JPWO2020236992A5 - - Google Patents
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Description
本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、説明されているが、そのような実施形態が例示として提供されるにすぎないことは、当業者には明らかであろう。本発明が本明細書内に提供されている特定の実施例によって制限されることは、意図されない。本発明は、前述の明細書を参照して記載されているが、本明細書における実施形態の説明および例示は、制限的な意味で解釈されることを意味するものではない。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変化形、変更、および置換を想起するであろう。さらに、本発明のすべての態様は、本明細書において記載されている特定の表現、構成、または相対的比率に制限されず、それらは、様々な条件および変数に依存することを理解すべきである。本明細書において記載される本発明の実施形態に対する様々な代替形を、本発明の実施に用いることができることを理解されたい。したがって、本発明は、あらゆるそのような代替形、修正形、変化形、または均等物も網羅すべきであることが企図される。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定めること、ならびにこれらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの均等物が、それによって網羅されることが意図される。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ａ）感光性化学部分を含む核酸構築物であって、第１の分子状態にあり、光への曝露の後に、第２の分子状態へと変化するように構成される、核酸構築物と、
ｂ）少なくとも１つの試薬と、
ｃ）少なくとも１つの酵素と
を含む反応チャンバーであって、
前記光が前記核酸構築物に到達することを可能にするように構成される、反応チャンバー。
（項目２）
前記核酸構築物が、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブである、項目１に記載の反応チャンバー。
（項目３）
前記少なくとも１つの酵素が、ポリメラーゼ、逆転写酵素、ターミナルトランスフェラーゼ、エクソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、制限酵素、またはリガーゼである、項目１～２のいずれか一項に記載の反応チャンバー。
（項目４）
前記少なくとも１つの試薬が、１つまたは複数の増幅試薬を含む、項目１～３のいずれか一項に記載の反応チャンバー。
（項目５）
標的核酸をさらに含む、項目１～４のいずれか一項に記載の反応チャンバー。
（項目６）
前記酵素が、前記標的核酸、前記少なくとも１つの試薬、および前記核酸構築物と関連する反応を触媒するように構成される、項目５に記載の反応チャンバー。
（項目７）
前記第１の分子状態にある前記核酸構築物が、前記反応において活性であるように構成される、項目６に記載の反応チャンバー。
（項目８）
前記第２の分子状態にある前記核酸構築物が、前記反応において不活性であるように構成される、項目７に記載の反応チャンバー。
（項目９）
前記第１の分子状態にある前記核酸構築物が、前記反応において不活性であるように構成される、項目６に記載の反応チャンバー。
（項目１０）
前記第２の分子状態にある前記核酸構築物が、前記反応において活性であるように構成される、項目９に記載の反応チャンバー。
（項目１１）
別の感光性化学部分を含む別の核酸構築物をさらに含み、前記別の核酸構築物が、第３の分子状態にあり、前記別の核酸構築物が、別の光への曝露の後に、第４の分子状態へと変化するように構成される、項目１～１０のいずれか一項に記載の反応チャンバー。
（項目１２）
前記別の光が、前記光である、項目１１に記載の反応チャンバー。
（項目１３）
前記第１の分子状態にある前記核酸構築物が、前記反応において活性であるように構成され、前記第３の分子状態にある前記別の核酸構築物が、前記反応において不活性であるように構成される、項目１１または項目１２に記載の反応チャンバー。
（項目１４）
前記第２の分子状態にある前記核酸構築物が、前記反応において不活性であるように構成され、前記第４の分子状態にある前記別の核酸構築物が、前記反応において活性であるように構成される、項目１１～１３のいずれか一項に記載の反応チャンバー。
（項目１５）
前記第１の分子状態にある前記核酸構築物および前記第３の分子状態にある前記別の核酸構築物が、前記反応において活性であるように構成される、項目１１または項目１２に記載の反応チャンバー。
（項目１６）
前記第２の分子状態にある前記核酸構築物および前記第４の分子状態にある前記別の核酸構築物が、前記反応において不活性であるように構成される、項目１１、１２、および１５のいずれか一項に記載の反応チャンバー。
（項目１７）
前記第１の分子状態にある前記核酸構築物および前記第３の分子状態にある前記別の核酸構築物が、前記反応において不活性であるように構成される、項目１１または項目１２に記載の反応チャンバー。
（項目１８）
前記第２の分子状態にある前記核酸構築物および前記第４の分子状態にある前記別の核酸構築物が、前記反応において活性であるように構成される、項目１１、１２、および１７のいずれか一項に記載の反応チャンバー。
（項目１９）
前記酵素が、前記ポリメラーゼであり、前記反応が、ポリメラーゼ連鎖反応であり、前記核酸構築物が、前記オリゴヌクレオチドプライマーである、項目６～１８のいずれか一項に記載の反応チャンバー。
（項目２０）
前記感光性化学部分が、前記核酸構築物の３末端、５末端、または中央に位置する、項目１～１９のいずれか一項に記載の反応チャンバー。
（項目２１）
前記核酸構築物が、追加の感光性化学部分をさらに含む、項目１～２０のいずれか一項に記載の反応チャンバー。
（項目２２）
第５の分子状態が、前記第１の分子状態であり、第６の分子状態が、前記第２の分子状態である項目１～２１のいずれか一項に記載の反応チャンバー。
（項目２３）
密閉チューブ反応チャンバーである、項目１～２２のいずれか一項に記載の反応チャンバー。
（項目２４）
反応を行う方法であって、
反応チャンバーを活性化して、反応を行うステップであって、前記反応チャンバーが、
ａ）第１の分子状態にある感光性化学部分を含む核酸構築物と、
ｂ）少なくとも１つの試薬と、
ｃ）少なくとも１つの酵素と
を含む、ステップと、
前記反応チャンバー内の前記核酸構築物に到達するように光を活性化し、それによって、前記核酸構築物を第２の分子状態へと変化させるステップと
を含む、方法。
（項目２５）
前記核酸構築物が、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記少なくとも１つの酵素が、ポリメラーゼ、逆転写酵素、ターミナルトランスフェラーゼ、エクソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、制限酵素、またはリガーゼである、項目２４または項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記少なくとも１つの試薬が、１つまたは複数の増幅試薬を含む、項目２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記反応チャンバーが、標的核酸をさらに含む、項目２４～２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記酵素が、前記標的核酸の、前記少なくとも１つの試薬および前記核酸構築物との前記反応を触媒する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記第１の分子状態にある前記核酸構築物が、前記反応において活性である、項目２４～２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記第２の分子状態にある前記核酸構築物が、前記反応において不活性である、項目２４～３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記第１の分子状態にある前記核酸構築物が、前記反応において不活性である、項目２４～２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記第２の分子状態にある前記核酸構築物が、前記反応において活性である、項目２４～２９および３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記反応チャンバーが、第３の分子状態にある別の感光性化学部分を含む別の核酸構築物をさらに含み、前記別の核酸構築物が、別の光への曝露の後に、第４の分子状態へと変化するように構成される、項目２４に記載の方法。
（項目３５）
前記別の光が、前記光であり、前記光を前記活性化するステップにより、前記核酸構築物を活性化する、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記別の核酸構築物に到達するように前記別の光を活性化するステップをさらに含む、項目３４または項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記光を前記活性化するステップの後に、前記反応において前記核酸構築物を不活性化するステップをさらに含む、項目３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記光を前記活性化するステップの後または前記別の光を前記活性化するステップの後に、前記別の核酸構築物を活性化するステップをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３９）
前記光を前記活性化するステップまたは前記別の光を前記活性化するステップの後に、前記別の核酸構築物を非活性化するステップをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目４０）
前記光を前記活性化するステップの後に、前記反応において前記核酸構築物を活性化するステップをさらに含む、項目３４～３６に記載の方法。
（項目４１）
前記光を前記活性化するステップまたは前記別の光を前記活性化するステップの後に、前記別の核酸構築物を非活性化するステップをさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目４２）
前記光を前記活性化するステップまたは前記別の光を前記活性化するステップの後に、前記別の核酸構築物を活性化するステップをさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記反応が、伸長、消化、転写、末端転移、またはライゲーションである、項目３４～４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記反応チャンバーにおいて前記反応を行う場合、外部試薬が、前記反応チャンバーに添加されない、項目３４～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記反応チャンバーにおいて前記反応を行う場合、前記核酸構築物、前記少なくとも１つの試薬、または前記少なくとも１つの酵素のいずれも、前記反応チャンバーから除去されない、項目３４～４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記酵素が、前記ポリメラーゼであり、前記反応が、ポリメラーゼ連鎖反応であり、前記核酸構築物が、前記オリゴヌクレオチドプライマーである、項目２４～４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記感光性化学部分が、前記核酸構築物の３末端、５末端、または中央に位置する、項目２４～４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記核酸構築物が、追加の感光性化学部分をさらに含む、項目２４～４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記標的核酸が、メジャー対立遺伝子およびマイナー対立遺伝子を含み、前記反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である、項目２８～４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記核酸構築物が、前記メジャー対立遺伝子に相補的な配列を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記第１の分子状態にある前記核酸構築物が、前記メジャー対立遺伝子のアンプリコンの作製に関して、前記ポリメラーゼ連鎖反応において不活性である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記第２の分子状態にある前記核酸構築物が、前記メジャー対立遺伝子の前記アンプリコンの作製に関して、前記ポリメラーゼ連鎖反応において活性である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記第２の分子状態にある前記核酸構築物が、前記メジャー対立遺伝子の前記アンプリコンの作製に関して、前記ポリメラーゼ連鎖反応において不活性である、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記別の核酸構築物が、前記マイナー対立遺伝子のプライマーであり、前記方法が、前記光を前記活性化するステップの前に前記マイナー対立遺伝子のアンプリコンを産生させるステップをさらに含む、項目４９～５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
ａ）複数のヌクレオチドと、
ｂ）１つまたは複数の光切断性部分と
を含む核酸構築物であって、
前記１つまたは複数の光切断性部分のそれぞれが、独立して、
ａ）前記核酸構築物の３’末端に位置するか、
ｂ）前記核酸構築物の５’末端に位置するか、
ｃ）前記３’末端と前記５’末端との間に位置するか、
ｄ）核酸塩基上もしくはそれに接続して位置するか、
ｅ）リボース上もしくはそれに接続して位置するか、
ｆ）前記複数のヌクレオチドの２つの連続したメンバーの間にそれらに接続して位置するか、または
ｇ）それらの組合せである、核酸構築物。
（項目５６）
前記核酸構築物が、生化学的反応において不活性であるように構成され、前記生化学的反応が、ポリメラーゼに触媒される鎖伸長、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ライゲーション、ターミナルトランスフェラーゼ伸長、ハイブリダイゼーション、エクソヌクレアーゼ消化、エンドヌクレアーゼ消化、または制限消化である、項目５５に記載の核酸構築物。
（項目５７）
前記核酸構築物が、前記１つまたは複数の光切断性部分の光切断の後に、核酸分子を形成するように構成され、前記核酸分子が、前記生化学的反応において活性であるように構成される、項目５５または項目５６に記載の核酸構築物。
（項目５８）
前記核酸構築物が、プライマーであり、前記生化学的反応が、ポリメラーゼに触媒される鎖伸長である、項目５５～５７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
（項目５９）
前記１つまたは複数の光切断性部分が、前記３’末端に位置する、項目５８に記載の核酸構築物。
（項目６０）
