KR0141563B1 - 잔류항생제의 진단방법 및 진단키트 - Google Patents

잔류항생제의 진단방법 및 진단키트

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KR0141563B1
KR0141563B1 KR1019940000108A KR19940000108A KR0141563B1 KR 0141563 B1 KR0141563 B1 KR 0141563B1 KR 1019940000108 A KR1019940000108 A KR 1019940000108A KR 19940000108 A KR19940000108 A KR 19940000108A KR 0141563 B1 KR0141563 B1 KR 0141563B1
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Abstract

항생제에 대한 항체를 하나 이상의 다수 개의 마이크로 웰을 갖는 기재상에 피복하고, 상기 항생제에 대한 항체가 피복된 기재상에 항생제-효소 표지 결합체 용액을 시료와 함께 첨가하고, 상기한 표지수단의 표지량을 측정하는 공정들을 포함하는 본 발명의 항생제의 진단방법은 식품내에 존재하는 항생제의 양을 현장에서 신속, 간편하게 정성적 및 정량적으로 확인할 수 있는 항생제의 진단방법이다.

Description

[발명의 명칭]
잔류 항생제의 진단방법 및 진단키트
[발명의 상세한 설명]
[산업상 이용분야]
본 발명은 항생제의 진단방법 및 진단키트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 식품에 함유되어 있는 항생제를 간편하게 정량적 및 정성적으로 확인할 수 있는 방법 및 그 진단키트에 관한 것이다.
[종래기술]
일반적으로 농작물 및 식용 동물 등을 재배 또는 사육할 경우 이들의 성장을 방해하는 미생물을 제거하기 위해서 또 이들로부터 제조한 식품을 보관할 경우 이들의 장기적인 보관을 위해서 이들 농작물 및 식용 동물에 항생제를 처리한다. 그러나 이러한 목적으로 처리한 항생제를 식품과 함께 일정량 이상 즉, 잔류허용기준치 이상 섭취할 경우 암, 알레르기, 위장염, 열, 구토, 체온저하 등이 발생하며 심할 경우에는 인체에 치명적인 악영향을 준다.
종래에는 이와 같은 식품 내의 항생제의 잔존량을 측정하기 위해서 미생물 배양법을 사용하거나 HPLC(High Perfomance Liquid Chromatography), 가스크로마토그래피(Gas Chromatography:GC)를 사용하여 왔다.
상기한 미생물 배양법은 항생제에 특이한 미생물을 시료와 함께 배양한후 특정시약을 첨가하여 항생제의 잔류여부를 색깔로 측정하는 방법(Igarashi, R.T, J. Dairy Sci., Vol. 43. P. 841, 1960)과 한천배지에 미생물을 단일층으로 도포한 후 디스크에 시료를 첨가하여 성장저해 영역을 측정하는 방법(Parks, O.W., J. Milk Food Technol., Vol. 22, pp. 74-76 1959)이 있다. 그러나 이와 같이 미생물을 이용한 종래의 방법은 미생물을 배양하는데 최소한 24시간 이상의 장시간이 소요되고 항생제종류에 따라 여러 미생물을 선택적으로 배양해야만 한다는 불편함이 있으며, 특히 검출한계가 낮아 정량 분석이 어렵다는 문제점이 있다.
또 HPLC, GC 방법은 정량분석은 가능하나 전처리 과정이 복잡하고 소요시간이 오래 걸리기 때문에 실험실에서만 사용가능하다는 장소적인 제한이 있어 산업현장에서 직접 사용하는 것이 불가능하다는 문제점이 있다.
[발명이 해결하려 하는 과제]
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은, 첫째 잔류 항생제의 정성적인 특성을 신속, 간편하게 확인할 수 있는 잔류 항생제의 진단방법을 제공하고, 둘째 잔류 항생제의 정량적인 특성을 신속, 간편하게 확인할 수 있는 잔류 항생제의 진단방법을 제공하고, 셋째 이와 같은 진단방법을 이용하여 현장에서 즉시 진단이 가능한 항생제 진단키트를 제공하고, 넷째 이와 같은 진단방법 및 진단키트를 사용하여 신속, 간편하게 식품내의 항생제의 잔류량을 측정하므로써 인체에 유해한 식품을 쉽게 구별하여 인류 건강에 도움을 주는 것을 목적으로 한다.
