JPWO2020252472A5

JPWO2020252472A5 -

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Publication number: JPWO2020252472A5
Application number: JP2021573759A
Authority: JP
Publication date: 2023-02-10

Description

[本発明1001]
ＭＵＣ1－ＳＥＡドメイン（配列番号1）または該ドメイン上のエピトープに対応するペプチドに結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
[本発明1002]
配列番号12、13、14、15、16の1つ以上のアミノ酸配列、もしくはその一部分に対応する、Ｖ _Ｈ、
配列番号17、18、19、20、21の1つ以上のアミノ酸配列、もしくは一部分に対応する、Ｖ _Ｌ、
またはそれらの任意の組み合わせ
を含む、本発明1001の抗体。
[本発明1003]
表1に記載されるアミノ酸配列のうちの1つ以上を含む、本発明1001の抗体。
[本発明1004]
クローンＴ4Ｅ3、Ｇ2－2－Ｆ8、Ｇ1－3－Ａ3、Ｇ1－2－Ｂ10、Ｇ1－1－Ａ1、またはＧ3－1－Ｄ6に対応する、本発明1001の抗体。
[本発明1005]
前記抗体のＣＤＲ3が、Ｖ _Ｈ－ＣＤＲ3の末端のアミノ酸配列ＧＭＤＶ、15～20アミノ酸であるＶ _Ｈ－ＣＤＲ3、Ｖ _ＬＣＤＲ3の3’末端に単一のアミノ酸挿入を有すること、またはそれらの任意の組み合わせのうちの1つ以上を含む、本発明1001の抗体。
[本発明1006]
ヒト化されている、または完全ヒトである、本発明1001の抗体。
[本発明1007]
単一特異性または二重特異性である、本発明1001の抗体。
[本発明1008]
一本鎖抗体である、本発明1001の抗体。
[本発明1009]
Ｆａｂフラグメント抗体を含む、本発明1001の抗体。
[本発明1010]
1ｐＭ～1μＭの範囲内の結合親和性を有する、本発明1001の抗体。
[本発明1011]
治療剤に連結された、先行本発明のいずれかの抗体。
[本発明1012]
前記治療剤が、毒素、放射性標識、ｓｉＲＮＡ、小分子、またはサイトカインである、本発明1010の抗体。
[本発明1013]
前記治療剤が、ＭＭＡＥである、本発明1011の抗体。
[本発明1014]
本発明1001～1013のいずれかの抗体を産生する、細胞。
[本発明1015]
本発明1001～1013のいずれかの抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
[本発明1016]
本発明1001～1013のいずれかの抗体をコードする、核酸。
[本発明1017]
ＭＵＣ1－ＳＥＡドメイン（配列番号1）または該ドメイン上のエピトープに対応するペプチドに結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、核酸。
[本発明1018]
配列番号23～32に記載の1つ以上のヌクレオチド配列、その一部分、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本発明1017の核酸。
[本発明1019]
本発明1017の核酸を含む、ベクター。
[本発明1020]
本発明1019のベクターを含む、細胞。
[本発明1021]
本発明1020の細胞を含む、薬学的組成物。
[本発明1022]
本発明1001～1013のいずれかの抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
[本発明1023]
前記抗原結合フラグメントが、ｓｃＦｖまたはＦａｂを含む、本発明1022のＣＡＲ。
[本発明1024]
二重特異性ＣＡＲまたは二重標的化ＣＡＲを含む、本発明1022のＣＡＲ。
[本発明1025]
本発明1022～1024のＣＡＲを含む、細胞。
[本発明1026]
Ｔ細胞を含む、本発明1025の細胞。
[本発明1027]
抗体またはそのフラグメントをさらに分泌する、本発明1023の細胞。
[本発明1028]
前記分泌された抗体が、モノクローナル抗体を含む、本発明1027の細胞。
[本発明1029]
前記分泌された抗体が、免疫チェックポイント遮断抗体を含む、本発明1027の細胞。
[本発明1030]
前記分泌された抗体が、対象の免疫系を調節する、本発明1027の細胞。
[本発明1031]
本発明1025の細胞および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
[本発明1032]
本発明1022～1024のＣＡＲをコードする、核酸。
[本発明1033]
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む、操作されたＴ細胞であって、該キメラ抗原受容体が、ＭＵＣ1－ＳＥＡドメインに特異的である、操作されたＴ細胞。
[本発明1034]
前記ＣＡＲが、ｓｃＦｖまたはＦａｂを含む、本発明1033の操作されたＴ細胞。
[本発明1035]
前記ＣＡＲが、二重特異性ＣＡＲを含む、本発明1033の操作されたＴ細胞。
[本発明1036]
前記核酸が、
前記操作された細胞から分泌され得るそのフラグメントの抗体を含む、ポリペプチド
をさらにコードする、本発明1033の操作されたＴ細胞。
[本発明1037]
本発明1033～1036のいずれかの操作されたＴ細胞および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
[本発明1038]
がんに罹患している対象を治療するための方法であって、がんに罹患している該対象に、本発明1001～1013のいずれかの抗体または本発明1033～1036のいずれかの細胞を含む組成物を投与することを含む、方法。
[本発明1039]
前記がんが、ＭＵＣ1、メソテリン、および／または他の腫瘍関連抗原を発現する、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記がんが、上皮がんを含む、本発明1038の方法。
[本発明1041]
前記上皮がんが、乳がん、基底細胞がん、腺がん、胃腸がん、口唇がん、口がん、食道がん、小腸がんおよび胃がん、結腸がん、肝臓がん、膀胱がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん、乳がんおよび皮膚がん、例えば、扁平上皮細胞および基底細胞がん、前立腺がん、腎細胞がん、ならびに全身の上皮細胞に影響を与える他の既知のがんを含む、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記対象に化学療法剤を投与することをさらに含む、本発明1038の方法。
[本発明1043]
ＭＵＣ1発現がんを有する対象を選択することをさらに含む、本発明1038の方法。
[本発明1044]
前記抗体または細胞が、ＭＵＣ1発現がん細胞のアポトーシスを誘導する、本発明1038の方法。
[本発明1045]
がん細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、該がん細胞を、本発明1001～1013のいずれかの抗体または本発明1022～1024のいずれかのＣＡＲと接触させることを含む、方法。
[本発明1046]
前記がん細胞が、その表面にＭＵＣ1－ＳＥＡを含有する、本発明1045の方法。
本発明の他の目的および利点は、その後の記載から容易に明らかになるであろう。
[Invention 1001]
An isolated monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the MUC1-SEA domain (SEQ ID NO: 1) or a peptide corresponding to an epitope on said domain.
[Invention 1002]
V _H , which corresponds to one or more of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, or a portion thereof ;
V _L , which corresponds to one or more amino acid sequences, or portions of SEQ ID NOS: 17, 18, 19, 20, 21 ;
or any combination thereof
The antibody of the invention 1001, comprising:
[Invention 1003]
An antibody of the invention 1001 comprising one or more of the amino acid sequences listed in Table 1.
[Invention 1004]
An antibody of the invention 1001 corresponding to clone T4E3, G2-2-F8, G1-3-A3, G1-2-B10, G1-1-A1, or G3-1-D6.
[Invention 1005]
wherein the CDR3 of said antibody has the amino acid sequence GMDV at the end of the VH-CDR3, a VH-CDR3 that is 15-20 amino acids, a single amino acid insertion at the 3' end of the V L CDR3 _, _or any of _these Antibodies of the invention 1001, including one or more of the combinations.
[Invention 1006]
An antibody of the invention 1001 that is humanized or fully human.
[Invention 1007]
The antibody of the invention 1001, which is monospecific or bispecific.
[Invention 1008]
The antibody of the invention 1001, which is a single chain antibody.
[Invention 1009]
Antibodies of the invention 1001, including Fab fragment antibodies.
[Invention 1010]
An antibody of the invention 1001 having a binding affinity in the range of 1 pM to 1 μM.
[Invention 1011]
An antibody of any preceding invention linked to a therapeutic agent.
[Invention 1012]
1010. The antibody of the invention 1010, wherein said therapeutic agent is a toxin, radiolabel, siRNA, small molecule, or cytokine.
[Invention 1013]
1011. The antibody of the invention 1011, wherein said therapeutic agent is MMAE.
[Invention 1014]
A cell that produces the antibody of any one of the inventions 1001-1013.
[Invention 1015]
A pharmaceutical composition comprising an antibody of any of the inventions 1001-1013 and a pharmaceutically acceptable excipient.
[Invention 1016]
A nucleic acid encoding the antibody of any of the inventions 1001-1013.
[Invention 1017]
A nucleic acid encoding an isolated monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the MUC1-SEA domain (SEQ ID NO: 1) or a peptide corresponding to an epitope on said domain.
[Invention 1018]
A nucleic acid of the invention 1017 comprising one or more nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs:23-32, portions thereof, or any combination thereof.
[Invention 1019]
A vector comprising the nucleic acid of the invention 1017.
[Invention 1020]
A cell containing the vector of the present invention 1019.
[Invention 1021]
A pharmaceutical composition comprising the cells of the invention 1020.
[Invention 1022]
A chimeric antigen receptor (CAR) comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof of any of the inventions 1001-1013.
[Invention 1023]
The CAR of the invention 1022, wherein said antigen-binding fragment comprises a scFv or Fab.
[Invention 1024]
CARs of the invention 1022, including bispecific or dual targeting CARs.
[Invention 1025]
A cell comprising the CAR of the invention 1022-1024.
[Invention 1026]
Cells of the invention 1025, including T cells.
[Invention 1027]
A cell of the invention 1023 which further secretes an antibody or fragment thereof.
[Invention 1028]
1027. The cell of the invention 1027, wherein said secreted antibody comprises a monoclonal antibody.
[Invention 1029]
1027. The cell of the invention 1027, wherein said secreted antibody comprises an immune checkpoint blocking antibody.
[Invention 1030]
1027. The cell of the invention 1027, wherein said secreted antibody modulates the subject's immune system.
[Invention 1031]
A pharmaceutical composition comprising cells of the invention 1025 and a pharmaceutically acceptable excipient.
[Invention 1032]
A nucleic acid encoding the CAR of the invention 1022-1024.
[Invention 1033]
An engineered T cell comprising a nucleic acid encoding a chimeric antigen receptor (CAR), wherein the chimeric antigen receptor is specific for the MUC1-SEA domain.
[Invention 1034]
1033. The engineered T cell of the invention 1033, wherein said CAR comprises a scFv or Fab.
[Invention 1035]
The engineered T cell of the invention 1033, wherein said CAR comprises a bispecific CAR.
[Invention 1036]
the nucleic acid is
a polypeptide comprising an antibody that is a fragment thereof that can be secreted from said engineered cell
The engineered T cell of the invention 1033 further encoding a
[Invention 1037]
A pharmaceutical composition comprising the engineered T cells of any of the inventions 1033-1036 and a pharmaceutically acceptable excipient.
[Invention 1038]
A method for treating a subject suffering from cancer, comprising administering to the subject suffering from cancer the antibody of any of the inventions 1001-1013 or the cell of any of the inventions 1033-1036 A method comprising administering a composition comprising
[Invention 1039]
1038. The method of the invention 1038, wherein said cancer expresses MUC1, mesothelin, and/or other tumor-associated antigens.
[Invention 1040]
1038. The method of the invention 1038, wherein said cancer comprises epithelial carcinoma.
[Invention 1041]
The epithelial cancer is breast cancer, basal cell carcinoma, adenocarcinoma, gastrointestinal cancer, lip cancer, mouth cancer, esophageal cancer, small intestine cancer and gastric cancer, colon cancer, liver cancer, bladder cancer , pancreatic, ovarian, cervical, lung, breast and skin cancers, including squamous and basal cell carcinoma, prostate cancer, renal cell carcinoma, and epithelial cells throughout the body. The method of the invention 1040, including other known cancers that give.
[Invention 1042]
The method of invention 1038, further comprising administering a chemotherapeutic agent to said subject.
[Invention 1043]
1038. The method of the invention 1038, further comprising selecting a subject with a MUC1-expressing cancer.
[Invention 1044]
1038. The method of the invention 1038, wherein said antibody or cell induces apoptosis of MUC1-expressing cancer cells.
[Invention 1045]
A method for inducing apoptosis of cancer cells, comprising contacting the cancer cells with the antibody of any of inventions 1001-1013 or the CAR of any of inventions 1022-1024. .
[Invention 1046]
1045. The method of the present invention 1045, wherein said cancer cells contain MUC1-SEA on their surface.
Other objects and advantages of the present invention will become readily apparent from the ensuing description.

