 같이 전기화학적 측정원리에 입각한 바이오센서의 경우 효소반응시 생성되는 이온들의 간접적 측정에 의존하기 때문에 이들 이온을 측정할 수 있는 변환장치(transducer)의 감도 및 성능에 크게 영향을 받으므로 바이오센서를 소형화하기 위해서는 상기 변환장치의 소형화와, 상기 변환장치와 생체물질간의 고정화기술에 관한 기술개발이 매우 중요하며, 현재까지는 일반적인 바이오센서의 경우 효소와 같은 생체물질을 센서감지막으로 사용함으로써 이러한 생체물질들이 가지는 수명의 한께, 즉 보관성이 떨어지므로 보관성을 향상시키거나 바이오센서를 일회용으로 사용하는 방법의 연구개발이 시급하다.In recent years, a method using a change in conductivity has also been attempted. As such, a biosensor based on the principle of electrochemical measurement depends on an indirect measurement of ions generated during an enzymatic reaction. Since the sensitivity and performance of the transducer are greatly affected, the miniaturization of the converter and the technology development of the immobilization technology between the converter and the biomaterial are very important to miniaturize the biosensor. In this case, by using a biomaterial such as an enzyme as a sensor sensing film, the life span of these biomaterials is reduced, that is, the storage is inferior, so it is urgent to research and develop a method of improving storage or using a biosensor for single use.
그러나 상기의 전기화학적 측정법을 이용한 요소측정용 바이오 센서의 경우에는 막대모양의 암모니윰이온 선택성전극 및 pH전극을 변환장치로 활용하는 경우 센서의 소형화가 어렵고, pH-ISFET의 경우에는 소형화는 가능하나 ISFET 단위 소자의 출력편차 때문에 안정된 센서신호를 얻는 것이 어려우며, 시료용액내에 존재하는 다른 이온, 즉 간섭물질에 의한 영향으로 정량측정이 어려운 문제점이 있다.However, when the rod-shaped ammonium ion selective electrode and pH electrode are used as the converter for the urea measurement biosensor using the electrochemical measurement method, it is difficult to miniaturize the sensor. In the case of pH-ISFET, the sensor can be miniaturized. It is difficult to obtain a stable sensor signal due to the output deviation of the ISFET unit element, and the quantitative measurement is difficult due to the influence of other ions, that is, interference materials, present in the sample solution.
따라서 본 발명의 제1목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 기준전극양측에 효소반응결과 생성되는 전극활성물질중 두 개의 이온을 측정하기 위한 두 개의 이온선택성전극을 형성함으로써 전극활성물질을 동시에 측정하여 감도를 높이고 다른 간섭물질의 영향을 배재하며, 스트립형(strip type)으로 형성함으로써 일정량의 혈액이나 뇨시료와 반응시키기 편리하고, 이온선택성 고체전극 상부에 효소감응막을 형성시킴으로써 시료와의 반응시 센서가 충분한 전기적신호를 나타낼 수 있으며, 효소막이 건조된 상태에서 센서를 보관하므로 저장성이 우수한 요소측정용 바이오센서를 제공하는 것이다.Therefore, the first object of the present invention is to measure the electrode active material at the same time by forming two ion selective electrodes for measuring two ions of the electrode active material generated as a result of the enzyme reaction on both sides of the reference electrode to solve the above problems Increase sensitivity, eliminate influence of other interferences, and form strip type, which is convenient to react with a certain amount of blood or urine sample, and react with sample by forming enzyme-sensitive membrane on the ion-selective solid electrode. The sensor can display a sufficient electrical signal, and the sensor is stored in the dried state of the enzyme membrane to provide a biosensor for measuring urea excellent.
본 발명의 제2목적은 기준전극 없이 4개의 이온선택성전극으로 구성되어 멀티일렉트로드를 구현할 수 있는 요소측정용 바이오센서를 제공하는 것이다.A second object of the present invention is to provide a biosensor for urea measurement, which is composed of four ion-selective electrodes without a reference electrode and can implement a multi-electrode.
