JPWO2021030657A5 - - Google Patents

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JPWO2021030657A5
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この実施例は、本明細書に提供される多重特異性結合分子を介してＬＴＢＲを活性化するアプローチ、例えば、細胞外マトリックスに関連するＬＴＢＲ及び腫瘍関連抗原の両方への結合が、それ以上試験された細胞外マトリックスの３つの異なる腫瘍関連抗原すべてに対して機能し、したがって、細胞外マトリックスに存在する腫瘍関連抗原には一般に適用可能であることを実証した。本実施例はまた、ｓｐＦｖを組み込んだ分子が機能的であることを実証した。

以下の態様を包含し得る。
［１］ 重鎖可変領域（ＶＨ）、リンカー（Ｌ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、
ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合、及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖ。
［２］ ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含む単離されたｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置にＶＨ Ｃｙｓを含み、前記Ｌが、第１のＬ Ｃｙｓを含むか、
ｂ）前記ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置にＶＬ Ｃｙｓを含み、前記Ｌが、第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又は
ｃ）前記ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置に前記ＶＨ Ｃｙｓを含み、前記ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置に前記ＶＬ Ｃｙｓを含み、前記Ｌが、前記第１のＬ Ｃｙｓ及び前記第２のＬ Ｃｙｓを含み、前記ＶＨ Ｃｙｓ及び前記第１のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができ、前記ＶＬ Ｃｙｓ及び前記第２のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができる、単離されたｓｃＦｖ。
［３］ 前記ＶＨ Ｃｙｓと前記ＶＬ Ｃｙｓとの間の距離が、約７Å～約９Åである、上記［１］又は［２］に記載のｓｃＦｖ。
［４］ 前記ＶＨ Ｃｙｓが、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ４０、Ｈ４３、Ｈ４６又はＨ１０５にあり、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
［５］ 前記ＶＬ Ｃｙｓが、Ｌ３、Ｌ５、Ｌ３９、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｌ１００又はＬ１０２にあり、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う、上記［１］～［４］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
［６］ ａ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｂ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、
ｃ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｄ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｅ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ｆ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｇ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｈ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、
ｉ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあるか、
ｊ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｋ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｌ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ｍ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｎ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｏ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、
ｐ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあるか、
ｑ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｒ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｓ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ｔ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｕ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｖ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、
ｗ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあるか、
ｘ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｙ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｚ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ａａ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｂｂ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｃｃ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあるか、
ｄｄ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｅｅ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｆｆ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ｇｇ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｈｈ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｉｉ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、
ｊｊ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあるか、
ｋｋ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｌｌ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｍｍ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ｎｎ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｏｏ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、又は
ｐｐ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあり、残基番号付けがＣｈｏｔｈｉａに従う、上記［１］～［５］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
［７］ 前記Ｌが、免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ領域に由来する連続アミノ酸配列を含む、上記［１］～［６］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
［８］ 前記Ｉｇヒンジ領域が、ヒト又は非ヒトＩｇヒンジ領域に由来する、上記［７］に記載のｓｃＦｖ。
［９］ 前記Ｉｇヒンジ領域が、前記ヒトＩｇヒンジ領域に由来する、上記［８］に記載のｓｃＦｖ。
［１０］ 前記ヒトＩｇヒンジ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプである、上記［９］に記載のｓｃＦｖ。
［１１］ 前記Ｌが、アミノ酸配列Ｃ（Ｘ） ｙ Ｃ（配列番号２３）を含み、式中、Ｘは、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）又はチロシン（Ｔｙｒ）であり、ｙは、１～３の整数である、上記［１］～［１０］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
［１２］ 前記Ｌが、アミノ酸配列Ｃ（Ｘ） ｙ Ｃ（配列番号２４）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ又はＰｒｏであり、ｙは、１～３の整数である、上記［１１］に記載のｓｃＦｖ。
［１３］ 前記Ｌが、前記アミノ酸配列ＣＰＣ、ＣＧＣ、ＣＳＣ、ＣＰＰＣ（配列番号１）、ＣＧＰＣ（配列番号２８）、ＣＰＧＣ（配列番号２９）、ＣＧＧＣ（配列番号３０）、ＣＳＰＧ（配列番号３１）、ＣＰＳＣ（配列番号３２）、ＣＳＳＣ（配列番号３３）、ＣＧＳＣ（配列番号３４）、ＣＳＧＣ（配列番号３５）、ＣＰＰＰＣ（配列番号３６）、ＣＧＰＰＣ（配列番号３７）、ＣＰＧＰＣ（配列番号３８）、ＣＰＰＧＣ（配列番号３９）、ＣＧＧＰＣ（配列番号４０）、ＣＰＧＧＣ（配列番号４１）、ＣＧＧＧＣ（配列番号４２）、ＣＳＰＰＣ（配列番号４３）、ＣＰＳＰＣ（配列番号４４）、ＣＰＰＳＣ（配列番号４５）、ＣＳＳＰＣ（配列番号４６）、ＣＰＳＳＣ（配列番号４７）、ＣＳＳＳＣ（配列番号４８）、ＣＧＳＰＣ（配列番号４９）、ＣＰＧＳＣ（配列番号５０）、ＣＳＧＰＣ（配列番号５１）又はＣＰＳＧＣ（配列番号５２）を含む、上記［１］～［１２］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
［１４］ 前記Ｌが、約１４～約１９アミノ酸、例えば、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、又は約１９アミノ酸を含む、上記［１］～［１３］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
［１５］ 前記Ｌが、アミノ酸配列（Ｘ） ｍ Ｃ（Ｘ） ｙ Ｃ（Ｘ） ｎ （配列番号２５）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である、上記［１］～［１４］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
［１６］ 前記Ｌが、アミノ酸配列（Ｘ） ｍ Ｃ（Ｘ） ｙ Ｃ（Ｘ） ｎ （配列番号２６）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＴｙｒであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である、上記［１５］に記載のｓｃＦｖ。
［１７］ 前記Ｌが、アミノ酸配列（Ｘ） ｍ Ｃ（Ｘ） ｙ Ｃ（Ｘ） ｎ （配列番号２７）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ又はＰｒｏであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である、上記［１６］に記載のｓｃＦｖ。
［１８］ 前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含む、上記［１］～［１７］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
［１９］ 前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、上記［１］～［１８］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
［２０］ 前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、上記［１］～［１８］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
［２１］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
［２２］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
［２３］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
［２４］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
［２５］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
［２６］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
［２７］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
［２８］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
［２９］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
［３０］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
［３１］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
［３２］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
［３３］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
［３４］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
［３５］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
［３６］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
［３７］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
［３８］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
［３９］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
［４０］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
［４１］ ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
［４２］ 前記Ｌが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、上記［２１］～［４１］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
［４３］ 前記Ｌが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、上記［２１］～［４１］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
［４４］ 前記Ｌが、配列番号７のアミノ酸配列を含む、上記［２１］～［４１］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
［４５］ 前記ｓｃＦｖが、第２の分子に共役される、上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
［４６］ 前記第２の分子が、半減期延長部分である、上記［４５］に記載のｓｃＦｖ。
［４７］ 前記半減期延長部分が、免疫グロブリン（Ｉｇ）、前記Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、前記Ｉｇ定常領域の断片、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミン結合ドメイン又はポリエチレングリコールである、上記［４６］に記載のｓｃＦｖ。
［４８］ 前記第２の分子が、細胞傷害性薬剤又は検出可能な標識である、上記［４５］に記載のｓｃＦｖ。
［４９］ 前記第２の分子が、抗体又はその断片である、上記［４８］に記載のｓｃＦｖ。
［５０］ 前記ｓｃＦｖ及び前記抗体又は前記その断片が、異なる抗原に結合している、上記［４９］に記載のｓｃＦｖ。
［５１］ 前記第２の分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、上記［４５］に記載のｓｃＦｖ。
［５２］ 上記［１］～［５１］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
［５３］ 上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖをコードする、ポリヌクレオチド。
［５４］ 上記［５３］に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［５５］ 上記［５４］に記載のベクターを含む、宿主細胞。
［５６］ 上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖを産生する方法であって、前記ｓｃＦｖが産生される条件で上記［５５］に記載の宿主細胞を培養することと、前記ｓｃＦｖを精製することと、を含む、方法。
［５７］ 前記宿主細胞が、原核細胞である、上記［５６］に記載の方法。
［５８］ 前記宿主細胞が、真核細胞である、上記［５６］に記載の方法。
［５９］ 上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖに結合する、抗イディオタイプ抗体。
［６０］ 上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖを含む、キット。
［６１］ 上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖを含む、多重特異性分子。
［６２］ 前記多重特異性分子が、抗体又は抗体断片を含む、上記［６１］に記載の多重特異性分子。
［６３］ 前記多重特異性タンパク質が、Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の断片を含む、上記［６１］に記載の多重特異性分子。
［６４］ 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、Ｆｃ領域を含む、上記［６３］に記載の多重特異性タンパク質。
［６５］ 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＣＨ２ドメインを含む、上記［６３］に記載の多重特異性分子。
［６６］ 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＣＨ３ドメインを含む、上記［６３］に記載の多重特異性分子。
［６７］ 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記ＣＨ２ドメインと、前記ＣＨ３ドメインと、を含む、上記［６３］に記載の多重特異性分子。
［６８］ 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ヒンジの少なくとも一部分、前記ＣＨ２ドメイン及び前記ＣＨ３ドメインを含む、上記［６３］に記載の多重特異性分子。
［６９］ 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記ヒンジと、前記ＣＨ２ドメインと、前記ＣＨ３ドメインと、を含む、上記［６３］に記載の多重特異性分子。
［７０］ 前記ｓｃＦｖが、前記Ｉｇ定常領域のＮ末端又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片のＮ末端に共役される、上記［６３］～［６９］のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
［７１］ 前記ｓｃＦｖが、前記Ｉｇ定常領域のＣ末端又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片のＮ末端に共役される、上記［６３］～［６９］のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
［７２］ 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプである、上記［６３］～［７１］のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
［７３］ 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記多重特異性分子のＦｃγＲへの結合を低減する少なくとも１つの変異を含む、上記［６３］～［７２］のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
［７４］ 前記多重特異性分子のＦｃγＲへの結合を低減する前記少なくとも１つの変異が、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６－欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６－欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、上記［７３］に記載の多重特異性分子。
［７５］ 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記多重特異性分子のＦｃγＲへの結合を増強する少なくとも１つの変異を含む、上記［６３］～［７２］のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
［７６］ 前記多重特異性分子のＦｃγＲへの結合を増強する前記少なくとも１つの変異が、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、上記［７５］に記載の多重特異性分子。
［７７］ ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである、上記［７３］～［７６］のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
［７８］ 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の断片が、前記多重特異性分子の半減期を調節する少なくとも１つの変異を含む、上記［６３］～［７２］のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
［７９］ 前記多重特異性分子の前記半減期を調節する前記少なくとも１つの変異が、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ及びＨ４３５Ｒからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、上記［７８］に記載の多重特異性分子。
［８０］ 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の断片が、前記ＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む、上記［６３］～［７２］のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
［８１］ 前記ＣＨ３ドメインにおける前記少なくとも１つの変異が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、上記［８０］に記載の多重特異性分子。
［８２］ 前記多重特異性分子が、二重特異性である、上記［６１］～［８１］のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
