JPWO2021092442A5

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Publication number: JPWO2021092442A5
Application number: JP2022525999A
Authority: JP
Publication date: 2023-09-21

Description

[本発明1001]
複数のマイクロキャピラリーウェルを備えているマイクロキャピラリーアレイから試料の内容物を回収するための方法であって、
（A）該複数のマイクロキャピラリーウェルの第1のマイクロキャピラリーウェルを標的とするようにレーザーを位置決めする工程;
（B）少なくとも1回、第1のマイクロキャピラリーウェルに向けてレーザーをパルス発振する工程;および
（C）該内容物を第1のマイクロキャピラリーウェルから抽出し、それにより第1のマイクロキャピラリーウェルの該内容物を回収する工程
を含む、前記方法。
[本発明1002]
レーザーを位置決めする工程（A）の前に、第1のマイクロキャピラリーウェルを識別する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
レーザーをパルス発振する工程（B）が、レーザーを第1のマイクロキャピラリーウェルの1つまたは複数のサブセクションに向けてパルス発振することをさらに含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
レーザーをパルス発振する工程（B）が、レーザーを1回より多くパルス発振すること、およびレーザーを第1のマイクロキャピラリーウェルの1つより多くのサブセクションに向けてパルス発振することをさらに含む、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記内容物が1つまたは複数のインタクトな細胞を含む、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記1つまたは複数のインタクトな細胞が哺乳動物細胞、真菌細胞、細菌細胞、昆虫細胞または植物細胞を含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記1つまたは複数のインタクトな細胞がもはや細胞増殖できない、本発明1005または1006の方法。
[本発明1008]
抽出して回収する工程（C）が、前記内容物の回収の際の該内容物のイメージングをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
レーザーを位置決めする工程（A）が、レーザーガイドシステムを用いて行なわれる、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
レーザーガイドシステムがレーザー、レーザースキャンアセンブリ、スキャンレンズシステムおよびチューブレンズを含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
レーザーガイドシステムがガルバノメーターシステムである、本発明1009または1010の方法。
[本発明1012]
レーザーガイドシステムがScannerMAX Compact-506REシステムである、本発明1009～1010のいずれかの方法。
[本発明1013]
レーザースキャンアセンブリがガルバノメーター用ミラーである、本発明1009～1011のいずれかの方法。
[本発明1014]
レーザーから出射される光の波長が213ナノメートル（nm）～1380 nmの範囲である、本発明1001～1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
レーザーから出射される光の波長が355 nm、514 nm、532 nmまたは1064 nmである、本発明1014の方法。
[本発明1016]
マイクロキャピラリーアレイが試料ステージに連結される、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
試料ステージが、レーザーを位置決めする工程（A）の際にレーザーガイドシステムより遅い速度で移動する、本発明1016の方法。
[本発明1018]
例えば20,000～120,000 Hzかつ10～1000のトータルパルスを含む、1秒間に100個のパルス～1秒間に1000個のパルスの範囲で、レーザーがパルス発振する、本発明1001～1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
レーザーが、20,000～120,000 Hzかつ10～1000のトータルパルスでパルス発振する、本発明1001～1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
レーザーが、1秒間に500個のパルスをパルス発振する、本発明1001～1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
レーザーを位置決めする工程（A）が、レーザーガイドシステムを用いた第1のマイクロキャピラリーウェルの内容物のイメージングをさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1022]
第1のマイクロキャピラリーウェルの、2個のサブセクション～10個のサブセクションの範囲の複数のサブセクションに、レーザーがパルス発振する、本発明1004～1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
レーザーが、第1のマイクロキャピラリーウェルの5個のサブセクションにパルス発振する、本発明1004～1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
レーザーが、第1のマイクロキャピラリーウェルのサブセクション1個あたり5個のパルス～15個のパルスの範囲でパルス発振する、本発明1004～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
レーザーが、第1のマイクロキャピラリーウェルのサブセクション1個あたり10個のパルスをパルス発振する、本発明1004～1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
各レーザーパルスが5ナノ秒（ns）～20 nsの範囲の持続時間を有する、本発明1004～1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
各レーザーパルスが15 nsの持続時間を有する、本発明1004～1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
レーザーが、第1のマイクロキャピラリーウェルの5個のサブセクションにパルス発振し、レーザーが、第1のマイクロキャピラリーウェルのサブセクション1個あたり10個のパルスをパルス発振し、かつ各レーザーパルスが15 nsの持続時間を有する、本発明1004～1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
レーザーガイドシステムが、レーザーから出射されるビームの形状を変更するための1つまたは複数の空間光変調器をさらに含む、本発明1009～1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
レーザーガイドシステムが、レーザーから出射されるビームの形状を変更するためのデジタルマイクロミラーデバイス（DMD）をさらに含む、本発明1009～1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
抽出して回収する工程（C）の内容物が収集スライド上に配置される、本発明1001～1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
収集スライドが、溶解バッファーが入っている1つまたは複数の収集スライドを備えており、該溶解バッファーが、内容物を回収する工程（C）の前に1つまたは複数の収集ウェルに添加される、本発明1031の方法。
[本発明1033]
収集スライドが、溶解バッファーが入っていない1つまたは複数の収集ウェルを備えており、該溶解バッファーが、内容物を回収する工程（C）の前に1つまたは複数の収集ウェルに添加されない、本発明1031の方法。
[本発明1034]
