KR0137056B1 - 호기성 탈질화 세균 - Google Patents

호기성 탈질화 세균

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Abstract

대청호와 소양호의 저질토에서 분리한 본 발명의 KCTC 8627P호의 균주는 호 산소와 질소를 최종 전자수용체로 사용하여 탈질화 작용을 하는 특성을 갖는 호기성 탈질화 균주로서, 호기성 pH5 내지 10에서 최고의 활성을 가지며 20 내지 45℃의 온도에서 활성을 갖는 탈질화 균주이다. 상기의 대청호와 소양호의 저질토에 분리한 본 발명의 균주는 중온성의 세균으로서 호기적 조건에서도 산소와 질산을 동시에 최종 전자수용체로 사용하는 호기성 탈질화 세균이다.

Description

호기성 탈질화 세균
제1A도 및 제1B도는 각각 본 발명의 탈질화균주1 및 탈질화균주3의 아세테이트를 탄소원으로 사용하였을때의 N2O의 생성량을 나타내는 그래프이다.
제2A도 및 제2B도는 각각 본 발명의 탈질화균주1 및 탈질화균주3의 TSB 내에서 NO3로 부터의 N2O의 생성량을 나타내는 그래프이다.
제3A도 및 제3B도는 각각 본 발명의 탈질화균주1 및 탈질화균주3의 TSB 내에서 N2O로 부터의 NO2의 생성량을 나타내는 그래프이다.
제4A도 본 발명의 탈질화균주1의 N2O의 생성에 있어서의 온도의 영향을 나타내는 그래프이며,
제4B도 본 발명의 탈질화균주1의 N2O의 생성에 있어서의 pH의 영향을 나타내는 그래프이다.
제5A도 본 발명의 탈질화균주3의 N2O의 생성에 있어서의 온도의 영향을 나타내는 그래프이며,
제5B도 본 발명의 탈질화균주3의 N2O의 생성에 있어서의 pH의 영향을 나타내는 그래프이다.
제6A, 제6B 및 제6C도는 탄소원으로서 다양한 탄수화물을 사용하였을때의 본 발명의 탈질화균주1의 N2O의 생성량을 나타내는 그래프이다.
제7A, 제7B 및 제7C도는 탄소원으로서 다양한 탄수화물을 사용하였을때의 본 발명의 탈질화균주1의 N2O의 생성량을 나타내는 그래프이다.
제8도 혐기적 및 호기적 조건에서의 본 발명의 탈질화균주1의 생장률 및 그에 의한 N2O 생성량을 나타내는 그래프이다.
산업상 이용분야
본 발명은 탈질화 세균에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 산소와 질산을 동시에 최종 전자수용체로 사용하는 호기성 탈질화 세균에 관한 것이다.
종래 기술
탈질화 작용은 혐기적 조건하에서 세균이 산소 대신 질산을 최종 전자수용체로 사용하여 질산을 환원시키면서 에너지를 생성하는 과정으로 알려져 있다. 오늘날 상기의 탈질화 공정에는 여러분야의 종사자들이 많은 관심을 기울이고 있다. 예를 들면 농업적 측면에서는 비료로서 토양에 뿌려진 질소원의 소실이라는 측면, 폐수 처리의 측면에서는 탈질화 작용에 의한 결합 질수(combined nitrogen)의 과도한 제거라는 측면, 환경 보존의 측면에 있어서의 질소에 의한 오존층의 파괴라는 측면, 탈질화 작용의 중간 산물인 NO2와 NO의 독성에 관한 측면, 아질산과 이차아민의 반응으로 생성된 질소원을 대기중으로 반환하는 질소 순환회로의 완성이라는 측면 등의 관점에서 많은 관심이 기울여져 왔다, 질산의 전환과정, 즉 탈질화 작용은 하기의 공정으로 진행된다. NO3→ NO2→ NO → N2O → N2상기 탈질화 공정의 중간 산물중의 하나인 N2O는 탈질화 작용에 의해서뿐만 아니라 산-촉매 파괴로 인한 화학적 탈질화 작용, 엔테로박테리아에 의한 비호흡성 NO2의 생성 및 NO2의 비독성화(detixification) 등에 의하여서도 생성된다.