前記１つまたは複数の光切断性部分のそれぞれが、独立して、前記３’末端と前記５’末端との間および選択された核酸塩基上に位置する、項目５８に記載の核酸構築物。
（項目６１）
前記１つまたは複数の光切断性部分のそれぞれが、独立して、前記３’末端と前記５’末端との間および前記複数のヌクレオチドの前記２つの連続したメンバーの間に位置する、項目５８に記載の核酸構築物。
（項目６２）
前記３’末端が、前記生化学的反応において不活性であるように構成される、項目６１に記載の核酸構築物。
（項目６３）
第１の核酸セクションおよび前記第１の核酸セクションに相補的な第２の核酸セクションを含み、ヘアピン構造を形成するように構成される、項目６１に記載の核酸構築物。
（項目６４）
前記第１の核酸セクションおよび前記第２の核酸セクションが、前記１つまたは複数の光切断性部分を含まない、項目６３に記載の核酸構築物。
（項目６５）
項目５５～６４のいずれか一項に記載の前記核酸構築物を使用して、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長を行う方法であって、
ａ）前記核酸構築物、少なくとも１つの鋳型核酸分子、ポリメラーゼを含む反応混合物を用意するステップであって、前記核酸構築物が、前記鋳型核酸分子と相補的な配列を有する、ステップと、
ｂ）前記反応混合物を、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長の条件に供するステップと、
ｃ）前記反応混合物または前記核酸構築物に光の光子を照射し、それによって、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長を実行するステップと
を含む、方法。
（項目６６）
前記ｂ）の供するステップが、前記ｃ）の実行するステップを作動させない、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記核酸構築物が、前記ｃ）の照射するステップの前に、前記反応混合物中でインタクトなままである、項目６５または項目６６に記載の方法。
（項目６８）
ｃ）において、前記１つまたは複数の光切断性部分を切断するステップをさらに含む、項目６５～６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
ｃ）において、前記核酸分子を形成するステップをさらに含む、項目６５～６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記ｃ）の実行するステップが、ｃ）において前記照射するステップの後に形成される前記核酸分子を、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長のプライマーとして使用するステップを含む、項目６５～６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記反応混合物が、別のプライマーをさらに含み、前記別のプライマーが、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長において活性である、項目６５～７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記別のプライマーが、前記ｃ）の照射するステップの前に、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長において活性である、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記ｂ）のポリメラーゼに触媒される鎖伸長により、前記別のプライマーを含むアンプリコンが産生される、項目７１または項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＰＣＲ）であり、前記方法が、ｃ）において、
１）項目５５～６４のいずれか一項に記載の前記核酸構築物の存在下において、２つまたはそれを上回るヌクレオチド配列に、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長を実行して、流体中に２つまたはそれを上回るアンプリコンを産生させるステップと、
２）独立して処理可能な位置に複数の核酸プローブを有する固体表面を含むアレイを用意するステップであって、前記アレイが、前記流体と接触するように構成される、ステップと、
３）前記流体が前記アレイと接触している間に、前記２つまたはそれを上回るアンプリコンの、前記複数の核酸プローブのうちの２つまたはそれを上回る核酸プローブへのハイブリダイゼーションを測定して、アンプリコンハイブリダイゼーション測定値を得るステップであって、前記アンプリコンが、クエンチャーを含む、ステップと
をさらに含む、項目６５～７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＰＣＲ）であり、前記方法が、ｃ）において、
１）表面および複数の異なるプローブを有する固体支持体を含むアレイを用意するステップであって、前記複数の異なるプローブが、異なる処理可能な位置で前記表面に固定されており、各処理可能な位置が、蛍光部分を含む、ステップと、
２）複数のヌクレオチド配列を含む試料にＰＣＲ増幅を実行するステップであって、前記ＰＣＲ増幅が、流体中で実行され、（ｉ）項目５５～６４のいずれか一項に記載の前記核酸構築物が、各核酸配列のＰＣＲプライマーであり、クエンチャーを含み、（ｉｉ）前記流体が、前記複数の異なるプローブと接触しており、前記ＰＣＲ増幅で産生されたアンプリコンが、前記複数のプローブとハイブリダイズし、それによって、前記蛍光部分からのシグナルをクエンチする、ステップと、
３）前記処理可能な位置のそれぞれにおいて前記蛍光部分からの前記シグナルを経時的に検出するステップと、
４）経時的に検出された前記シグナルを使用し、前記流体中の前記アンプリコンの量を決定するステップと、
５）前記流体中の前記アンプリコンの前記量を使用して、前記試料中の前記ヌクレオチド配列の量を決定するステップと
をさらに含む、項目６５～７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＰＣＲ）であり、前記方法が、ｃ）において、
１）少なくとも１つの鋳型核酸分子を含有する核酸試料、プライマー対、およびポリメラーゼを含む、前記反応混合物を用意するステップであって、前記プライマー対が、前記鋳型核酸分子との配列相補性を有し、前記プライマー対が、限定プライマーおよび過剰プライマーを含み、前記限定プライマーおよび前記過剰プライマーのうちの少なくとも１つが、項目５５～６４のいずれか一項に記載の前記核酸構築物である、ステップと、
２）前記反応混合物を、前記鋳型核酸分子および前記限定プライマーの増幅産物として少なくとも１つの標的核酸分子を得るのに十分な条件下において、前記Ｑ－ＰＣＲに供するステップであって、少なくとも１つの標的核酸分子が、前記限定プライマーを含む、ステップと、
３）前記反応混合物を、（ｉ）異なる個別に処理可能な位置で基板の表面に固定された複数のプローブを含む前記基板であって、前記プローブが、前記限定プライマーとの配列相補性を有し、前記限定プライマーを捕捉することができる、基板と、（ｉｉ）前記処理可能な位置からの少なくとも１つのシグナルを検出するように構成される検出器アレイであって、前記少なくとも１つのシグナルが、前記限定プライマーが前記複数のプローブの個々のプローブと結合していることを示す、検出器アレイとを有するセンサーアレイと接触させるステップと、
４）前記検出器アレイを使用して、前記核酸増幅反応中の複数の時点で、１つまたは複数の前記処理可能な位置からの前記少なくとも１つのシグナルを検出するステップと、
５）前記限定プライマーが前記複数のプローブの前記個々のプローブと結合していることを示す前記少なくとも１つのシグナルに基づいて、前記標的核酸分子を検出するステップと
をさらに含む、項目６５～７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
項目５５～６４のいずれか一項に記載の前記核酸構築物を使用して、少なくとも１つの標的核酸分子をアッセイするためのシステムであって、
１）少なくとも１つの鋳型核酸分子を含有する核酸試料、前記鋳型核酸分子に相補的な配列を有するプライマー対、およびポリメラーゼを含む反応混合物を含む反応チャンバーであって、前記プライマー対が、限定プライマーおよび過剰プライマーを含み、前記限定プライマーおよび前記過剰プライマーのうちの少なくとも１つが、項目５５～６４のいずれか一項に記載の前記核酸構築物であり、前記反応混合物を含む前記反応チャンバーが、前記反応混合物に対する核酸増幅反応を促進して、少なくとも１つの標的核酸分子を前記鋳型核酸の増幅産物として得るように構成される、反応チャンバーと、
２）（ｉ）異なる個別に処理可能な位置で基板の表面に固定された複数のプローブを含む前記基板であって、前記プローブが、前記限定プライマーとの配列相補性を有し、前記限定プライマーを捕捉することができる、基板と、（ｉｉ）前記処理可能な位置からの少なくとも１つのシグナルを検出するように構成される検出器アレイであって、前記少なくとも１つのシグナルが、前記限定プライマーが前記複数のプローブの個々のプローブと結合していることを示す、検出器アレイとを含む、センサーアレイと、
３）前記センサーアレイに連結され、（ｉ）前記反応混合物を前記核酸増幅反応に供し、（ｉｉ）前記核酸増幅反応中の複数の時点で、前記処理可能な位置のうちの１つまたは複数からの前記少なくとも１つのシグナルを検出するようにプログラミングされる、コンピュータープロセッサーと
を備える、システム。
（項目７８）
ａ）複数のヌクレオチドと、
ｂ）１つまたは複数の光切断性部分と
を含む核酸構築物であって、
前記１つまたは複数の光切断性部分のそれぞれが、独立して、
ａ）前記核酸構築物の３’末端と前記核酸構築物の５’末端との間に位置するか、
ｂ）核酸塩基上もしくはそれに接続して位置するか、
ｃ）リボース上もしくはそれに接続して位置するか、
ｄ）前記複数のヌクレオチドの２つの連続したメンバーの間にそれらに接続して位置するか、または
ｅ）それらの組合せである、核酸構築物。
（項目７９）
前記核酸構築物が、生化学的反応において活性であるように構成され、前記生化学的反応が、ポリメラーゼに触媒される鎖伸長、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ライゲーション、ターミナルトランスフェラーゼ伸長、ハイブリダイゼーション、エクソヌクレアーゼ消化、エンドヌクレアーゼ消化、または制限消化である、項目７８に記載の核酸構築物。
（項目８０）
前記核酸構築物が、前記１つまたは複数の光切断性部分の光切断の後に、核酸分子を形成するように構成され、前記核酸分子が、前記生化学的反応において不活性である、項目７８および項目７９に記載の核酸構築物。
（項目８１）
前記核酸構築物が、前記１つまたは複数の光切断性部分の光切断のすぐ後に、核酸分子を形成するように構成され、前記核酸分子が、前記生化学的反応において活性であり、前記核酸分子が、前記３’末端の近傍に位置する、項目７８および項目７９に記載の核酸構築物。
（項目８２）
前記核酸構築物が、プライマーであり、前記生化学的反応が、ポリメラーゼに触媒される鎖伸長である、項目７８～８１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
（項目８３）
前記１つまたは複数の光切断性部分のそれぞれが、独立して、前記３’末端と前記５’末端との間および選択された核酸塩基上に位置する、項目８２に記載の核酸構築物。
（項目８４）
前記１つまたは複数の光切断性部分の非存在下において、ヘアピン構造を形成するように構成され、それによって、前記１つまたは複数の光切断性部分の前記非存在下において、前記プライマーとして不活性となっている、項目８３に記載の核酸構築物。
（項目８５）
前記１つまたは複数の光切断性部分のそれぞれが、独立して、前記３’末端と前記５’末端との間および前記複数のヌクレオチドの前記２つの連続したメンバーの間に位置する、項目８２に記載の核酸構築物。
（項目８６）
前記核酸構築物が、鋳型核酸分子に相補的な第１の配列を含み、前記第１の配列が、前記３’末端またはその近傍に位置する、項目８２～８５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
（項目８７）
前記核酸構築物が、前記鋳型核酸分子に相補的な第２の配列をさらに含み、前記第２の配列が、前記５’末端またはその近傍に位置し、前記１つまたは複数の光切断性部分のうちの少なくとも１つが、前記第１の配列と前記第２の配列との間に位置する、項目８６に記載の核酸構築物。
（項目８８）
前記１つまたは複数の光切断性部分が、少なくとも１つのヌクレオチドによって、前記第１の配列および／または前記第２の配列から分離している、項目８７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
（項目８９）
前記第１の配列および前記第２の配列の両方が前記鋳型核酸分子とハイブリダイズした場合に、前記第１の配列と前記第２の配列との間でヘアピンループを形成するように構成される、項目８７または項目８８に記載の核酸構築物。
（項目９０）
前記第２の配列が、５’と５’との連結で、前記核酸構築物の残りへの接続を含み、前記第２の配列が、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長において非伸長性であるように構成される、項目８７～８９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
（項目９１）
項目７８～９０のいずれか一項に記載の前記核酸構築物を使用して、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長を行う方法であって、
ａ）前記核酸構築物、前記鋳型核酸分子、ポリメラーゼを含む、反応混合物を用意するステップであって、前記核酸構築物が、少なくとも前記第１の配列を含む、ステップと、
ｂ）前記反応混合物を、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長の条件に供し、それによって、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長を実行するステップと、
ｃ）前記反応混合物または前記核酸構築物に光の光子を照射し、それによって、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長を停止させるステップと
を含む、方法。
（項目９２）
ｃ）において、前記１つまたは複数の光切断性部分を切断するステップをさらに含む、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
ｃ）において、前記照射するステップの後に、前記核酸分子を形成するステップをさらに含み、前記核酸分子が、前記鋳型核酸分子から解離する、項目９１または項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記核酸分子が、ヘアピン構造を形成し、前記ヘアピン構造が、前記第１の配列の少なくとも一部を含む、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記核酸分子が、前記第１の配列を含む、項目９３に記載の方法。
（項目９６）
光作動型ネステッドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法であって、