본 발명의 제3 및 제4목적은 상기 요소측정용 바이오센서를 제조하기 위한 제조방법을 제공하는 것이다.It is a third and fourth object of the present invention to provide a manufacturing method for manufacturing the urea measurement biosensor.
본 발명의 제5목적은 상기 요소측정용 바이오센서의 감도를 효과적으로 측정하기 위한 요소측정용 바이오센서의 감도측정회로를 제공하는 것이다.A fifth object of the present invention is to provide a sensitivity measurement circuit of a urea measurement biosensor for effectively measuring the sensitivity of the urea measurement biosensor.
상기 제1목적을 달성하기 위한 본 발명의 요소측정용 바이오센서는 기판위에 서로 나란하게 형성된 다수의 전도성라인과, 상기 전도성 라인중 중앙의 전도성라인상에 형성된 기준전극과, 상기 기준전극을 중심으로 양측의 전도성라인상에 형성된 이온선택성전극과, 상기 기준전극 및 각각의 이온선택성 전극이 형성된 결과물 전면에 각 전극의 상부만 노출되도록 형성된 절연층과, 상기 각각의 이온선택성전극의 노출부분과 접촉하도록 형성된 효소고정화층과, 상기 모든 전극 전면에 걸쳐 형성된 외부막을 포함하여 구성된 것을 특징으로 한다.The biosensor for measuring urea of the present invention for achieving the first object includes a plurality of conductive lines formed parallel to each other on a substrate, a reference electrode formed on a conductive line in the center of the conductive lines, and the reference electrode. Ion-selective electrodes formed on the conductive lines on both sides, an insulating layer formed to expose only the upper portion of each electrode on the front surface of the resultant electrode on which the reference electrode and the respective ion-selective electrodes are formed, and contacting the exposed portions of the respective ion-selective electrodes. The enzyme immobilization layer formed, and the outer membrane formed over the entire electrode characterized in that it comprises a.
상기 제2목적을 달성하기 위한 본 발명의 요소측정용 바이오센서는 기판위에 서로 나란하게 형성된 다수의 전도성라인과, 두 개의 전도성 라인을 한쌍으로 하여 쌍별로 서로 다른 이온을 측정하여 상기 각각의 전도성 라인상에 형성된 이온선택성전극과, 상기 이온선택성 전극이 형성된 결과물 전면에 각 전극의 상부만 노출되도록 형성된 절연층과, 상기 한쌍의 이온선택성 전극마다 하나의 이온선택성전극을 선택하여 선택된 이온선택성전극의 상부와 연결되도록 형성된 효소고정화층과, 나머지 이온 선택성전극의 상부와 연결되도록 형성된 단백질층과, 상기 모든 이온선택성전극 전면에 걸쳐 형성된 외부막을 포함하여 구성된 것을 특징으로 한다.The urea measurement biosensor according to the present invention for achieving the second object is a plurality of conductive lines formed side by side on the substrate and two conductive lines in pairs to measure different ions by pairs to each of the conductive lines An ion selective electrode formed on the upper surface of the ion selective electrode selected by selecting an ion selective electrode for each of the pair of ion selective electrodes, an insulating layer formed to expose only an upper portion of each electrode on the entire surface of the resultant on which the ion selective electrode is formed And an enzyme immobilization layer formed to be connected to and a protein layer formed to be connected to an upper portion of the remaining ion selective electrodes, and an outer membrane formed over the entire surface of all the ion selective electrodes.