抽出して回収する工程（C）の後に、前記内容物を収集スライド上に配置する工程、および該収集スライドを凍結させる工程をさらに含む、本発明1001～1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
収集スライドがその後、解凍される、本発明1034の方法。
[本発明1036]
解凍された収集スライドが、細胞内のRNAを変性させるための処理に供される、本発明1035の方法。
[本発明1037]
変性したRNAを含む解凍された収集スライドがRT-PCR増幅に供される、本発明1036の方法。
[本発明1038]
RT-PCR増幅産物が定量される、本発明1037の方法。
[本発明1039]
RT-PCR増幅産物がシーケンシングされる、本発明1038の方法。
[本発明1040]
抽出して回収する工程（C）の後に、前記内容物を収集スライド上に配置する工程、および該収集スライドの該内容物をPCRプレートに移し変える工程、および該PCRプレートを凍結させる工程をさらに含む、本発明1001～1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
PCRプレートがその後、解凍される、本発明1040の方法。
[本発明1042]
解凍されたPCRプレートが、RNAを変性させるための処理に供される、本発明1041の方法。
[本発明1043]
変性したRNAを含む解凍されたPCRプレートがRT-PCR増幅に供される、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記内容物が遺伝物質を含み、前記試料が、所望の表現型を有する1つまたは複数のインタクトな細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1045]
前記1つまたは複数の細胞がB細胞である、本発明1044の方法。
[本発明1046]
遺伝物質が抗体配列を含む、本発明1044～1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
抗体配列が重鎖および軽鎖を含む、本発明1046の方法。
[本発明1048]
遺伝物質がmRNAを含む、本発明1047の方法。
[本発明1049]
逆転写がmRNAに対して行なわれる、本発明1048の方法。
[本発明1050]
重鎖および軽鎖のRT-PCR増幅が別々の反応で行なわれる、本発明1049の方法。
[本発明1051]
重鎖および軽鎖のRT-PCR増幅が単一の反応槽内で行なわれる、本発明1050の方法。
[本発明1052]
前記内容物が遺伝物質を含み、前記試料が、所望の表現型を有する1つまたは複数のインタクトな細胞を含み、シングルセルNGSシーケンシングが、遺伝的表現型を決定するために使用される、本発明1001の方法。
[本発明1053]
RT-PCR増幅が、1つまたは複数のシングルセル特異的DNAレベルバーコードをさらに含む、本発明1037～1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
RT-PCR増幅が、1つまたは複数のシングルセル特異的DNAレベルバーコードをさらに含み、ここで、増幅される抗体配列の重鎖および軽鎖に、同じバーコードが付加される、本発明1037～1052のいずれかの方法。
本開示の方法および装置は、本明細書に組み入れられる添付の図面および一緒になって本発明の一部の特定の原理を説明するのに役立つ以下の詳細な説明から明らかであるか、または図面および詳細な説明に、より詳細に示している他の特長および利点を有する。 [Invention 1001]
A method for recovering sample contents from a microcapillary array comprising a plurality of microcapillary wells, the method comprising:
(A) positioning a laser to target a first microcapillary well of the plurality of microcapillary wells;
(B) pulsing a laser into the first microcapillary well at least once; and
(C) extracting the contents from the first microcapillary well, thereby recovering the contents of the first microcapillary well;
The method described above.
[Present invention 1002]
1001. The method of the invention 1001 further comprising identifying the first microcapillary well before step (A) of positioning the laser.
[Present invention 1003]
The method of the invention 1001 or 1002, wherein pulsing the laser (B) further comprises pulsing the laser toward one or more subsections of the first microcapillary well.
[Present invention 1004]
pulsing the laser (B) further comprises pulsing the laser more than once and pulsing the laser to more than one subsection of the first microcapillary well; The method according to any one of the present inventions 1001 to 1003.
[Present invention 1005]
The method of any of the inventions 1001-1003, wherein said content comprises one or more intact cells.
[Present invention 1006]
1005. The method of the invention 1005, wherein said one or more intact cells comprise a mammalian cell, a fungal cell, a bacterial cell, an insect cell or a plant cell.
[Present invention 1007]
The method of the invention 1005 or 1006, wherein said one or more intact cells are no longer capable of cell proliferation.
[Present invention 1008]
1001. The method of the invention 1001, wherein the step of extracting and recovering (C) further comprises imaging the contents during recovery of the contents.
[Present invention 1009]
The method according to any of the inventions 1001 to 1008, wherein the step (A) of positioning the laser is performed using a laser guide system.
[Present invention 1010]
1009. The method of the invention 1009, wherein the laser guiding system includes a laser, a laser scanning assembly, a scanning lens system, and a tube lens.
[Present invention 1011]
The method of invention 1009 or 1010, wherein the laser guide system is a galvanometer system.