ａ）第１のプライマー対、第２のプライマー対、内部核酸配列を含む鋳型核酸分子、およびポリメラーゼを含む、反応混合物を用意するステップであって、前記第１のプライマー対の各メンバーが、独立して、項目７８～９０のいずれか一項に記載の前記核酸構築物であり、前記第２のプライマー対の各メンバーが、独立して、項目５５～６４のいずれか一項に記載の前記核酸構築物であり、前記内部核酸配列が、前記鋳型核酸分子内で入れ子になっている、ステップと、
ｂ）前記反応混合物を、前記第１のプライマー対を使用して第１の鎖伸長の条件に供して、前記鋳型核酸分子を増幅させ、それによって、前記鋳型核酸または前記鋳型核酸分子の相補的配列のアンプリコンを形成するステップと、
ｃ）前記反応混合物に光の光子を照射し、それによって、前記第１のプライマー対を非活性化させ、前記第１の伸長を停止させ、前記第２のプライマー対を活性化し、前記活性化された第２のプライマー対を使用して第２の鎖伸長を開始させ、前記内部核酸配列または前記内部核酸配列の相補的配列のアンプリコンを形成するステップと
を含み、
ａ）～ｃ）が、密閉チューブ様式で行われる、
方法。
（項目９７）
前記光作動型ＰＣＲが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＰＣＲ）であり、前記方法が、
１）前記第１のプライマー対および第２のプライマー対の存在下において、２つまたはそれを上回るヌクレオチド配列に、前記光作動型ＰＣＲを実行して、流体中に２つまたはそれを上回るアンプリコンを産生させるステップと、
２）独立して処理可能な位置に複数の核酸プローブを有する固体表面を含むアレイを用意するステップであって、前記アレイが、前記流体と接触するように構成される、ステップと、
３）前記流体が前記アレイと接触している間に、前記２つまたはそれを上回るアンプリコンの、前記複数の核酸プローブのうちの２つまたはそれを上回る核酸プローブへのハイブリダイゼーションを測定して、アンプリコンハイブリダイゼーション測定値を得るステップであって、前記アンプリコンが、クエンチャーを含む、ステップと
をさらに含む、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
前記光作動型ＰＣＲが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＰＣＲ）であり、前記方法が、
１）表面および複数の異なるプローブを有する固体支持体を含むアレイを用意するステップであって、前記複数の異なるプローブが、異なる処理可能な位置で前記表面に固定されており、各処理可能な位置が、蛍光部分を含む、ステップと、
２）複数のヌクレオチド配列を含む試料にＰＣＲ増幅を実行するステップであって、前記ＰＣＲ増幅が、流体中で実行され、（ｉ）各核酸配列の前記第１のプライマー対および前記第２のプライマー対のそれぞれが、クエンチャーを含み、（ｉｉ）前記流体が、前記複数の異なるプローブと接触しており、前記ＰＣＲ増幅において産生されたアンプリコンが、前記複数のプローブとハイブリダイズし、それによって、前記蛍光部分からのシグナルをクエンチする、ステップと、
３）前記処理可能な位置のそれぞれにおいて前記蛍光部分からの前記シグナルを経時的に検出するステップと、
４）経時的に検出された前記シグナルを使用し、前記流体中の前記アンプリコンの量を決定するステップと、
５）前記流体中の前記アンプリコンの前記量を使用して、前記試料中の前記ヌクレオチド配列の量を決定するステップと
をさらに含む、項目９６に記載の方法。
（項目９９）
前記光作動型ＰＣＲが、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＰＣＲ）であり、前記方法が、
１）少なくとも１つの鋳型核酸分子を含有する核酸試料、プライマー対、およびポリメラーゼを含む、前記反応混合物を用意するステップであって、前記プライマー対が、前記鋳型核酸分子との配列相補性を有し、前記プライマー対が、限定プライマーおよび過剰プライマーを含み、前記限定プライマーおよび前記過剰プライマーのうちの少なくとも１つが、項目５５～６４のいずれか一項に記載の前記核酸構築物である、ステップと、
２）前記反応混合物を、前記鋳型核酸分子および前記限定プライマーの増幅産物として少なくとも１つの標的核酸分子を得るのに十分な条件下において、前記Ｑ－ＰＣＲに供するステップであって、少なくとも１つの標的核酸分子が、前記限定プライマーを含む、ステップと、
３）前記反応混合物を、（ｉ）異なる個別に処理可能な位置で基板の表面に固定された複数のプローブを含む前記基板であって、前記プローブが、前記限定プライマーとの配列相補性を有し、前記限定プライマーを捕捉することができる、基板と、（ｉｉ）前記処理可能な位置からの少なくとも１つのシグナルを検出するように構成される検出器アレイであって、前記少なくとも１つのシグナルが、前記限定プライマーが前記複数のプローブの個々のプローブと結合していることを示す、検出器アレイとを有するセンサーアレイと接触させるステップと、
４）前記検出器アレイを使用して、前記核酸増幅反応中の複数の時点で、１つまたは複数の前記処理可能な位置からの前記少なくとも１つのシグナルを検出するステップと、
５）前記限定プライマーが前記複数のプローブの前記個々のプローブと結合していることを示す前記少なくとも１つのシグナルに基づいて、前記標的核酸分子を検出するステップと
をさらに含む、項目９６に記載の方法。
（項目１００）
ａ）複数のヌクレオチドと、
ｂ）１つまたは複数の光切断性部分と
を含む核酸構築物であって、
前記１つまたは複数の光切断性部分のそれぞれが、独立して、
ａ）前記核酸構築物の３’末端と前記核酸構築物の５’末端との間に位置するか、
ｂ）核酸塩基上もしくはそれに接続して位置するか、
ｃ）リボース上もしくはそれに接続して位置するか、
ｄ）前記複数のヌクレオチドの２つの連続したメンバーの間にそれらに接続して位置するか、または
ｅ）それらの組合せである、核酸構築物。
（項目１０１）
プローブであり、標的核酸分子とのハイブリダイゼーションにおいて不活性であるように構成される、項目１００に記載の核酸構築物。
（項目１０２）
前記核酸構築物が、前記１つまたは複数の光切断性部分の光切断の後に、核酸分子を形成するように構成され、前記核酸分子が、前記標的核酸分子との前記ハイブリダイゼーションにおいて活性であるように構成される、項目１００または項目１０１に記載の核酸構築物。
（項目１０３）
１つの遊離末端を含む、項目１００～１０２のいずれか一項に記載の核酸構築物。
（項目１０４）
固定末端またはポリメラーゼに触媒される鎖伸長において非伸長性である末端を含む、項目１００～１０３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
（項目１０５）
前記１つまたは複数の光切断性部分のそれぞれが、独立して、前記３’末端と前記５’末端との間および選択された核酸塩基上に位置し、前記選択された核酸塩基が、前記１つまたは複数の光切断性部分の非存在下において、前記標的核酸分子とハイブリダイズするように構成される、項目１０２～１０４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
（項目１０６）
前記１つまたは複数の光切断性部分のそれぞれが、独立して、前記３’末端と前記５’末端との間および前記複数のヌクレオチドの前記２つの連続したメンバーの間に位置する、項目１０２～１０４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
（項目１０７）
第１の核酸セクションおよび前記第１の核酸セクションに相補的な第２の核酸セクションを含み、ヘアピン構造を形成するように構成される、項目１０６に記載の核酸構築物。
（項目１０８）
前記第１の核酸セクションおよび前記第２の核酸セクションが、前記１つまたは複数の光切断性部分を含まない、項目１０７に記載の核酸構築物。
（項目１０９）
項目１００～１０８のいずれか一項に記載の前記核酸構築物を使用して、前記ハイブリダイゼーションを行う方法であって、
ａ）前記核酸構築物および前記標的核酸分子を含む反応混合物を用意するステップと、
ｂ）前記反応混合物を、前記ハイブリダイゼーションの条件に供するステップと、
ｃ）前記反応混合物または前記核酸構築物に光の光子を照射し、それによって、前記ハイブリダイゼーションを実行するステップと
を含む、方法。
（項目１１０）
前記ｂ）の供するステップが、前記ｃ）の実行するステップを作動させない、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記核酸構築物が、前記ｃ）の照射するステップの前に、前記反応混合物中でインタクトなままである、項目１０９または項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
ｃ）において、前記１つまたは複数の光切断性部分を切断するステップをさらに含む、項目１０９～１１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
ｃ）において、前記核酸分子を形成するステップをさらに含む、項目１０９～１１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１４）
前記照射するステップが、前記核酸構築物の前記ヘアピン構造を破断させ、前記核酸分子を形成する、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
ａ）複数のヌクレオチドと、
ｂ）１つまたは複数の光切断性部分と
を含む核酸構築物であって、
前記１つまたは複数の光切断性部分のそれぞれが、独立して、
ａ）前記核酸構築物の３’末端と前記核酸構築物の５’末端との間に位置するか、
ｂ）核酸塩基上もしくはそれに接続して位置するか、
ｃ）リボース上もしくはそれに接続して位置するか、
ｄ）前記複数のヌクレオチドの２つの連続したメンバーの間にそれらに接続して位置するか、または
ｅ）それらの組合せである、核酸構築物。
（項目１１６）
プローブであり、標的核酸分子とのハイブリダイゼーションにおいて活性であるように構成される、項目１１５に記載の核酸構築物。
（項目１１７）
前記核酸構築物が、前記１つまたは複数の光切断性部分の光切断の後に、核酸分子を形成するように構成され、前記核酸分子が、前記標的核酸分子との前記ハイブリダイゼーションにおいて不活性であるように構成される、項目１１５または項目１１６に記載の核酸構築物。
（項目１１８）
１つの遊離末端を含む、項目１１５～１１７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
（項目１１９）
固定末端またはポリメラーゼに触媒される鎖伸長において非伸長性である末端を含む、項目１１５～１１８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
（項目１２０）
前記１つまたは複数の光切断性部分のそれぞれが、独立して、前記３’末端と前記５’末端との間および前記複数のヌクレオチドの前記２つの連続したメンバーの間に位置する、項目１１５～１１９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
（項目１２１）
前記１つまたは複数の光切断性部分のそれぞれが、独立して、前記３’末端と前記５’末端との間および選択された核酸塩基上に位置し、前記選択された核酸塩基が、前記１つまたは複数の光切断性部分の非存在下において、前記核酸構築物の別の核酸塩基とハイブリダイズするように構成される、項目１１５～１１９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
（項目１２２）
第１の核酸セクションおよび前記第１の核酸セクションに相補的な第２の核酸セクションを含み、前記１つまたは複数の光切断性部分の非存在下において、ヘアピン構造を形成するように構成される、項目１１５～１１９および項目１１２のいずれか一項に記載の核酸構築物。
（項目１２３）
前記第１の核酸セクションまたは前記第２の核酸セクションが、前記１つまたは複数の光切断性部分を含む、項目１２２に記載の核酸構築物。
（項目１２４）
項目１１５～１２３のいずれか一項に記載の前記核酸構築物を使用して、前記ハイブリダイゼーションを行う方法であって、
ａ）前記核酸構築物および前記標的核酸分子を含む反応混合物を用意するステップと、
ｂ）前記反応混合物を、前記ハイブリダイゼーションの条件に供するステップと、
ｃ）前記反応混合物または前記核酸構築物に光の光子を照射し、それによって、前記ハイブリダイゼーションを停止させるステップと
を含む、方法。
（項目１２５）
ｃ）において、前記１つまたは複数の光切断性部分を切断するステップをさらに含む、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
ｃ）において、前記核酸分子を形成するステップをさらに含む、項目１２４または項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
ｃ）において、前記核酸分子に前記ヘアピン構造を形成するステップをさらに含む、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
ポリメラーゼに触媒される鎖伸長を行うステップをさらに含み、
１）前記反応混合物が、ポリメラーゼおよびプライマーをさらに含み、ｂ）において、前記核酸構築物が、ｂ）において前記標的核酸分子とハイブリダイズし、
２）ｂ）において、前記反応混合物を、前記プライマーを使用して、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長の条件に供し、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長が、前記核酸構築物が前記標的核酸分子と二重鎖を形成する位置またはその近傍で停止し、
３）前記ｃ）の照射するステップの後に、前記二重鎖を除去し、前記核酸構築物と以前にハイブリダイズしていた一本鎖配列を露出させ、それによって、ポリメラーゼに触媒される鎖伸長が継続され、前記一本鎖配列を通じて伸長することが可能となる、項目１２４～１２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２９）
前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＰＣＲ）であり、前記方法が、
１）項目１１５～１２３のいずれか一項に記載の前記核酸構築物の存在下において、項目１２８に従って、前記標的核酸分子を含む２つまたはそれを上回るヌクレオチド配列に、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長を実行し、それによって、流体中に２つまたはそれを上回るアンプリコンを産生させるステップと、
２）独立して処理可能な位置に複数の核酸プローブを有する固体表面を含むアレイを用意するステップであって、前記アレイが、前記流体と接触するように構成される、ステップと、
３）前記流体が前記アレイと接触している間に、前記２つまたはそれを上回るアンプリコンの、前記複数の核酸プローブのうちの２つまたはそれを上回る核酸プローブへのハイブリダイゼーションを測定して、アンプリコンハイブリダイゼーション測定値を得るステップであって、前記アンプリコンが、クエンチャーを含む、ステップと
をさらに含む、項目１２８に記載の方法。
（項目１３０）
前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＰＣＲ）であり、前記方法が、
１）表面および複数の異なるプローブを有する固体支持体を含むアレイを用意するステップであって、前記複数の異なるプローブが、異なる処理可能な位置で前記表面に固定されており、各処理可能な位置が、蛍光部分を含む、ステップと、