２つの抗ＭＵＣ１－ＣｓｃＦｖ－Ｆｃの用量応答曲線を示す。Ｔ４Ｅ３ｓｃＦｖ－Ｆｃは、３Ｄ１ｓｃＦｖ－Ｆｃよりも６倍低いＥＣ５０を示す。用量応答曲線は、ｓｃＦｖ－Ｆｃの段階希釈物をＨＣＴ１１６－ＭＵＣ１（ＭＵＣ１－Ｃ＋）またはＨＣＴ１１６－ｖ（ＭＵＣ１－）結腸がん細胞株とインキュベートし、続いて二次抗ヒトＦｃ－ＦＩＴＣ抗体とインキュベートし、フローサイトメトリーによって結合を検出することによって生成された。Dose-response curves of two anti-MUC1-C scFv-Fc are shown. T4E3 scFv-Fc exhibits a 6-fold lower EC50 than 3D1 scFv-Fc. Dose-response curves were obtained by incubating serial dilutions of scFv-Fc with HCT116-MUC1 (MUC1-C+) or HCT116-v (MUC1-) colon cancer cell lines followed by secondary anti-human Fc-FITC antibody. and detected binding by flow cytometry. 抗ＭＵＣ１－ＣＣＡＲＴ細胞３Ｄ１－ＺｓＧｒｅｅｎおよびＴ４Ｅ３－ＺｓＧｒｅｅｎによる腫瘍細胞殺滅を示す。細胞殺滅アッセイは、細胞殺滅を視覚化するためにＣｅｌｉｇｏイメージングサイトメーターを利用する。蛍光タンパク質を発現するがん細胞株：ＨＣＴ１１６－ｖ、ＨＣＴ１１６－ＭＵＣ１、およびＣＯＶ３６２は、９６ウェルプレートにおいて播種され（３０００細胞／ウェル）、１０：１または２：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でＴ細胞とインキュベートされる。プレートは、２２時間および４２時間後に画像化される。細胞生存率は、ｍＣａｒｄｉｎａｌ＋細胞を数えることによって計算することができる。ｍＣａｒｄｉｎａｌシグナルの喪失は、がん細胞死を示す。結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６－ｖは、ＭＵＣ１－Ｃを発現しないが、ＨＣＴ１１６－ＭＵＣ１およびＣＯＶ３６２は、１００％ＭＵＣ１－Ｃ陽性である。Ｘ４８－ＺｓＧｒｅｅｎは、利用されるがん細胞株のいずれにも見られないＣＸＣＲ４を標的とするＣＡＲＴ細胞である。注－Ｔ細胞の利用可能性のため、Ｔ４Ｅ３－ＺｓＧｒｅｅｎＣＡＲＴ細胞は、ＨＣＴ１１６－ＭＵＣ１がん細胞とインキュベートされなかった。Tumor cell killing by anti-MUC1-C CAR T cells 3D1-ZsGreen and T4E3-ZsGreen. The cell killing assay utilizes a Celigo Imaging Cytometer to visualize cell killing. Cancer cell lines expressing fluorescent proteins: HCT116-v, HCT116-MUC1, and COV362 were seeded (3000 cells/well) in 96-well plates with 10:1 or 2:1 effector to target (E:T ) ratio with T cells. Plates are imaged after 22 and 42 hours. Cell viability can be calculated by counting mCardinal+ cells. Loss of mCardinal signal indicates cancer cell death. Colon cancer cell line HCT116-v does not express MUC1-C, whereas HCT116-MUC1 and COV362 are 100% MUC1-C positive. X48-ZsGreen is a CAR T cell targeting CXCR4 that is not found in any of the cancer cell lines utilized. Note - T4E3-ZsGreen CAR T cells were not incubated with HCT116-MUC1 cancer cells due to T cell availability. 図３は、Ｔ４Ｅ３腫瘍細胞殺滅実験設計を示す。がん細胞は、２００μＬのＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳ＋２０ｍＭＨＥＰＥＳにおいてウェルあたり３０００で播種される。それらは、３００ｇで５分間スピンダウンされ、その後Ｃｅｌｉｇｏイメージングサイトメーターで画像化される。１００μＬの培地は、ウェルの各々から除去され、Ｔ細胞は、以下のプレートマップに従って１０：１または２：１のＥ：Ｔ比で添加される。Ｔ４Ｅ３細胞の不足のため、Ｔ４Ｅ３は、ＣＯＶ３６２の２つのウェルおよびＨＣＴ１１６－ｖの１つのウェルにのみ指定されたＥ：Ｔ比で添加した。Ｔ細胞寿命を確保するために、ＩＬ－２１（３０ｎｇ／ｍＬ）も培養物に添加した。Ｔ細胞の添加直後に、プレートを画像化した。プレートはまた、Ｔ細胞添加の７時間後、２２時間後、および４２時間後に画像化した。本明細書に含まれるものは、プレートマップであり、Ｘは、示されたＣＡＲＴ細胞を受けるウェルを示す。Figure 3 shows the T4E3 tumor cell killing experimental design. Cancer cells are seeded at 3000 per well in 200 μL RPMI-1640+10% FBS+20 mM HEPES. They are spun down at 300 g for 5 minutes and then imaged on a Celigo imaging cytometer. 100 μL of medium is removed from each well and T cells are added at an E:T ratio of 10:1 or 2:1 according to the plate map below. Due to lack of T4E3 cells, T4E3 was added only to two wells of COV362 and one well of HCT116-v at the indicated E:T ratio. IL-21 (30 ng/mL) was also added to the cultures to ensure T cell longevity. Plates were imaged immediately after addition of T cells. Plates were also imaged at 7, 22, and 42 hours after T cell addition. Included here are plate maps, with Xs indicating wells receiving the indicated CAR T cells. 図３－１の説明を参照のこと。See description of Figure 3-1. 図３－１の説明を参照のこと。See description of Figure 3-1. 抗ＭＵＣ－１－ＳＥＡｓｃＦｖの発見を示す。Shown is the discovery of anti-MUC-1-SEA scFv. 図５は、Ｔ４Ｅ３ｓｃＦｖＣＡＲＴ対３Ｄ１ｓｃＦｖＣＡＲＴ殺滅を示す。Figure 5 shows T4E3 scFv CAR T versus 3D1 scFv CAR T killing. 図５－１の説明を参照のこと。See description of Figure 5-1. 用量依存的な殺滅を示す。Shows dose-dependent killing. 図７は、遺伝子割り当てを示す。FIG. 7 shows gene assignments. 図７－１の説明を参照のこと。See description of Figure 7-1. 図７－１の説明を参照のこと。See description of Figure 7-1. ＭＵＣ１－ＳＥＡのアノテーションされた構造（配列番号１）を示す。Shown is the annotated structure of MUC1-SEA (SEQ ID NO: 1) . 図９は、抗ＭＵＣ１抗体アミノ酸配列（それぞれ出現順に、配列番号１３５、１２、１３、１５、１４、１３６、１６、１３７、１７、１８、２１、２０、１３８、１９、１３９、４８、および１４０～１４５）のアラインメントを示す。Figure 9 shows the anti-MUC1 antibody amino acid sequences (SEQ ID NOs: 135, 12, 13, 15, 14, 136, 16, 137, 17, 18, 21, 20, 138, 19, 139, 48, and 140, respectively, in order of appearance). 145) . 図９－１の説明を参照のこと。See description of Figure 9-1. 図９－１の説明を参照のこと。See description of Figure 9-1. 図９－１の説明を参照のこと。See description of Figure 9-1. 図１０は、抗ＭＵＣ１抗体ＣＤＲ３領域の分析を示す。図は、それぞれ出現順に配列番号１４６～１５８および１２０を開示している。 Figure 10 shows analysis of the anti-MUC1 antibody CDR3 regions. The figures disclose SEQ ID NOs: 146-158 and 120, respectively, in order of appearance. 図１０－１の説明を参照のこと。See description of Figure 10-1. 図１１は、上皮性卵巣がんの正確な情報を示す。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ｃａｎｃｅｒ－ｏｒｇ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｃａｎｃｅｒ－ｆａｃｔｓ－ａｎｄ－ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ／ａｎｎｕａｌ－ｃａｎｃｅｒ－ｆａｃｔｓ－ａｎｄ－ｆｉｇｕｒｅｓ／２０１８／ｃａｎｃｅｒ－ｆａｃｔｓ－ａｎｄ－ｆｉｇｕｒｅｓ－ｓｐｅｃｉａｌ－ｓｅｃｔｉｏｎ－ｏｖａｒｉａｎ－ｃａｎｃｅｒ－２０１８．ｐｄｆ。