JPWO2022172343A5 - - Google Patents
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Description
Y. Lee et al., FEBS Letters 579 (2005) 4769-4774
K. Yamauchi and K. Kasai, J. Mol. Evol., 86 (2018) 457-469
G. Zanotti, et al., J. Mol. Biol., 363 (2006) 1-9
A. Raychaudhuri and P. A. Tipton, Plant Physiol,. 130 (2002) 2061-2068
J. Pessoa et al., BMC Plant Biology, 10 (2010) 30
E. Lundberg et al., FEBS Journal, 276 (2009) 1999-2011
C. Matiollo et al., BBRC, 387 (2009) 712-716
J. B. French and S. E. Ealick, Acta. Cryst., D67 (2011) 671-677
S. He, et al., Appl. Environ. Microbiol., 85(19) e01107-19 (2019)
すなわち、本発明は、以下を提供するものである。
（１）ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼを含む、ウリカーゼ活性化剤。
（２）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、下記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列から選択される、少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する、（１）に記載のウリカーゼ活性化剤：
（ｉ）下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列；
[K/H]-[I/V]-L-[D/N]-x-x-x-G-x-P-[A/G]-x-x-[L/I/V/M]-x-[I/V] …(I)（配列番号１５）
[Y/W/F]-[T/H]-[I/V/T]-[A/P]-x-x-[L/I/V/M]-[S/T/A]-[P/Q]-[F/Y/W/G]-[G/S]-[F/Y]-[Q/S/T] …（ＩＩ）（配列番号１６）
（式（Ｉ）及び式（ＩＩ）において、ｘは任意のアミノ酸を示す）
（ｉｉ）前記（ｉ）に記載のいずれか１つのアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列。
（３）ウリカーゼと共存させてウリカーゼを活性化するために使用され、前記ヒドロキシ尿酸ヒドロラーゼの含有量が、共存させるウリカーゼの量に対して、重量比で０．００５～１．５倍である、（１）又は（２）に記載のウリカーゼ活性化剤。
（４）ウリカーゼの活性を１．２倍以上とする、（１）～（３）のいずれかに記載のウリカーゼ活性化剤。
（５）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、熱安定性の酵素である、（１）～（４）のいずれかに記載のウリカーゼ活性化剤。
（６）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼの比活性が１００Ｕ／ｍｇ以上である、（１）～（５）のいずれかに記載のウリカーゼ活性化剤。
（７）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、Bacillus属、Herbaspirillum属又はDeinococcus属由来である、（１）～（６）のいずれかに記載のウリカーゼ活性化剤。
（８）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの特徴を有する、（１）～（６）のいずれかに記載のウリカーゼ活性化剤：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する；
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する。
（９）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼがDeinococcus radiodurans由来である、（１）～（８）のいずれかに記載のウリカーゼ活性化剤。
（１０）ウリカーゼと（１）～（９）のいずれかに記載のウリカーゼ活性化剤とを共存させる工程を含む、ウリカーゼ活性化方法。
（１１）前記工程が、ウリカーゼとヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼとの重量比が１：０．００５～１．５となるように共存させる工程である、（１０）に記載の方法。
（１２）ウリカーゼ及びヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼを含み、生体から採取された試料中の尿酸濃度を測定するために使用される、尿酸測定試薬。
（１３）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、下記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列から選択される、少なくとも１つのアミノ酸配列を有し、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する、（１２）に記載の尿酸測定試薬：
（ｉ）下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列；
[K/H]-[I/V]-L-[D/N]-x-x-x-G-x-P-[A/G]-x-x-[L/I/V/M]-x-[I/V] …（Ｉ）（配列番号１５）
[Y/W/F]-[T/H]-[I/V/T]-[A/P]-x-x-[L/I/V/M]-[S/T/A]-[P/Q]-[F/Y/W/G]-[G/S]-[F/Y]-[Q/S/T] …（ＩＩ）（配列番号１６）
（式（Ｉ）及び式（ＩＩ）において、ｘは任意のアミノ酸を示す）
（ｉｉ）前記（ｉ）に記載のいずれか１つのアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列。