［８３］ 前記多重特異性分子が、三重特異性である、上記［６１］～［８１］のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
［８４］ 前記多重特異性分子が、四重特異性である、上記［６１］～［８１］のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
［８５］ 上記［６１］～［８４］のいずれか一項に記載の多重特異性分子及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
［８６］ 上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖを含む、異種分子。
［８７］ 前記ｓｃＦｖが、第２のタンパク質、ポリヌクレオチド、治療薬、細胞傷害性薬剤又は検出可能な標識に共役される、上記［８６］に記載の異種分子。
［８８］ 前記第２のタンパク質が、抗体又はその断片である、上記［８７］に記載の異種分子。
［８９］ 前記第２のタンパク質が、代替スカフォールドである、上記［８７］に記載の異種分子。
［９０］ 前記第２のタンパク質が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はその断片である、上記［８７］に記載の異種分子。
［９１］ 前記異種分子が、単一特異性である、上記［８６］～［９０］のいずれか一項に記載の異種分子。
［９２］ 前記異種分子が、多重特異性である、上記［８６］～［９０］のいずれか一項に記載の異種分子。
［９３］ 前記異種分子が、二重特異性である、上記［９２］に記載の異種分子。
［９４］ 前記異種分子が、三重特異性である、上記［９２］に記載の異種分子。
［９５］ 前記異種分子が、四重特異性である、上記［９２］に記載の異種分子。
［９６］ 上記［８６］～［９５］のいずれか一項に記載の異種分子と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
［９７］ 安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
抗原結合ドメインを形成する重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を提供することと、
第１のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれを含むように操作されたリンカー（Ｌ）を提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含むように前記ＶＨを操作することと、
前記ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、前記安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセス。
［９８］ 安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
抗原結合ドメインを形成するＶＨ及びＶＬを提供することと、
第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれを含むように操作されたＬを提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置にＶＬ Ｃｙｓを含むように前記ＶＬを操作することと、
前記ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、前記安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセス。
［９９］ 安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
抗原結合ドメインを形成するＶＨ及びＶＬを提供することと、
第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれらを含むように操作されたＬを提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置にＶＨ Ｃｙｓを含むように前記ＶＨを操作することと、
構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置にＶＬ Ｃｙｓを含むように前記ＶＬを操作することと、
前記ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成し、前記ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、前記安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセス。
［１００］ 前記安定化ｓｃＦｖが、上記［１］～［４４］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖである、上記［９７］～［９９］のいずれか一項に記載のプロセス。
［１０１］ 前記安定化ｓｃＦｖが、前記ジスルフィド結合を欠いている対照ｓｃＦｖと比較した場合、同等の親和性で抗原に結合する、上記［９７］～［１００］のいずれか一項に記載のプロセス。
［１０２］ 安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
ａ）ＶＨ、Ｌ及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを提供することであって、
ｉ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ｉｖ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｖ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｖｉ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｖｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｖｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ｉｘ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ｘ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ｘｉ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｘｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｘｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｘｉｖ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｘｖ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ｘｖｉ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ｘｖｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ｘｖｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｘｉｘ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｘｘ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｉ．前記ＶＨが、Ｈ４０にｉＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ｘｘｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｉｖ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ｘｘｖ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｖｉ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｘｘｖｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｖｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｉｘ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｉ．前記ＶＨがＨ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｉｖ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｖ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｖｉ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｖｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３でＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｖｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｉｘ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｘｌ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｘｌｉ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、又は
ｘｌｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
残基番号付けが、Ｃｈｏｔｈｉａに従う、提供することと、
ｂ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６、又は７のアミノ酸配列を含むことと、
ｃ）宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドを発現させて、前記安定化ｓｃＦｖを産生することと、を含む、プロセス。
［１０３］ 前記宿主細胞が、原核細胞である、上記［１０２］に記載の方法。
［１０４］ 前記宿主細胞が、真核細胞である、上記［１０２］に記載の方法。
［１０５］ 重鎖可変領域（ＶＨ）と、連結（Ｌ）のための手段と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖ。
［１０６］ 抗原結合のための手段と、リンカー（Ｌ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段システイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖ。
［１０７］ 重鎖可変領域（ＶＨ）と、リンカー（Ｌ）と、抗原結合のための手段と、を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと、第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖ。
［１０８］ 重鎖可変領域（ＶＨ）と、連結（Ｌ）のための手段と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む多重特異性分子であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、多重特異性分子。
［１０９］ 抗原結合のための手段と、リンカー（Ｌ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む多重特異性分子であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段システイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段システインＣｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、多重特異性分子。
［１１０］ 重鎖可変領域（ＶＨ）と、リンカー（Ｌ）と、抗原結合（ＶＬ）のための手段と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む多重特異性分子であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合と、を含む、多重特異性分子。
［１１１］ 重鎖可変領域（ＶＨ）と、連結のための手段（Ｌ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む異種分子であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子。
［１１２］ 抗原結合のための手段と、リンカー（Ｌ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む異種分子であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段システイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子。
［１１３］ 重鎖可変領域（ＶＨ）と、リンカー（Ｌ）と、抗原結合のための手段と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む異種分子であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子。
［１１４］ 上記［１０５］～［１１３］のいずれか一項に記載のｓｃＦｖをコードするための手段。
［１１５］ 前記１１４のベクターを複製するための手段。
［１１６］ ｓｃＦｖを安定化するための手段を含む組成物。
［１１７］ ｓｃＦｖの熱安定性を増加させるための手段を含む組成物。
［１１８］ 前記手段が、ＶＨとＬとの間、ＶＬと前記Ｌとの間、又は前記ＶＨと前記Ｌとの間及び前記ＶＬと前記Ｌとの間にジスルフィド結合を形成することを含む、上記［１１６］又は［１１７］に記載の組成物。
［１１９］ ｓｃＦｖを安定化するための手段を含む多重特異性分子。
［１２０］ ｓｃＦｖの熱安定性を増加させるための手段を含む多重特異性分子。
［１２１］ 前記手段が、ＶＨとＬとの間、ＶＬと前記Ｌとの間、又は前記ＶＨと前記Ｌとの間及び前記ＶＬと前記Ｌとの間にジスルフィド結合を形成することを含む、上記［１１９］又は［１２０］に記載の多重特異性分子。
［１２２］ ｓｃＦｖを安定化するための手段を含む異種分子。
［１２３］ ｓｃＦｖの熱安定性を増加させるための手段を含む異種分子。
［１２４］ 前記手段が、ＶＨとＬとの間、ＶＬと前記Ｌとの間、又は前記ＶＨと前記Ｌとの間及び前記ＶＬと前記Ｌとの間にジスルフィド結合を形成することを含む、上記［１２２］又は［１２３］に記載の異種分子。
［１２５］ 上記［１１６］～［１１８］のいずれか一項に記載の組成物を産生するための手段。
［１２６］ 上記［１１９］～［１２１］のいずれか一項に記載の多重特異性分子を産生するための手段。
［１２７］ 上記［１２２］～［１２４］のいずれか一項に記載の異種分子を産生するための手段。
This example demonstrates that approaches to activating the LTBR via the multispecific binding molecules provided herein, e.g., binding to both extracellular matrix-associated LTBR and tumor-associated antigens, can be further tested. demonstrated that it functions against all three different tumor-associated antigens of the extracellular matrix that has been developed and is therefore generally applicable to tumor-associated antigens present in the extracellular matrix. This example also demonstrated that molecules incorporating spFv were functional.

The following aspects may be included.
[1] An isolated single-chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region (VH), a linker (L) and a light chain variable region (VL),
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VH cysteine (Cys) and the first L Cys,
b) a second disulfide bond between a structurally conserved surface-exposed VL Cys and a second L Cys, or
c) said first disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed VH Cys and said first L Cys, and said structurally conserved surface-exposed VL Cys and said second L Cys; the second disulfide bond between the scFv.
[2] an isolated scFv comprising VH, L and VL,
a) said VH comprises a VH Cys at a structurally conserved surface-exposed VH framework residue position and said L comprises a first L Cys;
b) said VL comprises a VL Cys at a structurally conserved surface-exposed VL framework residue position and said L comprises a second L Cys, or
c) said VH comprises said VH Cys at structurally conserved surface-exposed VH framework residue positions and said VL comprises said VL Cys at structurally conserved surface-exposed VL framework residue positions; wherein said L comprises said first L Cys and said second L Cys, said VH Cys and said first L Cys are capable of forming a disulfide bond, said VL Cys and said second of the L Cys is capable of forming a disulfide bond.
[3] The scFv of [1] or [2] above, wherein the distance between the VH Cys and the VL Cys is about 7 Å to about 9 Å.
[4] The scFv of any one of [1] to [3] above, wherein the VH Cys is at H3, H5, H40, H43, H46 or H105, and residue numbering is according to Chothia.
[5] The scFv of any one of [1] to [4] above, wherein the VL Cys is at L3, L5, L39, L42, L45, L100 or L102, and residue numbering is according to Chothia. .
[6] a) said VH Cys is in H105 and said VL Cys is in L42;
b) said VH Cys is in H43 and said VL Cys is in L100;
c) said VH Cys is in H3 and said VL Cys is in L3;
d) said VH Cys is in H3 and said VL Cys is in L5;
e) said VH Cys is in H3 and said VL Cys is in L39;
f) said VH Cys is in H3 and said VL Cys is in L42;
g) said VH Cys is in H3 and said VL Cys is in L45;
h) said VH Cys is in H3 and said VL Cys is in L100;
i) said VH Cys is in H3 and said VL Cys is in L102;
j) said VH Cys is in H5 and said VL Cys is in L3;
k) said VH Cys is in H5 and said VL Cys is in L5;
l) said VH Cys is in H5 and said VL Cys is in L39;
m) said VH Cys is in H5 and said VL Cys is in L42;
n) said VH Cys is in H5 and said VL Cys is in L45;
o) said VH Cys is in H5 and said VL Cys is in L100;
p) said VH Cys is in H5 and said VL Cys is in L102;
q) said VH Cys is in H40 and said VL Cys is in L3;
r) said VH Cys is in H40 and said VL Cys is in L5;
s) said VH Cys is in H40 and said VL Cys is in L39;
t) said VH Cys is in H40 and said VL Cys is in L42;
u) said VH Cys is in H40 and said VL Cys is in L45;
v) said VH Cys is in H40 and said VL Cys is in L100;
w) said VH Cys is in H40 and said VL Cys is in L102;
x) said VH Cys is in H43 and said VL Cys is in L3;
y) said VH Cys is in H43 and said VL Cys is in L5;
z) said VH Cys is at H43 and said VL Cys is at L39;
aa) said VH Cys is in H43 and said VL Cys is in L42;
bb) said VH Cys is in H43 and said VL Cys is in L45;
cc) said VH Cys is in H43 and said VL Cys is in L102;
dd) said VH Cys is in H46 and said VL Cys is in L3;
ee) said VH Cys is in H46 and said VL Cys is in L5;
ff) said VH Cys is in H46 and said VL Cys is in L39;
gg) said VH Cys is in H46 and said VL Cys is in L42;
hh) said VH Cys is in H46 and said VL Cys is in L45;
ii) said VH Cys is in H46 and said VL Cys is in L100;
jj) said VH Cys is in H46 and said VL Cys is in L102;
kk) said VH Cys is in H105 and said VL Cys is in L3;
ll) said VH Cys is in H105 and said VL Cys is in L5;
mm) said VH Cys is in H105 and said VL Cys is in L39;
nn) said VH Cys is in H105 and said VL Cys is in L45;
oo) said VH Cys is in H105 and said VL Cys is in L100, or
pp) The scFv of any one of [1] to [5] above, wherein said VH Cys is at H105, said VL Cys is at L102, and residue numbering is according to Chothia.
