JPWO2020236846A5

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Publication number: JPWO2020236846A5
Application number: JP2021569054A
Authority: JP
Publication date: 2024-04-16

Description

添付の図面を参照して、本発明の非限定的な実施形態を例として説明する。図面は模式的であり、正確な縮尺は意図されない。例示目的上、すべての構成要素がすべての図面において標識されるとは限らず、また、当業者が本発明を理解することを可能にするために例示が必要とされない場合は、本発明の各実施形態のすべての構成要素が示されるとも限らない。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
高分子を分析する方法であって、
（ａ）空間位置で記録タグと関連付けられた高分子を含む空間サンプルを提供することと、
（ｂ）前記空間サンプル内の前記高分子の前記空間位置をその場で評価することと、
（ｃ１）プローブタグを含む分子プローブを、前記空間サンプル内の前記高分子または前記高分子に近接する部分に結合することと、
（ｃ２）前記分子プローブ内の前記プローブタグからの情報を前記記録タグに転送することによって、前記記録タグを伸長することであって、前記プローブタグからの情報を前記記録タグに転送すると、伸長記録タグが生成される、伸長することと、
（ｄ）少なくとも前記伸長記録タグ内の前記プローブタグの配列を決定することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）で決定された前記プローブタグの前記配列を、ステップ（ｂ）で評価された前記分子プローブおよび／または前記空間位置と相関させることと、を含み、
それにより、ステップ（ｄ）で決定された前記伸長記録タグまたはその一部の前記配列からの情報を、ステップ（ｂ）で評価された前記空間位置と関連付ける、方法。
（項目２）
高分子を分析する方法であって、
（ａ）記録タグと関連付けられた高分子を含む空間サンプルを提供することと、
（ｂ１）空間タグを含む空間プローブを前記空間サンプルに提供することと、
（ｂ２）前記空間タグをその場で評価して、前記空間サンプル内の前記空間タグの前記空間位置を取得することと、
（ｂ３）前記空間プローブ内の前記空間タグからの情報を前記記録タグに転送することによって、前記記録タグを伸長することと、
（ｃ１）プローブタグを含む分子プローブを、前記空間サンプル内の前記高分子または前記高分子に近接する部分に結合することと、
（ｃ２）前記分子プローブ内の前記プローブタグからの情報を前記記録タグに転送することによって、前記記録タグを伸長することであって、前記空間タグおよび／またはプローブタグからの情報を前記記録タグに転送すると、伸長記録タグが生成される、伸長することと、
（ｄ）少なくとも前記伸長記録タグ内の前記プローブタグおよび空間タグの前記配列を決定することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）で決定された前記空間タグの前記配列をステップ（ｂ２）で評価された前記空間タグと相関させることと、を含み、
それにより、前記伸長記録タグまたはその一部の前記配列からの情報、例えば、ステップ（ｄ）で決定された前記空間タグおよび／またはプローブタグからの前記情報を、ステップ（ｂ２）で評価された前記空間プローブの前記空間位置と関連付ける、方法。
（項目３）
前記方法が、前記空間サンプル内の複数の高分子を分析するためのものである、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記高分子が、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドである、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記方法が、複数の分子プローブを前記空間サンプルに結合することを含む、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記方法が、複数の空間プローブを前記空間サンプルに提供することを含む、項目２～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
ステップ（ｃ１）およびステップ（ｃ２）を順次２回以上繰り返すことをさらに含む、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
ステップ（ｃ１）を繰り返す前に、前記空間サンプルから前記分子プローブを除去することをさらに含む、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記空間プローブが、支持体と、核酸を含む空間タグと、を含む、項目２～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記支持体が、ビーズまたはナノ粒子を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ビーズまたはナノ粒子が、直径約５０ｎｍ～約１００μｍの間、約５０ｎｍ～約５０μｍ、約５０ｎｍ～約１０μｍ、約０．１μｍ～約１００μｍ、約０．１μｍ～約５０μｍの間、約１０μｍ～約５０μｍの間、約５μｍ～約１０μｍの間、約０．５μｍ～約１００μｍの間、約０．５μｍ～約５０μｍの間、約０．５μｍ～約１０μｍの間、約０．５μｍ～約５μｍの間、または約０．５μｍ～約１μｍの間の範囲である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記空間プローブが、バーコード化されたビーズを含む、項目２～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記空間プローブが、前記空間サンプル上にランダムに分散されている、項目６～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記空間タグが、切断可能なリンカーで前記支持体に付着されている、項目９～１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記空間タグが、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、非核酸シーケンシング可能なポリマー、例えば、多糖類、ポリペプチド、ペプチド、もしくはポリアミド、またはそれらの組み合わせを含む、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記空間タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、項目２～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記空間タグが、バーコードを含む、項目２～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記空間プローブが、複数のバーコードを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記空間プローブが、同じバーコードの２つ以上のコピーを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記空間タグが、スペーサーを含む、項目２～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記空間タグが、前記記録タグまたはその一部に相補的な配列を含む、項目２～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記空間プローブが、前記空間サンプルと非特異的に会合する、項目２～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記空間プローブが、電荷相互作用、ＤＮＡハイブリダイゼーション、および／または可逆的化学カップリングを介して前記空間サンプルと会合する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
ステップ（ｂ２）を実行することが、前記空間サンプルまたはその一部の画像を取得することを含む、項目２～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記空間サンプルまたはその一部の２つ以上の画像が取得される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
２つ以上の画像を比較、整列、および／またはオーバーレイすることをさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
ステップ（ｂ２）を実行することが、顕微鏡を使用することを含む、項目２～２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記顕微鏡が、蛍光顕微鏡である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記空間タグが、デコーダーを使用してステップ（ｂ２）で評価され、前記デコーダーが、検出可能な標識および前記空間タグまたはその一部に相補的な配列を含む、項目２～２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
２つ以上のデコーダーを使用して、１つ以上の前記空間タグを検出する、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記検出可能な標識が、放射性同位元素、蛍光標識、比色標識、または酵素基質標識を含む、項目２９または項目３０に記載の方法。
（項目３２）
ステップ（ｂ２）が、ライゲーションによるシーケンシング、単一分子シーケンシング、単一分子蛍光シーケンシング、またはプローブ検出によるシーケンシングを含む、項目２～２３に記載の方法。
（項目３３）
前記空間タグが、プライマー伸長またはライゲーションによって前記記録タグに転送される、項目２～３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記空間タグからの情報を前記記録タグに転送することによって前記記録タグを伸長することが、前記空間サンプルをポリメラーゼおよびヌクレオチド混合物と接触させ、それにより、１つ以上のヌクレオチドを前記記録タグに付加することを含む、項目２～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記分子プローブが、核酸、ポリペプチド、小分子、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目１～３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記分子プローブが、抗体、抗原結合抗体断片、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、組換え重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、サメ由来可変ドメイン（ｖＮＡＲ）、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、線状抗体、ダイアボディ、アプタマー、ペプチド模倣分子、融合タンパク質、反応性もしくは非反応性小分子、または合成分子を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記分子プローブが、特異的結合が可能な標的化部分を含む、項目１～３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記標的化部分が、核酸、炭水化物、脂質、ポリペプチド、ポリペプチドの翻訳後修飾、またはそれらの任意の組み合わせに結合するように構成される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記標的化部分が、タンパク質特異的標的化部分である、項目３７または項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記標的化部分が、エピトープ特異的標的化部分である、項目３７または項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記標的化部分が、核酸特異的標的化部分である、項目３７または項目３８に記載の方法。
（項目４２）
前記標的化部分が、細胞表面マーカーに結合するように構成される、項目３７～４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
ステップ（ｃ１）での前記結合が、化学結合、共有結合、および／または可逆的結合を含む、項目１～４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記プローブタグが、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、非核酸シーケンシング可能なポリマー、例えば、多糖類、ポリペプチド、ペプチド、もしくはポリアミド、またはそれらの組み合わせを含む、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記プローブタグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、項目１～４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記プローブタグが、バーコードを含む、項目１～４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記プローブタグが、スペーサーを含む、項目１～４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記プローブタグが、前記記録タグまたはその一部に相補的な配列を含む、項目１～４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記プローブタグが、プライマー伸長またはライゲーションによって前記記録タグに転送される、項目１～４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記プローブタグからの情報が、前記会合した分子プローブの近くの記録タグに転送される、項目１～４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記プローブタグからの情報を前記記録タグに転送することによって前記記録タグを伸長することが、前記空間サンプルをポリメラーゼおよびヌクレオチド混合物と接触させ、それにより、１つ以上のヌクレオチドを前記記録タグに付加することを含む、項目１～５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
ステップ（ｃ２）が、前記プローブタグからの情報を、直接的に、または前記プローブタグのコピーを介して間接的に前記記録タグへ転送することを含む、項目１～５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