FIG. 11 shows accurate information for epithelial ovarian cancer. https://www. cancer. org/content/dam/cancer-org/research/cancer-facts-and-statistics/annual-cancer-facts-and-figures/2018/cancer-facts-and-figures-special-section-ovarian-cancer-2018. pdf. 図１１－１の説明を参照のこと。See description of Figure 11-1. 図１２は、上皮性卵巣がんの治療を示す。FIG. 12 shows treatment of epithelial ovarian cancer. 図１２－１の説明を参照のこと。See description of Figure 12-1. 図１３は、卵巣がんの免疫抑制微小環境がＣＡＲＴ細胞有効性を妨げることを示す。FIG. 13 shows that the immunosuppressive microenvironment of ovarian cancer interferes with CAR T cell efficacy. 図１３－１の説明を参照のこと。See description of Figure 13-1. 卵巣がん微小環境におけるＴｒｅｇがＣＡＲＴ細胞有効性を妨げることを示す。Ｔｒｅｇは、例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞および樹状細胞の抑制による卵巣がんにおける腫瘍進行、ＴＧＦ－ベータおよびＩＬ－１０の分泌によるＴ細胞増殖の遮断、ならびにＴＩＬへの阻害シグナルの伝達をもたらす、Ｔｒｅｇ上のＣＴＬＡ－４の高発現に寄与する。We show that Tregs in the ovarian cancer microenvironment interfere with CAR T cell efficacy. Tregs lead to tumor progression in ovarian cancer, for example, by suppressing tumor-specific T cells and dendritic cells, blocking T cell proliferation by secreting TGF-beta and IL-10, and transmitting inhibitory signals to TILs. , contribute to the high expression of CTLA-4 on Tregs. 図１５は、固形腫瘍の治療のためのＣＡＲＴ細胞工場を示す。Figure 15 shows CAR T cell factories for treatment of solid tumors. 図１５－１の説明を参照のこと。See description of Figure 15-1. 図１５－１の説明を参照のこと。See description of Figure 15-1. 図１６は、卵巣がんＣＡＲＴ細胞工場成分の選択を示す。一実施形態では、標的指向成分は、抗ＭＵＣ１－Ｃ－ＣＡＲを含み、ペイロードは、抗ＣＣＲ４抗体を含む。理論によって縛られることを望むことなしに、ＭＵＣ１－ＣＣＡＲＴ細胞工場は、ＭＵＣ１＋腫瘍に移動し、免疫抑制性卵巣がん腫瘍微小環境を逆転させ、腫瘍細胞死をもたらすであろう。Figure 16 shows selection of ovarian cancer CAR T cell factory components. In one embodiment, the targeting component comprises anti-MUC1-C-CAR and the payload comprises an anti-CCR4 antibody. Without wishing to be bound by theory, MUC1-C CAR T cell factories may migrate to MUC1+ tumors and reverse the immunosuppressive ovarian cancer tumor microenvironment, resulting in tumor cell death. 図１６－１の説明を参照のこと。See description of Figure 16-1. 図１７は、ＭＵＣ１－ＣＣＡＲＴ細胞療法と併用することができる抗ＣＣＲ４ＣＡＲＴ細胞の開発を示す。Figure 17 shows the development of anti-CCR4 CAR T cells that can be used in combination with MUC1-C CAR T cell therapy. 図１７－１の説明を参照のこと。See description of Figure 17-1. 図１８は、抗ＭＵＣ１－Ｃ抗体ｈ３Ｄ１ＩｇＧ（Ｋｕｆｅ研究室提供）のＭＵＣ１－Ｃ末端ドメインおよび結合エピトープの概略図を示す。Figure 18 shows a schematic representation of the MUC1-C-terminal domain and binding epitope of anti-MUC1-C antibody h3D1 IgG (provided by Kufe lab). 図１８－１の説明を参照のこと。See description of Figure 18-1. 図１９は、ＣＡＲ親和性の効果およびＣＡＲエピトープの効果を示す。例えば、ＣＡＲの親和性は、Ｔ細胞活性化、殺滅率、および健常組織とがん性組織とを区別するＣＡＲの能力に影響を与える。さらに、膜近位ＣＡＲがより低い結合効率を有する場合でも、ＣＡＲが抗原上の膜近位エピトープを認識すると、より効率的なＴ細胞活性化が起こる。Figure 19 shows the effect of CAR affinity and the effect of CAR epitope. For example, CAR affinity affects T cell activation, killing rates, and the CAR's ability to distinguish between healthy and cancerous tissue. Furthermore, even though membrane-proximal CARs have lower binding efficiencies, more efficient T-cell activation occurs when CARs recognize membrane-proximal epitopes on antigens. 図１９－１の説明を参照のこと。See description of Figure 19-1. 図２０は、ｈ３Ｄ１ＩｇＧのｓｃＦｖへの変換後の親和性の低減を示す。細胞株への結合後のｓｃＦｖ－Ｆｃの親和性の喪失は、初期ＭＵＣ－１ＣＣＡＲＴ細胞の努力を妨げた。３Ｄ１ｓｃＦｖ－Ｆｃおよび３Ｄ１ＩｇＧの親和性の定量化。図は配列番号１５９を開示している。 Figure 20 shows affinity reduction after conversion of h3D1 IgG to scFv. Loss of affinity of scFv-Fc after binding to cell lines hampered the efforts of early MUC-1C CAR T cells. Affinity quantification of 3D1 scFv-Fc and 3D1 IgG. The figure discloses SEQ ID NO:159. 図２０－１の説明を参照のこと。See description of Figure 20-1. ＭＵＣ１－ＳＥＡを含む構築物のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。Shown is the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of a construct containing MUC1-SEA. 図２２は、ＭＵＣ１－ＳＥＡドメインを含む、全長ＭＵＣ１を示す。ＭＵＣ１－ＳＥＡドメインは、保存されたＧＶＶＳ配列（配列番号３３）で自己タンパク質分解による自己切断を受ける。矢印によって示されるように、切断は、Ｇの後およびＶの前で起こる。図は、それぞれ出現順に配列番号１６０、３４、および１６１を開示している。 Figure 22 shows full-length MUC1, including the MUC1-SEA domain. The MUC1-SEA domain undergoes autoproteolytic self-cleavage at the conserved GVVS sequence (SEQ ID NO:33) . Cleavage occurs after G and before V, as indicated by the arrows. The figures disclose SEQ ID NOs: 160, 34, and 161, respectively, in order of appearance. 図２２－１の説明を参照のこと。See description of Figure 22-1. Ｍｕｃ１－ＳＥＡ精製を示す。Ｍｕｃ１－ＳＥＡは、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞においてｐＥＴ２８ａベクターから発現された。タンパク質は、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂）を介して精製した。ｐＥＴ２８ａ－ＭＵＣ１（ｓｅａ）を有する１２５ｍｌのＢＬ２１（ＤＥ３）をＯＤ０．６まで継代培養し、０．１または０．５ｍＭいずれかのＩＰＴＧで誘導した。培養物を３０℃で一晩成長させ、９０００ｒｐｍでペレット化した。ペレットを４ｍＬのＢ－ＰＥＲに再懸濁した後、１５分間超音波処理した（３０／５９秒オン／オフサイクル）。溶解された細胞をスピンダウンし、上清をＮｉ－ＮＴＡ結合バッファー（２０ｍＭイミダゾール）で５０：５０に希釈した後、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂と１時間インキュベートした。樹脂は、収集し、結合バッファー（２０ｍＭイミダゾール）で洗浄した後、２５０ｍＭイミダゾールで溶出した。収集されたタンパク質は、長期貯蔵のためにＰＢＳにバッファー交換した。視覚化のために、すべての試料は、４倍ＬＤＳローディング色素で調製した。試料１～５は、還元されず、試料６は、１０％ＢＭＥで還元される。Mucl-SEA purification is shown. Mucl-SEA was expressed from the pET28a vector in BL21(DE3) cells. Proteins were purified via an N-terminal His-tag (Ni-NTA resin). 