상기 제3목적을 달성하기 위한 본 발명의 제조방법은 기판 위에 전도성 물질로 다수의 상호 평행한 전도성라인을 형성하는 과정과, 상기 전도성라인 형성 후 중앙의 전도성 라인을 제외한 양측 전도성라인상에 서로 다른 이온을 선택하기 위한 각각의 고분자 페이스트를 프린트하여 이온선택성전극을 형성하고 상기 중앙의 전도성 라인상에 은페이스트를 프린트하여 기준전극을 형성하는 과정과, 상기 기준전극 형성 후 결과물 전면에 상기 기준전극 및 각각의 이온선택성전극의 상부 일부영역만 노출되도록 유전물질을 프린트하여 절연층을 형성하는 과정과, 상기 이온선택성전극의 상부에 효소/고분자 페이스트를 프린트하여 효소고정화층을 형성하는 과정과, 상기 기준전극 및 각각의 이온선택성전극에 걸쳐 외부막을 형성하는 과정을 포함하여 구성된 것을 특징으로 한다.The manufacturing method of the present invention for achieving the third object is a process of forming a plurality of mutually parallel conductive lines with a conductive material on the substrate, and different from each other on both conductive lines except for the central conductive line after forming the conductive line Printing each polymer paste for selecting ions to form an ion selective electrode, and printing a silver paste on the central conductive line to form a reference electrode, and after forming the reference electrode, the reference electrode and Printing an dielectric material to expose only a portion of the upper portion of each ion selective electrode to form an insulating layer, printing an enzyme / polymer paste on the ion selective electrode to form an enzyme immobilization layer, and the reference A process including forming an outer film over the electrode and each ion selective electrode. It is characterized by.
상기 제4목적을 달성하기 위한 본 발명의 제조방법은 기판위에 전도성 물질로 다수의 상호평행한 전도성라인을 형성하는 과정과, 상기 두 개의 전도성라인을 한쌍으로 하여 각쌍별로 서로 다른 이온을 선택하기 위한 각각의 고분자 페이스트를 프린트하여 이온선택성전극을 형성하는 과정과, 상기 각각의 이온선택성전극의 상부일부영역이 노출되도록 유전물질을 프린트하여 절연층을 형성하는 과정과, 한쌍의 이온선택성전극마다 하나의 이온선택성전극을 선택하여 선택된 이온선택성전극 상부에 효소/고분자 페이스트를 프린트하여 효소고정화층을 형성하고 나머지 이온선택성전극 상부에 단백질층을 형성하는 과정과, 모든 이온선택성전극에 걸쳐 외부막을 형성하는 과정을 포함하여 구성된 것을 특징으로 한다.The manufacturing method of the present invention for achieving the fourth object is a process for forming a plurality of mutually parallel conductive lines with a conductive material on the substrate, and to select different ions for each pair by using the two conductive lines as a pair Printing each polymer paste to form an ion selective electrode, printing a dielectric material so as to expose a portion of the upper portion of each ion selective electrode, and forming an insulating layer, one for each pair of ion selective electrodes A process of forming an enzyme immobilization layer by forming an enzyme / polymer paste on top of a selected ion selective electrode by selecting an ion selective electrode, and forming a protein layer on top of the remaining ion selective electrodes, and forming an outer membrane over all ion selective electrodes. Characterized in that configured to include.
상기 제5목적을 달성하기 위한 본 발명의 요소측정용 바이오센서의 감도측정회로는 요소측정용 바이오센서의 각 전극의 신호를 버퍼링하기 위한 버퍼부와, 기준전극의 신호가 공통으로 비반전입력단자에 입력되고 각각의 이온선택성전극의 신호가 반전입력단자에 입력되는 두 개의 차동증폭기를 통해 기준전극의 신호와 이온선택성 전극간의 신호차를 증폭시키기 위한 제1차동증폭부와, 상기 제1차동증폭기의 출력신호를 이득조절하여 다시 차동증폭시키는 제2차동증폭부를 포함하여 구성된 것을 특징으로 한다.Sensitivity measurement circuit of the urea measurement biosensor of the present invention for achieving the fifth object is a non-inverting input terminal having a buffer for buffering the signal of each electrode of the urea measurement biosensor, the signal of the reference electrode in common A first differential amplifier for amplifying a signal difference between the signal of the reference electrode and the ion selective electrode through two differential amplifiers inputted to the inverting input terminal and the signal of each ion selective electrode is input to the inverting input terminal, and the first differential amplifier It is characterized in that it comprises a second differential amplifier for differentially amplifying again by controlling the gain of the output signal.
이하 첨부도면을 참조하여 본 발명을 좀 더 상세하게 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings.