ステップ（ｃ２）が、１つのプローブタグからの前記情報を、２つ以上の記録タグに転送することを含む、項目１～５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記プローブタグが、ステップ（ｃ２）の前に増幅される、項目１～５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記増幅が、線形増幅である、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記プローブタグの増幅が、ＲＮＡポリメラーゼを使用して実行される、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記プローブタグの情報を前記記録タグに転送することが、逆転写を使用して実行される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
高分子分析アッセイを実行することをさらに含む、項目１～５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記高分子分析アッセイが、ポリペプチド分析アッセイである、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記高分子分析アッセイが、その場で実行される、項目５８または項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記高分子分析アッセイを実行する前に、前記記録タグと関連付けられた前記高分子を、前記空間サンプルから放出することをさらに含む、項目５８～６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記高分子分析アッセイを実行する前に、前記記録タグと関連付けられた前記高分子を収集することをさらに含む、項目５８～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記高分子が、前記高分子分析アッセイを実行する前に、固体支持体に直接的または間接的にカップリングされる、項目５８～６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記高分子分析アッセイが、
前記高分子を、前記高分子に結合することができる結合剤と接触させることであって、前記結合剤が、前記結合剤に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、接触させることと、
前記コーディングタグの情報を前記記録タグに転送することにより、前記高分子と関連付けられた前記記録タグを伸長することと、を含む、項目５８～６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記高分子を、前記高分子に結合することができる追加の結合剤と接触させることであって、前記追加の結合剤が、前記追加の結合剤に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、接触させることと、
前記追加の結合剤に関する前記コーディングタグの前記識別情報を前記記録タグに転送することにより、前記高分子と関連付けられた前記記録タグを伸長することと、を１回以上繰り返すことをさらに含む、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記コーディングタグの前記識別情報を前記記録タグに転送することが、プライマー伸長またはライゲーションによるものである、項目５８～６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記コーディングタグの前記識別情報を前記記録タグに転送することが、ＤＮＡポリメラーゼによって媒介される、項目５８～６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記コーディングタグの前記識別情報を前記記録タグに転送することが、ＤＮＡリガーゼによって媒介される、項目５８～６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記コーディングタグが、スペーサー、結合サイクル特異的配列、固有の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、項目５８～６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記コーディングタグが、その３’末端にスペーサーを含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記結合剤および前記コーディングタグが、リンカーによって接合される、項目５８～７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記高分子が、ポリペプチドまたはタンパク質である、項目５８～７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記結合剤が、修飾されたアミノペプチダーゼ、修飾されたアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、修飾されたアンチカリン、または抗体もしくはその結合断片である、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記結合剤が、前記ペプチドの単一のアミノ酸残基、ジペプチド、トリペプチド、または翻訳後修飾に結合する、項目５８～７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記結合剤が、Ｎ末端アミノ酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基、または内部アミノ酸残基に結合する、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記結合剤が、化学的に修飾されたＮ末端アミノ酸残基または化学的に修飾されたＣ末端アミノ酸残基に結合する、項目７４に記載の方法。
（項目７７）
前記結合剤が、前記Ｎ末端アミノ酸残基に結合し、前記Ｎ末端アミノ酸残基が、前記コーディングタグの前記情報を前記記録タグに転送した後に切断される、項目７５または項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記結合剤が、前記Ｃ末端アミノ酸残基に結合し、前記Ｃ末端アミノ酸残基が、前記コーディングタグの前記情報を前記記録タグに転送した後に切断される、項目７５または項目７６に記載の方法。
（項目７９）
前記伸長記録タグが、１つ以上のプローブタグ、１つ以上の空間タグ、および任意選択的に１つ以上のコーディングタグからの情報を含む、項目１～７８に記載の方法。
（項目８０）
前記伸長記録タグが、２つ以上のプローブタグ、２つ以上の空間タグ、および任意選択的に２つ以上のコーディングタグからの情報を含む、項目１～７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記伸長記録タグが、ステップ（ｄ）の前に増幅される、項目１～８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記伸長記録タグが、ステップ（ｄ）の前に前記空間サンプルから放出される、項目１～８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記高分子の前記配列の少なくとも一部を決定し、ステップ（ｂ２）で評価されたその空間位置と関連付けることをさらに含む、項目５８～８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
ステップ（ｄ）が、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、パイロシーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアベースのシーケンシング、または高度な顕微鏡を使用するＤＮＡの直接イメージングを含む、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記空間サンプルが、複数の高分子、例えば、ポリペプチドを含む、項目１～８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
前記空間サンプルが、固体支持体上に提供される、項目１～８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
前記空間サンプルが、表面上に堆積された複数の細胞を含む、項目１～８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
前記空間サンプルが、組織サンプルを含む、項目１～８７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８９）
前記空間サンプルが、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片または細胞スプレッドである、項目１～８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
前記空間サンプルを、固定剤および／または架橋剤で処理することをさらに含む、項目１～８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記空間サンプルを、透過処理剤で処理することをさらに含む、項目１～９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記空間サンプルを、固定、架橋、および／または透過処理試薬で処理することが、ステップ（ｂ１）および／またはステップ（ｃ）の前に実行される、項目９０または項目９１に記載の方法。
（項目９３）
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチド分析アッセイを実行する前に断片化される、項目５８～９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９４）
前記断片化が、前記ポリペプチドをプロテアーゼと接触させることによって実行される、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記プロテアーゼが、トリプシン、ＬｙｓＮ、またはＬｙｓＣである、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記固体支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、シグナル変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、回転干渉計ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースベースのポリマー表面、ナノ粒子、またはミクロスフェアである、項目６３～９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
前記固体支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリアクリレートビーズ、セルロースビーズ、デキストランビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、もしくは制御された多孔質ビーズ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
前記記録タグが、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、非核酸シーケンシング可能なポリマー、例えば、多糖類、ポリペプチド、ペプチド、もしくはポリアミド、またはそれらの組み合わせを含む、項目１～９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
ステップ（ａ）が、前記空間サンプルに複数の記録タグを提供することを含む、項目１～９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
前記記録タグが、前記空間サンプルに適用されるマトリックスに含まれる、項目１～９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
前記記録タグが、前記高分子に直接的または間接的に関連付けられている、項目１～９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記高分子が、前記記録タグに直接的または間接的にカップリングされる、項目１～９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
前記記録タグが、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、項目１～１０２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記記録タグが、コンパートメントタグを含む、項目１～１０３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０５）
前記記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、項目１～１０４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
前記記録タグが、スペーサーポリマーを含む、項目１～１０５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０７）
前記スペーサーが、前記記録タグの３’末端にある、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
ステップ（ａ）が、ステップ（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｄ）、および（ｅ）の前に実行される、
ステップ（ｂ１）が、ステップ（ｂ２）、（ｄ）、および（ｅ）の前に実行される、
ステップ（ｃ１）および（ｃ２）が、ステップ（ｄ）およびステップ（ｅ）の前に実行される、
ステップ（ｃ１）および（ｃ２）が、ステップ（ｂ１）、（ｂ２）、および／もしくは（ｂ３）の前もしくは後に実行される、
ステップ（ｄ）が、ステップ（ｅ）の前に実行される、ならびに／または
ステップ（ｅ）が、ステップ（ａ）（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｃ１）、（ｃ２）、および（ｄ）の後に実行される、項目２～１０７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
ステップ（ｃ１）および（ｃ２）が、ステップ（ｄ）および（ｅ）を実行する前に順次２回以上繰り返される、項目２～１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
ステップ（ｃ１）および（ｃ２）が、ステップ（ｂ１）、（ｂ２）、および（ｂ３）の前に実行される、項目２～１０９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１１）