[과제를 해결하기 위한 수단]
본 발명자는 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 연구하던 중 면역학적 방법이 특이 항체를 이용하기 때문에 검출예민도가 높고 사용이 간편하다는데 착안하여 오랜 연구를 통하여 본 발명의 잔류 항생제 진단방법 및 진단키트를 완성하였다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 항생제에 대한 항체를 하나 이상의 다수 개의 마이크로 웰을 갖는 기재상에 피복하고, 상기 항생제에 대한 항체가 피복된 기재상에 항생제-효소 표지 결합체 용액을 시료와 함께 첨가하고, 상기한 표지수단의 표지량을 측정하는 공정들을 포함하는 항생제의 진단방법을 제공한다.
상기한 본 발명의 항생제 진단방법에 있어서, 상기한 표지수단의 표지량을 측정확인하는 공정은 다양한 농도의 항생제를 포함하는 표준 항생제 시료 용액에 상기한 본 발명의 항생제 진단 방법과 동일한 방법을 행하여 얻은 표지량과 비교하는 것이 바람직하며, 이와 같이 실시할 경우, 정성적인 검사뿐만 아니라 정량적인 검사도 손쉽게 가능하다.
또한 본 발명은 항생제에 대한 항체가 피복된 하나 이상의 다수 개의 마이크로 웰을 갖는 기재와 상기 항생제에 대한 항체가 피복된 기재상에 첨가될 항생제-효소 표지 결합체를 포함하는 항생제 진단키트를 제공한다.
상기한 본 발명의 항생제 진단키트에 있어서, 하나 이상의 다양한 농도의 항생제를 포함하는 표준 항생제 시료 용액을 더욱 포함하는 것이 바람직하며, 이와 같이 실시할 경우, 정성적인 검사 뿐만 아니라 정량적인 검사도 손쉽게 가능하다.
상기한 표준 항생제 시료의 항생제는 페니실린, 설파메타진, 테트라싸이클린으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항생제를 사용하는 것이 바람직하며, 이 때 표준 항생제 시료 용액의 농도는 상기한 페니실린은 0.0005 U/㎖ 내지 0.05 U/㎖, 상기한 설파메타진은 10ppb 내지 0.5 ppm, 상기한 테트라싸이클린은 20 ppb 내지 0.5 ppm 범위의 농도를 갖는 것이 바람직하다.
그리고 상기한 본 발명에 있어서 상기한 항생제는 페니실린, 설파메타진, 테트라싸이클린으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항생제인 것이 바람직하다. 본 발명은 상기한 다수 개의 마이크로웰 중 각각의 마이크로웰에 상기한 다양한 항생제의 항체를 피복한 하나의 기재를 사용하여 다양한 항생제에 대한 진단을 동시에 행할 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, 상기한 표지수단으로는 항체와 항원이 반응하는 것을 쉽게 확인할 수 있는 것이면 사용가능하며, 바람직하게는 발색효소법, 형광체를 이용하는 방법, 화학발광법, 방사성 동위원소 법으로 이루어진 군에서 선택하는 것이 바람직하며 특히 발색 효소, 발색물질, 기질용액을 사용하는 것이 바람직하다.
상기한 발색효소로서 호스라디쉬 페록시다제, 알칼린포스파타제, 베타-갈락토시다제로 이루어진 군에서 선택되는 발색효소를 사용하는 것이 바람직하며, 상기한 발색제는 테트라메틸 벤지딘, P-NPP (나이트로 페닐 포스페이트), 메틸움벨릴훼릴로 이루어진 군에서 선택되는 발색제인 것이 바람직하며, 상기한 기질은 과산화수소, 포스페이트, 베타-갈락토사이드로 이루어진 군에서 선택되는 기질인 것이 바람직하다. 이와 같은 발색효소 발색제 및 기질을 사용함으로써 상기한 발색유무 및 그 정도에 따라 항생제의 존재 및 존재량을 간편하게 확인할 수 있다.
또한 본 발명에서는 시료로서 가축의 혈청, 뇨, 우유 또는 식육추출물로부터 채취한 것을 바로 사용할 수 있어, 쉽게 산업현장에서 바로 항생제의 존재량을 측정할 수 있다.