２）前記標的核酸分子を含む複数のヌクレオチド配列を含む試料にＰＣＲ増幅を実行するステップであって、前記ＰＣＲ増幅が、項目１１５～１２３のいずれか一項に記載の前記核酸構築物を含む流体中で行われ、（ｉ）各核酸配列のＰＣＲプライマーが、クエンチャーを含み、（ｉｉ）前記流体が、前記複数の異なるプローブと接触しており、前記ＰＣＲ増幅において産生されたアンプリコンが、前記複数のプローブとハイブリダイズし、それによって、前記蛍光部分からのシグナルをクエンチし、前記照射するステップが、前記ＰＣＲ中に行われる、ステップと、
３）前記処理可能な位置のそれぞれにおいて前記蛍光部分からの前記シグナルを経時的に検出するステップと、
４）経時的に検出された前記シグナルを使用し、前記流体中の前記アンプリコンの量を決定するステップと、
５）前記流体中の前記アンプリコンの前記量を使用して、前記試料中の前記ヌクレオチド配列の量を決定するステップと
をさらに含む、項目１２８に記載の方法。
（項目１３１）
前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＰＣＲ）であり、前記方法が、
６）前記標的核酸分子を含む少なくとも１つの鋳型核酸分子を含有する核酸試料、プライマー対、およびポリメラーゼを含む、前記反応混合物を用意するステップであって、前記プライマー対が、前記少なくとも１つの鋳型核酸分子との配列相補性を有し、前記プライマー対が、限定プライマーおよび過剰プライマーを含み、前記反応混合物が、項目１１５～１２３のいずれか一項に記載の前記核酸構築物のうちの少なくとも１つをさらに含む、ステップと、
７）前記反応混合物を、前記鋳型核酸分子および前記限定プライマーの増幅産物を得るのに十分な条件下において、前記Ｑ－ＰＣＲに供するステップであって、アンプリコンが、前記限定プライマーを含む、ステップと、
８）前記反応混合物を、（ｉ）異なる個別に処理可能な位置で基板の表面に固定された複数のプローブを含む前記基板であって、前記プローブが、前記限定プライマーとの配列相補性を有し、前記限定プライマーを捕捉することができる、基板と、（ｉｉ）前記処理可能な位置からの少なくとも１つのシグナルを検出するように構成されるであって、前記少なくとも１つのシグナルが、前記限定プライマーが前記複数のプローブの個々のプローブと結合していることを示す、検出器アレイとを有するセンサーアレイと接触させるステップと、
９）前記検出器アレイを使用して、前記核酸増幅反応中の複数の時点で、１つまたは複数の前記処理可能な位置からの前記少なくとも１つのシグナルを検出するステップと、
１０）前記限定プライマーが前記複数のプローブの前記個々のプローブと結合していることを示す前記少なくとも１つのシグナルに基づいて、前記標的核酸分子を検出するステップと
をさらに含む、項目１２８に記載の方法。
（項目１３２）
ａ）複数のヌクレオチドと、
ｂ）前記核酸構築物の５’末端における１つまたは複数の光切断性部分であって、前記核酸構築物の前記５’末端が、エクソヌクレアーゼによる切断に耐性であるように構成される、光切断性部分と
を含む核酸構築物であって、
前記１つまたは複数の光切断性部分のそれぞれが、独立して、
ａ）核酸塩基上もしくはそれに接続して位置するか、
ｂ）リボース上もしくはそれに接続して位置するか、または
ｃ）それらの組合せである、核酸構築物。
（項目１３３）
前記核酸構築物が、前記１つまたは複数の光切断性部分の光切断の後に、核酸分子を形成するように構成され、前記核酸分子が、前記エクソヌクレアーゼによる前記切断に耐性ではない、項目１３２に記載の核酸構築物。
（項目１３４）
標的核酸分子にハイブリダイズし、前記エクソヌクレアーゼによる前記切断に耐性なままであるように構成される、項目１３２または項目１３３に記載の核酸構築物。
（項目１３５）
ポリメラーゼに触媒される鎖伸長を行う方法であって、
ａ）項目１３２～１３４のいずれか一項に記載の前記核酸構築物、前記標的核酸分子、プライマー、ポリメラーゼを含む、反応混合物を用意するステップであって、前記標的核酸分子が、前記核酸構築物に相補的な核酸配列を含む、ステップと、
ｂ）前記反応混合物を、前記標的核酸分子を鋳型として使用して、前記プライマーの前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長の条件に供するステップと、
ｃ）前記反応混合物または前記核酸構築物に光の光子を照射し、それによって、前記核酸配列を通じた前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長を実行するステップと
を含む、方法。
（項目１３６）
前記ｂ）の供するステップが、前記ｃ）の実行するステップを作動させない、項目１３５に記載の方法。
（項目１３７）
前記核酸構築物が、前記ｃ）の照射するステップの前に、前記反応混合物中でインタクトなままである、項目１３５または項目１３６に記載の方法。
（項目１３８）
ｃ）において、前記１つまたは複数の光切断性部分を切断するステップをさらに含む、項目１３５～１３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３９）
ｃ）において、前記核酸分子を形成するステップをさらに含む、項目１３５～１３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４０）
前記ｃ）の実行するステップが、ｃ）において前記照射するステップの後に形成される前記核酸分子を、前記エクソヌクレアーゼによって消化させるステップを含み、前記ポリメラーゼが、前記エクソヌクレアーゼである、項目１３５～１３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４１）
前記ｃ）の実行するステップが、前記照射するステップの後および／または前記消化するステップの後に、前記プライマーを、前記核酸配列を通じて伸長させるステップを含む、項目１３５～１４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４２）
項目７８、７９、８１、８２、および８５～８８のいずれか一項に記載の前記核酸構築物を使用して、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長を行う方法であって、
ａ）前記核酸構築物、前記鋳型核酸分子、ポリメラーゼを含む、反応混合物を用意するステップであって、前記核酸構築物が、少なくとも、前記３’末端またはその近傍に位置する前記第１の配列および前記５’末端またはその近傍に位置する前記第２の配列を含み、前記第１の配列が、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長において活性である、ステップと、
ｂ）前記反応混合物を、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長の条件に供し、それによって、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長を実行し、前記第１の配列および前記第２の配列の両方の配列、または前記第１の配列および前記第２の配列の両方に相補的な配列を含む、複数の第１のアンプリコンを産生させるステップと、
ｃ）前記反応混合物または前記核酸構築物に光の光子を照射し、それによって、前記核酸構築物を切断し、前記第１の配列または前記第１の配列に相補的な配列を含む複数の第２のアンプリコンを産生させるステップであって、前記複数の第２のアンプリコンのそれぞれが、前記第２の配列も前記第２の配列に相補的な配列も含有しないことを条件とする、ステップと
を含む、方法。
（項目１４３）
項目５５～６４、７８～９０、１００～１０８、および１１５～１２３のいずれか一項に記載の前記核酸構築物のうちの少なくとも１つを使用して、ポリメラーゼに触媒される鎖伸長を行う方法であって、
ａ）前記核酸構築物、前記鋳型核酸分子、ポリメラーゼを含む、反応混合物を用意するステップと、
ｂ）前記反応混合物を、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長の条件に供するステップと、
ｃ）前記反応混合物または前記核酸構築物に光の光子を照射し、
それによって、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長を実行するステップと
を含み、
前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長が、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＱＰＣＲ、またはｑＲＴ－ＰＣＲである、方法。
（項目１４４）
前記核酸構築物のうちの前記少なくとも１つが、独立して、
ａ）前記ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＱＰＣＲ、もしくはｑＲＴ－ＰＣＲのプライマー、
ｂ）前記ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＱＰＣＲ、もしくはｑＲＴ－ＰＣＲの溶液相プローブ、または
ｃ）前記ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＱＰＣＲ、もしくはｑＲＴ－ＰＣＲの固定プローブである、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
マイクロアレイデータを定量する自動化マイクロアレイシステムであって、
ａ）表面および複数の異なるプローブを有する固体支持体であって、前記複数の異なるプローブが、前記表面に固定されている、固体支持体と、
ｂ）検体を含む流体体積であって、前記流体体積が、前記固体支持体と接触しており、前記複数の異なるプローブのうちの少なくとも１つおよび前記検体が、項目５５～６４、７８～９０、１００～１０８、および１１５～１２３のいずれか一項に記載の前記核酸構築物のうちの少なくとも１つを含む、流体体積と、
ｃ）前記流体体積が前記固体支持体と接触している間に、前記固体支持体上の複数のスポットのそれぞれから複数の時点で測定されるシグナルを検出するように構成される、検出器または検出アセンブリーであって、前記シグナルが、光学シグナルまたは電気化学シグナルである、検出器または検出アセンブリーと、
ｄ）シグナルをマイクロアレイデータに変換するように構成されるコンピューターであって、前記マイクロアレイデータを、処理方法に従って、前記コンピューターによって処理させるように構成される命令をさらに含み、前記処理方法は、
１）（ｉ）分析表示、および（ｉｉ）前記固体支持体に少なくとも１つの標準的なプローブを使用した前記マイクロアレイのキャリブレーションによるものを含む、前記複数の異なるプローブと前記検体との間の相互作用の推定値を決定するステップと、
２）ハイブリダイゼーション、交差ハイブリダイゼーション、および状態間での非束縛遷移確率をモデリングすることを含むマルコフ連鎖モデルでの推定値を利用する、確率行列を生成するステップと、
３）前記検出器または前記検出器アセンブリーを使用して、親和性に基づくアレイデータを得るステップと、
４）前記親和性に基づくアレイデータを、前記確率行列に適用するステップと、
５）非特異的相互作用をノイズではなく干渉と考えることによって、前記非特異的相互作用を利用しそれを抑制しない、最大尤度推定アルゴリズム、最大事後確率基準、制約付き最小二乗計算法、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、最適化アルゴリズムを適用するステップと、
６）最適化された親和性に基づくアレイデータを、ユーザーに出力するステップであって、前記最適化された親和性に基づくアレイデータが、前記検出器または前記検出器アセンブリーを使用することによって得られる前記親和性に基づくアレイデータと比較して、改善されたシグナル対ノイズ比を有する、ステップと
を含む、コンピューターと
を備える、システム。
（項目１４６）
順に、
項目５５～６４、７８～９０、１００～１０８、および１１５～１２３のいずれか一項に記載の前記核酸構築物のうちの少なくとも１つを含む、分子認識層と、
光学層と、
サンドイッチ構成で組み込まれるセンサー層と
を備える一体型バイオセンサーアレイであって、
ａ）前記分子認識層が、異なる独立して処理可能な位置に付着した複数の異なるプローブを含み、前記独立して処理可能な位置のそれぞれが、前記分子認識層の単一の側面に位置する単一の源から直接的に励起光子束を受容するように構成され、前記分子認識層が、前記光学層に光を伝達し、前記複数の異なるプローブのうちの１つが、前記核酸構築物のうちの前記少なくとも１つを含み、
ｂ）前記光学層が、光学フィルター層を含み、前記光学層が、前記分子認識層から前記センサー層へ光を伝達し、それによって、前記伝達された光がフィルタリングされ、
ｃ）前記センサー層が、前記光学層から伝達された前記フィルタリングされた光を検出する光学センサーアレイを含み、前記センサー層が、ＣＭＯＳ製造プロセスを使用して製造されたセンサー素子を含み、前記分子認識層、前記光学層、および前記センサー層が、前記分子層が前記光学層と接触し、前記光学層が前記センサー層と接触する一体型構造を構成する、一体型バイオセンサーアレイ。
While preferred embodiments of the present invention have been shown and described herein, it will be apparent to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. It is not intended that the invention be limited by the specific examples provided herein. Although the invention has been described with reference to the foregoing specification, the descriptions and illustrations of the embodiments herein are not meant to be construed in a limiting sense. Numerous variations, modifications, and substitutions will occur to those skilled in the art without departing from the invention. Furthermore, it should be understood that all aspects of the invention are not limited to the specific expressions, configurations, or relative proportions set forth herein, which are dependent upon various conditions and variables. be. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed in practicing the invention. It is therefore contemplated that the invention shall cover any such alternatives, modifications, variations or equivalents. It is intended that the following claims define the scope of the invention and that methods and structures within the scope of these claims and their equivalents be covered thereby.