제1도 및 제2도는 기준전극 양측에 각기 다른 이온을 측정하기 위한 이온선택성전극을 형성한 본 발명의 일실시예로서, 먼저 후막형 고체전극 제조용 절연성기판으로, 예를 들어 0.3mm의 폴리에스테르(polyester) 기판(1) 위에 은(Ag) 페이스트를 스크린 프린팅한 후 110℃에서 약 10분간 건조시켜 두 개의 이온선택성전극(3,4) 및 기준전극(5)용 전도성라인(2) 및 연결패드를 형성한다.1 and 2 are embodiments of the present invention in which an ion selective electrode for measuring different ions is formed on both sides of a reference electrode. First, an insulating substrate for manufacturing a thick-film solid electrode, for example, 0.3 mm polyester Screen printing silver (Ag) paste on the (polyester) substrate 1 and drying at 110 ° C for about 10 minutes to connect the conductive lines 2 for the two ion-selective electrodes 3 and 4 and the reference electrode 5. Form a pad.
다음 상기 전도성라인(2) 위에 염화은(AgCl)이 함유된 은페이스트를 프린트하여 Ag/AgCl로 이루어진 기준전극(5)을 형성하고, 상기 기준전극(5)을 중심으로 양측의 전도성라인(2)에 고분자 페이스트를 각각 프린트하여 암모늄이온(NH4 +)과 바이카보네이트이온(HCO3 -)을 측정하기 위한 이온선택성막(3,4)을 형성한다.Next, a silver paste containing silver chloride (AgCl) is printed on the conductive line 2 to form a reference electrode 5 made of Ag / AgCl, and conductive lines 2 on both sides of the reference electrode 5 are formed. The polymer paste was printed on each other to form ion selective membranes 3 and 4 for measuring ammonium ion (NH 4 + ) and bicarbonate ion (HCO 3 − ).
이 때 상기 고분자 페이스트는 상기 폴리에스테르 기판(1)과의 접착성이 우수하도록 일반적인 이온선택성 고분자막을 변용시켜 사용하며, 본 발명에서는 폴리우레탄(polyurethane)과 폴리비닐클로라이드(polyvinyl-chloride)를 적정비율로 섞은 코폴리마(coploymer)에 이온투과성을 향상시키기 위한 이오노포아(ionopHore)로서 암모늄이온 측정용은 노낙틴(nonactin)을, 바이카보네이트이온 측정용은 트리훌루오로아세틸 부틸벤젠(trifluoroacetyl-p-butylbenzene)을 각각 1%가 되도록 첨가하고, 소성을 향상시키기 위한 가소제로서는 다이옥틸세바케이트(dioctyl sebacate)를 사용하여 형성한다.In this case, the polymer paste is used by modifying a general ion-selective polymer membrane to excellent adhesion to the polyester substrate (1), in the present invention, the appropriate ratio of polyurethane (polyurethane) and polyvinyl chloride (polyvinyl chloride) IonopHore to improve the ion permeability to co-polymer mixed with chlorine, nonactin for the measurement of ammonium ion and trifluoroacetyl- butylbenzene for the measurement of bicarbonate ion. p-butylbenzene) is added to 1%, respectively, and it forms using dioctyl sebacate as a plasticizer for improving plasticity.
그리고 상기 암모늄이온 및 바이카보네이트이온 선택성막은 이들 이온에 대한 선택성만 우수하면 어떤 형태라도 상기와 유사한 방법으로 페이스트를 제조해도 된다.The ammonium ion and bicarbonate ion selective film may be prepared in a similar manner to the paste in any form as long as the selectivity to these ions is excellent.
계속하여 상기 기준전극(5) 및 이온선택성전극(3,4)이 형성되면 유전체페이스트를프린팅하여 80W/cm 용량의 자외선을 9m/min의 속도로 조사시켜 절연층(6)을 형성한 후 상기 상부영역이 노출된 각각의 이온선택성전극(3,4)의 상부에 효소/고분자 페이스트를 프린트하여 효소고정화층(7)을 형성하며, 이어서 6%의 하이드록시에틸 셀룰로오즈(hydroxyethyl cellulose) 페이스트를 상기 기준전극(5)과 두 개의 이온선택성전극(3,4)에 걸쳐 프린팅하여 외부막(8)을 형성한다.Subsequently, when the reference electrode 5 and the ion selective electrodes 3 and 4 are formed, a dielectric paste is printed to irradiate 80 W / cm ultraviolet light at a speed of 9 m / min to form the insulating layer 6. An enzyme / polymer paste is printed on top of each of the ion-selective electrodes 3 and 4 where the upper region is exposed to form an enzyme immobilization layer 7, and then 6% hydroxyethyl cellulose paste is added. The outer film 8 is formed by printing over the reference electrode 5 and the two ion selective electrodes 3 and 4.