기존의 탈질화 작용에 관여하는 탈질화 세균들은 대부분 그람음성으로 중온성의 혐기성 세균으로서, 이에 해당하는 대표적인 균으로는 종속영양 세균인 알칼리지네스(Alcaligenes), 슈도모나스(Pseudomonas), 파라코커스(Paracoccus), 사이토박터(Cytobacter)등이 있다. 이외에도 아그로박터(Agrobater), 캄필로박터(Camphylobacter), 에이케넬라(Eikenella), 플라보박테리아(Flavobacterium), 킨젤라(Kingella), 모라셀라(Moraxella), 모로코커크(Morococcus), 오크로박테리아(Ochrobaterium), 올리젤라(Oligella), 스핑고박테리움(Sphingobacterium), 투수카무렐라(Tsukamurella)등이 있다. 또한 독립 영양 세균중 질화세균인 나이트로소모나스(Nitrosomonas), 나이트로박터(Nitrobacter)등에서도 그 속도가 느리기는 하지만 탈질화 작용이 일어나며, 황상화 세균인 티오바실러스(Thiobacillus), 티오스페라(Thiosphaera), 티오마이크로스피라(Thiomicrospira)와 광합성 세균인 로도박테리아(Rhodobacter) 등에서도 탈질화 작용이 일어난다. 또한 그람 양성 박테리아인 바실러스 아조토폴먼스(Bacillusazotoformans), 사이크로파일, 털모파일에서도 탈질화 작용이 일어난다. 생태계에서 주로 발견되는 탈질화 작용을 지닌 속은 슈도모나스 또는 알칼리지네스속으로 파라코거스, 로도박터속과 함께 4개의 속에서 주로 연구가 진행되고 있다. 앞서 언급하였듯이 일반적으로 탈질화 작용은 혐기적 조건에서 일어나며 산소에 의해 억제 받는 것으로 알려져 왔다. 그러나, 호기적 조건에서도 탈질화 작용이 일어난다는 보고가 간간히 있어 왔다. 1984년 로버트슨과 쿠에넨은 폐수처리중 티오스페라 판토로파라는 균주를 발견하여 호기적 조건에서 산소와 질산을 동시에 최종 전자수용체로 사용하는 호기성 것을 발견하였으며, 1987년 리오드는 호기적 조건에서도 탈질화 작용이 지속적으로 일어남을 발견하였다. 이와 같은 종래에 알려진 탈질화 세균은 그 대부분이 혐기성 세균이므로, 폐수처리 등의 산업분야에 사용할 때 그 환경을 혐기성으로 조성하여야만 하므로 그에 따라 공정이 복잡하여지고 경비가 많이 소요된다는 문제점을 지니고 있다. 또한 기존의 그 존재가 알려진 호기적 조건하에서 탈질화 작용을 보이는 균주들도 단지 존재에 대하여서만 미미하게 알려져 있을 뿐 그의 호기적 조건하에서의 탈질화 작용능과 그의 특성에 대하여서는 거의 연구되어 있지 않다는 문제점도 지니도 있다.
본 발명의 목적
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 대청호와 소양호의 저질토에 분리한 산소와 질소의 존재하에서 탈질화 작용을 지니는 새로운 호기성 탈질화 균주를 제공하는데 그 목적을 둔다. 또한 본 발명은 상기 탈질화 균주의 탈질화 작용능과 탈질화 작용의 최적 조건을 확인하는 것에도 그 목적을 둔다.
발명의 구성
본 발명은 1994년 10월 21일자로 한국과학기술원. 유전자 은행에 기탁된 국제기탁 제 KCTC 8627P호의 새로운 균주로서, 산소와 질소를 최종 전자수용체로 사용하여 탈질화 작용을 하는 특성을 갖는 호기성 탈질화 균주를 제공한다. 상기한 균주는 호기성이며, pH5 내지 10에서 최고의 활성을 가지며 20 내지 45℃의 온도에서 활성을 갖는 탈질화 균주이다. 상기한 발명의 탈질화 균주는 호기성 균주로서, 산소의 존재에서도 질소를 최종 전자수용체로 사용하여 탈질화 반응을 수행한다. 상기 균주들이 호기성 조건에서 탈질화 반응을 나타냄을 확인하기 위하여 가스치완으로 혐기적 조건을 조성하여 준 후의 NO3로부터의 NO2의 생성량과 가스치환을 행하지 않은 호기적 조건에서의 NO3로부터의 NO2의 생성량을 아세틸렌 저해방법으로 측정 비교하였다. 측정 결과 호기적 조건에서 혐기적 조건에서보다 더 많은 양의 NO2가 생성됨을 확인할 수 있었다. 이로부터 상기의 산소의 존재하에서 탈질화 작용능을 호기성의 탈질화 균주임을 알 수 있었다.