（１４）前記ウリカーゼと前記ヒドロキシ尿酸ヒドロラーゼの重量濃度比が、１：０．００５～１．５である、（１２）又は（１３）に記載の尿酸測定試薬。
（１５）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、熱安定性の酵素である、（１２）～（１４）のいずれかに記載の尿酸測定試薬。
（１６）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼの比活性が１００Ｕ／ｍｇ以上である、（１２）～（１５）のいずれかに記載の尿酸測定試薬。
（１７）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、Bacillus属、Herbaspirillum属又はDeinococcus属由来である、（１２）～（１６）のいずれかに記載の尿酸測定試薬。
（１８）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの特徴を有する、（１２）～（１７）のいずれかに記載の尿酸測定試薬：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する；
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する。
（１９）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼがDeinococcus radiodurans由来である、（１２）～（１８）のいずれかに記載の尿酸測定試薬。
（２０）生体から採取された試料と、（１２）～（１９）のいずれかに記載の尿酸測定試薬とを混合反応させる工程を含む、尿酸測定方法。
（１）ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼを含む、ウリカーゼ活性化剤。
（２）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、下記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列から選択される、少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する、（１）に記載のウリカーゼ活性化剤：
（ｉ）下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列；
[K/H]-[I/V]-L-[D/N]-x-x-x-G-x-P-[A/G]-x-x-[L/I/V/M]-x-[I/V] …(I)（配列番号１５）
[Y/W/F]-[T/H]-[I/V/T]-[A/P]-x-x-[L/I/V/M]-[S/T/A]-[P/Q]-[F/Y/W/G]-[G/S]-[F/Y]-[Q/S/T] …（ＩＩ）（配列番号１６）
（式（Ｉ）及び式（ＩＩ）において、ｘは任意のアミノ酸を示す）
（ｉｉ）前記（ｉ）に記載のいずれか１つのアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列。
（３）ウリカーゼと共存させてウリカーゼを活性化するために使用され、前記ヒドロキシ尿酸ヒドロラーゼの含有量が、共存させるウリカーゼの量に対して、重量比で０．００５～１．５倍である、（１）又は（２）に記載のウリカーゼ活性化剤。
（４）ウリカーゼの活性を１．２倍以上とする、（１）～（３）のいずれかに記載のウリカーゼ活性化剤。
（５）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、熱安定性の酵素である、（１）～（４）のいずれかに記載のウリカーゼ活性化剤。
（６）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼの比活性が１００Ｕ／ｍｇ以上である、（１）～（５）のいずれかに記載のウリカーゼ活性化剤。
（７）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、Bacillus属、Herbaspirillum属又はDeinococcus属由来である、（１）～（６）のいずれかに記載のウリカーゼ活性化剤。
（８）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの特徴を有する、（１）～（６）のいずれかに記載のウリカーゼ活性化剤：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する；
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する。
（９）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼがDeinococcus radiodurans由来である、（１）～（８）のいずれかに記載のウリカーゼ活性化剤。
（１０）ウリカーゼと（１）～（９）のいずれかに記載のウリカーゼ活性化剤とを共存させる工程を含む、ウリカーゼ活性化方法。
（１１）前記工程が、ウリカーゼとヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼとの重量比が１：０．００５～１．５となるように共存させる工程である、（１０）に記載の方法。
（１２）ウリカーゼ及びヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼを含み、生体から採取された試料中の尿酸濃度を測定するために使用される、尿酸測定試薬。
（１３）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、下記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列から選択される、少なくとも１つのアミノ酸配列を有し、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する、（１２）に記載の尿酸測定試薬：
（ｉ）下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列；
[K/H]-[I/V]-L-[D/N]-x-x-x-G-x-P-[A/G]-x-x-[L/I/V/M]-x-[I/V] …（Ｉ）（配列番号１５）