이 때 상기 효소/고분자 페이스트는 효소로서 역가 250U/mg protein인 잭 빈(jack beans)에서 추출한 요소가수분해효소 500mg을 2% 하이드록시에틸 셀룰로오즈 5ml와 함께 넣은 후 충분히 섞어 균질의 효소용액을 형성한 후 고분자인 친수성 폴리우레탄 1.5g을 상기 효소용액과 완전히 섞음으로써 형성하며, 이 효소/고분자 페이스트는 냉장고에 보관하면서 스크린 프린팅시 일정량씩 사용하도록 한다.At this time, the enzyme / polymer paste was added with 500 ml of 2% hydroxyethyl cellulose and 500 mg of urease hydrolysate extracted from jack beans having an activity of 250 U / mg protein as an enzyme. It is then formed by mixing a polymer of hydrophilic polyurethane 1.5g with the enzyme solution completely, the enzyme / polymer paste is to be used in a certain amount during screen printing while storing in the refrigerator.
이러한 방법은 센서를 후막형태의 고체전극으로 제조하는 것으로, 센서를 소형화시킬 수 있으며 막대모양의 일반적인 이온선택성전극과 달리 내부표준전위용액(internal reference electrolyte solution)이 필요없을 뿐 아니라 혈액이나 뇨 시료 약 20μl와 반응시키기 편리하도록 스트립형으로 만들 수 있기 때문에 일회용으로 만들기 용이하다.This method is to manufacture the sensor as a thick film-type solid-state electrode, which can be miniaturized and unlike the rod-shaped ion-selective electrode, there is no need for an internal reference electrolyte solution, and blood or urine samples It is easy to make single-use because it can be made into strip form for easy reaction with 20μl.
또한 상기 외부막으로 하이드록시에틸 셀룰로오즈가 함유된 페이스트를 제조, 프린팅하여 센서의 사용시 시료용액이 전극 감응부위에 잘 분산되도록할 뿐만 아니라 바이소센서를 제조하는 전 프로세스를 후막형 고체전극소자를 만드는 프로세스에 포함시킬 수 있어 양산에 매우 유리하다.In addition, by preparing and printing a paste containing hydroxyethyl cellulose as the outer membrane, the sample solution is well dispersed in the electrode sensitive area when the sensor is used, and the entire process of manufacturing the biso sensor is used to make a thick film-type solid electrode device. It can be included in the process, which is very advantageous for mass production.
그리고 상기와 같은 본 발명의 기본측정원리는 다음과 같다.And the basic measurement principle of the present invention as described above is as follows.
위에서 설명한 반응식(1,2,3)에서와 같이 효소반응결과 생성되는 전극활성물질인 암모니아 가스(NH3)및 탄산가스(CO2)에 의한 포텐시오메트릭(potentiometric) 측정이 기본원리이며, 암모늄이온(NH4 +)을 측정하기 위한 이온선택성막과 바이카보네이트이온(HCO3 +)을 측정하기 위한 이온선택성막을 동일한 기판상에 각각 제조한 후 그 위에 요소가수분해효소를 고정화시켜 다음과 같은 과정에 의해 요소측정을하게 된다.Potentiometric measurement by the ammonia gas (NH 3 ) and carbon dioxide (CO 2 ), the electrode active materials produced as a result of the enzyme reaction, as described in the reaction schemes (1, 2, 3) described above is the basic principle. Ion-selective membranes for measuring ions (NH 4 + ) and ion-selective membranes for measuring bicarbonate ions (HCO 3 + ) were prepared on the same substrate, and the urease was immobilized thereon as follows. Element measurement is performed by the process.