ステップ（ｂ２）が、ステップ（ｂ１）の後に実行される、項目２～１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
ステップ（ｂ２）が、ステップ（ｂ３）の前または後に実行される、項目２～１１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
ステップ（ａ）、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｄ）、および（ｅ）が、順番に起こる、項目２～１１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１４）
前記分子プローブが、空間プローブを前記空間サンプルに提供する前に除去されるか、または
前記空間プローブが、前記サンプルを分子プローブと結合する前に前記サンプルから除去される、項目２～１１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１５）
前記高分子分析アッセイが、ステップ（ｄ）およびステップ（ｅ）の前に実行される、項目５８～１１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
高分子を分析する方法であって、
（ａ）高分子を含む空間サンプルに記録タグを提供することと、
（ｂ）検出可能な標識およびプローブタグを含む分子プローブを、前記空間サンプル内の前記高分子または前記高分子に近接する部分に結合することと、
（ｃ）前記分子プローブ内の前記プローブタグからの情報を前記記録タグに転送して、伸長記録タグを生成することと、
（ｄ）前記検出可能な標識を評価、例えば、観察して、前記分子プローブの空間情報を取得することと、
（ｅ）少なくとも前記伸長記録タグ内の前記プローブタグの前記配列を決定することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）で決定された前記プローブタグの前記配列を、前記分子プローブと相関させることと、を含み、
それにより、ステップ（ｅ）で決定された前記配列からの情報を、ステップ（ｄ）で決定されたその空間情報と関連付ける、方法。
（項目１１７）
前記高分子が、タンパク質である、項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
前記高分子が、ポリペプチドまたはペプチドである、項目１１６に記載の方法。
（項目１１９）
前記方法が、複数の前記分子プローブを前記空間サンプルに結合することを含む、項目１１６～１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２０）
２つ以上のプローブが、同じ検出可能な標識と関連付けられている、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
前記複数の分子プローブ内の各分子プローブが、固有の検出可能な標識と関連付けられている、項目１１９に記載の方法。
（項目１２２）
ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）を順次２回以上繰り返すことをさらに含む、項目１１６～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２３）
ステップ（ｄ）を２回以上繰り返すことをさらに含む、項目１２２に記載の方法。
（項目１２４）
ステップ（ｂ）を繰り返す前に、前記空間サンプルから前記分子プローブを除去することをさらに含む、項目１２２または項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
前記検出可能な標識を評価、例えば、観察した後に、前記検出可能な標識を不活性化することをさらに含む、項目１１２または項目１２３に記載の方法。
（項目１２６）
前記分子プローブが、核酸、ポリペプチド、小分子、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目１１６～１２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２７）
前記分子プローブが、抗体、抗原結合抗体断片、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、組換え重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、サメ由来可変ドメイン（ｖＮＡＲ）、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、線状抗体、ダイアボディ、アプタマー、ペプチド模倣分子、融合タンパク質、反応性もしくは非反応性小分子、または合成分子を含む、項目１１６～１２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２８）
前記分子プローブが、特異的結合が可能な標的化部分を含む、項目１１６～１２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２９）
前記標的化部分が、核酸、炭水化物、脂質、ポリペプチド、ポリペプチドの翻訳後修飾、またはそれらの任意の組み合わせに結合するように構成される、項目１２８に記載の方法。
（項目１３０）
標的化部分が、タンパク質特異的標的化部分である、項目１２８または項目１２９に記載の方法。
（項目１３１）
標的化部分が、エピトープ特異的標的化部分である、項目１２８または項目１２９に記載の方法。
（項目１３２）
前記標的化部分が、核酸特異的標的化部分である、項目１２８または項目１２９に記載の方法。
（項目１３３）
標的化部分が、細胞表面マーカーに結合するように構成される、項目１２８～１３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３４）
ステップ（ｂ）での前記結合が、化学結合、共有結合、および／または可逆的結合を含む、項目１２８～１３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３５）
前記検出可能な標識が、放射性同位元素、蛍光標識、比色標識、または酵素基質標識を含む、項目１１６～１３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３６）
前記検出可能な標識を評価、例えば、観察することが、前記空間サンプルまたはその一部のデジタル画像を取得することを含む、項目１１６～１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３７）
前記空間サンプルの２つ以上のデジタル画像が取得される、項目１３６に記載の方法。
（項目１３８）
前記２つ以上のデジタル画像が、前記複数の分子プローブの組み合わせ空間情報を提供する、項目１３７に記載の方法。
（項目１３９）
前記画像のうちの少なくとも２つを比較、整列、および／またはオーバーレイすることをさらに含む、項目１３７または項目１３８に記載の方法。
（項目１４０）
前記検出可能な標識を評価、例えば、観察した後に、前記検出可能な標識を不活性化することをさらに含む、項目１１６～１３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４１）
前記検出可能な標識を評価、例えば、観察することが、顕微鏡を使用して実行される、項目１１６～１４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４２）
前記検出可能な標識を評価、例えば、観察することが、蛍光顕微鏡を使用して実行される、項目１４１に記載の方法。
（項目１４３）
前記プローブタグからの情報が、プライマー伸長またはライゲーションによって前記記録タグに転送される、項目１１６～１４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４４）
前記プローブタグからの情報を前記記録タグに転送することが、前記空間サンプルをポリメラーゼおよびヌクレオチド混合物と接触させ、それにより、１つ以上のヌクレオチドを前記記録タグに付加することを含む、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
前記プローブタグからの情報が、前記プローブタグの近くの記録タグに転送される、項目１１６～１４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４６）
ステップ（ｃ）が、前記プローブタグからの情報を、直接的に、または前記プローブタグのコピーを介して間接的に前記記録タグへ転送することを含む、項目１１６～１４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４７）
ステップ（ｃ）が、１つのプローブタグからの前記情報を、２つ以上の記録タグに転送することを含む、項目１１６～１４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４８）
前記プローブタグが、ステップ（ｃ）の前に増幅される、項目１１６～１４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４９）
前記プローブタグの増幅が、ＲＮＡポリメラーゼを使用して実行される、項目１４８に記載の方法。
（項目１５０）
前記増幅が、線形増幅である、項目１４８に記載の方法。
（項目１５１）
前記プローブタグからの情報を前記記録タグに転送することが、逆転写を使用して実行される、項目１４９または項目１５０に記載の方法。
（項目１５２）
ステップ（ａ）が、前記空間サンプルに複数の記録タグを提供することを含む、項目１１６～１５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５３）
前記記録タグが、前記空間サンプルに適用されるマトリックスに含まれる、項目１１６～１５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５４）
前記記録タグが、前記高分子に直接的または間接的に関連付けられている、項目１１６～１５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５５）
前記高分子が、前記記録タグに直接的または間接的にカップリングされる、項目１１６～１５１および１５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５６）
高分子分析アッセイを実行することをさらに含む、項目１１６～１５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５７）
前記高分子分析アッセイが、ポリペプチド分析アッセイである、項目１５６に記載の方法。
（項目１５８）
前記高分子分析アッセイが、その場で実行される、項目１５６または項目１５７に記載の方法。
（項目１５９）
前記高分子分析アッセイを実行する前に、前記記録タグと関連付けられた前記高分子を、前記空間サンプルから放出することをさらに含む、項目１５６～１５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６０）
前記高分子分析アッセイを実行する前に、前記記録タグと関連付けられた前記高分子を収集することをさらに含む、項目１５６～１５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６１）
前記高分子が、前記高分子分析アッセイを実行する前に、固体支持体に直接的または間接的にカップリングされる、項目１５６～１６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６２）
前記高分子分析アッセイが、
前記高分子を、前記高分子に結合することができる結合剤と接触させることであって、前記結合剤が、前記結合剤に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、接触させることと、
前記コーディングタグの前記情報を前記記録タグに転送して、前記伸長記録タグを生成することと、を含む、項目１５６～１６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６３）
前記高分子を、前記高分子に結合することができる追加の結合剤と接触させることであって、前記追加の結合剤が、前記追加の結合剤に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、接触させることと、
前記追加の結合剤に関する前記コーディングタグの前記識別情報を、前記伸長記録タグに転送することと、を１回以上繰り返すことをさらに含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６４）
前記コーディングタグの前記識別情報を前記記録タグに転送することが、ＤＮＡリガーゼによって媒介される、項目１６２または項目１６３に記載の方法。
（項目１６５）
前記コーディングタグの前記識別情報を前記記録タグに転送することが、ＤＮＡポリメラーゼによって媒介される、項目１６２または項目１６３に記載の方法。
（項目１６６）
前記コーディングタグの前記識別情報を前記記録タグに転送することが、化学ライゲーションによって媒介される、項目１６２または項目１６３に記載の方法。
（項目１６７）
前記コーディングタグが、スペーサー、結合サイクル特異的配列、固有の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、項目１６２～１６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６８）
前記コーディングタグが、その３’末端にスペーサーを含む、項目１６７に記載の方法。
（項目１６９）
前記結合剤および前記コーディングタグが、リンカーによって接合される、項目１６２～１６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７０）
前記結合剤が、ポリペプチドまたはタンパク質である、項目１６２～１６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７１）
前記結合剤が、修飾されたアミノペプチダーゼ、修飾されたアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、修飾されたアンチカリン、または抗体もしくはその結合断片である、項目１７０に記載の方法。
（項目１７２）
前記結合剤が、前記ポリペプチドの単一のアミノ酸残基、ジペプチド、トリペプチド、または翻訳後修飾に結合する、項目１６２～１７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７３）
前記結合剤が、Ｎ末端アミノ酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基、または内部アミノ酸残基に結合する、項目１７２に記載の方法。
（項目１７４）
前記結合剤が、化学的に修飾されたＮ末端アミノ酸残基または化学的に修飾されたＣ末端アミノ酸残基に結合する、項目１７２に記載の方法。
（項目１７５）
前記結合剤が、前記Ｎ末端アミノ酸残基に結合し、前記Ｎ末端アミノ酸残基が、前記コーディングタグの前記情報を前記記録タグに転送した後に切断される、項目１７３または項目１７４に記載の方法。