125 ml of BL21(DE3) harboring pET28a-MUC1(sea) were subcultured to OD 0.6 and induced with either 0.1 or 0.5 mM IPTG. Cultures were grown overnight at 30° C. and pelleted at 9000 rpm. The pellet was resuspended in 4 mL of B-PER and then sonicated for 15 minutes (30/59 sec on/off cycle). Lysed cells were spun down and the supernatant was diluted 50:50 with Ni-NTA binding buffer (20 mM imidazole) and then incubated with Ni-NTA resin for 1 hour. The resin was collected, washed with binding buffer (20 mM imidazole) and then eluted with 250 mM imidazole. Collected proteins were buffer exchanged into PBS for long-term storage. For visualization, all samples were prepared with 4x LDS loading dye. Samples 1-5 are not reduced and sample 6 is reduced with 10% BME. Ｍｕｃ１－ＳＥＡ自己切断を示す。４～１２％Ｂｏｌｔゲルは、ＭＥＳバッファー中で泳動した。試料は、特に指定がない限り、非還元性であった（１０％ＢＭＥ）。ＭＢＰ－Ｍｕｃ１（約４ｕｇ）を除いて、約５ｕｇを各ウェルに装填した。約６ｋＤａの非常にかすかなバンドは、切断産物であり得る。Mucl-SEA autocleavage is shown. 4-12% Bolt gels were run in MES buffer. Samples were non-reducing (10% BME) unless otherwise specified. Approximately 5 ug was loaded into each well, except for MBP-Muc1 (approximately 4 ug). A very faint band of approximately 6 kDa could be a cleavage product. ｈ３Ｄ１結合を示す。Ｎｕｎｃｍａｘｉｓｏｒｂプレートは、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのＭｕｃ１－ＳＥＡで一晩４℃でコーティングした。翌日、プレートは、４％ミルク－ＰＢＳで２時間３７℃でブロックした。次いで、ブロッキング溶液を捨て、２％ミルク－ＰＢＳＴ中の適切な抗体希釈物で置き換えた。抗体溶液を３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで６回洗浄した。抗ヒトＦｃ－ＨＲＰ二次を使用して、３Ｄ１結合を検出した（２％ミルク－ＰＢＳＴで１：１００ｋ希釈）。３７℃での１時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢ基質を加えた。反応は、ストップバッファーの添加によってクエンチし、４５０ｎｍで読み取った。h3D1 binding is shown. Nunc maxisorb plates were coated with 1 μg/ml Muc1-SEA in PBS overnight at 4°C. The following day, plates were blocked with 4% milk-PBS for 2 hours at 37°C. The blocking solution was then discarded and replaced with the appropriate antibody dilution in 2% milk-PBST. After incubating the antibody solution at 37° C. for 1 hour, it was washed 6 times with PBST. 3D1 binding was detected using an anti-human Fc-HRP secondary (1:100k dilution in 2% milk-PBST). After 1 hour incubation at 37° C., plates were washed 6 times with PBST and TMB substrate was added. Reactions were quenched by the addition of stop buffer and read at 450 nm. 図２６は、ＭＵＣ１パニング要約を示す。FIG. 26 shows the MUC1 panning summary. 図２６－１の説明を参照のこと。See description of Figure 26-1. ２つの抗ＭＵＣ１－ＣｓｃＦｖ－Ｆｃの用量応答曲線を示す。Ｔ４Ｅ３ｓｃＦｖ－Ｆｃは、３Ｄ１ｓｃＦｖ－Ｆｃよりも６倍低いＥＣ５０を示す。用量応答曲線は、ｓｃＦｖ－Ｆｃの段階希釈物をＨＣＴ１１６－ＭＵＣ１（ＭＵＣ１－Ｃ＋）またはＨＣＴ１１６－ｖ（ＭＵＣ１－）結腸がん細胞株とインキュベートし、続いて二次抗ヒトＦｃ－ＦＩＴＣ抗体とインキュベートし、フローサイトメトリーによって結合を検出することによって生成された。Dose-response curves of two anti-MUC1-C scFv-Fc are shown. T4E3 scFv-Fc exhibits a 6-fold lower EC50 than 3D1 scFv-Fc. Dose-response curves were obtained by incubating serial dilutions of scFv-Fc with HCT116-MUC1 (MUC1-C+) or HCT116-v (MUC1-) colon cancer cell lines followed by secondary anti-human Fc-FITC antibody. and detected binding by flow cytometry. 抗ＭＵＣ１－ＳＥＡｓｃＦｖの結合特性を示す。Binding properties of anti-MUC1-SEA scFv are shown. ＦＲ１－ＣＤＲ２のアラインメントを示す。図は、それぞれ出現順に配列番号１３５、１２、１３、１５、１４、１３６、１６、１３７、１７、１８、２１、２０、１３８、および１９のＦＲ１－ＣＤＲ２を開示している。 FR1-CDR2 alignment is shown. The figures disclose FR1-CDR2 of SEQ ID NOs: 135, 12, 13, 15, 14, 136, 16, 137, 17, 18, 21, 20, 138, and 19, respectively, in order of appearance. ＦＲ３－ＦＲ４のアラインメントを示す。図は、それぞれ出現順に配列番号１３５、１２、１３、１５、１４、１３６、１６、１３７、１７、１８、２１、２０、１３８、および１９のＦＲ３－ＦＲ４を開示している。 Alignment of FR3-FR4 is shown. The figures disclose FR3-FR4 of SEQ ID NOs: 135, 12, 13, 15, 14, 136, 16, 137, 17, 18, 21, 20, 138, and 19, respectively, in order of appearance. 図３１は、Ｔ４Ｅ３ｓｃＦｖＣＡＲＴ対３Ｄ１ｓｃＦｖＣＡＲＴ殺滅を示す。結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６－ｖは、対照、ＭＵＣ１－細胞株である。ＣＯＶ３６２は、ＭＵＣ１＋細胞株である。ｍＡｂ２－３は、対照、抗ＣＣＲ４抗体である。Figure 31 shows T4E3 scFv CAR T versus 3D1 scFv CAR T killing. Colon cancer cell line HCT116-v is the control, MUC1- cell line. COV362 is a MUC1+ cell line. mAb 2-3 is a control, anti-CCR4 antibody. 図３１－１の説明を参照のこと。See description of Figure 31-1. 用量依存的な殺滅を示す。ＨＣＴ１１６－ｖは、対照、ＭＵＣ１－細胞株である。ＣＯＶ３６２は、ＭＵＣ１＋細胞株である。ｍＡｂ２－３は、対照、抗ＣＣＲ４抗体である。Shows dose-dependent killing. HCT116-v is the control, MUC1- cell line. COV362 is a MUC1+ cell line. mAb 2-3 is a control, anti-CCR4 antibody. 抗ＭＵＣ１－ＣＣＡＲＴ細胞３Ｄ１－ＺｓＧｒｅｅｎおよびＴ４Ｅ３－ＺｓＧｒｅｅｎによる腫瘍細胞殺滅を示す。細胞殺滅アッセイは、細胞殺滅を視覚化するためにＣｅｌｉｇｏイメージングサイトメーターを利用する。蛍光タンパク質を発現するがん細胞株：ＨＣＴ１１６－ｖ、ＨＣＴ１１６－ＭＵＣ１、およびＣＯＶ３６２は、９６ウェルプレートにおいて播種され（３０００細胞／ウェル）、１０：１または２：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でＴ細胞とインキュベートされる。プレートは、２２時間および４２時間後に画像化される。細胞生存率は、ｍＣａｒｄｉｎａｌ＋細胞を数えることによって計算することができる。ｍＣａｒｄｉｎａｌシグナルの喪失は、がん細胞死を示す。結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６－ｖは、ＭＵＣ１－Ｃを発現しないが、ＨＣＴ１１６－ＭＵＣ１およびＣＯＶ３６２は、１００％ＭＵＣ１－Ｃ陽性である。Ｘ４８－ＺｓＧｒｅｅｎは、利用されるがん細胞株のいずれにも見られないＣＸＣＲ４を標的とするＣＡＲＴ細胞である。