먼저(반응식 1)과 같은 효소반응에서 생성된 암모니아가스의 경우(반응식 2)에서와 같이 막내에서 가수분해되어 암모늄이온과 하이드록실이온(OH-)이 생성되는데, 결과적으로 시료용액내 존재하는 요소농도에 비례하여 감응막내에 이들 이온의 농도가 증가하게 되고, 암모늄이온 농도에 비례하는 이온선택성전극의 전위차는 센서출력에 정(+)방향의 신호로 작용하게 되며, 탄산가스의 경우는 (반응식 3)과 같이 막내에서 가수분해되어 바이카보네이트이온과 수소이온(H+)을 생성하고, 결과적으로 시료용액내 존재하는 요소농도에 비례하여 감응막내에 이들 이온의 농도가 증가하게 되며, 이에 따라 바이카보네이드이온 농도에 비례하는 이온선택성전극의 전위차가 센서출력에 부(-)방향으로 작용하게 된다.First (Scheme 1) and an ammonium ion and hydroxyl ion is hydrolyzed in the membrane, as shown in (Scheme 2) In the case of the ammonia gas produced in the enzymatic reaction of (OH -) there is created, elements that result exist in the sample solution The concentration of these ions in the sensitizing membrane increases in proportion to the concentration, and the potential difference of the ion-selective electrode proportional to the concentration of ammonium ions acts as a positive signal to the sensor output. Hydrolysis in the membrane to produce bicarbonate ions and hydrogen ions (H + ), as shown in 3), results in an increase in the concentration of these ions in the sensitizing membrane in proportion to the concentration of urea present in the sample solution. The potential difference of the ion-selective electrode proportional to the concentration of carbonide ion acts negatively on the sensor output.
따라서 실온에서 pH 7.9인 1mM 트리스버퍼(tris buffer) 용액상에서 표준요소용액을 사용하여 본 발명의 요소측정용 바이오센서의 응답을 살펴보면, 제4도에 도시한 바와 같이 이들 암모늄이온 선택성 전극의 전압(실선)과 바이카보네이드이온 선택성 전극의 전압(일점쇄선)에 의한 전위차를 차동증폭시켜(점선) 암모늄이온 선택성 전극만을 이용할 때보다 약 두배의 신호증폭효과를 가져오며, 제5도에 도시한 바와 같이 요소농도 10-5~10-2［M］까지 좋은 응답특성을 나타낸다.Therefore, the response of the urea measurement biosensor using a standard urea solution in a 1 mM tris buffer solution at pH 7.9 at room temperature is shown. As shown in FIG. 4, the voltages of these ammonium ion selective electrodes ( Solid line) and the voltage difference (dotted line) of the bicarbonate ions selective electrode differentially amplified (dotted line), resulting in about twice the signal amplification effect as using only the ammonium ion selective electrode, as shown in FIG. Similarly, it shows good response characteristics from urea concentration 10 -5 to 10 -2 [M].
실제로 본 발명에서는 제3도에 도시한 바와 같이 각 이온선택성전극(3,4)의 신호를 비반전입력으로 하며 반전입력단자는 자신의 출력단과 연결된 오피엠프(34,36)와, 상기 기준전극(5)의 신호를 비반전입력으로 하며 반전입력단자는 자신의 출력단과 연결된 오피엠프(35)로 구성된 버퍼부(31)에서 상기 기준전극(5) 및 각각의 이온선택성전극(3,4)의 신호를 버퍼링한 후 상기 버퍼링된 기준전극의 신호가 공통으로 비반전입력단자에 입력되고 각각의 이온선택성전극의 신호가 반전입력단자에 입력되는 두 개의 차동증폭기(37,38)로 구성된 제1차동증폭부(32)에서 상기 기준전극의 신호와 이온선택성전극간의 신호차를 증폭시킨 후 다시 제2차동증폭부(33)에서 상기 제1차동증폭부(32)의 출력신호를 이득조절하여 다시 차동증폭시킨다.In fact, in the present invention, as shown in FIG. 3, the signals of the ion selective electrodes 3 and 4 are used as non-inverting inputs, and the inverting input terminals are op amps 34 and 36 connected to their output terminals, and the reference electrode. The signal of (5) is used as a non-inverting input, and the inverting input terminal is the reference electrode 5 and the respective ion selective electrodes 3 and 4 in the buffer unit 31 composed of an op amp 35 connected to its output terminal. A first signal comprising two differential amplifiers (37, 38) in which a signal of the buffered reference electrode is commonly input to a non-inverting input terminal and a signal of each ion-selective electrode is input to an inverting input terminal after buffering a signal of? After amplifying the signal difference between the signal of the reference electrode and the ion selective electrode in the differential amplifier 32, the second differential amplifier 33 gain-adjusts the output signal of the first differential amplifier 32 again. Differential amplification.