[Invention 1012]
The method of any of the inventions 1009-1010, wherein the laser guide system is a ScannerMAX Compact-506RE system.
[Present invention 1013]
The method of any of the inventions 1009-1011, wherein the laser scanning assembly is a galvanometer mirror.
[Present invention 1014]
The method according to any one of Inventions 1001 to 1013, wherein the wavelength of the light emitted from the laser is in the range of 213 nanometers (nm) to 1380 nm.
[Present invention 1015]
The method of the invention 1014, wherein the wavelength of the light emitted from the laser is 355 nm, 514 nm, 532 nm or 1064 nm.
[Invention 1016]
The method of any of the inventions 1001-1015, wherein the microcapillary array is coupled to the sample stage.
[Invention 1017]
The method of the invention 1016, wherein the sample stage moves at a slower speed than the laser guiding system during step (A) of positioning the laser.
[Invention 1018]
The method according to any one of the inventions 1001 to 1017, wherein the laser is pulsed in the range of 100 pulses per second to 1000 pulses per second, including, for example, 20,000 to 120,000 Hz and 10 to 1000 total pulses. .
[Invention 1019]
The method of any of the inventions 1001 to 1018, wherein the laser is pulsed at 20,000 to 120,000 Hz and 10 to 1000 total pulses.
[Invention 1020]
The method according to any one of Inventions 1001 to 1019, wherein the laser pulses 500 pulses per second.
[Invention 1021]
The method of the invention 1011, wherein positioning the laser (A) further comprises imaging the contents of the first microcapillary well using a laser guiding system.
[Invention 1022]
1022. The method of any of the inventions 1004-1021, wherein the laser is pulsed into a plurality of subsections of the first microcapillary well ranging from 2 subsections to 10 subsections.
[Invention 1023]
1023. The method of any of the inventions 1004-1022, wherein the laser is pulsed into five subsections of the first microcapillary well.
[Invention 1024]
The method of any of the inventions 1004-1023, wherein the laser is pulsed in the range of 5 pulses to 15 pulses per subsection of the first microcapillary well.
[Invention 1025]
1025. The method of any of the inventions 1004-1024, wherein the laser pulses 10 pulses per subsection of the first microcapillary well.
[Invention 1026]
The method of any of the inventions 1004-1025, wherein each laser pulse has a duration in the range of 5 nanoseconds (ns) to 20 ns.
[Invention 1027]
The method of any of the inventions 1004-1026, wherein each laser pulse has a duration of 15 ns.
[Invention 1028]
The laser pulses 5 subsections of the first microcapillary well, the laser pulses 10 pulses per subsection of the first microcapillary well, and each laser pulse pulses 15 The method of any of the inventions 1004-1027, having a duration of ns.
[Invention 1029]
1029. The method of any of the inventions 1009-1028, wherein the laser guiding system further includes one or more spatial light modulators to modify the shape of the beam emitted by the laser.
[Invention 1030]
1029. The method of any of the inventions 1009-1029, wherein the laser guiding system further comprises a digital micromirror device (DMD) for modifying the shape of the beam emitted by the laser.
[Present invention 1031]
The method of any of the inventions 1001-1030, wherein the contents of extracting and collecting step (C) are placed on a collection slide.
[Invention 1032]
the collection slide comprises one or more collection slides containing a lysis buffer, the lysis buffer being added to the one or more collection wells prior to step (C) of collecting the contents; , the method of the invention 1031.
[Present invention 1033]