[작용]
상기와 같은 면역학적인 방법 특히 효소 면역학적인 방법을 사용할 경우, 시료 속에 들어 있는 항생제와 항생제-효소 표지 결합체가 기재상에 도포되어 있는 항생제에 대한 항체에 대하여 경쟁적으로 반응하므로써 시료속에 들어 있는 항생제의 양이 많을 경우 상대적으로 적은 양의 항생제-표지수단 결합체가 항체와 반응하므로써 표지수단의 표지량이 감소하며, 시료속에 들어 있는 항생제의 양이 적을 경우 상대적으로 많은 양의 항생제-표지수단이 항체와 반응하므로써 표지수단의 표지량이 증가한다. 이와 같이 표지수단의 표지량이 많고 적음을 판단하므로써 본 발명은 식품내의 항생제의 존재여부를 간편하게 현장에서 확인할 수 있다.
또한 항생제의 존재량은 표지수단의 표지정도에 따라 판단할 수 있으며 보다 정확한 정량적인 판단을 위해서는 표준 항생제 시료 용액을 대상으로 동일한 반응을 행하여 그 표지 정도와 시료용액의 표지 정도를 비교함으로써 항생제의 정량적인 확인을 간편하게 할 수 있다.
이와 같은 본 발명의 진단방법 및 진단키트를 이용할 경우 식품내에 존재하는 항생제의 잔류량과 이들의 잔류허용기준을 동시에 확인할 수 있으며 특히 식육인 경우 동물의 혈청, 뇨, 우유, 등을 바로 시료로 사용하여 진단함으로써 간편하게 항생제의 잔류량을 측정할 수 있다는 장점이 있다.
[실시예]
이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 바람직한 실시예일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
먼저 본 발명의 대표적인 실시예를 기재하면 다음과 같다.
Ⅰ. 재료의 준비과정
1. 마이크로 플레이트 스트립 웰의 제조
마이크로 플레이트 스트립 웰의 내부표면에 페니실린(penicillin), 설파메타진(sulfamethazine), 테트라싸이클린(tetracycline)에 대한 항체를 각각 카보네이트 완충용액(50 mM, pH 9.6)에 적정 희석한 후 웰안에 200 ㎕씩 넣고 4℃에서 하루밤 방치시켜 항체를 피복하였다. 이후 웰 안의 용액을 털어내고 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH3PO4, 0.15 M NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% 트윈-20이 첨가된 PBST 완충용액으로 3회 세척한 후 BSA(Bovine Serum Albumin)을 상기 용액에 1%로 용해시켜 250㎕씩 웰에 넣었다. 그 후 실온에 1시간 방치시킨 후 용액을 털어내고 상기용액으로 3회 세척한 후 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH3PO4, 0.15 M NaCl, 2.7 mM KCl로 이루어진 PBS 용액을 상기 웰에 가득 채운 뒤 접착필름으로 윗면을 밀봉하여 플레이트 스트립 웰을 제조하였다.
2. 표준 항생제 용액의 제조
상기 PBS 용액에 페니실린을 각각 0.0005, 0.002, 0.005, 0.01, 0.05 (U/㎖)로 첨가한 뒤 균질하게 혼합하여 무색의 페니실린 표준 항생제 시료 용액을 제조하고 설파메타진과 테트라싸이크린을 각각 10 ppb, 20 ppb, 50 ppb, 0.1 ppm, 0.4 ppm으로 첨가한 뒤 균질하게 혼합하여 무색의 설파메타진, 테트라싸이크린 표준 항생제 용액을 제조하였다.
3. 항생제-호스라뒤시 페록시다제 결합체 용액의 제조
상기 PBS 용액에 페니실린, 설파메타진, 테트라싸이클린의 호스라디쉬 페록시다제 결합체를 각각 적정 희석배수로 희석하여 무색의 용액을 제조하였다.
4. 발색제 용액의 제조
무수 메틸알콜 100㎖에 테트라메틸 벤지딘(Tetramethyl benzidine:TMB) 6g을 첨가하여 TMB가 6 중량% 되도록 원액을 제조한 뒤 균질하게 혼합하였다.
이 후 원액 4.5 부피%, 무수 메틸알콜 55.5 부피%, 증류수 40 부피%를 혼합하여 무색의 발색제 용액을 제조하였다.