（項目１７６）
前記結合剤が、前記Ｃ末端アミノ酸残基に結合し、前記Ｃ末端アミノ酸残基が、前記コーディングタグの前記情報を前記記録タグに転送した後に切断される、項目１７３または項目１７４に記載の方法。
（項目１７７）
前記伸長記録タグが、１つ以上のプローブタグおよび１つ以上のコーディングタグからの情報を含む、項目１６２～１７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７８）
前記伸長記録タグが、２つ以上のプローブタグおよび２つ以上のコーディングタグからの情報を含む、項目１６２～１７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７９）
前記伸長記録タグが、ステップ（ｅ）の前に増幅される、項目１１６～１７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８０）
ステップ（ｅ）が、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、パイロシーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアベースのシーケンシング、または高度な顕微鏡を使用するＤＮＡの直接イメージングを含む、項目１１６～１７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８１）
前記空間サンプルが、複数の前記高分子、例えば、ポリペプチドを含む、項目１１６～１８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８２）
前記空間サンプルが、固体支持体上に提供される、項目１１６～１８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８３）
前記空間サンプルが、表面上に堆積された複数の細胞を含む、項目１８２に記載の方法。
（項目１８４）
前記空間サンプルが、組織サンプルを含む、項目１１６～１８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８５）
前記空間サンプルが、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片または細胞スプレッドである、項目１１６～１８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８６）
前記高分子の前記配列の少なくとも一部を決定し、ステップ（ｄ）で決定されたその空間位置と関連付けることをさらに含む、項目１５６～１８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８７）
前記空間サンプルを、固定剤、架橋剤、およびまたは透過処理剤で処理することをさらに含む、項目１１６～１８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８８）
前記空間サンプルの固定、架橋、および／または透過処理が、ステップ（ｂ）の前に実行される、項目１８７に記載の方法。
（項目１８９）
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチド分析アッセイを実行する前に断片化される、項目１５７～１８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９０）
前記断片化が、前記ポリペプチドをプロテアーゼと接触させることによって実行される、項目１８９に記載の方法。
（項目１９１）
前記プロテアーゼが、トリプシン、ＬｙｓＮ、またはＬｙｓＣである、項目１９０に記載の方法。
（項目１９２）
前記固体支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、シグナル変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、回転干渉計ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースベースのポリマー表面、ナノ粒子、またはミクロスフェアである、項目１６１～１９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９３）
前記固体支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリアクリレートビーズ、セルロースビーズ、デキストランビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、もしくは制御された多孔質ビーズ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目１９２に記載の方法。
（項目１９４）
前記プローブタグが、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、非核酸シーケンシング可能なポリマー、例えば、多糖類、ポリペプチド、ペプチド、もしくはポリアミド、またはそれらの組み合わせを含む、項目１１６～１９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９５）
前記プローブタグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、項目１１６～１９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９６）
前記プローブタグが、バーコードを含む、項目１１６～１９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９７）
前記プローブタグが、スペーサーを含む、項目１１６～１９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９８）
前記記録タグが、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、非核酸シーケンシング可能なポリマー、例えば、多糖類、ポリペプチド、ペプチド、もしくはポリアミド、またはそれらの組み合わせを含む、項目１１６～１９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９９）
前記記録タグが、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、項目１１６～１９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２００）
前記記録タグが、コンパートメントタグを含む、項目１１６～１９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０１）
前記記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、項目１１６～２００のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０２）
前記記録タグが、スペーサーポリマーを含む、項目１１６～２００のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０３）
前記スペーサーが、前記記録タグの３’末端にある、項目２０２に記載の方法。
（項目２０４）
ステップ（ａ）が、ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）の前に実行される、
ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）の前に実行される、
ステップ（ｃ）が、ステップ（ｄ）の前もしくは後に実行される、
ステップ（ｃ）が、ステップ（ｅ）および（ｆ）の前に実行される、
ステップ（ｄ）が、ステップ（ｅ）および（ｆ）の前に実行される、
ステップ（ｅ）が、ステップ（ａ）（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）の後に実行される、ならびに／または
ステップ（ｅ）が、ステップ（ｆ）の前に実行される、項目１１６～２０３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０５）
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）が、順番に起こるか、または
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｃ）、（ｅ）、および（ｆ）が、順番に起こる、項目１１６～２０３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０６）
ステップ（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）が、ステップ（ｅ）および（ｆ）を実行する前に順次２回以上繰り返される、項目２０５に記載の方法。
（項目２０７）
ステップ（ｂ）、（ｄ）、および（ｃ）が、ステップ（ｅ）および（ｆ）を実行する前に順次２回以上繰り返される、項目２０５に記載の方法。
（項目２０８）
前記高分子分析アッセイが、ステップ（ｅ）およびステップ（ｆ）の前に実行される、項目１５６～２０７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０９）
前記高分子分析アッセイが、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）の後に実行される、項目１５６～２０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１０）
ステップ（ａ）の前記高分子に空間タグが提供される、項目１に記載の方法。
（項目２１１）
前記空間タグが、前記記録タグと直接的または間接的に関連付けられている、項目２１０に記載の方法。
（項目２１２）
前記記録タグが、ＵＭＩを含む、項目１または項目２１０～２１１に記載の方法。
（項目２１３）
ステップ（ｂ）が、前記空間タグをその場で分析することを含む、項目１および２１０～２１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１４）
前記空間タグ配列が、顕微鏡ベースの方法を使用して分析される、項目１および２１０～２１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１５）
前記顕微鏡ベースの方法が、多重化される、項目２１４に記載の方法。
（項目２１６）
前記空間タグ配列が、シーケンシングによって分析される、項目１および２１０～２１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１７）
前記シーケンシングが、ライゲーションによるシーケンシング、単一分子シーケンシング、単一分子蛍光シーケンシング、またはプローブ検出によるシーケンシングを含む、項目２１６に記載の方法。
（項目２１８）
ステップ（ｂ）が、
（ｂ１）空間タグを含む空間プローブを前記空間サンプルに提供することと、
（ｂ２）前記空間タグをその場で評価して、前記空間サンプル内の前記空間タグの前記空間位置を取得することと、
（ｂ３）前記空間プローブ内の前記空間タグからの情報を前記記録タグに転送することによって、前記記録タグを伸長することと、を含む、項目１に記載の方法。
（項目２１９）
ステップ（ｂ）が、
（ｂ１）検出可能な標識およびプローブタグを含む分子プローブを、前記空間サンプル内の前記高分子または前記高分子に近接する部分に結合することと、
（ｂ２）前記検出可能な標識を評価、例えば、観察して、前記分子プローブの空間情報を取得することと、を含む、項目１に記載の方法。 Non-limiting embodiments of the invention will now be described, by way of example, with reference to the accompanying drawings. The drawings are schematic and not intended to be exact scale. For illustrative purposes, not all components are labeled in all drawings, and each component of the invention is illustrated where illustration is not needed to enable those skilled in the art to understand the invention. Not all components of an embodiment are shown.
In certain embodiments, for example, the following items are provided.
(Item 1)
A method of analyzing a macromolecule comprising:
(a) providing a spatial sample comprising macromolecules associated with recording tags at spatial locations;
(b) in situ evaluating the spatial locations of the macromolecules within the spatial sample;
(c1) binding a molecular probe comprising a probe tag to the macromolecule or a portion proximate to the macromolecule within the spatial sample;
(c2) decompressing the recording tag by transferring information from the probe tag in the molecular probe to the recording tag, wherein upon transferring information from the probe tag to the recording tag, decompressing recording tags are generated, decompressing;
(d) determining the sequence of said probe tag within at least said extended recording tag;
(e) correlating the sequences of the probe tags determined in step (d) with the molecular probes and/or the spatial locations evaluated in step (b);
A method thereby associating information from the sequence of the elongated recording tag or portion thereof determined in step (d) with the spatial location evaluated in step (b).