[Y/W/F]-[T/H]-[I/V/T]-[A/P]-x-x-[L/I/V/M]-[S/T/A]-[P/Q]-[F/Y/W/G]-[G/S]-[F/Y]-[Q/S/T] …（ＩＩ）（配列番号１６）
（式（Ｉ）及び式（ＩＩ）において、ｘは任意のアミノ酸を示す）
（ｉｉ）前記（ｉ）に記載のいずれか１つのアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列。
（１４）前記ウリカーゼと前記ヒドロキシ尿酸ヒドロラーゼの重量濃度比が、１：０．００５～１．５である、（１２）又は（１３）に記載の尿酸測定試薬。
（１５）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、熱安定性の酵素である、（１２）～（１４）のいずれかに記載の尿酸測定試薬。
（１６）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼの比活性が１００Ｕ／ｍｇ以上である、（１２）～（１５）のいずれかに記載の尿酸測定試薬。
（１７）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、Bacillus属、Herbaspirillum属又はDeinococcus属由来である、（１２）～（１６）のいずれかに記載の尿酸測定試薬。
（１８）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの特徴を有する、（１２）～（１７）のいずれかに記載の尿酸測定試薬：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する；
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する。
（１９）前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼがDeinococcus radiodurans由来である、（１２）～（１８）のいずれかに記載の尿酸測定試薬。
（２０）生体から採取された試料と、（１２）～（１９）のいずれかに記載の尿酸測定試薬とを混合反応させる工程を含む、尿酸測定方法。
ＴＴＲ及びＴＲＰにおいて高度に保存されたモチーフ配列は、具体的には以下の式（Ｉ）（モチーフＩ）及び式（ＩＩ）（モチーフＩＩ）で表されるアミノ酸配列である。
[K/H]-[I/V]-L-[D/N]-x-x-x-G-x-P-[A/G]-x-x-[L/I/V/M]-x-[I/V] …（Ｉ）（配列番号１５）
[Y/W/F]-[T/H]-[I/V/T]-[A/P]-x-x-[L/I/V/M]-[S/T/A]-[P/Q]-[F/Y/W/G]-[G/S]-[F/Y]-[Q/S/T] …（ＩＩ）（配列番号１６）
（式（Ｉ）及び式（ＩＩ）において、ｘは任意のアミノ酸を示す）。
[K/H]-[I/V]-L-[D/N]-x-x-x-G-x-P-[A/G]-x-x-[L/I/V/M]-x-[I/V] …（Ｉ）（配列番号１５）
[Y/W/F]-[T/H]-[I/V/T]-[A/P]-x-x-[L/I/V/M]-[S/T/A]-[P/Q]-[F/Y/W/G]-[G/S]-[F/Y]-[Q/S/T] …（ＩＩ）（配列番号１６）
（式（Ｉ）及び式（ＩＩ）において、ｘは任意のアミノ酸を示す）。
前記医薬組成物は、ＨｉＵＨの薬理効果を失わない範囲において、他の薬剤を含有することもできる。例えば、注射剤の場合であれば、抗生物質、抗炎症剤等を所定量含有していても良い。
前記医薬組成物の剤形は、有効成分であるＨｉＵＨ、及び他の付加的な有効成分を不活化させない形態であれば特に限定しない。例えば、液体、固体又は半固体のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、例えば、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、トローチ剤等の経口剤形又は注射剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、点鼻剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、シップ剤及び座剤等の非経口剤形が挙げられる。
本発明の尿酸測定試薬に使用するＨｉＵＨは、下記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列から選択される、少なくとも１つのアミノ酸配列を含むことが好ましい。
（ｉ）下記式（Ｉ）（モチーフＩ）及び下記式（ＩＩ）（モチーフＩＩ）に示されるアミノ酸配列；
[K/H]-[I/V]-L-[D/N]-x-x-x-G-x-P-[A/G]-x-x-[L/I/V/M]-x-[I/V] …（Ｉ）（配列番号１５）
[Y/W/F]-[T/H]-[I/V/T]-[A/P]-x-x-[L/I/V/M]-[S/T/A]-[P/Q]-[F/Y/W/G]-[G/S]-[F/Y]-[Q/S/T] …（ＩＩ）（配列番号１６）
（式（Ｉ）及び式（ＩＩ）において、ｘは任意のアミノ酸を示す）。
（ｉｉ）前記（ｉ）に記載のいずれか１つのアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列。
（ｉ）下記式（Ｉ）（モチーフＩ）及び下記式（ＩＩ）（モチーフＩＩ）に示されるアミノ酸配列；
[K/H]-[I/V]-L-[D/N]-x-x-x-G-x-P-[A/G]-x-x-[L/I/V/M]-x-[I/V] …（Ｉ）（配列番号１５）
[Y/W/F]-[T/H]-[I/V/T]-[A/P]-x-x-[L/I/V/M]-[S/T/A]-[P/Q]-[F/Y/W/G]-[G/S]-[F/Y]-[Q/S/T] …（ＩＩ）（配列番号１６）
（式（Ｉ）及び式（ＩＩ）において、ｘは任意のアミノ酸を示す）。
（ｉｉ）前記（ｉ）に記載のいずれか１つのアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列。
＜試験例１＞Deinococcus radiodurans、Bacillus subtilis及びHerbaspirillum seropedicae由来の組換えＨｉＵＨの調製
（１）各組換えＨｉＵＨ発現系の構築