이 때 상기 제2차동증폭부(33)는 상기 제1차동증폭부(32)의 차동증폭기(37)의 출력신호가 인가되는 전압플로워(39)와, 차동증폭기(38)의 출력신호가 인가되는 전압플로워(40)의 출력단 사이에 연결된 가변저항(42)을 통해 적절한 출력범위를 갖도록 차동증폭기(41)의 이득값을 조절한다.In this case, the second differential amplifier 33 is a voltage follower 39 to which the output signal of the differential amplifier 37 of the first differential amplifier 32 is applied, and the output signal of the differential amplifier 38 is applied. The gain of the differential amplifier 41 is adjusted to have an appropriate output range through the variable resistor 42 connected between the output terminals of the voltage follower 40.
제6도는 기준전극 없이 4개의 이온선택성전극으로 멀티일렉트로드를 구현한 본 발명의 다른 실시예로서, 폴리에스테르 기판(1) 위에 은 페이스트를 스크린 프린팅한 후 소정시간 건조시켜 이온선택성전극(3,3')(4,4')용 전도성라인(2) 및 연결패드를 형성한다.6 shows another embodiment of the present invention in which a multi-electrode is implemented using four ion-selective electrodes without a reference electrode. Screen printing of a silver paste on the polyester substrate 1 and drying for a predetermined time results in ion-selective electrodes 3, 3 ') (4,4') conductive lines 2 and connection pads are formed.
그리고 상기 두 개의 전도성라인(2)을 한 쌍으로 하여 각쌍별로 서로 다른 이온을 선택하기 위한 각각의 고분자 페이스트를 프린트하여 두 쌍의 이온선택성전극(3,3')(4,4)을 형성하는데, 이 때 예를들어 한쌍의 이온선택성전극(3,3')은 암모늄이온을 선택하도록 하고, 다른 한쌍의 이온선택성전극(4,4')은 바이카보네이트이온을 선택하도록 하며, 각각의 이온선택성전극(3,3')(4,4')의 상부 일부영역이 노출되도록 유전물질을 프린트하여 절연층(6)을 형성한 후 상기 한쌍의 이온선택성전극(3,3')(4,4') 마다 하나의 이온선택성전극을 선택하여 선택된 이온선택성전극 상부에 효소/고분자 페이스트를 프린트하여 효소고정화층(7)을 형성하고 나머지 이온선택성전극 상부에 단백질층(9)을 형성하며, 계속하여 상기 모든 이온선택성전극(3,3')(4,4')에 걸쳐 외부막(8)을 형성한다.Then, the two conductive lines 2 are paired to print respective polymer pastes for selecting different ions for each pair to form two pairs of ion selective electrodes 3, 3 'and 4 and 4, respectively. In this case, for example, a pair of ion selective electrodes 3 and 3 'selects ammonium ions, and another pair of ion selective electrodes 4 and 4' selects bicarbonate ions. A dielectric material is printed to expose a portion of the upper portions of the electrodes 3, 3 '(4, 4') to form an insulating layer 6, and then the pair of ion selective electrodes 3, 3 '(4, 4). One ion-selective electrode is selected for each '), and the enzyme / polymer paste is printed on the selected ion-selective electrode to form the enzyme immobilization layer 7 and the protein layer 9 is formed on the remaining ion-selective electrode. The outer membrane 8 is formed across all of the ion selective electrodes 3, 3 'and 4, 4'. Sung.