[7] The scFv of any one of [1] to [6] above, wherein said L comprises a contiguous amino acid sequence derived from an immunoglobulin (Ig) hinge region.
[8] The scFv of [7] above, wherein the Ig hinge region is derived from a human or non-human Ig hinge region.
[9] The scFv of [8] above, wherein the Ig hinge region is derived from the human Ig hinge region.
[10] The scFv of [9] above, wherein the human Ig hinge region is of the IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 isotype.
[11] L comprises the amino acid sequence C(X) y C (SEQ ID NO: 23), wherein X is glycine (Gly), serine (Ser), proline (Pro), alanine (Ala), arginine (Arg), asparagine (Asn), aspartic acid (Asp), glutamic acid (GIu), glutamine (Gln), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), phenylalanine (Phe), The scFv according to any one of [1] to [10] above, which is threonine (Thr), tryptophan (Trp), or tyrosine (Tyr), and y is an integer of 1-3.
[12] The above [ 11].
[13] L is the amino acid sequence CPC, CGC, CSC, CPPC (SEQ ID NO: 1), CGPC (SEQ ID NO: 28), CPGC (SEQ ID NO: 29), CGGC (SEQ ID NO: 30), CSPG (SEQ ID NO: 31) , CPSC (SEQ ID NO: 32), CSSC (SEQ ID NO: 33), CGSC (SEQ ID NO: 34), CSGC (SEQ ID NO: 35), CPPPC (SEQ ID NO: 36), CGPPC (SEQ ID NO: 37), CGPPC (SEQ ID NO: 38), CPPGC (SEQ ID NO: 39), CGGPC (SEQ ID NO: 40), CPGGC (SEQ ID NO: 41), CGGGC (SEQ ID NO: 42), CSPPC (SEQ ID NO: 43), CPSPC (SEQ ID NO: 44), CPPSC (SEQ ID NO: 45), CSSPC (SEQ ID NO: 46), CPSSC (SEQ ID NO: 47), CSSSC (SEQ ID NO: 48), CGSPC (SEQ ID NO: 49), CPGSC (SEQ ID NO: 50), CSGPC (SEQ ID NO: 51) or CPSGC (SEQ ID NO: 52); The scFv according to any one of [1] to [12] above.
[14] Any one of [1] to [13] above, wherein L comprises about 14 to about 19 amino acids, for example, about 14, about 15, about 16, about 17, about 18, or about 19 amino acids The scFv described in section.
[15] said L comprises the amino acid sequence (X) m C(X) y C(X) n (SEQ ID NO: 25), wherein X is Gly, Ser, Pro, Ala, Arg, Asn, Asp , Glu, Gln, His, Ile, leu, Lys, Phe, Thr, Trp or Tyr, m is an integer of 6 to 9, y is an integer of 1 to 3, n is 4 to The scFv according to any one of [1] to [14] above, which is an integer of 6.
[16] said L comprises the amino acid sequence (X) m C(X) y C(X) n (SEQ ID NO: 26), wherein X is Gly, Ser, Pro, Ala, Arg, Asn, Asp , Glu, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Thr or Tyr, m is an integer of 6 to 9, y is an integer of 1 to 3, n is an integer of 4 to 6 The scFv according to [15] above.
[17] said L comprises the amino acid sequence (X) m C(X) y C(X) n (SEQ ID NO: 27), wherein X is Gly or Pro, m is 6-9 The scFv according to [16] above, which is an integer, y is an integer of 1-3, and n is an integer of 4-6.
[18] The scFv of any one of [1] to [17] above, wherein said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7.
[19] The scFv of any one of [1] to [18] above, wherein the scFv is in the VL-L-VH orientation.
[20] The scFv of any one of [1] to [18] above, wherein the scFv is in the VH-L-VL orientation.
[21] a scFv comprising VH, L, and VL,
a) said VH contains Cys in H105,
b) said VL contains Cys at L42;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VL-L-VH orientation.
[22] A scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H105,
b) said VL contains Cys at L45;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VL-L-VH orientation.
[23] a scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H105,
b) said VL contains Cys at L39;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VL-L-VH orientation.
[24] a scFv comprising VH, L, and VL,
a) said VH contains Cys in H5,
b) said VL contains Cys at L42;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VL-L-VH orientation.
[25] a scFv comprising VH, L, and VL,
a) said VH contains Cys in H5,
b) said VL contains Cys at L45;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VL-L-VH orientation.
[26] A scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H5,
b) said VL contains Cys at L39;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VL-L-VH orientation.
[27] a scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H3,
b) said VL contains Cys at L42;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VL-L-VH orientation.
[28] A scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H3,
b) said VL contains Cys at L45;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VL-L-VH orientation.
[29] A scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H3,
b) said VL contains Cys at L39;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VL-L-VH orientation.
[30] A scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H43,
b) said VL contains Cys in L100,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VH-L-VL orientation.
[31] A scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H43,
b) said VL contains Cys at L102;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VH-L-VL orientation.
[32] A scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H43,
b) said VL comprises Cys in L5,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VH-L-VL orientation.
[33] A scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H43,
b) said VL contains Cys in L3,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VH-L-VL orientation.
[34] A scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H40,
b) said VL contains Cys in L100,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VH-L-VL orientation.
[35] A scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H40,
b) said VL contains Cys at L102;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VH-L-VL orientation.
[36] A scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H40,
b) said VL comprises Cys in L5,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VH-L-VL orientation.
[37] A scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H40,
b) said VL contains Cys in L3,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VH-L-VL orientation.
[38] A scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H46,
b) said VL contains Cys in L100,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VH-L-VL orientation.
[39] A scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H46,
b) said VL contains Cys at L102;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VH-L-VL orientation.
[40] a scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H46,
b) said VL comprises Cys in L5,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VH-L-VL orientation.
[41] A scFv comprising VH, L, and VL, wherein
a) said VH contains Cys in H46,
b) said VL contains Cys in L3,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
d) scFv, wherein said scFv is in the VH-L-VL orientation.
[42] The scFv of any one of [21] to [41] above, wherein said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:3.
[43] The scFv of any one of [21] to [41] above, wherein said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:6.
[44] The scFv of any one of [21] to [41] above, wherein said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:7.
[45] The scFv of any one of [1] to [44] above, wherein the scFv is conjugated to a second molecule.
[46] The scFv of [45] above, wherein the second molecule is a half-life extending moiety.
[47] The above-described [ 46].
[48] The scFv of [45] above, wherein the second molecule is a cytotoxic agent or a detectable label.
[49] The scFv of [48] above, wherein the second molecule is an antibody or fragment thereof.
[50] The scFv of [49] above, wherein the scFv and the antibody or fragment thereof bind to different antigens.
[51] The scFv of [45] above, wherein the second molecule is a chimeric antigen receptor (CAR).
[52] A pharmaceutical composition comprising the scFv of any one of [1] to [51] above and a pharmaceutically acceptable carrier.
[53] A polynucleotide that encodes the scFv of any one of [1] to [44] above.
[54] A vector comprising the polynucleotide of [53] above.
[55] A host cell containing the vector of [54] above.
[56] A method for producing the scFv of any one of [1] to [44] above, comprising culturing the host cell of [55] above under conditions for producing the scFv; and purifying said scFv.
[57] The method of [56] above, wherein the host cell is a prokaryotic cell.
[58] The method of [56] above, wherein the host cell is a eukaryotic cell.
[59] An anti-idiotypic antibody that binds to the scFv of any one of [1] to [44] above.
[60] A kit comprising the scFv of any one of [1] to [44] above.
[61] A multispecific molecule comprising the scFv of any one of [1] to [44] above.
[62] The multispecific molecule of [61] above, wherein the multispecific molecule comprises an antibody or antibody fragment.
[63] The multispecific molecule of [61] above, wherein the multispecific protein comprises an Ig constant region or a fragment of the Ig constant region.
[64] The multispecific protein of [63] above, wherein the fragment of the Ig constant region comprises an Fc region.
[65] The multispecific molecule of [63] above, wherein said fragment of said Ig constant region comprises a CH2 domain.
[66] The multispecific molecule of [63] above, wherein said fragment of said Ig constant region comprises a CH3 domain.
[67] The multispecific molecule of [63] above, wherein said fragment of said Ig constant region comprises said CH2 domain and said CH3 domain.
[68] The multispecific molecule of [63] above, wherein said fragment of said Ig constant region comprises at least a portion of a hinge, said CH2 domain and said CH3 domain.
[69] The multispecific molecule of [63] above, wherein said fragment of said Ig constant region comprises said hinge, said CH2 domain, and said CH3 domain.
[70] The multispecific molecule of any one of [63] to [69] above, wherein said scFv is conjugated to the N-terminus of said Ig constant region or the N-terminus of said fragment of said Ig constant region. .
[71] The multispecific molecule according to any one of [63] to [69] above, wherein the scFv is conjugated to the C-terminus of the Ig constant region or the N-terminus of the fragment of the Ig constant region. .
[72] The multispecific molecule according to any one of [63] to [71] above, wherein the Ig constant region or the fragment of the Ig constant region is of IgG1, IgG2, and IgG3 or IgG4 isotypes.
[73] Any one of [63] to [72] above, wherein said Ig constant region or said fragment of said Ig constant region comprises at least one mutation that reduces binding of said multispecific molecule to FcγR A multispecific molecule as described in .
[74] said at least one mutation that reduces binding of said multispecific molecule to an FcγR is selected from , F234A/L235A, S228P/F234A/L235A, N297A, V234A/G237A, K214T/E233P/L234V/L235A/G236-deletion/A327G/P331A/D365E/L358M, H268Q/V309L/A330 S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S and S228P/F234A/L235A/G236-deletion/G237A /P238S selected from the group consisting of , the multispecific molecule according to [73] above, wherein residue numbering is according to the EU index.