the collection slide comprises one or more collection wells without lysis buffer, and the lysis buffer is not added to the one or more collection wells prior to step (C) of collecting the contents; Method of the invention 1031.
[Present invention 1034]
1034. The method of any of the inventions 1001-1033, further comprising, after the step of extracting and collecting (C), placing the contents on a collection slide and freezing the collection slide.
[Invention 1035]
The method of the invention 1034, wherein the collection slide is then thawed.
[Invention 1036]
1035. The method of the invention 1035, wherein the thawed collection slide is subjected to a treatment to denature the RNA within the cells.
[Present invention 1037]
1036. The method of the invention 1036, wherein thawed collection slides containing denatured RNA are subjected to RT-PCR amplification.
[Invention 1038]
1037. The method of the invention 1037, wherein the RT-PCR amplification product is quantified.
[Invention 1039]
1038. The method of the invention 1038, wherein the RT-PCR amplification products are sequenced.
[Invention 1040]
After the step of extracting and collecting (C), further steps of placing the contents on a collection slide, transferring the contents of the collection slide to a PCR plate, and freezing the PCR plate. The method of any of inventions 1001-1039, comprising:
[Present invention 1041]
The method of the invention 1040, wherein the PCR plate is then thawed.
[Present invention 1042]
1041. The method of the invention 1041, wherein the thawed PCR plate is subjected to a treatment to denature the RNA.
[Invention 1043]
1042. The method of the invention 1042, wherein a thawed PCR plate containing denatured RNA is subjected to RT-PCR amplification.
[Present invention 1044]
1001. The method of the invention 1001, wherein the content includes genetic material and the sample includes one or more intact cells having a desired phenotype.
[Invention 1045]
1044. The method of the invention 1044, wherein said one or more cells are B cells.
[Invention 1046]
The method of any of the inventions 1044-1045, wherein the genetic material comprises an antibody sequence.
[Invention 1047]
1046. The method of the invention 1046, wherein the antibody sequence comprises a heavy chain and a light chain.
[Invention 1048]
1047. The method of the invention 1047, wherein the genetic material comprises mRNA.
[Invention 1049]
1048. The method of the invention, wherein reverse transcription is performed on mRNA.
[Invention 1050]
1049. The method of the invention 1049, wherein RT-PCR amplification of heavy and light chains is performed in separate reactions.
[Present invention 1051]
1050. The method of the invention 1050, wherein heavy chain and light chain RT-PCR amplification is performed in a single reaction vessel.
[Invention 1052]
the contents include genetic material, the sample includes one or more intact cells with a desired phenotype, and single cell NGS sequencing is used to determine the genetic phenotype; Method of the invention 1001.
[Present invention 1053]
The method of any of the inventions 1037-1052, wherein the RT-PCR amplification further comprises one or more single cell-specific DNA level barcodes.
[Invention 1054]
The invention 1037 wherein the RT-PCR amplification further comprises one or more single cell-specific DNA level barcodes, wherein the same barcode is appended to the heavy and light chains of the antibody sequence being amplified. Any method from ~1052.
The methods and apparatus of the present disclosure will be apparent from the accompanying drawings, which are incorporated herein and from the following detailed description, which together serve to explain certain principles of the invention, or the drawings. and other features and advantages which are set forth in more detail in the detailed description.