실시예
이하 본 발명의 바람직한 일 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
I. 균주 분리
대청호 및 소양호의 저질토의 스럴리 0.1ml을 변형시킨 숙신산염 아가배지에 접종하여 30℃의 혐기성 챔버(미국 포마사 제품)에서 3 내지 5일간 배양을하여 탈질화 세균을 분리 배양하였다. 배양후 형성된 균체를 트립틱 소이아가(디프코사, 미국)사면 배지에 접종하고 4℃에서 보관하였다. 상기 탈질화 세균의 분리공정은 탈질화 세균이 혐기적 조건에서 탄소원으로 비발효성 기질이 존재하면 질산을 최종 전자 수용체로하여 성장한다는 성질을 이용한 것이다. 균주의 분리에 사용한 숙신산 아기 배지의 조성은 하기와 같았다.
II. 동정
상기 I의 방법으로 분리한 균주를 변형시킨 사뮤엘슨배지에 접종하고 132시간 동안 배양후 12시간 간격으로 NO2의 생성량을 측정하였다. NO2의 생성량을 측정하였다. N2O의 생성량은 아세틸렌 저해(brockage)방법을 사용하여 기체크로마토그래피로 측정하였다. 배지의 조성은 하기와 같았다.
아세테이트를 탄소원으로 한 액체 배지에서 NO3로부터 N2O를 생성한 균주는 80여개의 균주중 10개이었다. 상기에서 분리된 10개의 균주중 NO2에서 N2O를 생성하는 균주는 균주1과 균주3 이었다. 균주1에서의 비발효성 탄소원인 아세테이트를 탄소원으로 한 NO3로부터의 N2O의 생성은 약 72시간이 지나면서 나타나기 시작하여 132시간이 경과하면서 34.26 N2O-N2mg/L의 생성능을 보였다(제1B도). 분리된 탈질화 균주1과 탈질화 균주3의 종류를 알아보기 위하여 생화학적 검사를 행한 결과 알칼리지네스속에 해당되는 균주임을 확인하였다(하기 표1 참조). 생화학적 실험에서는 알카리지네스 페칼리스와 알칼리지네스 유트로푸스를 대조군으로 이용하였으며, 임상적 박테리아의 확인에 사용하는 방법으로 수행하였다.
표 1. 분리한 균주와 표준 균주의 생화학적 테스트 및 그 결과
* DN1 :탈질화세균1 DN2 : 탈질화세균2 VP : 보제스-프로카우어 테스트 A/A : 알칼린/알칼라인 - : 음성 + : 양성 CF : 콜로니 형태 CE : 콜로니 표면 TSI : 삼 자당 철 아가(Triple Sugar iron agar)
III. 균주의 활성도
용기에 20mM (NH4)2SO4와 10mM KNO3또는 KNO2를 첨가하여 아세틸렌 저해방법으로 N2O의 생성을 측정함으로써 분리된 균주의 활성도를 측정하였다. 아세틸렌은 헤드 스페이스 농도가 5 내지 7% 정도가 되는 양으로 첨가하였다. 기체 크로마토크래피를 이용하여 N20의 생성양을 측정할 때 검출기로는 TCD를 사용하였으며, 칼럼은 포라팩 Q를 사용하였다. 이때 기체 크로마토그래피의 측정 조건은 하기 표2와 같았다.
표 2. 기체 크로마토그래피의 측정 조건 및 칼럼의 종류
이때, 표준 균주로는 미구의 미시건주립대학에서 분양받은 알칼리지네스 페칼리스 G-65와 알카리지네스 유트로푸스를 사용하였다. 분리된 균주1 및 균주3에서 NO3및 N2O의 생성능과 생장율(grwth yeild)를 비교하였다. 균주1의 NO3로부터 N2O의 생성량은 129.97 N2O-N2mg/L이었고 균주3의 생성량은 132.1 N2O-N2mg/L이었다. 생장율과 N2O의 생성을 비교하여 보면 균주1 및 균주3에 있어서 생장율이 증가할수록 N2O의 생성량도 증가함을 알 수 있었다(제2A도 및 제2B도). 또한 가하여준 NO3의 양과 생성된 N2O의 양을 비교하여 봄으로써 약 80% 이상의 NO3가 N2O-N2으로 전환됨을 알 수 있었다. 