[75] Any one of [63] to [72] above, wherein the Ig constant region or the fragment of the Ig constant region comprises at least one mutation that enhances binding of the multispecific molecule to FcγR A multispecific molecule as described in .
[76] the at least one mutation that enhances binding of the multispecific molecule to an FcγR is /Y300L/V305I/P396L and G236A/S239D/I332E, wherein residue numbering is according to the EU index, according to [75] above.
[77] The multispecific molecule of any one of [73] to [76] above, wherein the FcγR is FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, or FcγRIII, or any combination thereof.
[78] Any one of [63] to [72] above, wherein the Ig constant region or fragment of the Ig constant region comprises at least one mutation that modulates the half-life of the multispecific molecule. Multispecific molecule.
[79] the group wherein said at least one mutation that modulates said half-life of said multispecific molecule consists of H435A, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A and H435R and wherein residue numbering is according to the EU index, according to [78] above.
[80] The multispecific molecule of any one of [63]-[72] above, wherein said Ig constant region or fragment of said Ig constant region comprises at least one mutation in said CH3 domain.
[81] wherein said at least one mutation in said CH3 domain is I/ K392M/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, L351Y/Y407A, T366A/K409F, L351Y/Y407A, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y from 407V and T350V/T366L/K392L/T394W The multispecific molecule according to [80] above, wherein the residue numbering is according to the EU index.
[82] The multispecific molecule according to any one of [61] to [81] above, wherein the multispecific molecule is bispecific.
[83] The multispecific molecule of any one of [61] to [81] above, wherein the multispecific molecule is trispecific.
[84] The multispecific molecule according to any one of [61] to [81] above, wherein the multispecific molecule is tetraspecific.
[85] A pharmaceutical composition comprising the multispecific molecule of any one of [61] to [84] above and a pharmaceutically acceptable carrier.
[86] A heterologous molecule comprising the scFv of any one of [1] to [44] above.
[87] The heterologous molecule of [86] above, wherein said scFv is conjugated to a second protein, polynucleotide, therapeutic agent, cytotoxic agent or detectable label.
[88] The heterologous molecule of [87] above, wherein the second protein is an antibody or fragment thereof.
[89] The heterologous molecule of [87] above, wherein said second protein is an alternative scaffold.
[90] The heterologous molecule of [87] above, wherein said second protein is a chimeric antigen receptor (CAR) or a fragment thereof.
[91] The heterologous molecule of any one of [86] to [90] above, wherein the heterologous molecule is monospecific.
[92] The heterologous molecule of any one of [86] to [90] above, wherein the heterologous molecule is multispecific.
[93] The heterologous molecule of [92] above, wherein the heterologous molecule is bispecific.
[94] The heterologous molecule of [92] above, wherein the heterologous molecule is trispecific.
[95] The heterologous molecule of [92] above, wherein the heterologous molecule is quadraspecific.
[96] A pharmaceutical composition comprising the heterologous molecule of any one of [86] to [95] above and a pharmaceutically acceptable carrier.
[97] A process for preparing a stabilized scFv comprising:
providing a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) that form an antigen binding domain;
providing a linker (L) comprising or engineered to comprise the first L Cys;
engineering said VH to include VH Cys at structurally conserved surface-exposed VH framework residue positions;
forming a disulfide bond between said VH Cys and said first L Cys to prepare said stabilized scFv.
[98] A process for preparing a stabilized scFv comprising:
providing VH and VL that form an antigen binding domain;
providing L containing or engineered to contain a second L Cys;
engineering said VL to include VL Cys at structurally conserved surface-exposed VL framework residue positions;
forming a disulfide bond between said VL Cys and said second L Cys to prepare said stabilized scFv.
[99] A process for preparing a stabilized scFv comprising:
providing VH and VL that form an antigen binding domain;
providing L comprising or engineered to comprise a first L Cys and a second L Cys;
engineering said VH to include VH Cys at structurally conserved, surface-exposed VH framework residue positions;
engineering said VL to include VL Cys at structurally conserved surface-exposed VL framework residue positions;
forming a disulfide bond between the VH Cys and the first L Cys and a disulfide bond between the VL Cys and the second L Cys to prepare the stabilized scFv; , including the process.
[100] The process of any one of [97] to [99] above, wherein the stabilized scFv is the scFv of any one of [1] to [44] above.
[101] The process of any one of [97]-[100] above, wherein said stabilized scFv binds antigen with comparable affinity when compared to a control scFv lacking said disulfide bond. .
[102] A process for preparing a stabilized scFv comprising:
a) providing polynucleotides encoding VH, L and VL,
i. said VH comprises Cys at H105 and said VL comprises Cys at L42;
ii. said VH comprises Cys at H43 and said VL comprises Cys at L100;
iii. said VH comprises Cys in H3 and said VL comprises Cys in L3;
iv. said VH comprises Cys at H3 and said VL comprises Cys at L5;
v. said VH comprises Cys at H3 and said VL comprises Cys at L39;
vi. said VH comprises Cys at H3 and said VL comprises Cys at L42;
vii. said VH comprises Cys at H3 and said VL comprises Cys at L45;
viii. said VH comprises Cys in H3 and said VL comprises Cys in L100;
ix. said VH comprises Cys at H3 and said VL comprises Cys at L102;
x. said VH comprises Cys at H5 and said VL comprises Cys at L3;
xi. said VH comprises Cys at H5 and said VL comprises Cys at L5;
xii. said VH comprises Cys at H5 and said VL comprises Cys at L39;
xiii. said VH comprises Cys at H5 and said VL comprises Cys at L42;
xiv. said VH comprises Cys at H5 and said VL comprises Cys at L45;
xv. said VH comprises Cys at H5 and said VL comprises Cys at L100;
xvi. said VH comprises Cys at H5 and said VL comprises Cys at L102;
xvii. said VH comprises Cys at H40 and said VL comprises Cys at L3;
xviii. said VH comprises Cys at H40 and said VL comprises Cys at L5;
xix. said VH comprises Cys at H40 and said VL comprises Cys at L39;
xx. said VH comprises Cys at H40 and said VL comprises Cys at L42;
xxi. said VH comprises iCys in H40 and said VL comprises Cys in L45;
xxii. said VH comprises Cys in H40 and said VL comprises Cys in L100;
xxiii. said VH comprises Cys at H40 and said VL comprises Cys at L102;
xxiv. said VH comprises Cys at H43 and said VL comprises Cys at L3;
xxv. said VH comprises Cys at H43 and said VL comprises Cys at L5;
xxvi. said VH comprises Cys at H43 and said VL comprises Cys at L39;
xxvii. said VH comprises Cys at H43 and said VL comprises Cys at L42;
xxviii. said VH comprises Cys at H43 and said VL comprises Cys at L45;
xxix. said VH comprises Cys at H43 and said VL comprises Cys at L102;
xxx. said VH comprises Cys at H46 and said VL comprises Cys at L3;
xxxi. said VH comprises Cys at H46 and said VL comprises Cys at L5;
xxxii. said VH comprises Cys at H46 and said VL comprises Cys at L39;
xxxiii. said VH comprises Cys at H46 and said VL comprises Cys at L42;
xxxiv. said VH comprises Cys at H46 and said VL comprises Cys at L45;
xxxv. said VH comprises Cys at H46 and said VL comprises Cys at L100;
xxxvi. said VH comprises Cys at H46 and said VL comprises Cys at L102;
xxxvii. said VH comprises Cys at H105 and said VL comprises Cys at L3;
xxxviii. said VH comprises Cys at H105 and said VL comprises Cys at L5;
xxxix. said VH comprises Cys at H105 and said VL comprises Cys at L39;
xl. said VH comprises Cys at H105 and said VL comprises Cys at L45;
xli. said VH comprises Cys at H105 and said VL comprises Cys at L100, or
xli. the VH contains Cys at H105, the VL contains Cys at L102,
providing residue numbering according to Chothia;
b) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, or 7;
c) expressing said polynucleotide in a host cell to produce said stabilized scFv.
[103] The method of [102] above, wherein the host cell is a prokaryotic cell.
[104] The method of [102] above, wherein the host cell is a eukaryotic cell.
[105] An isolated single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region (VH), a means for joining (L), and a light chain variable region (VL), wherein said scFv but,
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VH cysteine (Cys) and the first L Cys,
b) a second disulfide bond between a structurally conserved surface-exposed VL Cys and a second L Cys, or
c) said first disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed VH Cys and said first L Cys and said structurally conserved surface-exposed VL Cys and said second L Cys; the second disulfide bond between
[106] An isolated single chain variable fragment (scFv) comprising means for antigen binding, a linker (L), and a light chain variable region (VL), wherein said scFv comprises
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed antigen binding means cysteine (Cys) and the first L Cys;
b) a second disulfide bond between a structurally conserved surface-exposed VL Cys and a second L Cys, or
c) said first disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed antigen binding means Cys and said first L Cys and said structurally conserved surface-exposed VL Cys and said second L said second disulfide bond with Cys.
[107] An isolated single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region (VH), a linker (L), and a means for antigen binding, said scFv comprising:
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VH cysteine (Cys) and the first L Cys,
b) a second disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed antigen binding means Cys and the second L Cys, or
c) said first disulfide bond between said structurally conserved surface exposed VH Cys and said first L Cys and said structurally conserved surface exposed antigen binding means Cys and said second L said second disulfide bond with Cys.
[108] A multispecific molecule comprising a single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region (VH), a means for joining (L), and a light chain variable region (VL), wherein The scFv is
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VH cysteine (Cys) and the first L Cys,
b) a second disulfide bond between a structurally conserved surface-exposed VL Cys and a second L Cys, or
c) said first disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed VH Cys and said first L Cys and said structurally conserved surface-exposed VL Cys and said second L Cys; said second disulfide bond between
[109] A multispecific molecule comprising a single chain variable fragment (scFv) comprising means for antigen binding, a linker (L), and a light chain variable region (VL), wherein said scFv is
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed antigen binding means cysteine (Cys) and the first L Cys;
b) a second disulfide bond between a structurally conserved surface-exposed VL Cys and a second L Cys, or
c) said first disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed antigen binding means Cysteine Cys and said first L Cys and said structurally conserved surface-exposed VL Cys and said second said second disulfide bond with L Cys.
[110] A multispecific molecule comprising a single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region (VH), a linker (L), and means for antigen binding (VL), wherein said scFv but,
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VH cysteine (Cys) and the first L Cys,
b) a second disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed antigen binding means Cys and the second L Cys, or
c) said first disulfide bond between said structurally conserved surface exposed VH Cys and said first L Cys and said structurally conserved surface exposed antigen binding means Cys and said second L and said second disulfide bond with Cys.