5. 기질 용액의 제조
1ℓ의 증류수에 초산나트륨(CH3COONa 3H2O) 22.6 g을 가하여 완전히 용해시킨 후 포화구연산을 이용하여 용액의 pH를 5.5로 조절하고 무색의 용액을 얻었으며 여기서 얻은 용액 10 ㎖에 1 중량%의 H2O260 ㎕를 첨가하여 무색의 과산화수소 용액을 제조하였다.
상기한 공정에서 제조한 모든 용액은 항체의 변성을 방지하고 장기간 보존, 사용할 수 있도록 하기 위하여 냉장고에서 보관하였으며, 진단키트를 이용한 진단은 20-28℃의 온도에서 행하였다.
Ⅱ.잔류 항생제의 분석 공정
소,돼지의 혈청, 뇨, 우유 및 식육의 추출물을 시료로 준비하여 냉동 식육 50g을 녹인 후 PBS(PH7.2) 용액 100㎖로 1분동안 브랜딩하였다. 그 후 8000rpm, 30분동안 원심분리한 후 상층액을 와트만 42번 필터 페이퍼로 여과한 용액을 시료로 사용하였다. 상기한 재료준비 공정에서 준비한 페니실린, 설파메타진, 테트라싸이클린에 대한 항체가 피복되어 잇는 마이크로 플레이트 웰의 일부 웰에 표준 항생제 시료 용액을 순차적으로 50㎕씩 넣고 나머지 웰에는 준비한 시료를 50㎕씩 첨가하였다. 그리고 곧바로 항생제-호스라디쉬 페록시다제 용액을 각각의 웰에 200㎕씩 첨가하고 20분간 방치한 후 웰안의 용액을 버리고 수돗물로 4회 세척하였다. 상기 웰을 거꾸로하여 웰안에 남아 있는 물기를 완전히 제거한 뒤, 발색제 용액을 각 웰에 50㎕씩 넣은 후 기질 용액을 100㎕첨가하고, 10분후 발현되는 색을 표준 항생제 용액과 비교하여 잔류 항생제의 양을 확인하였다. 이후 시료의 정확한 잔류치를 확인하기 위하여 10분후에 2 MH2SO4를 50㎕씩 첨가하여 흔든 후 450nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
[실시예 1]
페니실린 0.0005, 0.005, 0.01U/㎖을 각각 시료로서 준비하여 상기한 대표적인 실시예와 실질적으로 동일한 방법을 사용하여 항생제 잔류 농도를 측정하였다.
[실시예 2]
설파메타진 10, 50, 100 ppb을 각각 시료로서 준비하여 상기한 대표적인 실시예와 실질적으로 동일한 방법을 사용하여 항생제 잔류 농도를 측정하였다.
[실시예 3]
테트라싸이크린 10, 50, 100 ppb을 각각 시료로서 준비하여 상기한 대표적인 실시예와 실질적으로 동일한 방법을 사용하여 항생제 잔류 농도를 측정하였다.
[비교예 1]
페니실린 0.0005, 0.005, 0.01 U/㎖을 각각 시료로서 준비하였다.
바실러스 스테아로써모필루스 (Bacillus stearothermophilus) 디스크 검사법에 따라 상기 미생물의 포자가 심어진 아기배지를 페트리디쉬에 넣고 굳힌 후 그 위에 시료가 묻어 있는 디스크를 올려놓고 64˚C에서 2.5시간 방치한 후 억제 지역을 측정하여 16mm이상이면 양성 판정하였다.
[비교예 2]
설파메타진 50, 200, 400ppb을 각각 시료로서 준비하여 비교예1)의 방법과 실질적으로 동일한 방법을 사용하여 항생제 잔류 농도를 측정하였다.
비교예 3
테트라싸이크린 50, 600, 2,400 ppb을 각각 시료로서 준비하여 비교예1)의 방법과 실질적으로 동일한 방법을 사용하여 항생제 잔류 농도를 측정하였다.
상기한 실시예와 비교예에 의하여 측정한 잔류항생제의 측정결과는 하기한 (표1)와 같다.