In certain embodiments, for example, the following items are provided.
(Item 1)
a) a nucleic acid construct comprising a photosensitive chemical moiety, the nucleic acid construct being in a first molecular state and configured to change to a second molecular state following exposure to light;
b) at least one reagent;
c) at least one enzyme and
A reaction chamber comprising
A reaction chamber configured to allow said light to reach said nucleic acid construct.
(Item 2)
The reaction chamber of item 1, wherein the nucleic acid construct is an oligonucleotide primer or probe.
(Item 3)
3. The reaction chamber of any one of items 1-2, wherein said at least one enzyme is a polymerase, reverse transcriptase, terminal transferase, exonuclease, endonuclease, restriction enzyme or ligase.
(Item 4)
4. The reaction chamber of any one of items 1-3, wherein said at least one reagent comprises one or more amplification reagents.
(Item 5)
5. The reaction chamber of any one of items 1-4, further comprising a target nucleic acid.
(Item 6)
6. The reaction chamber of item 5, wherein the enzyme is configured to catalyze a reaction associated with the target nucleic acid, the at least one reagent, and the nucleic acid construct.
(Item 7)
7. The reaction chamber of item 6, wherein said nucleic acid construct in said first molecular state is configured to be active in said reaction.
(Item 8)
8. The reaction chamber of item 7, wherein said nucleic acid construct in said second molecular state is configured to be inert in said reaction.
(Item 9)
7. The reaction chamber of item 6, wherein said nucleic acid construct in said first molecular state is configured to be inert in said reaction.
(Item 10)
10. The reaction chamber of item 9, wherein said nucleic acid construct in said second molecular state is configured to be active in said reaction.
(Item 11)
further comprising another nucleic acid construct comprising another photosensitive chemical moiety, wherein said another nucleic acid construct is in a third molecular state, and said another nucleic acid construct is in a fourth state after exposure to another light; 11. The reaction chamber of any one of items 1-10, configured to change to a molecular state.
(Item 12)
12. The reaction chamber of item 11, wherein said another light is said light.
(Item 13)
The nucleic acid construct in the first molecular state is configured to be active in the reaction and the another nucleic acid construct in the third molecular state is configured to be inactive in the reaction. 13. The reaction chamber of item 11 or item 12, wherein
(Item 14)
The nucleic acid construct in the second molecular state is configured to be inactive in the reaction and the another nucleic acid construct in the fourth molecular state is configured to be active in the reaction. 14. The reaction chamber according to any one of items 11-13.
(Item 15)
13. The reaction chamber of item 11 or item 12, wherein said nucleic acid construct in said first molecular state and said another nucleic acid construct in said third molecular state are configured to be active in said reaction.
(Item 16)
Any of items 11, 12, and 15, wherein said nucleic acid construct in said second molecular state and said another nucleic acid construct in said fourth molecular state are configured to be inert in said reaction. A reaction chamber according to paragraph 1.
(Item 17)
13. The reaction chamber of item 11 or item 12, wherein the nucleic acid construct in the first molecular state and the another nucleic acid construct in the third molecular state are configured to be inert in the reaction. .
(Item 18)
Any one of items 11, 12 and 17, wherein said nucleic acid construct in said second molecular state and said another nucleic acid construct in said fourth molecular state are configured to be active in said reaction. A reaction chamber as described above.
(Item 19)
19. The reaction chamber of any one of items 6-18, wherein the enzyme is the polymerase, the reaction is the polymerase chain reaction, and the nucleic acid construct is the oligonucleotide primer.
(Item 20)
20. The reaction chamber of any one of items 1-19, wherein said photosensitive chemical moiety is located at the 3-end, 5-end or middle of said nucleic acid construct.
(Item 21)
21. The reaction chamber of any one of items 1-20, wherein said nucleic acid construct further comprises an additional photosensitive chemical moiety.
(Item 22)
22. The reaction chamber according to any one of items 1 to 21, wherein a fifth molecular state is said first molecular state and a sixth molecular state is said second molecular state.
(Item 23)
23. The reaction chamber of any one of items 1-22, which is a closed tube reaction chamber.
(Item 24)
A method of conducting a reaction comprising:
activating a reaction chamber to conduct a reaction, the reaction chamber comprising:
a) a nucleic acid construct comprising a photosensitive chemical moiety in a first molecular state;
b) at least one reagent;
c) at least one enzyme and
a step comprising
activating light to reach the nucleic acid construct in the reaction chamber, thereby changing the nucleic acid construct to a second molecular state;
A method, including
(Item 25)
25. The method of item 24, wherein the nucleic acid construct is an oligonucleotide primer or probe.
(Item 26)
26. The method of item 24 or item 25, wherein the at least one enzyme is a polymerase, reverse transcriptase, terminal transferase, exonuclease, endonuclease, restriction enzyme, or ligase.
(Item 27)
27. The method of any one of items 24-26, wherein said at least one reagent comprises one or more amplification reagents.
(Item 28)
28. The method of any one of items 24-27, wherein the reaction chamber further comprises a target nucleic acid.
(Item 29)
29. The method of item 28, wherein said enzyme catalyzes said reaction of said target nucleic acid with said at least one reagent and said nucleic acid construct.
(Item 30)
30. The method of any one of items 24-29, wherein said nucleic acid construct in said first molecular state is active in said reaction.
(Item 31)
31. The method of any one of items 24-30, wherein said nucleic acid construct in said second molecular state is inactive in said reaction.
(Item 32)
30. The method of any one of items 24-29, wherein said nucleic acid construct in said first molecular state is inactive in said reaction.
(Item 33)
33. The method of any one of items 24-29 and 32, wherein said nucleic acid construct in said second molecular state is active in said reaction.
(Item 34)
said reaction chamber further comprising another nucleic acid construct comprising another photosensitive chemical moiety in a third molecular state, said another nucleic acid construct being in a fourth molecular state after exposure to another light; 25. The method of item 24, wherein the method is configured to vary from
(Item 35)
35. The method of item 34, wherein said another light is said light and said activating said light activates said nucleic acid construct.
(Item 36)
36. The method of item 34 or item 35, further comprising activating said another light to reach said another nucleic acid construct.
(Item 37)
37. The method of any one of items 34-36, further comprising inactivating said nucleic acid construct in said reaction after said activating said light.
(Item 38)
35. The method of item 34, further comprising activating said another nucleic acid construct after said activating said light or after said activating said another light.
(Item 39)
35. The method of item 34, further comprising deactivating said another nucleic acid construct after said activating said light or said activating said another light.
(Item 40)
37. The method of items 34-36, further comprising activating said nucleic acid construct in said reaction after said activating said light.
(Item 41)
31. The method of item 30, further comprising deactivating said another nucleic acid construct after said activating said light or said activating said another light.
(Item 42)
42. The method of item 41, further comprising activating said another nucleic acid construct after said activating said light or said activating said another light.
(Item 43)
43. The method of any one of items 34-42, wherein the reaction is extension, digestion, transcription, terminal transfer, or ligation.
(Item 44)
44. The method of any one of items 34-43, wherein when performing the reaction in the reaction chamber, no external reagents are added to the reaction chamber.
(Item 45)
45. The method of any one of items 34-44, wherein none of the nucleic acid construct, the at least one reagent, or the at least one enzyme is removed from the reaction chamber when performing the reaction in the reaction chamber. .
(Item 46)
46. The method of any one of items 24-45, wherein the enzyme is the polymerase, the reaction is the polymerase chain reaction, and the nucleic acid construct is the oligonucleotide primer.
(Item 47)
47. The method of any one of items 24-46, wherein said photosensitive chemical moiety is located at the 3-end, 5-end or middle of said nucleic acid construct.
(Item 48)
48. The method of any one of items 24-47, wherein said nucleic acid construct further comprises an additional photolabile chemical moiety.
(Item 49)
49. The method of any one of items 28-48, wherein the target nucleic acid comprises a major allele and a minor allele and the reaction is the polymerase chain reaction.
(Item 50)
50. The method of item 49, wherein said nucleic acid construct comprises a sequence complementary to said major allele.
(Item 51)
51. The method of item 50, wherein said nucleic acid construct in said first molecular state is inactive in said polymerase chain reaction with respect to making an amplicon of said major allele.
(Item 52)
52. The method of item 51, wherein said nucleic acid construct in said second molecular state is active in said polymerase chain reaction for making said amplicon of said major allele.
(Item 53)
52. The method of item 51, wherein said nucleic acid construct in said second molecular state is inactive in said polymerase chain reaction with respect to making said amplicon of said major allele.
(Item 54)
Items 49-53, wherein said another nucleic acid construct is a primer for said minor allele and said method further comprises producing an amplicon for said minor allele prior to said activating said light. The method according to any one of .
(Item 55)
a) a plurality of nucleotides;
b) one or more photocleavable moieties;
A nucleic acid construct comprising
each of the one or more photocleavable moieties independently:
a) located at the 3' end of said nucleic acid construct,
b) located at the 5′ end of said nucleic acid construct, or
c) located between said 3′ end and said 5′ end, or
d) located on or connected to a nucleobase;
e) located on or connected to ribose,
f) is located between two consecutive members of said plurality of nucleotides and connected to them, or
g) Nucleic acid constructs which are combinations thereof.