(Item 2)
A method of analyzing a macromolecule comprising:
(a) providing a spatial sample comprising a macromolecule associated with a recording tag;
(b1) providing the spatial sample with a spatial probe comprising a spatial tag;
(b2) evaluating the spatial tag in situ to obtain the spatial location of the spatial tag within the spatial sample;
(b3) decompressing the recording tag by transferring information from the spatial tag in the spatial probe to the recording tag;
(c1) binding a molecular probe comprising a probe tag to the macromolecule or a portion proximate to the macromolecule within the spatial sample;
(c2) extending the recording tag by transferring information from the probe tag within the molecular probe to the recording tag, wherein information from the spatial tag and/or probe tag is transferred to the recording tag; decompressing to generate a decompressed record tag when transferred to
(d) determining the sequences of at least the probe tags and spatial tags within the extended recording tags;
(e) correlating the sequence of the spatial tags determined in step (d) with the spatial tags evaluated in step (b2);
Thereby, information from said sequence of said extended recording tag or part thereof, e.g. said information from said spatial tag and/or probe tag determined in step (d), was evaluated in step (b2) associating with the spatial location of the spatial probe.
(Item 3)
3. The method of item 1 or item 2, wherein the method is for analyzing a plurality of macromolecules within the spatial sample.
(Item 4)
4. The method of any one of items 1-3, wherein the macromolecules are proteins, polypeptides or peptides.
(Item 5)
5. The method of any one of items 1-4, wherein said method comprises binding a plurality of molecular probes to said spatial sample.
(Item 6)
6. The method of any one of items 2-5, wherein said method comprises providing a plurality of spatial probes to said spatial sample.
(Item 7)
7. The method of any one of items 1-6, further comprising repeating steps (c1) and (c2) sequentially two or more times.
(Item 8)
7. The method of item 6, further comprising removing said molecular probes from said spatial sample before repeating step (c1).
(Item 9)
A method according to any one of items 2-8, wherein said spatial probe comprises a support and a spatial tag comprising a nucleic acid.
(Item 10)
10. The method of item 9, wherein the support comprises beads or nanoparticles.
(Item 11)
The beads or nanoparticles are between about 50 nm and about 100 μm in diameter, between about 50 μm, between about 5 μm and about 10 μm, between about 0.5 μm and about 100 μm, between about 0.5 μm and about 50 μm, between about 0.5 μm and about 10 μm, between about 0.5 μm and about 5 μm 11. The method of item 10, wherein the thickness ranges between, or between about 0.5 μm and about 1 μm.
(Item 12)
12. The method of any one of items 2-11, wherein said spatial probes comprise barcoded beads.
(Item 13)
13. The method of any one of items 6-12, wherein the spatial probes are randomly distributed over the spatial sample.
(Item 14)
14. The method of any one of items 9-13, wherein said spatial tag is attached to said support with a cleavable linker.
(Item 15)
wherein the spatial tag is a DNA molecule, a DNA with pseudo-complementary bases, an RNA molecule, a BNA molecule, an XNA molecule, an LNA molecule, a PNA molecule, a γPNA molecule, a non-nucleic acid sequenceable polymer such as a polysaccharide, a polypeptide, 15. A method according to any one of items 1-14, comprising a peptide, or a polyamide, or a combination thereof.
(Item 16)
16. The method of any one of items 2-15, wherein said spatial tag comprises a universal priming site.
(Item 17)
17. The method of any one of items 2-16, wherein the spatial tag comprises a barcode.
(Item 18)
18. The method of item 17, wherein the spatial probe comprises a plurality of barcodes.
(Item 19)
19. The method of item 18, wherein said spatial probe comprises two or more copies of the same barcode.
(Item 20)
20. The method of any one of items 2-19, wherein said spatial tag comprises a spacer.
(Item 21)
21. The method of any one of items 2-20, wherein said spatial tag comprises a sequence complementary to said recording tag or part thereof.
(Item 22)
22. The method of any one of items 2-21, wherein said spatial probe associates non-specifically with said spatial sample.
(Item 23)
23. The method of item 22, wherein said spatial probe associates with said spatial sample via charge interaction, DNA hybridization and/or reversible chemical coupling.
(Item 24)
24. The method of any one of items 2-23, wherein performing step (b2) comprises acquiring an image of said spatial sample or part thereof.
(Item 25)
25. Method according to item 24, wherein two or more images of the spatial sample or part thereof are acquired.
(Item 26)
26. The method of item 25, further comprising comparing, aligning and/or overlaying two or more images.
(Item 27)
27. The method of any one of items 2-26, wherein performing step (b2) comprises using a microscope.
(Item 28)
28. The method of item 27, wherein the microscope is a fluorescence microscope.
(Item 29)
29. Any one of items 2-28, wherein said spatial tag is evaluated in step (b2) using a decoder, said decoder comprising a detectable label and a sequence complementary to said spatial tag or part thereof. The method described in section.
(Item 30)
30. The method of item 29, wherein two or more decoders are used to detect one or more of said spatial tags.
(Item 31)
31. The method of item 29 or item 30, wherein the detectable label comprises a radioisotope, fluorescent label, colorimetric label, or enzymatic substrate label.
(Item 32)
24. The method of items 2-23, wherein step (b2) comprises sequencing by ligation, single molecule sequencing, single molecule fluorescence sequencing, or sequencing by probe detection.
(Item 33)
33. The method of any one of items 2-32, wherein the spatial tags are transferred to the recording tags by primer extension or ligation.
(Item 34)
Extending the recording tag by transferring information from the spatial tag to the recording tag contacts the spatial sample with a polymerase and a nucleotide mixture, thereby adding one or more nucleotides to the recording tag. 34. The method of any one of items 2-33, comprising:
(Item 35)
35. The method of any one of items 1-34, wherein said molecular probe comprises a nucleic acid, a polypeptide, a small molecule, or any combination thereof.
(Item 36)
said molecular probe is an antibody, antigen-binding antibody fragment, single domain antibody (sdAb), recombinant heavy chain only antibody (VHH), single chain antibody (scFv), shark-derived variable domain (vNAR), Fv, Fab , Fab', F(ab')2, linear antibodies, diabodies, aptamers, peptidomimetic molecules, fusion proteins, reactive or non-reactive small molecules, or synthetic molecules.
(Item 37)
37. The method of any one of items 1-36, wherein said molecular probe comprises a targeting moiety capable of specific binding.
(Item 38)
38. The method of item 37, wherein the targeting moiety is configured to bind to nucleic acids, carbohydrates, lipids, polypeptides, post-translational modifications of polypeptides, or any combination thereof.
(Item 39)
39. The method of item 37 or item 38, wherein said targeting moiety is a protein-specific targeting moiety.
(Item 40)
39. The method of item 37 or item 38, wherein said targeting moiety is an epitope-specific targeting moiety.
(Item 41)
39. The method of item 37 or item 38, wherein said targeting moiety is a nucleic acid-specific targeting moiety.
(Item 42)
42. The method of any one of items 37-41, wherein said targeting moiety is configured to bind to a cell surface marker.
(Item 43)
43. A method according to any one of items 1 to 42, wherein said binding in step (c1) comprises chemical binding, covalent binding and/or reversible binding.
(Item 44)
wherein the probe tag is a DNA molecule, a DNA with pseudo-complementary bases, an RNA molecule, a BNA molecule, an XNA molecule, an LNA molecule, a PNA molecule, a γPNA molecule, a non-nucleic acid sequenceable polymer such as a polysaccharide, a polypeptide, 44. A method according to any one of items 1-43, comprising a peptide, or a polyamide, or a combination thereof.
(Item 45)
45. The method of any one of items 1-44, wherein the probe tag comprises a universal priming site.
(Item 46)
46. The method of any one of items 1-45, wherein the probe tag comprises a barcode.
(Item 47)
47. The method of any one of items 1-46, wherein the probe tag comprises a spacer.
(Item 48)
48. A method according to any one of items 1 to 47, wherein said probe tag comprises a sequence complementary to said recording tag or part thereof.
(Item 49)
49. The method of any one of items 1-48, wherein the probe tag is transferred to the recording tag by primer extension or ligation.
(Item 50)
50. The method of any one of items 1-49, wherein information from the probe tag is transferred to a recording tag near the assembled molecular probe.
(Item 51)
Extending the recording tag by transferring information from the probe tag to the recording tag contacts the spatial sample with a polymerase and a nucleotide mixture, thereby adding one or more nucleotides to the recording tag. 51. The method of any one of items 1-50, comprising:
(Item 52)
52. Any one of items 1-51, wherein step (c2) comprises transferring information from said probe tag to said recording tag, either directly or indirectly via a copy of said probe tag. described method.
(Item 53)
53. The method of any one of items 1-52, wherein step (c2) comprises transferring said information from one probe tag to two or more recording tags.
(Item 54)
54. A method according to any one of items 1 to 53, wherein said probe tags are amplified before step (c2).
(Item 55)
55. The method of item 54, wherein said amplification is linear amplification.
(Item 56)
56. The method of item 55, wherein said probe tag amplification is performed using an RNA polymerase.
(Item 57)
57. The method of item 56, wherein transferring the probe tag information to the recording tag is performed using reverse transcription.