[111] A heterologous molecule comprising a single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region (VH), a means for linking (L), and a light chain variable region (VL), wherein said scFv but,
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VH cysteine (Cys) and the first L Cys,
b) a second disulfide bond between a structurally conserved surface-exposed VL Cys and a second L Cys, or
c) said first disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed VH Cys and said first L Cys and said structurally conserved surface-exposed VL Cys and said second L Cys; said second disulfide bond between
[112] A heterologous molecule comprising a single chain variable fragment (scFv) comprising means for antigen binding, a linker (L), and a light chain variable region (VL), wherein said scFv comprises
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed antigen binding means cysteine (Cys) and the first L Cys;
b) a second disulfide bond between a structurally conserved surface-exposed VL Cys and a second L Cys, or
c) said first disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed antigen binding means Cys and said first L Cys and said structurally conserved surface-exposed VL Cys and said second L said second disulfide bond with Cys.
[113] A heterologous molecule comprising a single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region (VH), a linker (L), and means for antigen binding, wherein said scFv is
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VH cysteine (Cys) and the first L Cys,
b) a second disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed antigen binding means Cys and the second L Cys, or
c) said first disulfide bond between said structurally conserved surface exposed VH Cys and said first L Cys and said structurally conserved surface exposed antigen binding means Cys and said second L said second disulfide bond with Cys.
[114] A means for encoding the scFv of any one of [105] to [113] above.
[115] A means for replicating the vector of 114 above.
[116] A composition comprising a means for stabilizing a scFv.
[117] A composition comprising a means for increasing the thermostability of a scFv.
[118] said means comprises forming a disulfide bond between VH and L, between VL and said L, or between said VH and said L and between said VL and said L; The composition according to [116] or [117] above.
[119] Multispecific molecules comprising means for stabilizing scFv.
[120] Multispecific molecules comprising means for increasing the thermostability of scFv.
[121] said means comprises forming a disulfide bond between VH and L, between VL and said L, or between said VH and said L and between said VL and said L; The multispecific molecule of [119] or [120] above.
[122] Heterologous molecules comprising means for stabilizing scFv.
[123] Heterologous molecules, including means for increasing the thermostability of scFv.
[124] said means comprises forming a disulfide bond between VH and L, between VL and said L, or between said VH and said L and between said VL and said L; The heterologous molecule of [122] or [123] above.
[125] A means for producing the composition of any one of [116] to [118] above.
[126] A means for producing the multispecific molecule of any one of [119] to [121] above.
[127] A means for producing the heterologous molecule of any one of [122] to [124] above.

Claims (77)

重鎖可変領域（ＶＨ）、リンカー（Ｌ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、
ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合、及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖ。 An isolated single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region (VH), a linker (L) and a light chain variable region (VL),
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VH cysteine (Cys) and the first L Cys,
b) a second disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VL Cys and the second L Cys, or c) said structurally conserved surface-exposed VH Cys and said first L Cys. and said second disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed VL Cys and said second L Cys. ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含む単離されたｓｃＦｖであって、
ａ）前記ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置にＶＨ Ｃｙｓを含み、前記Ｌが、第１のＬ Ｃｙｓを含むか、
ｂ）前記ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置にＶＬ Ｃｙｓを含み、前記Ｌが、第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又は
ｃ）前記ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置に前記ＶＨ Ｃｙｓを含み、前記ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置に前記ＶＬ Ｃｙｓを含み、前記Ｌが、前記第１のＬ Ｃｙｓ及び前記第２のＬ Ｃｙｓを含み、前記ＶＨ Ｃｙｓ及び前記第１のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができ、前記ＶＬ Ｃｙｓ及び前記第２のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができる、単離されたｓｃＦｖ。 An isolated scFv comprising VH, L and VL,
a) said VH comprises a VH Cys at a structurally conserved surface-exposed VH framework residue position and said L comprises a first L Cys;
b) said VL comprises a VL Cys at a structurally conserved surface-exposed VL framework residue position and said L comprises a second L Cys, or c) said VH is structurally conserved said VH Cys at surface-exposed VH framework residue positions, said VL comprising said VL Cys at structurally conserved surface-exposed VL framework residue positions, said L comprising L Cys and said second L Cys, wherein said VH Cys and said first L Cys are capable of forming a disulfide bond, and said VL Cys and said second L Cys form a disulfide bond An isolated scFv that can be. 前記ＶＨ Ｃｙｓと前記ＶＬ Ｃｙｓとの間の距離が、約７Å～約９Åである、請求項１又は２に記載のｓｃＦｖ。 The scFv of claim 1 or 2, wherein the distance between said VH Cys and said VL Cys is from about 7 Å to about 9 Å. 前記ＶＨ Ｃｙｓが、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ４０、Ｈ４３、Ｈ４６又はＨ１０５にあり、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う、及び／又は
前記ＶＬ Ｃｙｓが、Ｌ３、Ｌ５、Ｌ３９、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｌ１００又はＬ１０２にあり、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う、
請求項１～３のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。 said VH Cys is at H3, H5, H40, H43, H46 or H105 and residue numbering is according to Chothia; and/or
the VL Cys is at L3, L5, L39, L42, L45, L100 or L102 and residue numbering is according to Chothia;
The scFv of any one of claims 1-3. ａ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｂ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、
ｃ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｄ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｅ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ｆ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｇ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｈ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、
ｉ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあるか、
ｊ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｋ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｌ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ｍ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｎ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｏ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、
ｐ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあるか、
ｑ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｒ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｓ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ｔ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｕ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｖ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、
ｗ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあるか、
ｘ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｙ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｚ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ａａ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｂｂ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｃｃ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあるか、
ｄｄ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｅｅ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｆｆ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ｇｇ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｈｈ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｉｉ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、
ｊｊ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあるか、
ｋｋ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｌｌ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｍｍ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ｎｎ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｏｏ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、又は
ｐｐ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあり、残基番号付けがＣｈｏｔｈｉａに従う、請求項１～４のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。 a) said VH Cys is in H105 and said VL Cys is in L42;
b) said VH Cys is in H43 and said VL Cys is in L100;
c) said VH Cys is in H3 and said VL Cys is in L3;
d) said VH Cys is in H3 and said VL Cys is in L5;
e) said VH Cys is in H3 and said VL Cys is in L39;
f) said VH Cys is in H3 and said VL Cys is in L42;
g) said VH Cys is in H3 and said VL Cys is in L45;
h) said VH Cys is in H3 and said VL Cys is in L100;
i) said VH Cys is in H3 and said VL Cys is in L102;
j) said VH Cys is in H5 and said VL Cys is in L3;
k) said VH Cys is in H5 and said VL Cys is in L5;
l) said VH Cys is in H5 and said VL Cys is in L39;
m) said VH Cys is in H5 and said VL Cys is in L42;
n) said VH Cys is in H5 and said VL Cys is in L45;
o) said VH Cys is in H5 and said VL Cys is in L100;
p) said VH Cys is in H5 and said VL Cys is in L102;
q) said VH Cys is in H40 and said VL Cys is in L3;
r) said VH Cys is in H40 and said VL Cys is in L5;
s) said VH Cys is in H40 and said VL Cys is in L39;
t) said VH Cys is in H40 and said VL Cys is in L42;
u) said VH Cys is in H40 and said VL Cys is in L45;
v) said VH Cys is in H40 and said VL Cys is in L100;
w) said VH Cys is in H40 and said VL Cys is in L102;
x) said VH Cys is in H43 and said VL Cys is in L3;
y) said VH Cys is in H43 and said VL Cys is in L5;
z) said VH Cys is at H43 and said VL Cys is at L39;
aa) said VH Cys is in H43 and said VL Cys is in L42;
bb) said VH Cys is in H43 and said VL Cys is in L45;
cc) said VH Cys is in H43 and said VL Cys is in L102;
dd) said VH Cys is in H46 and said VL Cys is in L3;
ee) said VH Cys is in H46 and said VL Cys is in L5;
ff) said VH Cys is in H46 and said VL Cys is in L39;
gg) said VH Cys is in H46 and said VL Cys is in L42;
hh) said VH Cys is in H46 and said VL Cys is in L45;
ii) said VH Cys is in H46 and said VL Cys is in L100;
jj) said VH Cys is in H46 and said VL Cys is in L102;
kk) said VH Cys is in H105 and said VL Cys is in L3;
ll) said VH Cys is in H105 and said VL Cys is in L5;
mm) said VH Cys is in H105 and said VL Cys is in L39;
nn) said VH Cys is in H105 and said VL Cys is in L45;
oo) said VH Cys is at H105 and said VL Cys is at L100, or pp) said VH Cys is at H105 and said VL Cys is at L102, residue numbering according to Chothia. 5. The scFv of any one of 4 . 前記Ｌが、免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ領域に由来する連続アミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。 The scFv of any one of claims 1-5 , wherein said L comprises a contiguous amino acid sequence derived from an immunoglobulin (Ig) hinge region. 前記Ｉｇヒンジ領域が、ヒト又は非ヒトＩｇヒンジ領域に由来するか、
前記Ｉｇヒンジ領域が、前記ヒトＩｇヒンジ領域に由来するか、又は
前記Ｉｇヒンジ領域が、前記ヒトＩｇヒンジ領域に由来し、前記ヒトＩｇヒンジ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプである、
請求項６に記載のｓｃＦｖ。 whether said Ig hinge region is derived from a human or non-human Ig hinge region;
said Ig hinge region is derived from said human Ig hinge region, or
said Ig hinge region is derived from said human Ig hinge region and said human Ig hinge region is of the IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 isotype;
The scFv of claim 6 . 前記Ｌが、アミノ酸配列Ｃ（Ｘ）ｙＣ（配列番号２３）を含み、式中、Ｘは、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）又はチロシン（Ｔｙｒ）であり、ｙは、１～３の整数である、又は
前記Ｌが、アミノ酸配列Ｃ（Ｘ） ｙ Ｃ（配列番号２４）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ又はＰｒｏであり、ｙは、１～３の整数である、
請求項１～７のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。 L comprises the amino acid sequence C(X) y C (SEQ ID NO: 23), wherein X is glycine (Gly), serine (Ser), proline (Pro), alanine (Ala), arginine (Arg) , asparagine (Asn), aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu), glutamine (Gln), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), phenylalanine (Phe), threonine (Thr ), tryptophan (Trp) or tyrosine (Tyr), and y is an integer from 1 to 3, or