(Item 56)
The nucleic acid construct is configured to be inert in a biochemical reaction, the biochemical reaction being polymerase-catalyzed chain elongation, polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). ), ligation, terminal transferase extension, hybridization, exonuclease digestion, endonuclease digestion, or restriction digestion.
(Item 57)
The nucleic acid construct is configured to form a nucleic acid molecule after photocleavage of the one or more photocleavable moieties, wherein the nucleic acid molecule is configured to be active in the biochemical reaction. , item 55 or item 56.
(Item 58)
58. The nucleic acid construct of any one of items 55-57, wherein said nucleic acid construct is a primer and said biochemical reaction is polymerase-catalyzed chain elongation.
(Item 59)
59. The nucleic acid construct of item 58, wherein said one or more photocleavable moieties are located at said 3' terminus.
(Item 60)
59. The nucleic acid construct of item 58, wherein each of said one or more photocleavable moieties is independently located between said 3' end and said 5' end and on selected nucleobases.
(Item 61)
Item 58, wherein each of said one or more photocleavable moieties is independently located between said 3′ end and said 5′ end and between said two contiguous members of said plurality of nucleotides. 4. A nucleic acid construct according to .
(Item 62)
62. The nucleic acid construct of item 61, wherein said 3' end is configured to be inert in said biochemical reaction.
(Item 63)
62. The nucleic acid construct of item 61, comprising a first nucleic acid section and a second nucleic acid section complementary to said first nucleic acid section and configured to form a hairpin structure.
(Item 64)
64. The nucleic acid construct of item 63, wherein said first nucleic acid section and said second nucleic acid section do not comprise said one or more photocleavable moieties.
(Item 65)
A method of performing polymerase-catalyzed chain extension using the nucleic acid construct of any one of items 55-64, comprising:
a) providing a reaction mixture comprising said nucleic acid construct, at least one template nucleic acid molecule, a polymerase, said nucleic acid construct having a sequence complementary to said template nucleic acid molecule;
b) subjecting said reaction mixture to conditions for said polymerase-catalyzed chain elongation;
c) irradiating said reaction mixture or said nucleic acid construct with photons of light, thereby effecting said polymerase-catalyzed chain elongation;
A method, including
(Item 66)
66. The method of item 65, wherein the providing step of b) does not activate the performing step of c).
(Item 67)
67. The method of item 65 or item 66, wherein the nucleic acid construct remains intact in the reaction mixture prior to the irradiating step of c).
(Item 68)
68. The method of any one of items 65-67, further comprising in c) cleaving said one or more photocleavable moieties.
(Item 69)
69. The method of any one of items 65-68, further comprising, in c), forming said nucleic acid molecule.
(Item 70)
Any of items 65-69, wherein the performing step of c) comprises using the nucleic acid molecule formed after the irradiating step in c) as a primer for the polymerase-catalyzed chain elongation. The method according to item 1.
(Item 71)
71. The method of any one of items 65-70, wherein said reaction mixture further comprises another primer, said another primer being active in said polymerase-catalyzed chain elongation.
(Item 72)
72. The method of item 71, wherein said another primer is active in said polymerase-catalyzed chain extension prior to said step of irradiating in c).
(Item 73)
73. The method of item 71 or item 72, wherein the polymerase-catalyzed chain extension of b) produces an amplicon comprising said another primer.
(Item 74)
The polymerase-catalyzed chain elongation is quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR), and the method comprises in c)
1) in the presence of said nucleic acid construct according to any one of items 55-64, two or more nucleotide sequences are subjected to said polymerase-catalyzed chain extension to produce two in a fluid; producing an amplicon that is equal to or greater than
2) providing an array comprising a solid surface having a plurality of nucleic acid probes in independently processable locations, said array being configured to contact said fluid;
3) measuring hybridization of said two or more amplicons to two or more nucleic acid probes of said plurality of nucleic acid probes while said fluid is in contact with said array; and obtaining an amplicon hybridization measurement, wherein the amplicon comprises a quencher;
74. The method of any one of items 65-73, further comprising
(Item 75)
The polymerase-catalyzed chain elongation is quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR), and the method comprises in c)
1) providing an array comprising a solid support having a surface and a plurality of different probes, said plurality of different probes being immobilized on said surface at different addressable locations, each addressable location comprises a fluorescent moiety; and
2) performing PCR amplification on a sample comprising a plurality of nucleotide sequences, said PCR amplification being performed in a fluid, and (i) said nucleic acid construct according to any one of items 55-64 comprising , PCR primers for each nucleic acid sequence and comprising a quencher; lysing, thereby quenching the signal from said fluorescent moiety;
3) detecting the signal from the fluorescent moiety at each of the addressable locations over time;
4) using the signal detected over time to determine the amount of the amplicon in the fluid;
5) using said amount of said amplicon in said fluid to determine the amount of said nucleotide sequence in said sample;
74. The method of any one of items 65-73, further comprising
(Item 76)
The polymerase-catalyzed chain elongation is quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR), and the method comprises in c)
1) providing said reaction mixture comprising a nucleic acid sample containing at least one template nucleic acid molecule, a primer pair and a polymerase, said primer pair having sequence complementarity with said template nucleic acid molecule; , said primer pair comprises a limiting primer and an excess primer, at least one of said limiting primer and said excess primer being said nucleic acid construct according to any one of items 55-64;
2) subjecting said reaction mixture to said Q-PCR under conditions sufficient to obtain at least one target nucleic acid molecule as an amplification product of said template nucleic acid molecule and said limiting primer, wherein at least one target the nucleic acid molecule comprises the limiting primer;
3) subjecting the reaction mixture to (i) the substrate comprising a plurality of probes immobilized on the surface of the substrate at different individually addressable locations, the probes having sequence complementarity to the limiting primers; and (ii) a detector array configured to detect at least one signal from the addressable locations, wherein the at least one signal is and a detector array indicating that the limiting primers are bound to individual probes of the plurality of probes;
4) using the detector array to detect the at least one signal from one or more of the processable locations at multiple time points during the nucleic acid amplification reaction;
5) detecting said target nucleic acid molecule based on said at least one signal indicative of binding of said limiting primer to said individual probe of said plurality of probes;
74. The method of any one of items 65-73, further comprising
(Item 77)
A system for assaying at least one target nucleic acid molecule using the nucleic acid construct of any one of items 55-64,
1) a reaction chamber containing a reaction mixture comprising a nucleic acid sample containing at least one template nucleic acid molecule, a primer pair having a sequence complementary to said template nucleic acid molecule, and a polymerase, wherein said primer pair comprises a limiting primer and comprising an excess primer, wherein at least one of said limiting primer and said excess primer is said nucleic acid construct according to any one of items 55-64, said reaction chamber comprising said reaction mixture comprising said reaction mixture; a reaction chamber configured to facilitate a nucleic acid amplification reaction for obtaining at least one target nucleic acid molecule as an amplification product of said template nucleic acid;
2)(i) said substrate comprising a plurality of probes immobilized on the surface of said substrate at different individually addressable locations, said probes having sequence complementarity to said defining primers, said defining primers and (ii) a detector array configured to detect at least one signal from said addressable locations, said at least one signal being said limited primers a sensor array comprising a detector array indicating binding to individual probes of the plurality of probes;
3) coupled to the sensor array, (i) subjecting the reaction mixture to the nucleic acid amplification reaction, and (ii) at multiple times during the nucleic acid amplification reaction, from one or more of the addressable locations a computer processor programmed to detect said at least one signal of
A system comprising:
(Item 78)
a) a plurality of nucleotides;
b) one or more photocleavable moieties;
A nucleic acid construct comprising
each of the one or more photocleavable moieties independently:
a) located between the 3′ end of said nucleic acid construct and the 5′ end of said nucleic acid construct, or
b) located on or connected to a nucleobase;
c) located on or connected to the ribose,
d) is located between two consecutive members of said plurality of nucleotides and connected to them, or
e) Nucleic acid constructs which are combinations thereof.
(Item 79)
wherein said nucleic acid construct is configured to be active in a biochemical reaction, said biochemical reaction being polymerase catalyzed chain elongation, polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) , ligation, terminal transferase extension, hybridization, exonuclease digestion, endonuclease digestion, or restriction digestion.
(Item 80)
78, wherein said nucleic acid construct is configured to form a nucleic acid molecule after photocleavage of said one or more photocleavable moieties, said nucleic acid molecule being inert in said biochemical reaction; and A nucleic acid construct according to item 79.
(Item 81)
wherein said nucleic acid construct is configured to form a nucleic acid molecule upon photocleavage of said one or more photocleavable moieties, said nucleic acid molecule being active in said biochemical reaction, said nucleic acid molecule is located near said 3' end.
(Item 82)
82. The nucleic acid construct of any one of items 78-81, wherein said nucleic acid construct is a primer and said biochemical reaction is polymerase-catalyzed chain elongation.
(Item 83)
83. The nucleic acid construct of item 82, wherein each of said one or more photocleavable moieties is independently located between said 3' end and said 5' end and on selected nucleobases.
(Item 84)
configured to form a hairpin structure in the absence of said one or more photocleavable moieties, thereby disabling as said primer in said absence of said one or more photocleavable moieties. 84. The nucleic acid construct of item 83, which is active.
(Item 85)
Item 82, wherein each of said one or more photocleavable moieties is independently located between said 3′ end and said 5′ end and between said two contiguous members of said plurality of nucleotides. 4. A nucleic acid construct according to .
(Item 86)
86. The nucleic acid of any one of items 82-85, wherein said nucleic acid construct comprises a first sequence complementary to a template nucleic acid molecule, said first sequence being located at or near said 3' terminus. construction.
(Item 87)
The nucleic acid construct further comprises a second sequence complementary to the template nucleic acid molecule, wherein the second sequence is located at or near the 5' end of the one or more photocleavable moieties. 87. The nucleic acid construct of item 86, at least one of which is located between said first sequence and said second sequence.
(Item 88)
88. The nucleic acid construct of any one of items 87, wherein said one or more photocleavable moieties are separated from said first sequence and/or said second sequence by at least one nucleotide.
(Item 89)
configured to form a hairpin loop between the first sequence and the second sequence when both the first sequence and the second sequence hybridize to the template nucleic acid molecule , item 87 or item 88.
(Item 90)
wherein said second sequence comprises a connection to the rest of said nucleic acid construct at a 5' to 5' junction, said second sequence being non-extendable in said polymerase catalyzed chain elongation. 90. The nucleic acid construct of any one of items 87-89, which is composed of:
(Item 91)
A method of performing polymerase-catalyzed chain extension using the nucleic acid construct of any one of items 78-90, comprising:
a) providing a reaction mixture comprising said nucleic acid construct, said template nucleic acid molecule, a polymerase, said nucleic acid construct comprising at least said first sequence;
b) subjecting said reaction mixture to conditions of said polymerase-catalyzed chain elongation, thereby effecting said polymerase-catalyzed chain elongation;
c) irradiating said reaction mixture or said nucleic acid construct with photons of light, thereby terminating said polymerase-catalyzed chain elongation;
A method, including
(Item 92)
92. The method of item 91, further comprising in c) cleaving said one or more photocleavable moieties.
(Item 93)
93. The method of item 91 or item 92, wherein in c), after said irradiating step, further comprising forming said nucleic acid molecule, said nucleic acid molecule dissociating from said template nucleic acid molecule.
(Item 94)
94. The method of item 93, wherein said nucleic acid molecule forms a hairpin structure, said hairpin structure comprising at least part of said first sequence.