(Item 58)
58. The method of any one of items 1-57, further comprising performing a macromolecular analysis assay.
(Item 59)
59. The method of item 58, wherein said macromolecular analytical assay is a polypeptide analytical assay.
(Item 60)
60. The method of item 58 or item 59, wherein said macromolecular analysis assay is performed in situ.
(Item 61)
61. The method of any one of items 58-60, further comprising releasing the macromolecules associated with the recording tags from the spatial sample prior to performing the macromolecular analysis assay.
(Item 62)
62. The method of any one of items 58-61, further comprising collecting the macromolecules associated with the recording tags prior to performing the macromolecular analysis assay.
(Item 63)
63. The method of any one of items 58-62, wherein said macromolecule is directly or indirectly coupled to a solid support prior to carrying out said macromolecular analytical assay.
(Item 64)
the macromolecular analysis assay comprising:
contacting the macromolecule with a binding agent capable of binding to the macromolecule, the binding agent comprising a coding tag having identifying information about the binding agent;
64. The method of any one of items 58-63, comprising extending the recording tag associated with the macromolecule by transferring the coding tag information to the recording tag.
(Item 65)
contacting the macromolecule with an additional binding agent capable of binding to the macromolecule, wherein the additional binding agent comprises a coding tag having identifying information about the additional binding agent. and
extending the recording tag associated with the macromolecule by transferring the identifying information of the coding tag for the additional binding agent to the recording tag, and repeating one or more times. 64. The method according to 64.
(Item 66)
66. The method of any one of items 58-65, wherein transferring the identifying information of the coding tag to the recording tag is by primer extension or ligation.
(Item 67)
66. A method according to any one of items 58-65, wherein transferring said identifying information of said coding tag to said recording tag is mediated by a DNA polymerase.
(Item 68)
66. The method of any one of items 58-65, wherein transferring the identifying information of the coding tag to the recording tag is mediated by DNA ligase.
(Item 69)
69. The method of any one of items 58-68, wherein said coding tag further comprises a spacer, a binding cycle specific sequence, a unique molecular identifier, a universal priming site, or any combination thereof.
(Item 70)
70. The method of item 69, wherein said coding tag comprises a spacer at its 3' end.
(Item 71)
71. The method of any one of items 58-70, wherein said binding agent and said coding tag are joined by a linker.
(Item 72)
72. The method of any one of items 58-71, wherein said macromolecules are polypeptides or proteins.
(Item 73)
73. The method of item 72, wherein the binding agent is a modified aminopeptidase, a modified aminoacyl-tRNA synthetase, a modified anticalin, or an antibody or binding fragment thereof.
(Item 74)
74. The method of any one of items 58-73, wherein said binding agent binds to a single amino acid residue, dipeptide, tripeptide or post-translational modification of said peptide.
(Item 75)
75. The method of item 74, wherein the binding agent binds to an N-terminal amino acid residue, a C-terminal amino acid residue, or an internal amino acid residue.
(Item 76)
75. The method of item 74, wherein the binding agent binds to a chemically modified N-terminal amino acid residue or a chemically modified C-terminal amino acid residue.
(Item 77)
77. The method of item 75 or item 76, wherein the binding agent binds to the N-terminal amino acid residue, and the N-terminal amino acid residue is cleaved after transferring the information of the coding tag to the recording tag. .
(Item 78)
77. The method of item 75 or item 76, wherein the binding agent binds to the C-terminal amino acid residue, and the C-terminal amino acid residue is cleaved after transferring the information of the coding tag to the recording tag. .
(Item 79)
79. The method of items 1-78, wherein the extended recording tags comprise information from one or more probe tags, one or more spatial tags, and optionally one or more coding tags.
(Item 80)
80. The method of any one of items 1-79, wherein the extended recording tag comprises information from two or more probe tags, two or more spatial tags, and optionally two or more coding tags. .
(Item 81)
81. The method of any one of items 1-80, wherein the extended recording tag is amplified prior to step (d).
(Item 82)
81. The method of any one of items 1-80, wherein the extended recording tag is released from the spatial sample prior to step (d).
(Item 83)
83. The method of any one of items 58-82, further comprising determining at least part of said sequence of said macromolecules and associating with its spatial position evaluated in step (b2).
(Item 84)
step (d) is sequencing by synthesis, sequencing by ligation, sequencing by hybridization, polony sequencing, ion-semiconductor sequencing, pyrosequencing, single-molecule real-time sequencing, nanopore-based sequencing, or 84. The method of item 83, comprising direct imaging of DNA using advanced microscopy.
(Item 85)
85. The method of any one of items 1-84, wherein said spatial sample comprises a plurality of macromolecules, eg polypeptides.
(Item 86)
86. The method of any one of items 1-85, wherein said spatial sample is provided on a solid support.
(Item 87)
87. The method of any one of items 1-86, wherein said spatial sample comprises a plurality of cells deposited on a surface.
(Item 88)
88. The method of any one of items 1-87, wherein the spatial sample comprises a tissue sample.
(Item 89)
89. The method of any one of items 1-88, wherein said spatial sample is a formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) section or cell spread.
(Item 90)
90. The method of any one of items 1-89, further comprising treating said spatial sample with a fixative and/or a cross-linking agent.
(Item 91)
91. The method of any one of items 1-90, further comprising treating the spatial sample with a permeabilizing agent.
(Item 92)
92. The method of item 90 or item 91, wherein treating said spatial sample with a fixing, cross-linking and/or permeabilizing reagent is performed before step (b1) and/or step (c).
(Item 93)
93. The method of any one of items 58-92, wherein said polypeptide is fragmented prior to performing said polypeptide analysis assay.
(Item 94)
94. The method of item 93, wherein said fragmentation is performed by contacting said polypeptide with a protease.
(Item 95)
95. The method of item 94, wherein the protease is trypsin, LysN, or LysC.
(Item 96)
biochips wherein said solid support comprises beads, porous beads, porous matrices, arrays, glass surfaces, silicon surfaces, plastic surfaces, filters, membranes, nylon, silicon wafer chips, flow-through chips, signal conversion electronics; 96. The method of any one of items 63-95, which is a microtiter well, an ELISA plate, a rotating interferometer disc, a nitrocellulose membrane, a nitrocellulose-based polymer surface, a nanoparticle or a microsphere.
(Item 97)
said solid support comprises polystyrene beads, polyacrylate beads, cellulose beads, dextran beads, polymeric beads, agarose beads, acrylamide beads, solid core beads, porous beads, paramagnetic beads, glass beads, or controlled porous beads; or any combination thereof.
(Item 98)
wherein the recording tag is a DNA molecule, a DNA with pseudo-complementary bases, an RNA molecule, a BNA molecule, an XNA molecule, an LNA molecule, a PNA molecule, a γPNA molecule, a non-nucleic acid sequenceable polymer such as a polysaccharide, a polypeptide, 98. A method according to any one of items 1-97, comprising a peptide, or a polyamide, or a combination thereof.
(Item 99)
99. The method of any one of items 1-98, wherein step (a) comprises providing a plurality of recording tags to the spatial samples.
(Item 100)
99. The method of any one of items 1-99, wherein the recording tags are included in a matrix applied to the spatial samples.
(Item 101)
99. The method of any one of items 1-99, wherein the recording tag is directly or indirectly associated with the macromolecule.
(Item 102)
99. The method of any one of items 1-99, wherein the macromolecule is directly or indirectly coupled to the recording tag.
(Item 103)
103. The method of any one of items 1-102, wherein the recording tag comprises a unique molecular identifier (UMI).
(Item 104)
104. The method of any one of items 1-103, wherein the recording tag comprises a compartment tag.
(Item 105)
105. The method of any one of items 1-104, wherein the recording tag comprises a universal priming site.
(Item 106)
106. The method of any one of items 1-105, wherein the recording tag comprises a spacer polymer.
(Item 107)
107. The method of item 106, wherein said spacer is at the 3' end of said recording tag.
(Item 108)
step (a) is performed before steps (b1), (b2), (b3), (c1), (c2), (d) and (e);
step (b1) is performed before steps (b2), (d) and (e);
steps (c1) and (c2) are performed before steps (d) and (e);
steps (c1) and (c2) are performed before or after steps (b1), (b2), and/or (b3);
step (d) is performed before step (e) and/or
any one of items 2-107, wherein step (e) is performed after steps (a)(b1), (b2), (b3), (c1), (c2), and (d); described method.
(Item 109)
109. The method of any one of items 2-108, wherein steps (c1) and (c2) are sequentially repeated two or more times before performing steps (d) and (e).