Claims

A method for recovering sample contents from a microcapillary array comprising a plurality of microcapillary wells, the method comprising:
(A) positioning a laser to target a first microcapillary well of the plurality of microcapillary wells;
(B) pulsing a laser into the first microcapillary well at least once; and (C) extracting the contents from the first microcapillary well, thereby The method, comprising the step of recovering the contents.

2. The method of claim 1, further comprising identifying the first microcapillary well before step (A) of positioning the laser.

2. The method of claim 1, wherein pulsing the laser (B) further comprises pulsing the laser toward one or more subsections of the first microcapillary well.

pulsing the laser (B) further comprises pulsing the laser more than once and pulsing the laser to more than one subsection of the first microcapillary well; The method according to claim 1.

2. The method of claim 1, wherein the contents include one or more intact cells.

2. The method of claim 1, wherein the step of extracting and recovering (C) further comprises imaging the contents during recovery.

2. The method of claim 1, wherein step (A) of positioning the laser is performed using a laser guiding system.

8. The method of claim 7 , wherein the laser guide system is a galvanometer system.

2. The method of claim 1, wherein the microcapillary array is coupled to the sample stage.

2. The method of claim 1, wherein the frequency of the laser pulses is in the range of 100 Hz to 120,000 Hz and between 10 and 1000 total pulses.

2. The method of claim 1 , wherein positioning the laser (A) further comprises imaging the contents of the first microcapillary well using a laser guiding system.

5. The method of claim 4, wherein the laser is pulsed into a plurality of subsections of the first microcapillary well ranging from 2 subsections to 10 subsections.

5. The method of claim 4, wherein the laser is pulsed in the range of 5 pulses to 15 pulses per subsection of the first microcapillary well.

8. The method of claim 7 , wherein the laser guiding system further includes one or more spatial light modulators to modify the shape of the beam emitted by the laser.

2. The method of claim 1, wherein the contents of extracting and collecting step (C) are placed on a collection slide.

2. The method of claim 1, further comprising, after extracting and collecting step (C), placing the contents on a collection slide and freezing the collection slide.

17. The method of claim 16 , wherein the collection slide is then thawed and subjected to treatment to denature the RNA within the cells, and the denatured RNA is subjected to RT-PCR amplification.

2. The method of claim 1, wherein the contents include genetic material and the sample includes one or more intact cells having a desired phenotype.

19. The method of claim 18 , wherein the one or more intact cells are B cells.

the contents include genetic material, the sample includes one or more intact cells with a desired phenotype, and single cell NGS sequencing is used to determine the genetic phenotype; The method according to claim 1.