(Item 95)
94. The method of item 93, wherein said nucleic acid molecule comprises said first sequence.
(Item 96)
A method of performing a light-activated nested polymerase chain reaction (PCR), comprising:
a) providing a reaction mixture comprising a first primer pair, a second primer pair, a template nucleic acid molecule comprising an internal nucleic acid sequence, and a polymerase, wherein each member of said first primer pair independently and said nucleic acid construct according to any one of items 78-90, wherein each member of said second primer pair independently comprises said nucleic acid according to any one of items 55-64 a construct, wherein said internal nucleic acid sequence is nested within said template nucleic acid molecule;
b) subjecting said reaction mixture to conditions of first strand elongation using said first primer pair to amplify said template nucleic acid molecule, thereby amplifying said template nucleic acid or the complement of said template nucleic acid molecule; forming an amplicon of the sequences;
c) irradiating said reaction mixture with photons of light, thereby deactivating said first primer pair, terminating said first extension, activating said second primer pair, said activating initiating second strand elongation using the second primer pair to form an amplicon of said internal nucleic acid sequence or a sequence complementary to said internal nucleic acid sequence;
including
a) to c) are performed in a closed tube fashion,
Method.
(Item 97)
The light-activated PCR is quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR), and the method comprises
1) performing said light-activated PCR on two or more nucleotide sequences in the presence of said first primer pair and second primer pair to produce two or more amplicons in a fluid; and
2) providing an array comprising a solid surface having a plurality of nucleic acid probes in independently processable locations, said array being configured to contact said fluid;
3) measuring hybridization of the two or more amplicons to two or more of the plurality of nucleic acid probes while the fluid is in contact with the array; and obtaining an amplicon hybridization measurement, wherein the amplicon comprises a quencher;
97. The method of item 96, further comprising:
(Item 98)
The light-activated PCR is quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR), and the method comprises
1) providing an array comprising a solid support having a surface and a plurality of different probes, said plurality of different probes being immobilized on said surface at different addressable locations, each addressable location comprises a fluorescent moiety; and
2) performing PCR amplification on a sample comprising a plurality of nucleotide sequences, said PCR amplification being performed in a fluid; (i) said first primer pair and said second primer for each nucleic acid sequence; each of the pairs comprises a quencher; (ii) said fluid is in contact with said plurality of different probes, and amplicons produced in said PCR amplification hybridize with said plurality of probes, thereby quenching the signal from said fluorescent moiety;
3) detecting the signal from the fluorescent moiety at each of the addressable locations over time;
4) using the signal detected over time to determine the amount of the amplicon in the fluid;
5) using said amount of said amplicon in said fluid to determine the amount of said nucleotide sequence in said sample;
97. The method of item 96, further comprising:
(Item 99)
The light-activated PCR is quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR), and the method comprises
1) providing said reaction mixture comprising a nucleic acid sample containing at least one template nucleic acid molecule, a primer pair and a polymerase, said primer pair having sequence complementarity with said template nucleic acid molecule; , said primer pair comprises a limiting primer and an excess primer, at least one of said limiting primer and said excess primer being said nucleic acid construct according to any one of items 55-64;
2) subjecting said reaction mixture to said Q-PCR under conditions sufficient to obtain at least one target nucleic acid molecule as an amplification product of said template nucleic acid molecule and said limiting primer, wherein at least one target the nucleic acid molecule comprises the limiting primer;
3) subjecting the reaction mixture to (i) the substrate comprising a plurality of probes immobilized on the surface of the substrate at different individually addressable locations, the probes having sequence complementarity to the limiting primers; and (ii) a detector array configured to detect at least one signal from the addressable locations, wherein the at least one signal is and a detector array indicating that the limiting primers are bound to individual probes of the plurality of probes;
4) using the detector array to detect the at least one signal from one or more of the processable locations at multiple time points during the nucleic acid amplification reaction;
5) detecting said target nucleic acid molecule based on said at least one signal indicative of binding of said limiting primer to said individual probe of said plurality of probes;
97. The method of item 96, further comprising:
(Item 100)
a) a plurality of nucleotides;
b) one or more photocleavable moieties;
A nucleic acid construct comprising
each of the one or more photocleavable moieties independently:
a) located between the 3′ end of said nucleic acid construct and the 5′ end of said nucleic acid construct, or
b) located on or connected to a nucleobase;
c) located on or connected to the ribose,
d) is located between two consecutive members of said plurality of nucleotides and connected to them, or
e) Nucleic acid constructs which are combinations thereof.
(Item 101)
101. The nucleic acid construct of item 100, which is a probe and is configured to be inert upon hybridization with a target nucleic acid molecule.
(Item 102)
wherein said nucleic acid construct is configured to form a nucleic acid molecule after photocleavage of said one or more photocleavable moieties, said nucleic acid molecule being active upon said hybridization with said target nucleic acid molecule; 102. The nucleic acid construct of item 100 or item 101, which is composed of:
(Item 103)
103. A nucleic acid construct according to any one of items 100-102, comprising one free end.
(Item 104)
104. The nucleic acid construct of any one of items 100-103, comprising fixed ends or ends that are non-extendible in polymerase-catalyzed chain elongation.
(Item 105)
Each of said one or more photocleavable moieties is independently located between said 3′ end and said 5′ end and on a selected nucleobase, said selected nucleobase 105. The nucleic acid construct of any one of items 102-104, configured to hybridize with said target nucleic acid molecule in the absence of one or more photocleavable moieties.
(Item 106)
Item 102, wherein each of said one or more photocleavable moieties is independently located between said 3′ end and said 5′ end and between said two contiguous members of said plurality of nucleotides. 104. The nucleic acid construct of any one of claims 1-104.
(Item 107)
107. The nucleic acid construct of item 106, comprising a first nucleic acid section and a second nucleic acid section complementary to said first nucleic acid section and configured to form a hairpin structure.
(Item 108)
108. The nucleic acid construct of item 107, wherein said first nucleic acid section and said second nucleic acid section do not comprise said one or more photocleavable moieties.
(Item 109)
A method of performing the hybridization using the nucleic acid construct of any one of items 100-108, comprising:
a) providing a reaction mixture comprising said nucleic acid construct and said target nucleic acid molecule;
b) subjecting said reaction mixture to said hybridization conditions;
c) irradiating said reaction mixture or said nucleic acid construct with photons of light, thereby performing said hybridization;
A method, including
(Item 110)
110. The method of item 109, wherein the providing step of b) does not activate the performing step of c).
(Item 111)
111. The method of item 109 or item 110, wherein said nucleic acid construct remains intact in said reaction mixture prior to said irradiating step of c).
(Item 112)
112. The method of any one of items 109-111, further comprising in c) cleaving said one or more photocleavable moieties.
(Item 113)
113. The method of any one of items 109-112, further comprising forming said nucleic acid molecule in c).
(Item 114)
114. The method of item 113, wherein said irradiating step breaks said hairpin structure of said nucleic acid construct to form said nucleic acid molecule.
(Item 115)
a) a plurality of nucleotides;
b) one or more photocleavable moieties;
A nucleic acid construct comprising
each of the one or more photocleavable moieties independently:
a) located between the 3′ end of said nucleic acid construct and the 5′ end of said nucleic acid construct, or
b) located on or connected to a nucleobase;
c) located on or connected to the ribose,
d) is located between two consecutive members of said plurality of nucleotides and connected to them, or
e) Nucleic acid constructs which are combinations thereof.
(Item 116)
116. The nucleic acid construct of item 115, which is a probe and is configured to be active upon hybridization with a target nucleic acid molecule.
(Item 117)
said nucleic acid construct is configured to form a nucleic acid molecule after photocleavage of said one or more photocleavable moieties, said nucleic acid molecule being inactive upon said hybridization with said target nucleic acid molecule 117. The nucleic acid construct of item 115 or item 116, which is configured to:
(Item 118)
118. A nucleic acid construct according to any one of items 115-117, comprising one free end.
(Item 119)
119. The nucleic acid construct of any one of items 115-118, comprising fixed ends or ends that are non-extendible in polymerase-catalyzed chain elongation.
(Item 120)
Item 115, wherein each of said one or more photocleavable moieties is independently located between said 3′ end and said 5′ end and between said two contiguous members of said plurality of nucleotides. A nucleic acid construct according to any one of claims 1-119.
(Item 121)
Each of said one or more photocleavable moieties is independently located between said 3′ end and said 5′ end and on a selected nucleobase, said selected nucleobase 120. The nucleic acid construct of any one of items 115-119, configured to hybridize with another nucleobase of said nucleic acid construct in the absence of one or more photocleavable moieties.
(Item 122)
comprising a first nucleic acid section and a second nucleic acid section complementary to said first nucleic acid section, configured to form a hairpin structure in the absence of said one or more photocleavable moieties , items 115-119 and item 112.
(Item 123)
123. The nucleic acid construct of item 122, wherein said first nucleic acid section or said second nucleic acid section comprises said one or more photocleavable moieties.
(Item 124)
A method of performing said hybridization using said nucleic acid construct according to any one of items 115-123, comprising:
a) providing a reaction mixture comprising said nucleic acid construct and said target nucleic acid molecule;
b) subjecting said reaction mixture to said hybridization conditions;
c) irradiating said reaction mixture or said nucleic acid construct with photons of light, thereby stopping said hybridization;
A method, including
(Item 125)
125. The method of item 124, further comprising in c) cleaving the one or more photocleavable moieties.
(Item 126)
126. The method of item 124 or item 125, further comprising in c) forming said nucleic acid molecule.
(Item 127)
127. The method of item 126, further comprising forming said hairpin structure in said nucleic acid molecule in c).
(Item 128)
further comprising performing polymerase-catalyzed chain elongation;
1) said reaction mixture further comprises a polymerase and primers, and in b) said nucleic acid construct hybridizes with said target nucleic acid molecule in b);
2) in b), subjecting the reaction mixture to conditions for polymerase-catalyzed chain elongation using the primers, wherein the polymerase-catalyzed chain elongation causes the nucleic acid construct to bind to the target nucleic acid molecule; terminating at or near the position of duplex formation,
3) after the irradiating step of c), the duplex is removed, exposing single-stranded sequences previously hybridized to the nucleic acid construct, thereby allowing polymerase-catalyzed chain elongation; 128. The method of any one of items 124-127, wherein the method is continued and allowed to extend through said single-stranded sequence.
(Item 129)
The polymerase-catalyzed chain extension is quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR), and the method comprises
1) in the presence of said nucleic acid construct according to any one of items 115-123, according to item 128, to two or more nucleotide sequences comprising said target nucleic acid molecule, said polymerase-catalyzed chain extension thereby producing two or more amplicons in the fluid;
2) providing an array comprising a solid surface having a plurality of nucleic acid probes in independently processable locations, said array being configured to contact said fluid;
3) measuring hybridization of said two or more amplicons to two or more nucleic acid probes of said plurality of nucleic acid probes while said fluid is in contact with said array; and obtaining an amplicon hybridization measurement, wherein the amplicon comprises a quencher;
129. The method of item 128, further comprising:
(Item 130)
The polymerase-catalyzed chain extension is quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR), and the method comprises
1) providing an array comprising a solid support having a surface and a plurality of different probes, said plurality of different probes being immobilized on said surface at different addressable locations, each addressable location comprises a fluorescent moiety; and
2) performing PCR amplification on a sample comprising a plurality of nucleotide sequences comprising said target nucleic acid molecule, said PCR amplification in a fluid comprising said nucleic acid construct according to any one of items 115-123. wherein (i) the PCR primers for each nucleic acid sequence comprise a quencher, (ii) the fluid is in contact with the plurality of different probes, and the amplicons produced in the PCR amplification comprise the hybridizing with a plurality of probes to thereby quench the signal from said fluorescent moiety and said illuminating is performed during said PCR;
3) detecting the signal from the fluorescent moiety at each of the addressable locations over time;
4) using the signal detected over time to determine the amount of the amplicon in the fluid;
5) using said amount of said amplicon in said fluid to determine the amount of said nucleotide sequence in said sample;
129. The method of item 128, further comprising:
(Item 131)
The polymerase-catalyzed chain extension is quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR), and the method comprises
6) providing said reaction mixture comprising a nucleic acid sample containing at least one template nucleic acid molecule comprising said target nucleic acid molecule, a primer pair, and a polymerase, said primer pair comprising said at least one template nucleic acid molecule; having sequence complementarity with a molecule, said primer pair comprising a limiting primer and an excess primer, said reaction mixture comprising at least one of said nucleic acid constructs according to any one of items 115-123. further comprising a step;
7) subjecting said reaction mixture to said Q-PCR under conditions sufficient to obtain amplification products of said template nucleic acid molecule and said limiting primers, wherein amplicons comprise said limiting primers; and,
8) subjecting the reaction mixture to (i) the substrate comprising a plurality of probes immobilized on the surface of the substrate at different individually addressable locations, the probes having sequence complementarity to the limiting primers; and (ii) a substrate capable of capturing said defining primer; and (ii) configured to detect at least one signal from said addressable location, said at least one signal contacting with a sensor array having a detector array indicating that primers are bound to individual probes of the plurality of probes;
9) using the detector array to detect the at least one signal from one or more of the processable locations at multiple time points during the nucleic acid amplification reaction;
10) detecting said target nucleic acid molecule based on said at least one signal indicating binding of said limiting primer to said individual probe of said plurality of probes;
129. The method of item 128, further comprising:
(Item 132)
a) a plurality of nucleotides;
b) one or more photocleavable moieties at the 5′ end of said nucleic acid construct, configured such that said 5′ end of said nucleic acid construct is resistant to cleavage by an exonuclease. part and
A nucleic acid construct comprising
each of the one or more photocleavable moieties independently:
a) located on or connected to a nucleobase,
b) located on or connected to the ribose, or
c) Nucleic acid constructs which are combinations thereof.