Tumor cell killing by anti-MUC1-C CAR T cells 3D1-ZsGreen and T4E3-ZsGreen. The cell killing assay utilizes a Celigo Imaging Cytometer to visualize cell killing. Cancer cell lines expressing fluorescent proteins: HCT116-v, HCT116-MUC1, and COV362 were seeded (3000 cells/well) in 96-well plates with 10:1 or 2:1 effector to target (E:T ) ratio with T cells. Plates are imaged after 22 and 42 hours. Cell viability can be calculated by counting mCardinal+ cells. Loss of mCardinal signal indicates cancer cell death. Colon cancer cell line HCT116-v does not express MUC1-C, whereas HCT116-MUC1 and COV362 are 100% MUC1-C positive. X48-ZsGreen is a CAR T cell targeting CXCR4 that is not found in any of the cancer cell lines utilized. Ｔｒｅｇおよび腫瘍細胞を同様に殺滅するＭＵＣ１－ＣＣＲ４二重標的ＣＡＲのＣＡＲ挿入マップを示す。CAR insertion map of MUC1-CCR4 dual-targeting CAR that kills Tregs and tumor cells alike. 図３５は、Ｔｒｅｇおよび腫瘍細胞を同様に殺滅するＭＵＣ１－ＣＣＲ４二重標的ＣＡＲのベクターマップを示す。Figure 35 shows a vector map of the MUC1-CCR4 dual targeting CAR that kills Tregs and tumor cells alike. 図３５－１の説明を参照のこと。See description of Figure 35-1. 図３６は、Ｆａｂ構築物を生成するＦ２Ａの利用を示す。図は、それぞれ出現順に配列番号１６３～１７４としての配列のアライメント、および配列番号１６２としての「ＲＡＫＲＳＧＳＧ」を開示している。 Figure 36 shows the use of F2A to generate Fab constructs. The figure discloses an alignment of the sequences as SEQ ID NOS: 163-174 and "RAKRSGSG" as SEQ ID NO: 162, respectively, in order of appearance. 図３６－１の説明を参照のこと。See description of Figure 36-1. 図３６－１の説明を参照のこと。See description of Figure 36-1. 図３７は、初期設計構築物設計の分析を示す。Figure 37 shows an analysis of the initial design construct design. 図３７－１の説明を参照のこと。See description of Figure 37-1. Ｆ１０５リーダーを使用したＦａｂ設計の戦略を示す。構築物において、初期Ｂ細胞受容体設計が重鎖の発現のためのＶＨリーダーの代わりにｐＨＡＧＥベクターにあるＦ１０５リーダーを使用したという観察に基づいて、リーダー配列が変更された。加えて、Ｆａｂの同一性は、ＨＡステムに結合する、市販の抗血球凝集素抗体Ｍｅｄｉ８８５２に変更された。図は、配列番号１６２としての「ＲＡＫＲＳＧＳＧ」を開示している。 A strategy for Fab design using the F105 reader is shown. In the construct the leader sequence was changed based on the observation that the initial B-cell receptor design used the F105 leader in the pHAGE vector instead of the VH leader for heavy chain expression. Additionally, the identity of the Fab was changed to the commercial anti-hemagglutinin antibody Medi8852, which binds to the HA stem. The figure discloses "RAKRSGSG" as SEQ ID NO:162. Ｍｅｄｉ８８５２がＨＡステムに結合するが、ＭＵＣ１－ＳＥＡに結合しないことを示す。Medi8852 binds to the HA stem but not to MUC1-SEA. Ｍｅｄｉ８８５２ＦａｂＦ１０５構築物にクローン化され、結合および発現について評価されたｍＡｂ２－３Ｆａｂおよび３Ｄ１Ｆａｂを示す。ｍＡｂ２－３および３Ｄ１Ｆａｂの両方がそれぞれのｓｃＦｖよりも高いＥＣ５０を有することが観察された。Shown are mAb2-3 Fab and 3D1 Fab cloned into the Medi8852 Fab F105 construct and evaluated for binding and expression. Both mAb2-3 and 3D1 Fab were observed to have higher EC50 than their respective scFv. Ｍｅｄｉ８８５２ＦａｂＦ１０５構築物にクローン化され、フローサイトメトリーによって結合および発現について評価されたｍＡｂ２－３Ｆａｂおよび３Ｄ１Ｆａｂを示す。各値は、３つの複製の平均を表す。Shown are mAb2-3 and 3D1 Fabs cloned into the Medi8852 Fab F105 construct and assessed for binding and expression by flow cytometry. Each value represents the average of three replicates. ラムダ軽鎖を有するＦａｂ（抗Ｍｕｃ１Ｔ４Ｅ３Ｆａｂ）を生成するために拡張されたＭｅｄｉａ８８５２構築物を示す。結果は、ｓｃＦｖよりも低い親和性を有するＦａｂの例を示す。Media8852 construct extended to generate Fab with lambda light chain (anti-Muc1 T4E3 Fab). The results show examples of Fabs with lower affinities than scFv. ＦａｂＣＡＲＴ細胞殺滅を示す。ＦａｂＣＡＲＴ細胞は、ｓｃＦｖＣＡＲＴ細胞よりも低い効率でＭＵＣ１＋腫瘍細胞を殺滅する。Fab CAR T cell killing is shown. Fab CAR T cells kill MUC1+ tumor cells with lower efficiency than scFv CAR T cells. 図４４は、二重特異性クロスオーバーＦａｂの実施形態を示す。Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、リンカーの非限定的な例を指す。図は、配列番号１６２としての「ＲＡＫＲＳＧＳＧ」、配列番号１７５としての「（Ｇｌｙ） _７」、および配列番号１７６としての「（Ｇｌｙ） _５」を開示している。 Figure 44 shows an embodiment of a bispecific crossover Fab. L1, L2, L3, and L4 refer to non-limiting examples of linkers. The figure discloses "RAKRSGSG" as SEQ ID NO:162, "(Gly) ₇ " as SEQ ID NO:175, and "(Gly) ₅ " as SEQ ID NO:176 . 図４４－１の説明を参照のこと。See description of Figure 44-1. 図４５は、二重特異性クロスオーバーＦａｂの実施形態を示す。すべての値は、３つの複製の平均である。Figure 45 shows an embodiment of a bispecific crossover Fab. All values are the average of three replicates. 図４５－１の説明を参照のこと。See description of Figure 45-1. 図４６は、結合についての用量応答曲線を示す。Figure 46 shows dose response curves for binding. 図４６－１の説明を参照のこと。See description of Figure 46-1. （Ａ）単一特異性抗ＭＵＣ１－Ｃのレンチウイルス構築物および（Ｂ）抗メソテリンＣＡＲＴ細胞を示す。（Ｃ）二重特異性抗ＭＵＣ１－Ｃ／メソテリンＣＡＲＴ細胞のレンチウイルス構築物。（Ｄ）二重特異性抗ＭＵＣ１－Ｃ／メソテリンＣＡＲＴ細胞工場のレンチウイルス構築物。（Ｅ）抗ＭＵＣ１－Ｃ／メソテリンＣＡＲＴ工場作用機序の略図表現。(A) Monospecific anti-MUC1-C lentiviral constructs and (B) anti-mesothelin CAR T cells. (C) Lentiviral constructs of bispecific anti-MUC1-C/mesothelin CAR T cells. (D) Lentiviral construct of a bispecific anti-MUC1-C/mesothelin CAR T cell factory. (E) Schematic representation of anti-MUC1-C/mesothelin CAR T factory mechanism of action. （上のパネル）染色されていない対照（赤）と比較され、Ｏｖｃａｒ－４が１１．４％メソテリン＋であり、ＣＯＶ３６２が５４．２％メソテリン＋であることを明らかにする、抗メソテリンＡＰＣ（青）で染色されたＯｖｃａｒ－４およびＣＯＶ３６２のフローサイトメトリーヒストグラム（下のパネル）２３３ｎＭの抗ＭＵＣ１－Ｃｈ３Ｄ１ＩｇＧで染色され、続いて抗ヒトＦｃ－ＦＩＴＣ二次染色によって、Ｏｖｃａｒ－４が４６．１％ＭＵＣ１－Ｃ＋であり、ＣＯＶ３６２が８５．５％ＭＵＣ１－Ｃ＋であることを明らかにする、Ｏｖｃａｒ－４およびＣＯＶ３６２のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。