Deinococcus radiodurans（ＤＲ）のＨｉＵＨのアミノ酸配列（配列番号１０）、Bacillus subtilis（ＢＳ）のＨｉＵＨのアミノ酸配列（配列番号８）及びHerbaspirillum seropedicae（ＨＳ）のＨｉＵＨのアミノ酸配列（配列番号９）をそれぞれコードする塩基配列を、大腸菌コドンに至適化して各菌由来のＨｉＵＨ遺伝子を設計した。各遺伝子について、５’末端にＮｄｅＩ制限酵素サイト、３’末端にＢａｍＨＩ制限酵素サイトが付加するよう設計し、化学合成した。得られたＨｉＵＨ遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で処理を行い、アガロースゲル電気泳動後、GFX(商標)PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）により回収した。回収したＤＮＡ断片はDNA Ligation Kit <Mighty Mix>（タカラバイオ社製）を用いて、予め制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で処理した発現ベクターｐＥＴ１５ｂに挿入した。次いで、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、組換え体Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＥＴ１５ｂ－ＤＲＨｉＵＨ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＥＴ１５ｂ－ＢＳＨｉＵＨ）、Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＥＴ１５ｂ－ＨＳＨｉＵＨ）を得た。本組換え体を、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地にて３７℃、１８時間で振とう培養した。菌体を回収し、PureLink Quick Plasmid DNA Miniprep Kits（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）によりＨｉＵＨ発現ベクターｐＥＴ１５ｂ－ＤＲＨｉＵＨ、ｐＥＴ１５ｂ－ＢＳＨｉＵＨ、ｐＥＴ１５ｂ－ＨＳＨｉＵＨを回収した。これらのＨｉＵＨ発現ベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、組換え体Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ１５ｂ－ＤＲＨｉＵＨ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ１５ｂ－ＢＳＨｉＵＨ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ１５ｂ－ＨＳＨｉＵＨ）を得た。
（１）各組換えＨｉＵＨ発現系の構築
Deinococcus radiodurans（ＤＲ）のＨｉＵＨのアミノ酸配列（配列番号１０）、Bacillus subtilis（ＢＳ）のＨｉＵＨのアミノ酸配列（配列番号８）及びHerbaspirillum seropedicae（ＨＳ）のＨｉＵＨのアミノ酸配列（配列番号９）をそれぞれコードする塩基配列を、大腸菌コドンに至適化して各菌由来のＨｉＵＨ遺伝子を設計した。各遺伝子について、５’末端にＮｄｅＩ制限酵素サイト、３’末端にＢａｍＨＩ制限酵素サイトが付加するよう設計し、化学合成した。得られたＨｉＵＨ遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で処理を行い、アガロースゲル電気泳動後、GFX(商標)PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）により回収した。回収したＤＮＡ断片はDNA Ligation Kit <Mighty Mix>（タカラバイオ社製）を用いて、予め制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で処理した発現ベクターｐＥＴ１５ｂに挿入した。次いで、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、組換え体Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＥＴ１５ｂ－ＤＲＨｉＵＨ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＥＴ１５ｂ－ＢＳＨｉＵＨ）、Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＥＴ１５ｂ－ＨＳＨｉＵＨ）を得た。本組換え体を、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地にて３７℃、１８時間で振とう培養した。菌体を回収し、PureLink Quick Plasmid DNA Miniprep Kits（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）によりＨｉＵＨ発現ベクターｐＥＴ１５ｂ－ＤＲＨｉＵＨ、ｐＥＴ１５ｂ－ＢＳＨｉＵＨ、ｐＥＴ１５ｂ－ＨＳＨｉＵＨを回収した。これらのＨｉＵＨ発現ベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、組換え体Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ１５ｂ－ＤＲＨｉＵＨ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ１５ｂ－ＢＳＨｉＵＨ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ１５ｂ－ＨＳＨｉＵＨ）を得た。
＜試験例２＞Bacillus属由来の組換えウリカーゼの調製
（１）組換えウリカーゼ発現系の構築
