JPWO2021053208A5

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Publication number: JPWO2021053208A5
Application number: JP2022512862A
Authority: JP
Publication date: 2023-09-08

Claims

増幅およびシーケンス後のハイスループットシーケンシングデータのゲノムデータ分析ワークフローにおいて断片の同定を容易にするために、少なくとも２つのＤＮＡ断片からＤＮＡアダプター産物のライブラリーを生成する方法であって、
（Ｉ）ＤＮＡアダプターのプールを生成する工程であって、前記アダプターは、お互いに全長が少なくとも３ヌクレオチド、最大でＬ_ｍａｘヌクレオチド異なり、各アダプターは、長さＬ_ＴＳの定常終結部分配列ＴＳを含み、Ｌ_ＴＳが３以上のヌクレオチドが可変スペーサー部分配列と連結しており、前記可変スペーサー部分配列は、長さがＬ_Ｓのヌクレオチドを有する共通の一定の所定のヌクレオチド配列から切断されており、Ｌ _Ｓは５～２０ヌクレオチドの間である、工程、
（ＩＩ）反応混合物中で、ＤＮＡ－アダプターのプールからの第１および第２アダプターを第１の二本鎖ＤＮＡ断片の各末端に連結して、第１のＤＮＡ－アダプター産物を産生する工程であって、各アダプターが複数の二本鎖または部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを含み、各二本鎖または部分的に二本鎖のポリヌクレオチドがアダプターの二本鎖末端にスペーサー配列を含み、その結果、第１のＤＮＡ－アダプター産物が、第１および第２のＤＮＡ－アダプタースペーサー配列（ＳＳ_１、ＳＳ_２）のそれぞれの長さ（Ｌ_１，Ｌ_２）によって形成される数値コードによって特徴付けられ得る、工程、
（ＩＩＩ）同じ反応混合物中で、ＤＮＡ－アダプターのプールからの第３および第４のアダプターを第２の二本鎖ＤＮＡ断片の各末端に連結して、第２のＤＮＡ－アダプター産物を産生する工程であって、各アダプターが複数の二本鎖または部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを含み、各二本鎖または部分的に二本鎖のポリヌクレオチドがアダプターの二本鎖末端にスペーサー配列を含み、その結果、第２のＤＮＡ－アダプター産物が、第３および第４のＤＮＡ－アダプタースペーサー配列（ＳＳ _３、ＳＳ _４）のそれぞれの長さ（Ｌ_３，Ｌ_４）によって形成される数値コードによって特徴付けられ得る、工程、
を含む方法。
前記定常終結部分配列ＴＳが、前記一定の所定のヌクレオチド配列Ｓと、編集距離が少なくとも２だけ異なる、請求項１に記載の方法。
前記スペーサー部分配列が、前記一定のヌクレオチド配列（Ｓ）から開始して左から右に切断されている、請求項１または２に記載の方法。
前記スペーサー部分配列が、前記一定のヌクレオチド配列（Ｓ）から終了して右から左に切断されている、請求項１または２に記載の方法。
前記定常終結部分配列ＴＳが、前記ＤＮＡ断片への連結を容易にするためのＴオーバーハングで終わるトリプレットヌクレオチドである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記定常終結部分配列ＴＳが、前記ＤＮＡ断片への連結を容易にするためのＴオーバーハングで終わるクアドロプレットヌクレオチドである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
（ＩＶ）ＤＮＡ－アダプター産物を増幅して、ハイスループットシーケンシングに適したＰＣＲ複製物を生成する工程、
（Ｖ）前記ＰＣＲ複製物をハイスループットシーケンサーでシーケンシングして生のシーケンシングリードを生成する工程、
をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
（Ｖ）各シーケンシングリードＲ_ｎについて、