(Upper panel) Anti-mesothelin APC (anti-mesothelin APC), compared to unstained controls (red), revealing that Ovcar-4 is 11.4% mesothelin+ and COV362 is 54.2% mesothelin+. Flow cytometry histograms of Ovcar-4 and COV362 stained with (blue) (bottom panel) stained with 233 nM anti-MUC1-C h3D1 IgG followed by anti-human Fc-FITC secondary staining revealed that Ovcar-4 Flow cytometry histograms of Ovcar-4 and COV362 revealing 0.1% MUC1-C+ and COV362 85.5% MUC1-C+. （Ａ）卵巣がん転移を示すことにおけるその有用性を強調する、卵巣がんの同所性マウスモデルの略画表現を示す。（Ｂ）同所性卵巣腫瘍を有する５匹のマウスから得られた腫瘍および卵巣。上のマウスの腫瘍は、高異型度漿液性卵巣がん（ＨＧＳＣ）細胞株Ｏｖｃａｒ－４（３５０，０００細胞／マウス）から生成され、下の４つの卵巣および腫瘍は、ＨＧＳＣ細胞株ＣＯＶ３６２（５００，０００細胞／マウス）から生成された。(A) Shows a schematic representation of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, highlighting its utility in indicating ovarian cancer metastasis. (B) Tumors and ovaries from 5 mice bearing orthotopic ovarian tumors. Top mouse tumors were generated from the high-grade serous ovarian cancer (HGSC) cell line Ovcar-4 (350,000 cells/mouse), bottom four ovaries and tumors were generated from the HGSC cell line COV362 (500 cells/mouse). ,000 cells/mouse). 図５０は、（Ａ）転移および腫瘍微小環境の研究を可能にする、同所性ヒト化マウスモデルの略図表現、（Ｂ）腎細胞がんのヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスモデルにおけるＣＤ４５＋白血球のマッピングを示すｔ－ＳＮＥ２Ｄ散布図、（Ｃ）クラスター１および２内のＣＣＲ４の存在を示し、ＴｒｅｇおよびＴｈ２細胞の存在を示すバイオリン図を示す。FIG. 50. (A) Schematic representation of an orthotopic humanized mouse model that allows the study of metastasis and tumor microenvironment, (B) Mapping of CD45+ leukocytes in a humanized NSG-SGM3 mouse model of renal cell carcinoma. (C) t-SNE 2D scatterplot showing the presence of CCR4 within clusters 1 and 2, showing the presence of Treg and Th2 cells. 図５０－１の説明を参照のこと。See description of Figure 50-1. 図５１（Ａ）は、抗ＭＵＣ１抗体のアミノ酸配列を示す。図５１（Ａ）および図５１（Ｂ）は、それぞれ出現順に配列番号４７、１５、１３、４８～５７、７３、２０、１８、および７４～８３を開示している。 Figure 51(A) shows the amino acid sequence of the anti-MUC1 antibody. Figures 51(A) and 51(B) disclose SEQ ID NOs: 47, 15, 13, 48-57, 73, 20, 18, and 74-83, respectively, in order of appearance. 図５１（Ａ）－１の説明を参照のこと。See description of FIG. 51(A)-1. 図５１（Ａ）－１の説明を参照のこと。See description of FIG. 51(A)-1. 図５１（Ａ）－１の説明を参照のこと。See description of FIG. 51(A)-1. 図５１（Ｂ）は、抗ＭＵＣ１抗体のアミノ酸配列を示す。図５１（Ａ）および図５１（Ｂ）は、それぞれ出現順に配列番号４７、１５、１３、４８～５７、７３、２０、１８、および７４～８３を開示している。 Figure 51(B) shows the amino acid sequence of the anti-MUC1 antibody. Figures 51(A) and 51(B) disclose SEQ ID NOs: 47, 15, 13, 48-57, 73, 20, 18, and 74-83, respectively, in order of appearance. 図５１（Ｂ）－１の説明を参照のこと。See description of FIG. 51(B)-1. 図５２（Ａ）は、抗ＭＵＣ１抗体のヌクレオチド配列を示す。図５２（Ａ）から図５２（Ｄ）は、それぞれ出現順に配列番号３５、３６、２４、３７～４６、および６０～７２を開示している。 Figure 52(A) shows the nucleotide sequence of the anti-MUC1 antibody. Figures 52(A) through 52(D) disclose SEQ ID NOs: 35, 36, 24, 37-46, and 60-72, respectively, in order of appearance. 図５２（Ａ）－１の説明を参照のこと。See description of FIG. 52(A)-1. 図５２（Ｂ）は、抗ＭＵＣ１抗体のヌクレオチド配列を示す。図５２（Ａ）から図５２（Ｄ）は、それぞれ出現順に配列番号３５、３６、２４、３７～４６、および６０～７２を開示している。 Figure 52(B) shows the nucleotide sequence of the anti-MUC1 antibody. Figures 52(A) through 52(D) disclose SEQ ID NOs: 35, 36, 24, 37-46, and 60-72, respectively, in order of appearance. 図５２（Ｂ）－１の説明を参照のこと。See description of FIG. 52(B)-1. 図５２（Ｂ）－１の説明を参照のこと。See description of FIG. 52(B)-1. 図５２（Ｂ）－１の説明を参照のこと。See description of FIG. 52(B)-1. 図５２（Ｃ）は、抗ＭＵＣ１抗体のヌクレオチド配列を示す。図５２（Ａ）から図５２（Ｄ）は、それぞれ出現順に配列番号３５、３６、２４、３７～４６、および６０～７２を開示している。 Figure 52(C) shows the nucleotide sequence of the anti-MUC1 antibody. Figures 52(A) through 52(D) disclose SEQ ID NOs: 35, 36, 24, 37-46, and 60-72, respectively, in order of appearance. 図５２（Ｃ）－１の説明を参照のこと。See description of FIG. 52(C)-1. 図５２（Ｄ）は、抗ＭＵＣ１抗体のヌクレオチド配列を示す。図５２（Ａ）から図５２（Ｄ）は、それぞれ出現順に配列番号３５、３６、２４、３７～４６、および６０～７２を開示している。 Figure 52(D) shows the nucleotide sequence of the anti-MUC1 antibody. Figures 52(A) through 52(D) disclose SEQ ID NOs: 35, 36, 24, 37-46, and 60-72, respectively, in order of appearance. 図５２（Ｄ）－１の説明を参照のこと。See description of FIG. 52(D)-1. 図５３（Ａ）は、抗ＭＵＣ１抗体のアミノ酸配列を示す。図５３（Ａ）から図５３（Ｃ）は、それぞれ出現順に配列番号１６、５８、５１、１４、４８、１７７、５９、２１、８４、８５、１９、７４、８６、および８７を開示している。 Figure 53(A) shows the amino acid sequence of the anti-MUC1 antibody. Figures 53(A) to 53(C) disclose SEQ ID NOS: 16, 58, 51, 14, 48, 177, 59, 21, 84, 85, 19, 74, 86, and 87, respectively, in order of appearance. there is 図５３（Ｂ）は、抗ＭＵＣ１抗体のアミノ酸配列を示す。図５３（Ａ）から図５３（Ｃ）は、それぞれ出現順に配列番号１６、５８、５１、１４、４８、１７７、５９、２１、８４、８５、１９、７４、８６、および８７を開示している。 Figure 53(B) shows the amino acid sequence of the anti-MUC1 antibody. Figures 53(A) to 53(C) disclose SEQ ID NOS: 16, 58, 51, 14, 48, 177, 59, 21, 84, 85, 19, 74, 86, and 87, respectively, in order of appearance. there is 図５３（Ｃ）は、抗ＭＵＣ１抗体のアミノ酸配列を示す。図５３（Ａ）から図５３（Ｃ）は、それぞれ出現順に配列番号１６、５８、５１、１４、４８、１７７、５９、２１、８４、８５、１９、７４、８６、および８７を開示している。 Figure 53(C) shows the amino acid sequence of the anti-MUC1 antibody. Figures 53(A) to 53(C) disclose SEQ ID NOS: 16, 58, 51, 14, 48, 177, 59, 21, 84, 85, 19, 74, 86, and 87, respectively, in order of appearance. there is