(Item 133)
133, wherein said nucleic acid construct is configured to form a nucleic acid molecule after photocleavage of said one or more photocleavable moieties, wherein said nucleic acid molecule is not resistant to said cleavage by said exonuclease. A nucleic acid construct as described.
(Item 134)
134. The nucleic acid construct of item 132 or item 133, configured to hybridize to a target nucleic acid molecule and remain resistant to said cleavage by said exonuclease.
(Item 135)
A method of performing polymerase-catalyzed chain extension, comprising:
a) providing a reaction mixture comprising the nucleic acid construct of any one of items 132-134, the target nucleic acid molecule, primers, a polymerase, wherein the target nucleic acid molecule is complementary to the nucleic acid construct; a step comprising a nucleic acid sequence;
b) subjecting said reaction mixture to conditions for said polymerase-catalyzed strand extension of said primer using said target nucleic acid molecule as a template;
c) irradiating said reaction mixture or said nucleic acid construct with photons of light, thereby effecting said polymerase-catalyzed chain extension through said nucleic acid sequence;
A method, including
(Item 136)
136. The method of item 135, wherein the providing step of b) does not activate the performing step of c).
(Item 137)
137. The method of item 135 or item 136, wherein said nucleic acid construct remains intact in said reaction mixture prior to said irradiating step of c).
(Item 138)
138. The method of any one of items 135-137, further comprising in c) cleaving said one or more photocleavable moieties.
(Item 139)
139. The method of any one of items 135-138, further comprising, in c), forming said nucleic acid molecule.
(Item 140)
Items 135-139, wherein the performing step of c) comprises digesting the nucleic acid molecule formed after the irradiating step in c) with the exonuclease, wherein the polymerase is the exonuclease. The method according to any one of .
(Item 141)
141. The method according to any one of items 135 to 140, wherein said performing step of c) comprises extending said primer through said nucleic acid sequence after said irradiating and/or after said digesting step. the method of.
(Item 142)
89. A method of performing polymerase-catalyzed chain extension using the nucleic acid construct of any one of items 78, 79, 81, 82, and 85-88, comprising:
a) providing a reaction mixture comprising said nucleic acid construct, said template nucleic acid molecule, a polymerase, wherein said nucleic acid construct comprises at least said first sequence located at or near said 3′ end and said 5 ' comprising said second sequence located at or near its terminus, said first sequence being active in said polymerase-catalyzed chain elongation;
b) subjecting said reaction mixture to conditions of said polymerase-catalyzed chain elongation, thereby effecting said polymerase-catalyzed chain elongation; or generating a plurality of first amplicons comprising sequences complementary to both the first and second sequences;
c) irradiating said reaction mixture or said nucleic acid construct with photons of light, thereby cleaving said nucleic acid construct and forming a plurality of second sequences comprising said first sequence or a sequence complementary to said first sequence; producing an amplicon, provided that each of said plurality of second amplicons contains neither said second sequence nor a sequence complementary to said second sequence;
A method, including
(Item 143)
A method for polymerase-catalyzed chain extension using at least one of the nucleic acid constructs of any one of items 55-64, 78-90, 100-108, and 115-123. There is
a) providing a reaction mixture comprising said nucleic acid construct, said template nucleic acid molecule and a polymerase;
b) subjecting said reaction mixture to conditions for said polymerase-catalyzed chain elongation;
c) irradiating said reaction mixture or said nucleic acid construct with photons of light;
thereby performing said polymerase-catalyzed chain elongation;
including
The method, wherein the polymerase-catalyzed chain elongation is PCR, RT-PCR, QPCR, or qRT-PCR.
(Item 144)
said at least one of said nucleic acid constructs independently:
a) the PCR, RT-PCR, QPCR, or qRT-PCR primers;
b) a solution phase probe of said PCR, RT-PCR, QPCR or qRT-PCR, or
144. The method of item 143, wherein c) is an immobilized probe for said PCR, RT-PCR, QPCR or qRT-PCR.
(Item 145)
An automated microarray system for quantifying microarray data, comprising:
a) a solid support having a surface and a plurality of different probes, said plurality of different probes being immobilized on said surface;
b) a fluid volume comprising an analyte, said fluid volume being in contact with said solid support, wherein at least one of said plurality of different probes and said analyte are connected to items 55-64, 78-90; a fluid volume comprising at least one of the nucleic acid constructs of any one of , 100-108, and 115-123;
c) a detector configured to detect signals measured at multiple time points from each of a plurality of spots on said solid support while said fluid volume is in contact with said solid support; or a detector or detection assembly, wherein said signal is an optical signal or an electrochemical signal;
d) a computer configured to convert signals into microarray data, further comprising instructions configured to cause said microarray data to be processed by said computer according to a processing method, said processing method comprising:
1) interaction between the plurality of different probes and the analyte, including by (i) analytical indication and (ii) calibration of the microarray using at least one standard probe on the solid support; determining an estimate of the action;
2) generating a probability matrix that utilizes estimates in a Markov chain model, including modeling hybridization, cross-hybridization, and unconstrained transition probabilities between states;
3) obtaining affinity-based array data using said detector or said detector assembly;
4) applying the affinity-based array data to the stochastic matrix;
5) maximum likelihood estimation algorithms, maximum posterior probability criteria, constrained least-squares calculation methods, and which exploit and do not suppress non-specific interactions by considering them as interference rather than noise; applying an optimization algorithm selected from the group consisting of any combination thereof;
6) outputting optimized affinity-based array data to a user, wherein said optimized affinity-based array data is obtained by using said detector or said detector assembly; having an improved signal-to-noise ratio compared to the affinity-based array data obtained from
including computers and
A system comprising:
(Item 146)
in turn,
a molecular recognition layer comprising at least one of the nucleic acid constructs of any one of items 55-64, 78-90, 100-108, and 115-123;
an optical layer;
Sensor layers incorporated in a sandwich configuration and
An integrated biosensor array comprising:
a) said molecular recognition layer comprises a plurality of different probes attached to different independently addressable locations, each of said independently addressable locations located on a single side of said molecular recognition layer; configured to receive excitation photon flux directly from a single source, wherein the molecular recognition layer transmits light to the optical layer, and one of the plurality of different probes is one of the nucleic acid constructs; said at least one of
b) said optical layer comprises an optical filter layer, said optical layer transmitting light from said molecular recognition layer to said sensor layer, thereby filtering said transmitted light;
c) the sensor layer comprises an optical sensor array that detects the filtered light transmitted from the optical layer, the sensor layer comprises sensor elements manufactured using a CMOS manufacturing process, and the molecule An integrated biosensor array, wherein the recognition layer, the optical layer and the sensor layer constitute a unitary structure in which the molecular layer is in contact with the optical layer and the optical layer is in contact with the sensor layer.
Claims (20)
ｂ）１つまたは複数の光切断性部分と
を含む核酸構築物であって、
前記１つまたは複数の光切断性部分の光切断性部分が、
ａ）前記核酸構築物の３’末端に位置するか、
ｂ）前記核酸構築物の５’末端に位置するか、
ｃ）前記３’末端と前記５’末端との間に位置するか、
ｄ）前記複数のヌクレオチドのヌクレオチドの核酸塩基上もしくはそれに接続して位置するか、
ｅ）前記ヌクレオチドのリボース上もしくはそれに接続して位置するか、
ｆ）前記複数のヌクレオチドの前記ヌクレオチドと別のヌクレオチドとの間にそれらに接続して位置するか、または
ｇ）それらの組合せである、核酸構築物。 a) a plurality of nucleotides;
b) a nucleic acid construct comprising one or more photocleavable moieties,
wherein the photocleavable portion of the one or more photocleavable moieties is
a) located at the 3' end of said nucleic acid construct,
b) located at the 5′ end of said nucleic acid construct, or
c) located between said 3′ end and said 5′ end, or
d) located on or contiguous with a nucleobase of a nucleotide of said plurality of nucleotides ;
e) located on or connected to the ribose of said nucleotide ,
f) a nucleic acid construct located between said nucleotide and another nucleotide of said plurality of nucleotides connected to them, or g) a combination thereof.
ａ）核酸構築物、少なくとも１つの鋳型核酸分子、ポリメラーゼを含む反応混合物を用意するステップであって、前記核酸構築物が、前記鋳型核酸分子と相補的な配列を有し、前記核酸構築物が、
ｉ）複数のヌクレオチドと、
ｉｉ）１つまたは複数の光切断性部分と
を含み、前記１つまたは複数の光切断性部分の光切断性部分が、
ｉ）前記核酸構築物の３’末端に位置するか、
ｉｉ）前記核酸構築物の５’末端に位置するか、
ｉｉｉ）前記３’末端と前記５’末端との間に位置するか、
ｉｖ）前記複数のヌクレオチドのヌクレオチドの核酸塩基上もしくはそれに接続して位置するか、
ｖ）前記ヌクレオチドのリボース上もしくはそれに接続して位置するか、
ｖｉ）前記複数のヌクレオチドの前記ヌクレオチドと別のヌクレオチドとの間にそれらに接続して位置するか、または
ｖｉｉ）それらの組合せである、ステップと、
ｂ）前記反応混合物を、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長の条件に供するステップと、
ｃ）前記反応混合物または前記核酸構築物に光の光子を照射し、それによって、前記ポリメラーゼに触媒される鎖伸長を実行するステップと
を含む、方法。 A method of performing polymerase -catalyzed chain extension, comprising:
a ) providing a reaction mixture comprising a nucleic acid construct, at least one template nucleic acid molecule, a polymerase, said nucleic acid construct having a sequence complementary to said template nucleic acid molecule, said nucleic acid construct comprising:
i) a plurality of nucleotides;
ii) one or more photocleavable moieties;
wherein the photocleavable moiety of the one or more photocleavable moieties comprises
i) located at the 3' end of said nucleic acid construct, or
ii) located at the 5' end of said nucleic acid construct, or
iii) located between said 3′ end and said 5′ end, or
iv) located on or contiguous with a nucleobase of a nucleotide of said plurality of nucleotides;
v) located on or connected to the ribose of said nucleotide,
vi) is located between said nucleotide and another nucleotide of said plurality of nucleotides in connection with them, or
vii) a step that is a combination thereof ;
b) subjecting said reaction mixture to conditions for said polymerase-catalyzed chain elongation;
c) irradiating said reaction mixture or said nucleic acid construct with photons of light, thereby effecting said polymerase-catalyzed chain elongation.
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