(Item 110)
109. The method of any one of items 2-109, wherein steps (c1) and (c2) are performed before steps (b1), (b2) and (b3).
(Item 111)
111. The method of any one of items 2-110, wherein step (b2) is performed after step (b1).
(Item 112)
112. A method according to any one of items 2 to 111, wherein step (b2) is performed before or after step (b3).
(Item 113)
113. The method according to any one of items 2 to 112, wherein steps (a), (c1), (c2), (b1), (b2), (b3), (d) and (e) occur in sequence. the method of.
(Item 114)
the molecular probe is removed prior to providing the spatial probe to the spatial sample, or
114. The method of any one of items 2-113, wherein said spatial probes are removed from said sample prior to binding said sample with molecular probes.
(Item 115)
115. The method of any one of items 58-114, wherein said macromolecular analysis assay is performed before step (d) and step (e).
(Item 116)
A method of analyzing a macromolecule comprising:
(a) providing a recording tag to a spatial sample containing macromolecules;
(b) binding a molecular probe comprising a detectable label and a probe tag to said macromolecules or moieties proximate to said macromolecules within said spatial sample;
(c) transferring information from the probe tag in the molecular probe to the recording tag to generate an extended recording tag;
(d) evaluating, e.g., observing, the detectable label to obtain spatial information of the molecular probe;
(e) determining the sequence of the probe tag within at least the extended recording tag;
(f) correlating the sequence of the probe tag determined in step (e) with the molecular probe;
A method thereby associating information from said array determined in step (e) with its spatial information determined in step (d).
(Item 117)
117. The method of item 116, wherein the macromolecules are proteins.
(Item 118)
117. The method of item 116, wherein the macromolecule is a polypeptide or peptide.
(Item 119)
119. The method of any one of items 116-118, wherein said method comprises binding a plurality of said molecular probes to said spatial sample.
(Item 120)
120. The method of item 119, wherein the two or more probes are associated with the same detectable label.
(Item 121)
120. The method of item 119, wherein each molecular probe in said plurality of molecular probes is associated with a unique detectable label.
(Item 122)
122. The method of any one of items 116-121, further comprising repeating steps (b) and (c) sequentially two or more times.
(Item 123)
123. The method of item 122, further comprising repeating step (d) two or more times.
(Item 124)
124. The method of item 122 or item 123, further comprising removing said molecular probes from said spatial sample before repeating step (b).
(Item 125)
124. The method of item 112 or item 123, further comprising deactivating the detectable label after evaluating, eg observing, the detectable label.
(Item 126)
126. The method of any one of items 116-125, wherein said molecular probe comprises a nucleic acid, a polypeptide, a small molecule, or any combination thereof.
(Item 127)
said molecular probe is an antibody, antigen-binding antibody fragment, single domain antibody (sdAb), recombinant heavy chain only antibody (VHH), single chain antibody (scFv), shark-derived variable domain (vNAR), Fv, Fab , Fab', F(ab')2, linear antibodies, diabodies, aptamers, peptidomimetic molecules, fusion proteins, reactive or non-reactive small molecules, or synthetic molecules. The method described in section.
(Item 128)
128. The method of any one of items 116-127, wherein said molecular probe comprises a targeting moiety capable of specific binding.
(Item 129)
129. The method of item 128, wherein said targeting moiety is configured to bind to nucleic acids, carbohydrates, lipids, polypeptides, post-translational modifications of polypeptides, or any combination thereof.
(Item 130)
130. The method of item 128 or item 129, wherein the targeting moiety is a protein-specific targeting moiety.
(Item 131)
130. The method of item 128 or item 129, wherein the targeting moiety is an epitope-specific targeting moiety.
(Item 132)
130. The method of item 128 or item 129, wherein said targeting moiety is a nucleic acid-specific targeting moiety.
(Item 133)
133. The method of any one of items 128-132, wherein the targeting moiety is configured to bind to a cell surface marker.
(Item 134)
134. The method of any one of items 128-133, wherein said binding in step (b) comprises chemical, covalent and/or reversible binding.
(Item 135)
135. The method of any one of items 116-134, wherein the detectable label comprises a radioisotope, fluorescent label, colorimetric label, or enzymatic substrate label.
(Item 136)
136. The method of any one of items 116-135, wherein assessing, eg, observing, the detectable label comprises acquiring a digital image of the spatial sample or portion thereof.
(Item 137)
137. The method of item 136, wherein two or more digital images of the spatial sample are acquired.
(Item 138)
138. The method of item 137, wherein said two or more digital images provide combined spatial information of said plurality of molecular probes.
(Item 139)
138. The method of item 137 or item 138, further comprising comparing, aligning and/or overlaying at least two of said images.
(Item 140)
139. The method of any one of items 116-139, further comprising deactivating the detectable label after evaluating, eg observing, the detectable label.
(Item 141)
141. The method of any one of items 116-140, wherein assessing, eg observing, the detectable label is performed using a microscope.
(Item 142)
142. The method of item 141, wherein evaluating, eg observing, the detectable label is performed using a fluorescence microscope.
(Item 143)
143. The method of any one of items 116-142, wherein information from the probe tag is transferred to the recording tag by primer extension or ligation.
(Item 144)
to item 143, wherein transferring information from the probe tag to the recording tag comprises contacting the spatial sample with a polymerase and a nucleotide mixture, thereby adding one or more nucleotides to the recording tag; described method.
(Item 145)
145. The method of any one of items 116-144, wherein information from the probe tag is transferred to a recording tag near the probe tag.
(Item 146)
146. Any one of items 116-145, wherein step (c) comprises transferring information from said probe tag to said recording tag, either directly or indirectly via a copy of said probe tag. described method.
(Item 147)
147. The method of any one of items 116-146, wherein step (c) comprises transferring said information from one probe tag to two or more recording tags.
(Item 148)
148. The method of any one of items 116-147, wherein the probe tag is amplified prior to step (c).
(Item 149)
149. The method of item 148, wherein said probe tag amplification is performed using an RNA polymerase.
(Item 150)
149. The method of item 148, wherein said amplification is linear amplification.
(Item 151)
151. The method of item 149 or item 150, wherein transferring information from the probe tags to the recording tags is performed using reverse transcription.
(Item 152)
152. The method of any one of items 116-151, wherein step (a) comprises providing a plurality of recording tags to the spatial samples.
(Item 153)
153. The method of any one of items 116-152, wherein the recording tags are included in a matrix applied to the spatial samples.
(Item 154)
153. The method of any one of items 116-152, wherein the recording tag is directly or indirectly associated with the macromolecule.
(Item 155)
155. The method of any one of items 116-151 and 154, wherein said macromolecule is directly or indirectly coupled to said recording tag.
(Item 156)
156. The method of any one of items 116-155, further comprising performing a macromolecular analysis assay.
(Item 157)
157. The method of item 156, wherein said macromolecular analytical assay is a polypeptide analytical assay.
(Item 158)
158. The method of item 156 or item 157, wherein said macromolecular analysis assay is performed in situ.
(Item 159)
159. The method of any one of items 156-158, further comprising releasing the macromolecules associated with the recording tags from the spatial sample prior to performing the macromolecular analysis assay.
(Item 160)
160. The method of any one of items 156-159, further comprising collecting the macromolecules associated with the recording tags prior to performing the macromolecular analysis assay.
(Item 161)
161. The method of any one of items 156-160, wherein said macromolecule is directly or indirectly coupled to a solid support prior to carrying out said macromolecular analytical assay.
(Item 162)
the macromolecular analysis assay comprising:
contacting the macromolecule with a binding agent capable of binding to the macromolecule, the binding agent comprising a coding tag having identifying information about the binding agent;
transferring the information of the coding tag to the recording tag to generate the decompressed recording tag.
(Item 163)
contacting the macromolecule with an additional binding agent capable of binding to the macromolecule, wherein the additional binding agent comprises a coding tag having identifying information about the additional binding agent. and
163. The method of item 162, further comprising repeating: transferring the identifying information of the coding tag for the additional binding agent to the extended recording tag one or more times.
(Item 164)
164. The method of item 162 or item 163, wherein transferring the identifying information of the coding tag to the recording tag is mediated by DNA ligase.
(Item 165)
164. The method of item 162 or item 163, wherein transferring said identifying information of said coding tag to said recording tag is mediated by a DNA polymerase.
(Item 166)
164. The method of item 162 or item 163, wherein transferring the identifying information of the coding tag to the recording tag is mediated by chemical ligation.
(Item 167)
167. The method of any one of items 162-166, wherein said coding tag further comprises a spacer, a binding cycle specific sequence, a unique molecular identifier, a universal priming site, or any combination thereof.
(Item 168)
168. The method of item 167, wherein said coding tag comprises a spacer at its 3' end.
(Item 169)
169. The method of any one of items 162-168, wherein said binding agent and said coding tag are joined by a linker.
(Item 170)
The method of any one of items 162-169, wherein said binding agent is a polypeptide or protein.