ＭＵＣ１遺伝子は、立体構造ストレスにより、ウニ精子タンパク質エンテロキナーゼおよびアグリン（ＳＥＡ）ドメイン内に位置する、ＧＳＶＶＶモチーフ（配列番号３４）（以下の下線および太字を参照されたい）で翻訳直後に、２つのペプチドフラグメント：より長いＮ末端サブユニット（ＭＵＣ１－Ｎ）およびより短いＣ末端サブユニット（ＭＵＣ１－Ｃ）へと自己タンパク質分解的に切断される、単一のポリペプチド鎖をコードする。細胞外では、２つのサブユニットは、安定した水素結合を通して会合したままである。
Due to conformational stress, the MUC1 gene is split into two sequences immediately after translation with the GSVVV motif (SEQ ID NO: 34) (see underlined and bolded below), located within the sea urchin sperm protein enterokinase and agrin (SEA) domain. Peptide fragment: Encodes a single polypeptide chain that is autoproteolytically cleaved into a longer N-terminal subunit (MUC1-N) and a shorter C-terminal subunit (MUC1-C). Extracellularly, the two subunits remain associated through stable hydrogen bonds.

重鎖ヌクレオチド配列

heavy chain nucleotide sequence

重鎖アミノ酸配列（ＣＤＲ１は太字で示され、ＣＤＲ２は下線で示され、ＣＤＲ３は太字および下線で示される）

Heavy chain amino acid sequence (CDR1 is shown in bold, CDR2 is underlined, CDR3 is shown in bold and underlined)

軽鎖ヌクレオチド配列

light chain nucleotide sequence

軽鎖アミノ酸配列（ＣＤＲ１は太字で示され、ＣＤＲ２は下線で示され、ＣＤＲ３は太字および下線で示される）

Light chain amino acid sequence (CDR1 is shown in bold, CDR2 is underlined, CDR3 is shown in bold and underlined)

一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチド分子は、共有結合的に連結されたＶ_Ｈ：Ｖ_Ｌヘテロ二量体であり、これは、ペプチドコードリンカーによって連結されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌコード遺伝子を含む遺伝子融合体から発現され得る。（Ｈｕｓｔｏｎｅｔａｌ．（１９８８）ＰｒｏｃＮａｔＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８５（１６）：５８７９－５８８３を参照されたい）。例えば、図９を参照すると、一実施形態は、Ｔ４Ｅ３Ｖ_Ｌ（配列番号１７）アミノ酸配列に連結された本明細書に記載されるＴ４Ｅ３Ｖ_Ｈ（配列番号１２）アミノ酸配列を含むことができる。
A single-chain Fv (“scFv”) polypeptide molecule is a covalently linked V _H :V _L heterodimer, which consists of the V _H and V _L encoding genes joined by a peptide-encoding linker. can be expressed from a gene fusion containing (See Huston et al. (1988) Proc Nat Acad Sci USA 85(16):5879-5883). For example, referring to FIG. 9, one embodiment can include the T4E3 V _H (SEQ ID NO: 12 ) amino acid sequence described herein linked to the T4E3 V _L (SEQ ID NO: 17 ) amino acid sequence.