생성된 N2O의 양과 생장률과의 관계는 슈도모나스 에루기노사에서와 동일한 양상을 보였으며, 생성된 N2O의 양 역시 슈도모나스 에루기노사에서와 유사한 값이었다. NO2로부터 N2O의 생성정도과 균주의 생장률과 비교하였다. 그 결과 NO3로부터 N2O의 생성량에서와 마찬가지고 NO2로부터 N2O의 생성정도도 균주의 생장률과 비례함을 알수 있었다. NO2로부터 N2O의 생성은 균주1에서는 120.69 N2O-N2mg/L이고, 균주3에서는 123.43 N2O-N2mg/L의 생성능을 보여 주었다. 또한 가하여준 N2O-N 양의 80% 이상의 N2O-N2로 전환 생성되었음을 알 수 있었다.(제3A도 및 제3B도) 상기에서 측정한 균주1과 균주3의 N2O 생성능을 대표적인 탈질화 균주인 알칼리지네스 페칼리스 및 알칼리지네스 유트로푸스와 비교하였다. 알칼리지네스 페칼리스에서의 N2O생산량은 125.05 N2O-N2mg/L이었고, 알카리지네스 유트로푸스는 130.24 N2O-N2mg/L의 값을 나타내어 분류된 균주들과 거의 유사한 수준의 생성량을 지님을 알 수 있었다.(제4A도 및 제4B도). N2O의 생성 공정중 하나인 프로피오닉박테리아에 의한 독성물질인 NO2의 비독성화 기작에서 생성된 N2O의 경우에는 NO2로부터 N2O의 생성속도가 NO3로부터의 N2O로의 생성속도 보다 20 내지 50배 가량 빠르며, NO2로부터 N2O의 생성량도 약 1배 반이상 많다는 특징을 지니고 있다. 따라서, 분리한 균주1과 균주3에서 비록 NO2에서 N2O의 생성이 NO3에서의 생성보다 빠르게 나타나긴 하지만 생성된 N2O양은 NO3로부터 생성된 양이 NO2로부터 생성된 양보다 많으므로 분리된 균주1 및 균주3에 의하여 생성되는 N2O는 비독성화 기작에 의한 것이 아니며, 탈질화 공정에 의한 것임을 알수 있었다.(제2도 및 제3도 참조).
IV. 환경에 따른 활성도
1. 온도 및 pH의 영향
상기의 공정으로 분리된 균주의 N2O생성에 영향을 미치는 환경요인을 알아 보기 위하여 온도 10℃와 45℃ 그리고 pH5와 9에서 N2O의 생성능을 측정하여 30℃, pH7에서의 생성능과 비교하였다. 탈질화 균주1의 N2O생성은 pH6 내지 9, 온도 10 내지 45℃에서 진행되며, 더욱 바람직하게는 pH7, 온도 30℃에서 최대의 생성량 126.18 N2O-N2mg/L을 가졌다. 균주1은 10℃에서는 2.319 N2O-N2mg/L에서는 56.488 N2O-N2mg/L의 측정치를 나타내었으며, pH9에서의 N2O의 생성은 측정이 되지 않았고, pH9에서의 N2O생성은 83.591 N2O-N2mg/L이었다(제4A도 및 제4B도)
탈질화 균주3의 N2O생성량은 pH5 내지 10, 온도 20에서 45℃에서 진행되며, 더욱 바람직하게는 pH7, 온도 30℃에서 최대의 생성량, 128.645 N2O-N2mg/L을 가짐을 알수 있었다. 균주3은 10℃에서는 N2O를 특허 제137056호 6/10생성하지 않는 것으로 측정되었으며 45℃에서는 36.217 N2O-N2mg/L의 측정치를 나타냈었으며, pH5에서는 1.27 N2O-N2mg/L, pH9에서의 130.818 N2O-N2mg/L의 N2O가 생성됨을 측정되었다(제4A도 및 제4B도) 상기 결과로부터 분리한 균주1 및 3은 중온성의 탈질화 균주임을 알수 있었다. 상기 균주들 중 균주3은 높은 pH에서 N2O의 생성이 늦게 나타나긴 하지만 중성에서와 유사한 생성량을 지니며 낮은 pH에서 N2O를 생성하므로 균주1에 비하여 넓은 활성 pH 범위를 지님을 알수 있었다. 이와 같은 결과는 일반적으로 탈질화 세균의 성질과 유사한 것이다.