Bacillus属由来ウリカーゼ（NCBI Accesion No.BAA08723、配列番号１４、表６）のアミノ酸配列をコードする、大腸菌コドンに至適化した遺伝子について、５’末端にＮｄｅＩ制限酵素サイト、３’末端にＳａｌＩ制限酵素サイトが付加するよう設計し、化学合成した。得られたウリカーゼ遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩ、ＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で処理を行い、アガロースゲル電気泳動後、GFX(商標)PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）により回収した。回収したＤＮＡ断片はDNA Ligation Kit <Mighty Mix>（タカラバイオ社製）を用いて、予め制限酵素ＮｄｅＩ、ＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で処理した発現ベクターｐＴＲＰ２Ｃに挿入した。次いで、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、組換え体Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＴＲＰ２Ｃ－ＵＡＯ）を得た。
（１）組換えウリカーゼ発現系の構築
Bacillus属由来ウリカーゼ（NCBI Accesion No.BAA08723、配列番号１４、表６）のアミノ酸配列をコードする、大腸菌コドンに至適化した遺伝子について、５’末端にＮｄｅＩ制限酵素サイト、３’末端にＳａｌＩ制限酵素サイトが付加するよう設計し、化学合成した。得られたウリカーゼ遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩ、ＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で処理を行い、アガロースゲル電気泳動後、GFX(商標)PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）により回収した。回収したＤＮＡ断片はDNA Ligation Kit <Mighty Mix>（タカラバイオ社製）を用いて、予め制限酵素ＮｄｅＩ、ＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で処理した発現ベクターｐＴＲＰ２Ｃに挿入した。次いで、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、組換え体Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＴＲＰ２Ｃ－ＵＡＯ）を得た。
分光光度計（ＵＶ１８００、島津製作所製）のセルにウリカーゼ反応試験液各３ｍＬを添加し、３７℃の恒温槽で５分間保温した。保温後のセルに測定用試料２０μＬを添加し、素早く転倒混和した。測定開始後６０～１２０秒の２９３ｎｍの吸光度変化率ΔｍＡｂｓを算出した。ＨｉＵＨ濃度がゼロのΔｍＡｂｓを１００％として、各ウリカーゼ反応試験液のΔｍＡｂｓの変化量相対値（％）を算出した。各ウリカーゼ反応試験液のウリカーゼ活性を図２に示す。図２（Ａ）は、ウリカーゼ（Ｂ）の活性に対するＨｉＵＨの影響を示す。図２（Ｂ）は、ウリカーゼ（Ｙ）の活性に対するＨｉＵＨの影響を示す。いずれのウリカーゼにおいても、ＨｉＵＨの添加による活性化が認められた。特にＤＲ由来のＨｉＵＨを使用することで、ウリカーゼが活性化されることが示された。
＜試験例５＞ 尿酸測定試薬の安定性試験
市販の尿酸測定試薬「セロテック」ＵＡ－Ｌ（セロテック社製）を用いて、以下のＲ－２（Ａ）～（Ｃ）を調製した。
Ｒ－２（Ａ）（対照）：「セロテック」ＵＡ－ＬのＲ－２のウリカーゼを、試験例２で調製した組換えウリカーゼに置き換えたもの。Ｒ－２を限外ろ過フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５、１０ｋメンブレン、Ｍｅｒｃｋ社製）でろ過し、回収したろ液に試験例２で調製した組換えウリカーゼを添加した。添加した組換えウリカーゼは、元々製品に使用されていたウリカーゼと同じ活性量とした。
Ｒ－２（Ｂ）：測定試薬１のＲ－２に、さらに、試験例１で調製したＤＲ由来のＨｉＵＨを添加したもの。添加したＨｉＵＨの活性量は、ウリカーゼの活性量の２倍とした。
Ｒ－２（Ｃ）：測定試薬１のＲ－２に、さらに、試験例１で調製したＤＲ由来のＨｉＵＨを添加したもの。添加したＨｉＵＨの活性量は、ウリカーゼの活性量の３倍とした。
各Ｒ－２に含まれるウリカーゼ及びＨｉＵＨの濃度を表８に示す。
市販の尿酸測定試薬「セロテック」ＵＡ－Ｌ（セロテック社製）を用いて、以下のＲ－２（Ａ）～（Ｃ）を調製した。
Ｒ－２（Ａ）（対照）：「セロテック」ＵＡ－ＬのＲ－２のウリカーゼを、試験例２で調製した組換えウリカーゼに置き換えたもの。Ｒ－２を限外ろ過フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５、１０ｋメンブレン、Ｍｅｒｃｋ社製）でろ過し、回収したろ液に試験例２で調製した組換えウリカーゼを添加した。添加した組換えウリカーゼは、元々製品に使用されていたウリカーゼと同じ活性量とした。
Ｒ－２（Ｂ）：測定試薬１のＲ－２に、さらに、試験例１で調製したＤＲ由来のＨｉＵＨを添加したもの。添加したＨｉＵＨの活性量は、ウリカーゼの活性量の２倍とした。
Ｒ－２（Ｃ）：測定試薬１のＲ－２に、さらに、試験例１で調製したＤＲ由来のＨｉＵＨを添加したもの。添加したＨｉＵＨの活性量は、ウリカーゼの活性量の３倍とした。
各Ｒ－２に含まれるウリカーゼ及びＨｉＵＨの濃度を表８に示す。
Claims (20)
- ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼを含む、ウリカーゼ活性化剤。
- 前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、下記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列から選択される、少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する、請求項１に記載のウリカーゼ活性化剤：
（ｉ）下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列；
[K/H]-[I/V]-L-[D/N]-x-x-x-G-x-P-[A/G]-x-x-[L/I/V/M]-x-[I/V] …(I)（配列番号１５）
[Y/W/F]-[T/H]-[I/V/T]-[A/P]-x-x-[L/I/V/M]-[S/T/A]-[P/Q]-[F/Y/W/G]-[G/S]-[F/Y]-[Q/S/T] …（ＩＩ）（配列番号１６）
（式（Ｉ）及び式（ＩＩ）において、ｘは任意のアミノ酸を示す）