抗体は、上記の一本鎖抗体をコードするＤＮＡセグメントを含有するベクターによって発現させることができる。例えば、ベクターは、配列番号２３～２７、３５、３６、２４、もしくは３７～４６（重鎖配列）または配列番号２８～３２もしくは６０～７２（軽鎖配列）のうちの１つ以上を含むことができる。
The antibody can be expressed from a vector containing a DNA segment encoding the single chain antibody described above. For example, the vector comprises one or more of SEQ ID NOs : 23-27, 35, 36, 24, or 37-46 (heavy chain sequences) or SEQ ID NOs: 28-32 or 60-72 (light chain sequences). can be done.

二重特異性抗体
二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、２つの可変ドメインまたはｓｃＦｖユニットを含む抗体であり、結果として、得られる抗体は、２つの異なる抗原を認識する。本発明は、ＭＵＣ１－ＳＥＡおよび第２の抗原を認識する二重特異性抗体を提供する。例示的な第２の抗原には、腫瘍関連抗原（例えば、メソテリン、ＬＩＮＧＯ１）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５）、および細胞表面受容体が含まれる。異なるフォーマットの二重特異性抗体も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗ＭＵＣ１フラグメントおよび第２のフラグメントの各々は、Ｆａｂフラグメント、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体から各々独立して選択される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃフラグメントをさらに含む。本発明の二重特異性抗体は、本明細書に開示されるＭＵＣ１抗体の重鎖および軽鎖の組み合わせまたはｓｃＦｖを含む。例えば、配列番号２３～２７、３５、３６、２４、もしくは３７～４６（重鎖配列）または配列番号２８～３２もしくは６０～７２（軽鎖配列）を参照されたい。
Bispecific Antibodies Bispecific antibodies (bsAbs) are antibodies that contain two variable domains or scFv units, such that the resulting antibody recognizes two different antigens. The present invention provides bispecific antibodies that recognize MUC1-SEA and a second antigen. Exemplary second antigens include tumor-associated antigens (eg, mesothelin, LINGO1), cytokines (eg, IL-12, IL-15), and cell surface receptors. Different formats of bispecific antibodies are also provided herein. In some embodiments, each of the anti-MUC1 fragment and second fragment are each independently selected from a Fab fragment, a single chain variable fragment (scFv), or a single domain antibody. In some embodiments, a bispecific antibody further comprises an Fc fragment. The bispecific antibodies of the invention comprise heavy and light chain combinations or scFvs of the MUC1 antibodies disclosed herein. See, eg, SEQ ID NOs :23-27, 35, 36, 24, or 37-46 (heavy chain sequences) or SEQ ID NOs:28-32 or 60-72 (light chain sequences).

別の実施形態では、二重特異性抗体は、２つ以上の異なる抗体からの重－軽鎖二量体の交換を通して構築されて、第１の重－軽鎖二量体がＭＵＣ１を認識し、第２の重－軽鎖二量体が第２の抗原を認識するハイブリッド抗体を生成することができる。重－軽鎖二量体のメカニズムは、二重特異性分子としても機能するヒトＩｇＧ４の形成に類似している。ＩｇＧ重鎖の二量体化は、各重鎖のＣＨ３ドメインとジスルフィド架橋とのペアリングなどの分子内力によって促進される。ＣＨ３ドメインにおける特定のアミノ酸の存在（Ｒ４０９）は、二量体交換およびＩｇＧ４分子の構築を促進することが示されている。重鎖ペアリングはまた、抗体のヒンジ領域における重鎖間ジスルフィド架橋によってさらに安定化される。具体的には、ＩｇＧ４において、ヒンジ領域は、アミノ酸２２６～２３０で（配列Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（配列番号１３４））を含有する安定なＩｇＧ１ヒンジ領域と比較して）アミノ酸配列Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ（配列番号１３３）を含有する。２２９位のセリンのこの配列の違いは、ＩｇＧ４がヒンジ領域において新規鎖内ジスルフィドを形成する傾向に関連している（ＶａｎｄｅｒＮｅｕｔＫｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ，Ｍ．ｅｔａｌ，２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１７：１５５４－１５５７およびＬａｂｒｉｊｎ，Ａ．Ｆ．ｅｔａｌ，２０１１，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌ１８７：３２３８－３２４６）。
In another embodiment, bispecific antibodies are constructed through the exchange of heavy-light chain dimers from two or more different antibodies, the first heavy-light chain dimer recognizing MUC1. , a second heavy-light chain dimer can generate a hybrid antibody that recognizes a second antigen. The mechanism of heavy-light chain dimerization is similar to the formation of human IgG4, which also functions as a bispecific molecule. Dimerization of IgG heavy chains is facilitated by intramolecular forces such as the pairing of the CH3 domains of each heavy chain with disulfide bridges. The presence of a specific amino acid (R409) in the CH3 domain has been shown to promote dimer exchange and assembly of IgG4 molecules. Heavy chain pairing is also further stabilized by inter-heavy chain disulfide bridges in the hinge region of the antibody. Specifically, in IgG4, the hinge region has the amino acid sequence Cys-Pro -Ser-Cys (SEQ ID NO: 133) . This sequence difference at serine 229 is associated with the propensity of IgG4 to form novel intrachain disulfides in the hinge region (Van der Neut Kolfschoten, M. et al, 2007, Science 317:1554-1557 and Labrijn , AF et al, 2011, Journal of Immunol 187:3238-3246).

したがって、本発明の二重特異性抗体は、ＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９残基およびＭＵＣ１または第２の抗原を認識する抗体のヒンジ領域におけるＣｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ配列（配列番号１３３）の導入を通して作製することができ、その結果、重－軽鎖二量体は、交換して、ＭＵＣ１を認識する１つの重－軽鎖二量体および第２の抗原を認識する第２の重－軽鎖二量体を有する抗体分子を産生し、第２の抗原は、本明細書に開示される任意の抗原である。本明細書に開示されるように、既知のＩｇＧ４分子はまた、重鎖および軽鎖がＭＵＣ１または第２の抗原を認識するように改変され得る。本発明の二重特異性抗体を構築するためのこの方法の使用は、特定の白血球によって発現される補体およびＦｃ受容体などの、免疫応答のエフェクターシステムとの相互作用が不十分であるという点で、Ｆｃ領域が他のＩｇＧサブタイプとは異なるＩｇＧ４分子の固有の特徴のために有益であり得る。この特定の特性によって、これらのＩｇＧ４ベースの二重特異性抗体は、抗体が標的に結合し、標的に関連するシグナル伝達経路を機能的に改変する必要があるが、エフェクター活性を誘導しない、治療用途に魅力的となる。

Thus, the bispecific antibodies of the invention are generated through the introduction of the R409 residue in the CH3 domain and the Cys-Pro-Ser-Cys sequence (SEQ ID NO: 133) in the hinge region of an antibody that recognizes MUC1 or a second antigen. so that the heavy-light chain dimers exchange to form one heavy-light chain dimer that recognizes MUC1 and a second heavy-light chain dimer that recognizes a second antigen. The second antigen is any of the antigens disclosed herein. As disclosed herein, known IgG4 molecules can also be modified such that the heavy and light chains recognize MUC1 or a second antigen. The use of this method to construct the bispecific antibodies of the invention has been shown to interact poorly with effector systems of the immune response, such as complement and Fc receptors expressed by certain leukocytes. In that regard, the Fc region may be beneficial due to unique features of the IgG4 molecule that distinguish it from other IgG subtypes. Due to this particular property, these IgG4-based bispecific antibodies require that the antibody bind to the target and functionally alter target-associated signaling pathways, but do not induce effector activity, therapeutic Attractive for use.