wherein L comprises the amino acid sequence C(X) y C (SEQ ID NO: 24), wherein X is Gly, Ser or Pro and y is an integer from 1 to 3;
The scFv of any one of claims 1-7 . 前記Ｌが、前記アミノ酸配列ＣＰＣ、ＣＧＣ、ＣＳＣ、ＣＰＰＣ（配列番号１）、ＣＧＰＣ（配列番号２８）、ＣＰＧＣ（配列番号２９）、ＣＧＧＣ（配列番号３０）、ＣＳＰＧ（配列番号３１）、ＣＰＳＣ（配列番号３２）、ＣＳＳＣ（配列番号３３）、ＣＧＳＣ（配列番号３４）、ＣＳＧＣ（配列番号３５）、ＣＰＰＰＣ（配列番号３６）、ＣＧＰＰＣ（配列番号３７）、ＣＰＧＰＣ（配列番号３８）、ＣＰＰＧＣ（配列番号３９）、ＣＧＧＰＣ（配列番号４０）、ＣＰＧＧＣ（配列番号４１）、ＣＧＧＧＣ（配列番号４２）、ＣＳＰＰＣ（配列番号４３）、ＣＰＳＰＣ（配列番号４４）、ＣＰＰＳＣ（配列番号４５）、ＣＳＳＰＣ（配列番号４６）、ＣＰＳＳＣ（配列番号４７）、ＣＳＳＳＣ（配列番号４８）、ＣＧＳＰＣ（配列番号４９）、ＣＰＧＳＣ（配列番号５０）、ＣＳＧＰＣ（配列番号５１）又はＣＰＳＧＣ（配列番号５２）を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。 The L is the amino acid sequence CPC, CGC, CSC, CPPC (SEQ ID NO: 1), CGPC (SEQ ID NO: 28), CPGC (SEQ ID NO: 29), CGGC (SEQ ID NO: 30), CSPG (SEQ ID NO: 31), CPSC ( SEQ ID NO: 32), CSSC (SEQ ID NO: 33), CGSC (SEQ ID NO: 34), CSGC (SEQ ID NO: 35), CPPPC (SEQ ID NO: 36), CGPPC (SEQ ID NO: 37), CPGPC (SEQ ID NO: 38), CPPGC (SEQ ID NO: 38) No. 39), CGGPC (SEQ ID NO: 40), CPGGC (SEQ ID NO: 41), CGGGC (SEQ ID NO: 42), CSPPC (SEQ ID NO: 43), CPSPC (SEQ ID NO: 44), CPPSC (SEQ ID NO: 45), CSSPC (SEQ ID NO: 45) 46), CPSSC (SEQ ID NO: 47), CSSSC (SEQ ID NO: 48), CGSPC (SEQ ID NO: 49), CPGSC (SEQ ID NO: 50), CSGPC (SEQ ID NO: 51) or CPSGC (SEQ ID NO: 52). 9. The scFv of any one of paragraphs 1-8 . 前記Ｌが、約１４～約１９アミノ酸、例えば、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、又は約１９アミノ酸を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。 The scFv of any one of claims 1-9, wherein L comprises about 14 to about 19 amino acids, such as about 14, about 15, about 16, about 17, about 18, or about 19 amino acids. 前記Ｌが、アミノ酸配列（Ｘ）ｍＣ（Ｘ）ｙＣ（Ｘ）ｎ（配列番号２５）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である、又は
前記Ｌが、アミノ酸配列（Ｘ） ｍ Ｃ（Ｘ） ｙ Ｃ（Ｘ） ｎ （配列番号２６）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＴｙｒであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である、又は
前記Ｌが、アミノ酸配列（Ｘ） ｍ Ｃ（Ｘ） ｙ Ｃ（Ｘ） ｎ （配列番号２７）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ又はＰｒｏであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である、
請求項１～１０のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。 L comprises the amino acid sequence (X) m C(X) y C(X) n (SEQ ID NO: 25), wherein X is Gly, Ser, Pro, Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, His, Ile, leu, Lys, Phe, Thr, Trp or Tyr, m is an integer of 6 to 9, y is an integer of 1 to 3, n is an integer of 4 to 6 is or
L comprises the amino acid sequence (X) m C(X) y C(X) n (SEQ ID NO: 26), wherein X is Gly, Ser, Pro, Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Thr or Tyr, m is an integer from 6 to 9, y is an integer from 1 to 3, and n is an integer from 4 to 6, or
L comprises the amino acid sequence (X) m C(X) y C(X) n (SEQ ID NO: 27), wherein X is Gly or Pro and m is an integer from 6 to 9 , y is an integer from 1 to 3 and n is an integer from 4 to 6;
The scFv of any one of claims 1-10 . 前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。 The scFv of any one of claims 1-11 , wherein said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 , 4, 5, 6 or 7. 前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、又は
前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、
請求項１～１２のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。 said scFv is in the VL-L-VH orientation, or
said scFv is in the VH-L-VL orientation;
The scFv of any one of claims 1-12 . ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
（１）ａ）前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にあるか、
（２）ａ）前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にあるか、
（３）ａ）前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にあるか、
（４）ａ）前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にあるか、
（５）ａ）前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にあるか、
（６）ａ）前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にあるか、
（７）ａ）前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にあるか、
（８）ａ）前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にあるか、
（９）ａ）前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にあるか、
（１０）ａ）前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にあるか、
（１１）ａ）前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にあるか、
（１２）ａ）前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にあるか、
（１３）ａ）前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にあるか、
（１４）ａ）前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にあるか、
（１５）ａ）前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にあるか、
（１６）ａ）前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にあるか、
（１７）ａ）前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にあるか、
（１８）ａ）前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にあるか、
（１９）ａ）前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にあるか、
（２０）ａ）前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にあるか、又は
（２１）ａ）前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、
ｓｃＦｖ。 scFv comprising VH, L, and VL,
(1) a) the VH contains Cys in H105,
b) said VL contains Cys at L42;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO : 3 , 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VL-L-VH orientation ;
(2) a) the VH contains Cys in H105;
b) said VL contains Cys at L45;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VL-L-VH orientation;
(3) a) the VH contains Cys in H105;
b) said VL contains Cys at L39;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VL-L-VH orientation;
(4) a) the VH contains Cys in H5;
b) said VL contains Cys at L42;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VL-L-VH orientation;
(5) a) the VH contains Cys in H5;
b) said VL contains Cys at L45;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VL-L-VH orientation;
(6) a) the VH contains Cys in H5;
b) said VL contains Cys at L39;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VL-L-VH orientation;
(7) a) the VH contains Cys in H3;
b) said VL contains Cys at L42;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VL-L-VH orientation;
(8) a) the VH contains Cys in H3;
b) said VL contains Cys at L45;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VL-L-VH orientation;
(9) a) the VH contains Cys in H3;
b) said VL contains Cys at L39;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VL-L-VH orientation;
(10) a) the VH contains Cys in H43;
b) said VL contains Cys in L100,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VH-L-VL orientation;
(11) a) the VH contains Cys in H43;
b) said VL contains Cys at L102;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VH-L-VL orientation;
(12) a) the VH contains Cys in H43;
b) said VL comprises Cys in L5,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VH-L-VL orientation;
(13) a) the VH contains Cys in H43;
b) said VL contains Cys in L3,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VH-L-VL orientation;
(14) a) the VH contains Cys in H40,
b) said VL contains Cys in L100,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VH-L-VL orientation;
(15) a) the VH contains Cys in H40,
b) said VL contains Cys at L102;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VH-L-VL orientation;
(16) a) the VH contains Cys in H40,
b) said VL comprises Cys in L5,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VH-L-VL orientation;
(17) a) the VH contains Cys in H40,
b) said VL contains Cys in L3,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VH-L-VL orientation;
(18) a) the VH contains Cys in H46;
b) said VL contains Cys in L100,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VH-L-VL orientation;
(19) a) the VH contains Cys in H46;
b) said VL contains Cys at L102;
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VH-L-VL orientation;
(20) a) the VH contains Cys in H46;
b) said VL comprises Cys in L5,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VH-L-VL orientation, or
(21) a) the VH contains Cys in H46;
b) said VL contains Cys in L3,
c) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7;
d) said scFv is in the VH-L-VL orientation,
scFv. 前記Ｌが、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、
前記Ｌが、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、又は
前記Ｌが、配列番号７のアミノ酸配列を含む、
請求項１４に記載のｓｃＦｖ。 said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 ;
said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or
wherein said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:7;
The scFv of claim 14 . 前記ｓｃＦｖが、第２の分子に共役される、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。 The scFv of any one of claims 1-15 , wherein said scFv is conjugated to a second molecule. 前記第２の分子が、半減期延長部分であるか、
前記第２の分子が、細胞傷害性薬剤又は検出可能な標識であるか、
前記第２の分子が、抗体又はその断片であるか、又は
前記第２の分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、
請求項１６に記載のｓｃＦｖ。 said second molecule is a half-life extending moiety ;
whether said second molecule is a cytotoxic agent or a detectable label;
said second molecule is an antibody or fragment thereof, or
wherein said second molecule is a chimeric antigen receptor (CAR);
The scFv of claim 16 . 前記半減期延長部分が、免疫グロブリン（Ｉｇ）、前記Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、前記Ｉｇ定常領域の断片、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミン結合ドメイン又はポリエチレングリコールであるか、又は
前記ｓｃＦｖ及び前記抗体又は前記その断片が、異なる抗原に結合する、
請求項１７に記載のｓｃＦｖ。 said half-life extending moiety is an immunoglobulin (Ig), a fragment of said Ig, an Ig constant region, a fragment of said Ig constant region, an Fc region, transferrin, albumin, an albumin binding domain or polyethylene glycol , or
said scFv and said antibody or said fragment thereof bind to different antigens;
The scFv of claim 17 . 請求項１～１８のいずれか一項に記載のｓｃＦｖと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising the scFv according to any one of claims 1 to 18 and a pharmaceutically acceptable carrier. 請求項１～１５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖをコードする、ポリヌクレオチド。 A polynucleotide encoding the scFv of any one of claims 1-15 . 請求項２０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。 A vector comprising the polynucleotide of claim 20 . 請求項２１に記載のベクターを含む、宿主細胞。 A host cell comprising the vector of claim 21 . 請求項１～１５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖを産生する方法であって、前記ｓｃＦｖが産生される条件で請求項２２に記載の宿主細胞を培養することと、前記ｓｃＦｖを精製することと、を含む、方法。 A method of producing the scFv of any one of claims 1 to 15 , comprising culturing the host cell of claim 22 under conditions in which the scFv is produced, and purifying the scFv. and, including, methods. 前記宿主細胞が、原核細胞であるか、又は
前記宿主細胞が、真核細胞である、
請求項２３に記載の方法。 said host cell is a prokaryotic cell , or
said host cell is a eukaryotic cell;
24. The method of claim 23 . 請求項１～１５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖに結合する、抗イディオタイプ抗体。 An anti-idiotypic antibody that binds to the scFv of any one of claims 1-15 . 請求項１～１５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖを含む、キット。 A kit comprising the scFv of any one of claims 1-15 . 請求項１～１５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖを含む、多重特異性分子。 A multispecific molecule comprising the scFv of any one of claims 1-15 . 前記多重特異性分子が、抗体又は抗体断片を含むか、又は
前記多重特異性タンパク質が、Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の断片を含む、
請求項２７に記載の多重特異性分子。 said multispecific molecule comprises an antibody or antibody fragment , or
said multispecific protein comprises an Ig constant region or a fragment of said Ig constant region;
28. The multispecific molecule of claim 27 . 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、Ｆｃ領域を含むか、
前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＣＨ２ドメインを含むか、
前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＣＨ３ドメインを含むか、
前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記ＣＨ２ドメインと、前記ＣＨ３ドメインと、を含むか、
前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ヒンジの少なくとも一部分、前記ＣＨ２ドメイン及び前記ＣＨ３ドメインを含むか、又は
前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記ヒンジと、前記ＣＨ２ドメインと、前記ＣＨ３ドメインと、を含む、
請求項２８に記載の多重特異性タンパク質。 said fragment of said Ig constant region comprises an Fc region ;
said fragment of said Ig constant region comprises a CH2 domain;
said fragment of said Ig constant region comprises a CH3 domain;
said fragment of said Ig constant region comprises said CH2 domain and said CH3 domain;
said fragment of said Ig constant region comprises at least a portion of the hinge, said CH2 domain and said CH3 domain, or
said fragment of said Ig constant region comprises said hinge, said CH2 domain and said CH3 domain;