（ｉｉ）前記（ｉ）に記載のいずれか１つのアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列。 - ウリカーゼと共存させてウリカーゼを活性化するために使用され、前記ヒドロキシ尿酸ヒドロラーゼの含有量が、共存させるウリカーゼの量に対して、重量比で０．００５～１．５倍である、請求項１又は２に記載のウリカーゼ活性化剤。
- ウリカーゼの活性を１．２倍以上とする、請求項１～３のいずれか１項に記載のウリカーゼ活性化剤。
- 前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、熱安定性の酵素である、請求項１～４のいずれか１項に記載のウリカーゼ活性化剤。
- 前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼの比活性が１００Ｕ／ｍｇ以上である、請求項１～５のいずれか１項に記載のウリカーゼ活性化剤。
- 前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、Bacillus属、Herbaspirillum属又はDeinococcus属由来である、請求項１～６のいずれか１項に記載のウリカーゼ活性化剤。
- 前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの特徴を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載のウリカーゼ活性化剤：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する；
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する。 - 前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼがDeinococcus radiodurans由来である、請求項１～８のいずれか１項に記載のウリカーゼ活性化剤。
- ウリカーゼと請求項１～９のいずれか１項に記載のウリカーゼ活性化剤とを共存させる工程を含む、ウリカーゼ活性化方法。
- 前記工程が、ウリカーゼとヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼとの重量比が１：０．００５～１．５となるように共存させる工程である、請求項１０に記載の方法。
- ウリカーゼ及びヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼを含み、生体から採取された試料中の尿酸濃度を測定するために使用される、尿酸測定試薬。
- 前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、下記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列から選択される、少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する、請求項１２に記載の尿酸測定試薬：
（ｉ）下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列；
[K/H]-[I/V]-L-[D/N]-x-x-x-G-x-P-[A/G]-x-x-[L/I/V/M]-x-[I/V] …（Ｉ）（配列番号１５）
[Y/W/F]-[T/H]-[I/V/T]-[A/P]-x-x-[L/I/V/M]-[S/T/A]-[P/Q]-[F/Y/W/G]-[G/S]-[F/Y]-[Q/S/T] …（ＩＩ）（配列番号１６）
（式（Ｉ）及び式（ＩＩ）において、ｘは任意のアミノ酸を示す）
（ｉｉ）前記（ｉ）に記載のいずれか１つのアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列。 - 前記ウリカーゼと前記ヒドロキシ尿酸ヒドロラーゼの重量濃度比が、１：０．００５～１．５である、請求項１２又は１３に記載の尿酸測定試薬。
- 前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、熱安定性の酵素である、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の尿酸測定試薬。
- 前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼの比活性が１００Ｕ／ｍｇ以上である、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の尿酸測定試薬。
- 前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、Bacillus属、Herbaspirillum属又はDeinococcus属由来である、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の尿酸測定試薬。
- 前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼが、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの特徴を有する、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の尿酸測定試薬：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有し、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する；
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、５－ヒドロキシイソ尿酸の２－オキソ－４－ヒドロキシ－４－カルボキシ－５－ウレイドイミダゾリンへの加水分解を触媒する活性を有する。 - 前記ヒドロキシイソ尿酸ヒドロラーゼがDeinococcus radiodurans由来である、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の尿酸測定試薬。
- 生体から採取された試料と、請求項１２～１９のいずれか１項に記載の尿酸測定試薬とを混合反応させる工程を含む、尿酸測定方法。
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