N2O의 생성에 대한 탄소원의 영향 N2O의 생성에 미치는 탄소원의 영향을 알아보기 위하여 변형된 사뮤엘슨배지에 탄소원으로 아세테이트 대신에 당을 넣고 0.1 g/L의 이스트 추출물을 첨가하여 실험을 하였다. N2O 생성능은 12시간 간격으로 측정하였다. 이용된 탄수화물은 전분, 자당, 엿당, 과당, 유당, 포도당, 트레할로오즈, 라피노오즈, 자일로오즈(시그마사, 미국)이며 최종 농도가 0.4%가 되게 하였다. 탈질화 균주1의 N2O의 생성은 락토오즈에서 15.19 N2O-N2mg/L의 최저치와 자일로오즈에서 60.61 N2O-N2mg/L의 최고치를 나타냈다. 대부분의 당에서 N2O의 생성은 12시간이 지나면서 나타나기 시작하였으며, 특이하게도 가장 적은 생성량을 지닌 포도당의 경우 12시간 이전에 N2O를 생성하는 것으로 관찰되었다(제6도). 탈질화 균주3에는 락토오즈에서 8.12 N2O-N2mg/L의 최저치와 엿당에서 55.54 N2O-N2mg/L의 최고치를 보였다. 이 경우에도 균주1에서와 마찬가지로 12시간이 경과하면서 N2O 생성이 일어났다. 특히 비교적 높은 측정치를 갖는 엿당 및 포도당은 24시간이 경과한 후에 N2O를 생성하였다(제7도).
배양 및 가스치환
바이얼에 배지 9ml에 24시간 전 배양한 균주 1ml을 600nm에서의 스펙트로포토미터로 OD가 0.2이 되도록 하는 농도로 맞추어 접종하여 배양하였다. 헤드스페이스의 가스 치환은 혐기성 챔버에서 진공치환을 통하여 실시하였다. 가스 치환후 배양은 30℃에서 24시간 진탕배양하였으며, 4시간 간격으로 N2O의 생성을 측정하였다.
호기적 조건에서 탈질화 작용
호기적 조건에서 탈질화 작용은 TBS에 20mM (NH4)2SO4와 10mM KNO3를 첨가한 배지에 균을 접종하여 가스치환한 혐기적 조건과 치환하지 않은 호기적 조건에서 아세틸렌 저해방법으로 N2O의 생성을 기체 크로마토크래피로 측정 비교하였다. 또한 호기적 조건과 혐기적 조건의 성장율을 비교하였다. 성장율은 600nm에서 측정된 OD로 표시하였다. 호기적 조건에서 측정한 균주1의 N2O의 생성량은 137.137 N2O-N2mg/L이며, 혐의적 조건에서의 생성량은 123.68 N2O-N2mg/L으로 호기적 조건에서 더 높은 N2O생성량을 보였다. 균주1은 산소의 존재 유무와 상관없이 N2O의 생산량이 증가하면 생장률이 증가되는 양상을 지님을 알수 있었다. 더욱이 호기적 조건에서는 생장률이 혐기적 조건에서의 생장률의 거의 2배정도였다(제8A도). 균주3의 호기적 조건에서의 N2O생성량은 133.727 N2O-N2mg/L이며, 혐기적 조건에서의 생성량은 124.797 N2O-N2mg/L이었다. 따라서 이 경우에도 호기적 조건에서의 생성량이 혐기적 조건에서의 생성량보다 높음을 알수 있었다. 이 경우에도 N2O의 생성이 증가될수록 생장률이 증가하였음을 볼수 있었다(제8B도) 호기적 조건에서의 분리된 균주1 및 3에서의 성장 정도는 혐기적 조건에서보다
대략 1.5배 정도이상 높은 것을 알수 있는데, 이로부터 분리된 두 균주 1 및 3은 호기적 조건에서 산소와 NO3을 동시에 최종 전자수용체로 사용하고 있음을 알수 있었다(제8A도 및 제8B도).
본 발명의 효과
상기 실시예로부터 대청호와 소양호의 저질토에서 분리한 균주1 및 균주3은 중온성의 세균으로서 호기적 조건에서도 산소와 질산을 동시에 최종 전자수용체로 사용하는 호기성 탈질화 세균임을 알수 있었다.

Claims (4)

  1. 호기성 탈질화 작용을 하는 특성을 갖는 알칼리지네서 sp. DN3 균주(국제기탁 제 KCTC 8627P호)
  2. 제1항에 있어서, 상기한 균주는 산소와 질소를 최종 전자수용체로 사용하여 탈질화 작용을 하는 특성을 갖는 균주.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기한 균주는 pH5 내지 10에서 활성을 갖는 균주.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기한 균주는 20 내지 45℃에서 활성을 갖는 균주.
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WO2012004026A3 (de) * 2010-07-07 2012-04-19 Robert Bosch Gmbh Verfahren zur gewinnung von distickstoffmonooxid (n2o)
KR20210054235A (ko) 2019-11-05 2021-05-13 박상훈 배합사료 제조 반응기 및 이를 포함하는 배합사료 제조 라인

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