29. The multispecific protein of claim 28 . 前記ｓｃＦｖが、前記Ｉｇ定常領域のＮ末端又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片のＮ末端に共役されるか、又は
前記ｓｃＦｖが、前記Ｉｇ定常領域のＣ末端又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片のＮ末端に共役される、
請求項２８又は２９に記載の多重特異性分子。 said scFv is conjugated to the N-terminus of said Ig constant region or to the N-terminus of said fragment of said Ig constant region , or
said scFv is conjugated to the C-terminus of said Ig constant region or the N-terminus of said fragment of said Ig constant region;
30. A multispecific molecule according to claim 28 or 29 . 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプである、及び／又は
前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記多重特異性分子のＦｃγＲへの結合を低減する少なくとも１つの変異を含む、
請求項２８～３０のいずれか一項に記載の多重特異性分子。 said Ig constant region or said fragment of said Ig constant region is of IgG1, IgG2, and IgG3 or IgG4 isotypes, and/or
said Ig constant region or said fragment of said Ig constant region comprises at least one mutation that reduces binding of said multispecific molecule to an FcγR;
Multispecific molecule according to any one of claims 28-30 . 前記多重特異性分子のＦｃγＲへの結合を低減する前記少なくとも１つの変異が、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６－欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６－欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項３１に記載の多重特異性分子。 said at least one mutation that reduces binding of said multispecific molecule to an FcγR is F234A/L235A, L234A/L235A, L234A/L235A/D265S, V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/ L235A, S228P/F234A/L235A, N297A, V234A/G237A, K214T/E233P/L234V/L235A/G236-deletion/A327G/P331A/D365E/L358M, H268Q/V309L/A330S/P331S , S267E/L328F, L234F/L235E /D265A, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S and S228P/F234A/L235A/G236-deletion/G237A/P238S and the residue 32. The multispecific molecule of claim 31 , wherein numbering follows the EU index. 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記多重特異性分子のＦｃγＲへの結合を増強する少なくとも１つの変異を含む、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の多重特異性分子。 32. The multispecificity of any one of claims 28-31 , wherein said Ig constant region or said fragment of said Ig constant region comprises at least one mutation that enhances binding of said multispecific molecule to an FcγR. molecule. 前記多重特異性分子のＦｃγＲへの結合を増強する前記少なくとも１つの変異が、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項３３に記載の多重特異性分子。 said at least one mutation that enhances binding of said multispecific molecule to an FcγR is S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/ 34. The multispecific molecule of claim 33 , selected from the group consisting of V305I/P396L and G236A/S239D/I332E, wherein residue numbering is according to the EU index. ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の多重特異性分子。 35. The multispecific molecule of any one of claims 31-34 , wherein the FcγR is FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB or FcγRIII, or any combination thereof. 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の断片が、前記多重特異性分子の半減期を調節する少なくとも１つの変異を含む、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の多重特異性分子。 32. The multispecific molecule of any one of claims 28-31 , wherein said Ig constant region or fragment of said Ig constant region comprises at least one mutation that modulates the half-life of said multispecific molecule. 前記多重特異性分子の前記半減期を調節する前記少なくとも１つの変異が、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ及びＨ４３５Ｒからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項３６に記載の多重特異性分子。 said at least one mutation that modulates said half-life of said multispecific molecule is selected from the group consisting of H435A, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A and H435R , residue numbering according to the EU index. 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の断片が、前記ＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の多重特異性分子。 The multispecific molecule of any one of claims 28-31 , wherein said Ig constant region or fragment of said Ig constant region comprises at least one mutation in said CH3 domain. 前記ＣＨ３ドメインにおける前記少なくとも１つの変異が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項３８に記載の多重特異性分子。 wherein said at least one mutation in said CH3 domain is T350V, L351Y, F405A, Y407V, T366Y, T366W, F405W, T394W, T394S, Y407T, Y407A, T366S/L368A/Y407V, L351Y/F405A/Y407V, T366I/K3 92M/T394W , F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, L351Y/Y407A, T366A/K409F, L351Y/Y407A, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V and T350V/ from the group consisting of T366L/K392L/T394W 39. The multispecific molecule of claim 38 , selected and residue numbering according to the EU index. 前記多重特異性分子が、二重特異性であるか、
前記多重特異性分子が、三重特異性であるか、又は
前記多重特異性分子が、四重特異性である、
請求項２７～３９のいずれか一項に記載の多重特異性分子。 said multispecific molecule is bispecific ;
said multispecific molecule is trispecific, or
said multispecific molecule is tetraspecific;
Multispecific molecule according to any one of claims 27-39 . 請求項２７～３９のいずれか一項に記載の多重特異性分子及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising the multispecific molecule of any one of claims 27-39 and a pharmaceutically acceptable carrier. 請求項１～１５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖを含む、異種分子。 A heterologous molecule comprising the scFv of any one of claims 1-15 . 前記ｓｃＦｖが、第２のタンパク質、ポリヌクレオチド、治療薬、細胞傷害性薬剤又は検出可能な標識に共役される、請求項４２に記載の異種分子。 43. The heterologous molecule of claim 42 , wherein said scFv is conjugated to a second protein, polynucleotide, therapeutic agent, cytotoxic agent or detectable label. 前記第２のタンパク質が、抗体又はその断片であるか、
前記第２のタンパク質が、代替スカフォールドであるか、又は
前記第２のタンパク質が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はその断片である、
請求項４３に記載の異種分子。 the second protein is an antibody or fragment thereof ;
said second protein is an alternative scaffold, or
wherein said second protein is a chimeric antigen receptor (CAR) or a fragment thereof;
44. The heterologous molecule of claim 43 . 前記異種分子が、単一特異性であるか、又は
前記異種分子が、多重特異性である、
請求項４２～４４のいずれか一項に記載の異種分子。 said heterologous molecule is monospecific , or
said heterologous molecule is multispecific;
A heterologous molecule according to any one of claims 42-44 . 前記異種分子が、二重特異性であるか、
前記異種分子が、三重特異性であるか、又は
前記異種分子が、四重特異性である、
請求項４５に記載の異種分子。 said heterologous molecule is bispecific;
said heterologous molecule is trispecific, or
said heterologous molecule is tetraspecific;
46. The heterologous molecule of claim 45 . 請求項４２～４６のいずれか一項に記載の異種分子と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising a heterologous molecule according to any one of claims 42-46 and a pharmaceutically acceptable carrier. 安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
抗原結合ドメインを形成する重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を提供することと、
第１のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれを含むように操作されたリンカー（Ｌ）を提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含むように前記ＶＨを操作することと、
前記ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、前記安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセス。 A process for preparing a stabilized scFv comprising:
providing a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) that form an antigen binding domain;
providing a linker (L) comprising or engineered to comprise the first L Cys;
engineering said VH to include VH Cys at structurally conserved, surface-exposed VH framework residue positions;
forming a disulfide bond between said VH Cys and said first L Cys to prepare said stabilized scFv. 安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
抗原結合ドメインを形成するＶＨ及びＶＬを提供することと、
第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれを含むように操作されたＬを提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置にＶＬ Ｃｙｓを含むように前記ＶＬを操作することと、
前記ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、前記安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセス。 A process for preparing a stabilized scFv comprising:
providing VH and VL that form an antigen binding domain;
providing L containing or engineered to contain a second L Cys;
engineering said VL to include VL Cys at structurally conserved, surface-exposed VL framework residue positions;
forming a disulfide bond between said VL Cys and said second L Cys to prepare said stabilized scFv. 安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
抗原結合ドメインを形成するＶＨ及びＶＬを提供することと、
第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれらを含むように操作されたＬを提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置にＶＨ Ｃｙｓを含むように前記ＶＨを操作することと、
構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置にＶＬ Ｃｙｓを含むように前記ＶＬを操作することと、
前記ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成し、前記ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、前記安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセス。 A process for preparing a stabilized scFv comprising:
providing VH and VL that form an antigen binding domain;
providing L comprising or engineered to comprise a first L Cys and a second L Cys;
engineering said VH to include VH Cys at structurally conserved, surface-exposed VH framework residue positions;
engineering said VL to include VL Cys at structurally conserved surface-exposed VL framework residue positions;
forming a disulfide bond between the VH Cys and the first L Cys and a disulfide bond between the VL Cys and the second L Cys to prepare the stabilized scFv; , including, the process. 前記安定化ｓｃＦｖが、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖである、請求項４８～５０のいずれか一項に記載のプロセス。 The process of any one of claims 48-50 , wherein said stabilized scFv is the scFv of any one of claims 1-15 . 前記安定化ｓｃＦｖが、前記ジスルフィド結合を欠いている対照ｓｃＦｖと比較した場合、同等の親和性で抗原に結合する、請求項４８～５１のいずれか一項に記載のプロセス。 52. The process of any one of claims 48-51 , wherein said stabilized scFv binds antigen with comparable affinity when compared to a control scFv lacking said disulfide bond. 安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
ａ）ＶＨ、Ｌ及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを提供することであって、
ｉ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ｉｖ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｖ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｖｉ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｖｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｖｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ｉｘ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ｘ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ｘｉ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｘｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｘｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｘｉｖ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｘｖ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ｘｖｉ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ｘｖｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ｘｖｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｘｉｘ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｘｘ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｉ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ｘｘｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｉｖ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ｘｘｖ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｖｉ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｘｘｖｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｖｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｉｘ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｉ．前記ＶＨがＨ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｉｖ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｖ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｖｉ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｖｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｖｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｉｘ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｘｌ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｘｌｉ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、又は
ｘｌｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
残基番号付けが、Ｃｈｏｔｈｉａに従う、提供することと、
ｂ）前記Ｌが、配列番号３、４、５、６、又は７のアミノ酸配列を含むことと、
ｃ）宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドを発現させて、前記安定化ｓｃＦｖを産生することと、を含む、プロセス。 A process for preparing a stabilized scFv comprising:
a) providing polynucleotides encoding VH, L and VL,
i. said VH comprises Cys at H105 and said VL comprises Cys at L42;
ii. said VH comprises Cys at H43 and said VL comprises Cys at L100;