[효과]
상기한 실시예 및 비교예에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 진단방법을 사용할 경우에는 색의 변화로 항생제의 잔류여부를 확인할 수 있으며, 표준 항생제 시료 용액의 발색도와 비교함으로써 즉, 시료의 색이 허용기준치의 표준 항생제 시료 용액보다 짙은 색을 나타내면 잔류항생제의 농도가 허용기준치 이하이고 색이 옅으면 잔류항생제의 농도가 허용기준치 이상으로 간편하게 정량적인 분석도 할 수 있다. 또한 본 발명의 항생제 진단방법은 그 정량범위가 하기한 (표2)에 개시한 바와 같이 종래의 방법에 비하여 더욱 미세한 양도 측정 가능한 우수한 진단방법이다. 또한 본 발명은 잔류 문제가 심각한 항생제 3개 계열을 동시에 진단가능하며, 진단 소요시간이 짧고, 현장에서 사용이 용이하다. 이와 같이 편리한 항생제의 진단방법을 사용함으로써 잔류허용치 이상의 항생제를 포함하고 있는 식품의 유통을 막을 수 있게 되며 그 결과 항생제 섭취로 인한 인체의 여러 발병증세 예를 들면, 발암작용, 알레르기, 피부발진, 위장병, 열, 구토, 체온저하 등을 미연에 방지하는데 도움을 줄 수 있으며 유가공업체의 생산공정상에서 유가공업체의 생산공정에서 유가공품내에 항생제 존재로 인한 문제점을 사전에 방지할 수 있다.

Claims (14)

  1. 항생제에 특이한 반응을 나타내는 항체를 하나 이상의 다수 개의 마이크로 웰을 갖는 기재상에 피복하고; 상기 항생제에 특이한 반응을 나타내는 항체가 피복된 기재상에 항체와 항원의 반응을 확인할 수 있는 항생제-효소 표지 수단 결합체 용액을 시료와 함께 첨가하고; 상기한 표지 수단의 표지량을 측정하는: 공정들을 포함하는 항생제의 진단 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기한 표지 수단의 표지량을 측정하는 공정은 다양한 농도의 항생제를 포함하는 표준 항생제 시료 용액에 제1항의 방법과 동일한 방법을 행하여 얻은 표지량과 비교하는 것인 항생제의 진단 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기한 표준 항생제 시료의 항생제는 페니실린, 설파메타진, 테트라싸이클린으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항생제인 항생제의 진단방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기한 페니실린은 0.0005 U/㎖ 내지 0.05 U/㎖ 범위의 농도를 갖는 표준 항생제 시료 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 항생제의 진단 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기한 설파메타진은 10 ppb 내지 1 ppm범위의 농도를 갖는 표준 항생제 시료 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 항생제의 진단 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기한 테트라싸이클린은 10 ppb 내지 1ppm 범위의 농도를 갖는 표준 항생제 시료 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 항생제의 진단 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기한 항생제는 페니실린, 설파메타진, 테트라싸이클린으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항생제인 항생제의 진단 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기한 시료는 가축이 혈청, 뇨, 우유 또는 식육 추출물로부터 채취되는 것을 특징으로 하는 항생제의 진단 방법.
  9. 항생제에 특이한 반응을 나타내는 항체를 하나 이상의 다수 개의 마이크로 웰을 갖는 기재; 상기 항생제에 특이한 반응을 나타내는 항체가 피복된 기재상에 첨가될 항체와 항원의 반응을 확인할 수 있는 항생제-효소 표지 수단 결합체; 및 하나 이상의 다양한 농도의 항생제를 포함하는 표준 항생제 시료 용액: 을 포함하는 항생제 진단 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기한 표준 항생제 시료의 항생제는 페니실린, 설파메타진, 테트라싸이클린으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항생제인 항생제 진단 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기한 페니실린은 0.0005 U/㎖ 내지 0.05 U/㎖ 범위의 농도를 갖는 표준 항생제 시료 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 항생제 진단 키트.
  12. 제10항에 있어서, 상기한 설파메타진은 10 ppb 내지 1 ppm 범위의 농도를 갖는 표준 항생제 시료 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 항생제 진단 키트.
  13. 제10항에 있어서, 상기한 테트라싸이클린은 10 ppb 내지 1 ppm 범위의 농도를 갖는 표준 항생제 시료 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 항생제 진단 키트.
  14. 제9항에 있어서, 상기한 항생제는 페니실린, 설파메타진, 테트라싸이클린으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항생제인 항생제 진단 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101949922A (zh) * 2010-08-11 2011-01-19 杭州南开日新生物技术有限公司 一种检测磺胺二甲基嘧啶的试剂板的制备方法

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