이 때 상기 기판(1) 위에 형성된 모든 구조물들, 즉 전도성라인(2), 이온선택성전극(3,3')(4,4'), 절연층 효소고정화층(7) 및 외부막(8)은 상술한 일실시예에서와 동일한 물질을 사용하여 형성한다.At this time, all the structures formed on the substrate 1, that is, the conductive line 2, the ion selective electrodes 3, 3 '(4, 4'), the insulating layer enzyme immobilization layer 7 and the outer film 8 Is formed using the same material as in the above-described embodiment.
상기와 같이 다른 실시예에 의해 형성된 요소측정용 바이오센서는 상기 반응식(1)과 (2)에서 생성된 암모늄이온의 농도에 비례하는 전위차가 이온선택성전극(3,3')에 의해 차동출력되므로 온도 및 기타 간섭물질의 영향이 보정된 후 센서의 출력에 정방향의 신호로 작용하고, 또한 반응식(1)과 (3)에서 생성된 바이카보네이트 이온의 농도에 비례하는 전위차도 이온선택성전극(4,4')에 의해 차동출력되어 온도 및 기타 간섭물질에 의한 영향이 보정된 후 센서의 출력에 부방향으로 작용하게 된다.In the biosensor for urea measurement according to another embodiment as described above, the potential difference proportional to the concentration of ammonium ions produced in the reaction equations (1) and (2) is differentially output by the ion selective electrodes (3,3 '). After the influence of temperature and other interferences is corrected, it acts as a forward signal to the output of the sensor, and also the potential difference proportional to the concentration of bicarbonate ions produced in equations (1) and (3). 4 ') is differentially outputted to compensate for the effects of temperature and other interferences and then act in the negative direction of the sensor's output.
따라서 이러한 방법으로 상기 암모늄이온과 바이카보네이트 이온에 의한 차동전위차를 다시 차동증폭하여 측정해보면, 본 실시예에서는 상기 일실시에에서와 달리 이온선택성전극이 가지고 있는 간섭물질의 영향, 예를 들면 암모늄이온을 선택하기 위한 이온선택성전극의 경우 칼륨(K+)에 의한 간섭효과를 배제시킴으로써 실제 혈액이나 요시료를 분석하는데 매우 유리하다.Therefore, the differential potential difference between the ammonium ion and the bicarbonate ion is measured by differential amplification again. In this embodiment, unlike in the above embodiment, the influence of the interference material of the ion selective electrode, for example, ammonium ion The ion-selective electrode for selecting is very advantageous in analyzing the actual blood or urine sample by excluding the interference effect by potassium (K + ).
이상에서와 같이 본 발명에 의하면, 요가수분해효소 반응결과 생성되는 암모늄이온과 바이카보네이트 이온을 측정하기 위한 전극을 한 기판위에 구현한 멀티일렉트로드형이므로 상기 두개의 이온을 두개의 전극을 이용해 동시에 차동방식으로 측정함으로써 감도를 향상시킬 수 있으며, 다른 간섭물질의 영향을 배재할 수 있고, 효소고정화를 포함하여 바이오센서를 제조하는 모든 프로세스를 후막형 고체전극소자를 만드는 프로세스에 포함시킬 수 있게되어 요소센서의 소형화 및 양산에 유리하므로 이를 활용하면 휴대용 요소측정기, 병원 임상용 자동분석기들에 널리 사용할 수 있으며, 또한 효소막이 건조된 상태로 바이오센서를 보관할 수 있기 때문에 건조포장 후 측정시에만 시료와 반응시킴으로써 센서의 보관성을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.As described above, according to the present invention, since the electrodes for measuring ammonium ions and bicarbonate ions generated as a result of the hydrolytic enzyme reaction are embodied on one substrate, the two ions are simultaneously differentially operated using two electrodes. In this way, the sensitivity can be improved, sensitivity to other interferences can be eliminated, and all processes of manufacturing biosensors, including enzyme immobilization, can be included in the process of making thick-film solid-electrode devices. Since it is advantageous for miniaturization and mass production of sensors, it can be widely used in portable ureameters and automatic clinical analyzers for hospitals.In addition, biosensors can be stored with the enzyme membrane dried. This has the effect of improving the storage of the sensor. All.
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