ａ．トリミングされたシーケンシングリードを生成するために、リードの開始点からＬ_ｍａｘヌクレオチドをトリミングする工程、
ｂ．トリミングされたシーケンシングリードを前処理されたシーケンシングリードファイルに記録する工程、
（ＶＩ）それぞれのトリミングされたリードを開始位置および終了位置にマッピングするように、トリミングされたシーケンシングリードを前処理されたシーケンシングリードファイルから参照ゲノムにアラインメントする工程、
をさらに含む、請求項７に記載の方法。
（Ｖ）各シーケンシングリードＲ_ｎについて、
ｃ．シーケンシングリードの最初のＬ_ｍａｘヌクレオチド中の定常終結部分配列ＴＳを探索し、スペーサー配列ＳＳ_Ｒｎの長さＬ_ｎを、定常終結部分配列ＴＳの開始点をシーケンシングリードＲ_ｎの開始点から分離するヌクレオチドの数の関数として測定する工程、
ｄ．リードの開始点から少なくともＬ_ｎヌクレオチドをトリミングして、トリミングされたシーケンシングリードを生成する工程、
ｅ．測定された長さＬ_ｎおよびトリミングされたシーケンシングリードを前処理されたシーケンシングリードファイルに記録する工程、
（ＶＩ）それぞれのトリミングされたリードを開始位置および終了位置にマッピングするように、トリミングされたシーケンシングリードを前処理されたシーケンシングリードファイルから参照ゲノムにアラインメントする工程、
をさらに含む、請求項７に記載の方法。
各シーケンシングリードＲ_ｎについて、Ｌ_ｍａｘに等しい数のヌクレオチドが前記リードの開始点からトリミングされる、請求項９に記載の方法。
各シーケンシングリードＲ_ｎについて、そのスペーサー配列の前記測定された長さに対応する数のＬ_ｎヌクレオチドが、前記リードの開始点からトリミングされる、請求項９に記載の方法。
シーケンシングがペアエンドリードを生成し、参照ゲノム配列リード方向に対して同じ開始位置および終了位置にアラインメントされ、測定されたスペーサー配列長（Ｌ１，Ｌ２）の同じ数値コード対を有するペアエンドリードを、同じ元の二本鎖ＤＮＡ断片の前記２本鎖から生じるシーケンシングリードとしてグループ化し、測定されたスペーサー配列長（Ｌ１，Ｌ２）の数値コード対が、Ｆ１Ｒ２配向を有するペアエンドリードの場合には｛Ｌ_{ｎ（ｆｏｒｗａｒｄ）}，Ｌ_{ｍ（ｒｅｖｅｒｓｅ）}｝によって、Ｆ２Ｒ１配向を有するペアエンドリードの場合には｛Ｌ_{ｎ（ｒｅｖｅｒｓｅ）}，Ｌ_{ｍ（ｆｏｒｗａｒｄ）}｝によって与えられる場合、それらのペアエンドリードをそれらの鎖起源に従って２つのサブグループにさらに細分化する工程をさらに含む、請求項９、１０または１１のいずれか一項に記載の方法。
同一の開始コード、終了コードおよび数値コードを共有する各リードグループを、それらの親フラグメントのコンセンサス配列に折り畳み、バリアントコーリング法で、この親フラグメントのバリアントを前記折り畳まれたコンセンサス配列に同定する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
同一の開始コード、終了コードおよび数値コードを共有する各リードグループについて、統計的バリアントコーリング法で、それらの親フラグメントに対するバリアントの確率を同定することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
サンプルのプールから少なくとも２つの患者サンプル中のゲノムバリアントを同定するためのマルチプレックスハイスループット配列決定ゲノム分析方法であって、請求項１に記載の方法を用いてＤＮＡアダプター産物のライブラリーを生成することを含み、前記ＤＮＡアダプター産物のライブラリーがサンプル間で異なる、方法。
前記ＤＮＡアダプター産物のライブラリーが、前記終結部分配列ＴＳによってサンプル間で異なる、請求項１５に記載の方法。
前記ＤＮＡ－アダプター産物のライブラリーが、可変スペーサー部分配列の切断に使用される所定のヌクレオチド配列（Ｓ）によってサンプル間で異なる、請求項１５または１６記載の方法。