iii. said VH comprises Cys in H3 and said VL comprises Cys in L3;
iv. said VH comprises Cys at H3 and said VL comprises Cys at L5;
v. said VH comprises Cys at H3 and said VL comprises Cys at L39;
vi. said VH comprises Cys at H3 and said VL comprises Cys at L42;
vii. said VH comprises Cys at H3 and said VL comprises Cys at L45;
viii. said VH comprises Cys in H3 and said VL comprises Cys in L100;
ix. said VH comprises Cys at H3 and said VL comprises Cys at L102;
x. said VH comprises Cys at H5 and said VL comprises Cys at L3;
xi. said VH comprises Cys at H5 and said VL comprises Cys at L5;
xii. said VH comprises Cys at H5 and said VL comprises Cys at L39;
xiii. said VH comprises Cys at H5 and said VL comprises Cys at L42;
xiv. said VH comprises Cys at H5 and said VL comprises Cys at L45;
xv. said VH comprises Cys at H5 and said VL comprises Cys at L100;
xvi. said VH comprises Cys at H5 and said VL comprises Cys at L102;
xvii. said VH comprises Cys at H40 and said VL comprises Cys at L3;
xviii. said VH comprises Cys at H40 and said VL comprises Cys at L5;
xix. said VH comprises Cys at H40 and said VL comprises Cys at L39;
xx. said VH comprises Cys at H40 and said VL comprises Cys at L42;
xxi. said VH comprises Cys at H40 and said VL comprises Cys at L45;
xxii. said VH comprises Cys in H40 and said VL comprises Cys in L100;
xxiii. said VH comprises Cys at H40 and said VL comprises Cys at L102;
xxiv. said VH comprises Cys at H43 and said VL comprises Cys at L3;
xxv. said VH comprises Cys at H43 and said VL comprises Cys at L5;
xxvi. said VH comprises Cys at H43 and said VL comprises Cys at L39;
xxvii. said VH comprises Cys at H43 and said VL comprises Cys at L42;
xxviii. said VH comprises Cys at H43 and said VL comprises Cys at L45;
xxix. said VH comprises Cys at H43 and said VL comprises Cys at L102;
xxx. said VH comprises Cys at H46 and said VL comprises Cys at L3;
xxxi. said VH comprises Cys at H46 and said VL comprises Cys at L5;
xxxii. said VH comprises Cys at H46 and said VL comprises Cys at L39;
xxxiii. said VH comprises Cys at H46 and said VL comprises Cys at L42;
xxxiv. said VH comprises Cys at H46 and said VL comprises Cys at L45;
xxxv. said VH comprises Cys at H46 and said VL comprises Cys at L100;
xxxvi. said VH comprises Cys at H46 and said VL comprises Cys at L102;
xxxvii. said VH comprises Cys at H105 and said VL comprises Cys at L3;
xxxviii. said VH comprises Cys at H105 and said VL comprises Cys at L5;
xxxix. said VH comprises Cys at H105 and said VL comprises Cys at L39;
xl. said VH comprises Cys at H105 and said VL comprises Cys at L45;
xli. said VH comprises Cys at H105 and said VL comprises Cys at L100, or xlii. the VH contains Cys at H105, the VL contains Cys at L102,
providing residue numbering according to Chothia;
b) said L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 , 4, 5, 6, or 7;
c) expressing said polynucleotide in a host cell to produce said stabilized scFv. 前記宿主細胞が、原核細胞であるか、又は
前記宿主細胞が、真核細胞である、
請求項５３に記載の方法。 said host cell is a prokaryotic cell , or
said host cell is a eukaryotic cell;
54. The method of claim 53 . 重鎖可変領域（ＶＨ）と、連結（Ｌ）のための手段と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖ。 An isolated single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region (VH), a means for joining (L), and a light chain variable region (VL), wherein said scFv comprises
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VH cysteine (Cys) and the first L Cys,
b) a second disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VL Cys and the second L Cys, or c) said structurally conserved surface-exposed VH Cys and said first L Cys. and said second disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed VL Cys and said second L Cys. 抗原結合のための手段と、リンカー（Ｌ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段システイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖ。 An isolated single chain variable fragment (scFv) comprising a means for antigen binding, a linker (L) and a light chain variable region (VL), said scFv comprising:
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed antigen binding means cysteine (Cys) and the first L Cys;
b) a second disulfide bond between a structurally conserved surface-exposed VL Cys and a second L Cys, or c) said structurally conserved surface-exposed antigen binding means Cys and said first L a scFv comprising said first disulfide bond between Cys and said second disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed VL Cys and said second L Cys. 重鎖可変領域（ＶＨ）と、リンカー（Ｌ）と、抗原結合のための手段と、を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと、第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖ。 An isolated single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region (VH), a linker (L) and means for antigen binding, said scFv comprising:
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VH cysteine (Cys) and the first L Cys,
b) a second disulfide bond between a structurally conserved surface-exposed antigen binding means Cys and a second L Cys, or c) a second disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed VH Cys and said first scFv comprising said first disulfide bond between L Cys and said second disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed antigen binding means Cys and said second L Cys. 重鎖可変領域（ＶＨ）と、連結（Ｌ）のための手段と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む多重特異性分子であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、多重特異性分子。 A multispecific molecule comprising a single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region (VH), means for linking (L) and a light chain variable region (VL), wherein said scFv is ,
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VH cysteine (Cys) and the first L Cys,
b) a second disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VL Cys and the second L Cys, or c) said structurally conserved surface-exposed VH Cys and said first L Cys. and said second disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed VL Cys and said second L Cys. 抗原結合のための手段と、リンカー（Ｌ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む多重特異性分子であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段システイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、多重特異性分子。 A multispecific molecule comprising a single chain variable fragment (scFv) comprising a means for antigen binding, a linker (L) and a light chain variable region (VL), said scFv comprising:
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed antigen binding means cysteine (Cys) and the first L Cys;
b) a second disulfide bond between a structurally conserved surface-exposed VL Cys and a second L Cys, or c) a second disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed antigen binding means Cys and said first A multispecific molecule comprising said first disulfide bond between L Cys and said second disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed VL Cys and said second L Cys. 重鎖可変領域（ＶＨ）と、リンカー（Ｌ）と、抗原結合（ＶＬ）のための手段と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む多重特異性分子であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合と、を含む、多重特異性分子。 A multispecific molecule comprising a single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region (VH), a linker (L) and means for antigen binding (VL), said scFv comprising:
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VH cysteine (Cys) and the first L Cys,
b) a second disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed antigen binding means Cys and the second L Cys, or c) said structurally conserved surface-exposed VH Cys and said first L Cys. said first disulfide bond between Cys and said second disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed antigen binding means Cys and said second L Cys. molecule. 重鎖可変領域（ＶＨ）と、連結のための手段（Ｌ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む異種分子であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子。 A heterologous molecule comprising a single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region (VH), a means for linking (L) and a light chain variable region (VL), said scFv comprising:
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VH cysteine (Cys) and the first L Cys,
b) a second disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VL Cys and the second L Cys, or c) said structurally conserved surface-exposed VH Cys and said first L Cys. and said second disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed VL Cys and said second L Cys. 抗原結合のための手段と、リンカー（Ｌ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む異種分子であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段システイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子。 A heterologous molecule comprising a single chain variable fragment (scFv) comprising a means for antigen binding, a linker (L) and a light chain variable region (VL), said scFv comprising:
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed antigen binding means cysteine (Cys) and the first L Cys;
b) a second disulfide bond between a structurally conserved surface-exposed VL Cys and a second L Cys, or c) said structurally conserved surface-exposed antigen binding means Cys and said first L a heterologous molecule comprising said first disulfide bond between Cys and said second disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed VL Cys and said second L Cys. 重鎖可変領域（ＶＨ）と、リンカー（Ｌ）と、抗原結合のための手段と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む異種分子であって、前記ｓｃＦｖが、
ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子。 A heterologous molecule comprising a single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region (VH), a linker (L) and means for antigen binding, said scFv comprising:
a) the first disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed VH cysteine (Cys) and the first L Cys,
b) a second disulfide bond between the structurally conserved surface-exposed antigen binding means Cys and the second L Cys, or c) said structurally conserved surface-exposed VH Cys and said first L Cys. A heterologous molecule comprising said first disulfide bond between Cys and said second disulfide bond between said structurally conserved surface-exposed antigen binding means Cys and said second L Cys. 請求項５５～６３のいずれか一項に記載のｓｃＦｖをコードするための手段。 Means for encoding the scFv of any one of claims 55-63 . 請求項６４に記載のベクターを複製するための手段。 65. Means for replicating the vector of claim 64 . ｓｃＦｖを安定化するための手段を含む組成物。 A composition comprising means for stabilizing scFv. ｓｃＦｖの熱安定性を増加させるための手段を含む組成物。 A composition comprising a means for increasing the thermostability of scFv. 前記手段が、ＶＨとＬとの間、ＶＬと前記Ｌとの間、又は前記ＶＨと前記Ｌとの間及び前記ＶＬと前記Ｌとの間にジスルフィド結合を形成することを含む、請求項６６又は６７に記載の組成物。 66 , wherein said means comprises forming a disulfide bond between VH and L, between VL and said L, or between said VH and said L and between said VL and said L Or the composition according to 67 . ｓｃＦｖを安定化するための手段を含む多重特異性分子。 A multispecific molecule comprising means for stabilizing scFv. ｓｃＦｖの熱安定性を増加させるための手段を含む多重特異性分子。 Multispecific molecules comprising means for increasing thermostability of scFv. 前記手段が、ＶＨとＬとの間、ＶＬと前記Ｌとの間、又は前記ＶＨと前記Ｌとの間及び前記ＶＬと前記Ｌとの間にジスルフィド結合を形成することを含む、請求項６９又は７０に記載の多重特異性分子。 69. Said means comprises forming a disulfide bond between VH and L, between VL and said L, or between said VH and said L and between said VL and said L. or the multispecific molecule according to 70 . ｓｃＦｖを安定化するための手段を含む異種分子。 Heterologous molecules comprising means for stabilizing scFv. ｓｃＦｖの熱安定性を増加させるための手段を含む異種分子。 Heterologous molecules comprising means for increasing the thermostability of scFv. 前記手段が、ＶＨとＬとの間、ＶＬと前記Ｌとの間、又は前記ＶＨと前記Ｌとの間及び前記ＶＬと前記Ｌとの間にジスルフィド結合を形成することを含む、請求項７２又は７３に記載の異種分子。 72. Claim 72 , wherein said means comprises forming a disulfide bond between VH and L, between VL and said L, or between said VH and said L and between said VL and said L or the heterologous molecule according to 73 . 請求項６６～６８のいずれか一項に記載の組成物を産生するための手段。 A means for producing a composition according to any one of claims 66-68 . 請求項６９～７１のいずれか一項に記載の多重特異性分子を産生するための手段。 A means for producing a multispecific molecule according to any one of claims 69-71 . 請求項７２～７４のいずれか一項に記載の異種分子を産生するための手段。 A means for producing a heterologous molecule according to any one of claims 72-74 .
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