(Item 171)
171. The method of item 170, wherein said binding agent is a modified aminopeptidase, a modified aminoacyl-tRNA synthetase, a modified anticalin, or an antibody or binding fragment thereof.
(Item 172)
172. The method of any one of items 162-171, wherein said binding agent binds to a single amino acid residue, dipeptide, tripeptide or post-translational modification of said polypeptide.
(Item 173)
173. The method of item 172, wherein the binding agent binds to an N-terminal amino acid residue, a C-terminal amino acid residue, or an internal amino acid residue.
(Item 174)
173. The method of item 172, wherein the binding agent binds to a chemically modified N-terminal amino acid residue or a chemically modified C-terminal amino acid residue.
(Item 175)
175. The method of item 173 or item 174, wherein said binding agent binds to said N-terminal amino acid residue, and said N-terminal amino acid residue is cleaved after transferring said information of said coding tag to said recording tag. .
(Item 176)
175. The method of item 173 or item 174, wherein said binding agent binds to said C-terminal amino acid residue, and said C-terminal amino acid residue is cleaved after transferring said information of said coding tag to said recording tag. .
(Item 177)
177. The method of any one of items 162-176, wherein the extended recording tags comprise information from one or more probe tags and one or more coding tags.
(Item 178)
177. The method of any one of items 162-176, wherein the extended recording tag comprises information from two or more probe tags and two or more coding tags.
(Item 179)
179. The method of any one of items 116-178, wherein the extended recording tag is amplified prior to step (e).
(Item 180)
step (e) is sequencing by synthesis, sequencing by ligation, sequencing by hybridization, polony sequencing, ion-semiconductor sequencing, pyrosequencing, single-molecule real-time sequencing, nanopore-based sequencing, or 179. The method of any one of items 116-179, comprising direct imaging of DNA using advanced microscopy.
(Item 181)
181. Method according to any one of items 116 to 180, wherein said spatial sample comprises a plurality of said macromolecules, eg polypeptides.
(Item 182)
182. The method of any one of items 116-181, wherein said spatial sample is provided on a solid support.
(Item 183)
183. The method of item 182, wherein the spatial sample comprises a plurality of cells deposited on a surface.
(Item 184)
183. The method of any one of items 116-182, wherein the spatial sample comprises a tissue sample.
(Item 185)
183. The method of any one of items 116-182, wherein said spatial sample is a formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) section or cell spread.
(Item 186)
186. The method of any one of items 156-185, further comprising determining at least part of said sequence of said macromolecules and associating with its spatial position determined in step (d).
(Item 187)
186. The method of any one of items 116-185, further comprising treating said spatial sample with a fixative, a cross-linking agent and/or a permeabilizing agent.
(Item 188)
188. The method of item 187, wherein fixing, cross-linking and/or permeabilizing the spatial sample is performed prior to step (b).
(Item 189)
189. The method of any one of items 157-188, wherein said polypeptide is fragmented prior to performing said polypeptide analysis assay.
(Item 190)
189. The method of item 189, wherein said fragmentation is performed by contacting said polypeptide with a protease.
(Item 191)
191. The method of item 190, wherein said protease is trypsin, LysN, or LysC.
(Item 192)
biochips wherein said solid support comprises beads, porous beads, porous matrices, arrays, glass surfaces, silicon surfaces, plastic surfaces, filters, membranes, nylon, silicon wafer chips, flow-through chips, signal conversion electronics; 192. The method of any one of items 161-191, which is a microtiter well, an ELISA plate, a rotating interferometer disc, a nitrocellulose membrane, a nitrocellulose-based polymer surface, a nanoparticle or a microsphere.
(Item 193)
said solid support comprises polystyrene beads, polyacrylate beads, cellulose beads, dextran beads, polymeric beads, agarose beads, acrylamide beads, solid core beads, porous beads, paramagnetic beads, glass beads, or controlled porous beads; 193. A method according to item 192, including or any combination thereof.
(Item 194)
wherein the probe tag is a DNA molecule, a DNA with pseudo-complementary bases, an RNA molecule, a BNA molecule, an XNA molecule, an LNA molecule, a PNA molecule, a γPNA molecule, a non-nucleic acid sequenceable polymer such as a polysaccharide, a polypeptide, 194. A method according to any one of items 116-193, comprising peptides, or polyamides, or combinations thereof.
(Item 195)
195. The method of any one of items 116-194, wherein said probe tag comprises a universal priming site.
(Item 196)
196. The method of any one of items 116-195, wherein the probe tag comprises a barcode.
(Item 197)
197. The method of any one of items 116-196, wherein said probe tag comprises a spacer.
(Item 198)
wherein the recording tag is a DNA molecule, a DNA with pseudo-complementary bases, an RNA molecule, a BNA molecule, an XNA molecule, an LNA molecule, a PNA molecule, a γPNA molecule, a non-nucleic acid sequenceable polymer such as a polysaccharide, a polypeptide, 198. A method according to any one of items 116-197, comprising peptides, or polyamides, or combinations thereof.
(Item 199)
199. The method of any one of items 116-198, wherein said recording tag comprises a unique molecular identifier (UMI).
(Item 200)
199. The method of any one of items 116-199, wherein the recording tag comprises a compartment tag.
(Item 201)
200. The method of any one of items 116-200, wherein the recording tag comprises a universal priming site.
(Item 202)
200. The method of any one of items 116-200, wherein the recording tag comprises a spacer polymer.
(Item 203)
203. The method of item 202, wherein the spacer is at the 3' end of the recording tag.
(Item 204)
step (a) is performed before steps (b), (c), (d), (e) and (f);
step (b) is performed before steps (c), (d), (e) and (f);
step (c) is performed before or after step (d);
step (c) is performed before steps (e) and (f);
step (d) is performed before steps (e) and (f);
step (e) is performed after steps (a)(b), (c) and (d); and/or
204. The method of any one of items 116-203, wherein step (e) is performed before step (f).
(Item 205)
steps (a), (b), (c), (d), (e) and (f) occur in sequence, or
204. The method of any one of items 116-203, wherein steps (a), (b), (d), (c), (e) and (f) occur in sequence.
(Item 206)
206. The method of item 205, wherein steps (b), (c) and (d) are sequentially repeated two or more times before performing steps (e) and (f).
(Item 207)
206. The method of item 205, wherein steps (b), (d) and (c) are sequentially repeated two or more times before performing steps (e) and (f).
(Item 208)
208. The method of any one of items 156-207, wherein said macromolecular analysis assay is performed prior to steps (e) and (f).
(Item 209)
209. The method of any one of items 156-208, wherein said macromolecular analysis assay is performed after steps (a), (b), (c) and (d).
(Item 210)
The method of item 1, wherein the macromolecules of step (a) are provided with spatial tags.
(Item 211)
210. The method of item 210, wherein the spatial tag is directly or indirectly associated with the recording tag.
(Item 212)
212. The method of item 1 or items 210-211, wherein the recording tag comprises a UMI.
(Item 213)
213. The method of any one of items 1 and 210-212, wherein step (b) comprises analyzing said spatial tags in situ.
(Item 214)
214. The method of any one of items 1 and 210-213, wherein said spatial tag sequences are analyzed using microscopy-based methods.
(Item 215)
215. The method of item 214, wherein the microscope-based method is multiplexed.
(Item 216)
216. The method of any one of items 1 and 210-215, wherein said spatial tag sequences are analyzed by sequencing.
(Item 217)
217. The method of item 216, wherein said sequencing comprises sequencing by ligation, single molecule sequencing, single molecule fluorescence sequencing, or sequencing by probe detection.
(Item 218)
step (b) is
(b1) providing the spatial sample with a spatial probe comprising a spatial tag;
(b2) evaluating the spatial tag in situ to obtain the spatial location of the spatial tag within the spatial sample;
(b3) decompressing the recording tag by transferring information from the spatial tag in the spatial probe to the recording tag.
(Item 219)
step (b) is
(b1) binding a molecular probe comprising a detectable label and a probe tag to the macromolecule or a portion proximate to the macromolecule within the spatial sample;
(b2) evaluating, eg, observing, the detectable label to obtain spatial information of the molecular probe.

Claims

1. A method for analyzing a macromolecule, comprising:
(a) providing a spatial sample comprising macromolecules associated with recording tags at spatial locations;
(b) assessing in situ the spatial location of the macromolecule within the spatial sample; and
(c1) binding a molecular probe comprising a probe tag to the macromolecule or a portion of the macromolecule proximate to the macromolecule within the spatial sample;
(c2) extending the recording tag by transferring information from the probe tag in the molecular probe to the recording tag, where transferring information from the probe tag to the recording tag generates an extended recording tag; and
(d) determining the sequence of at least the probe tag within the extended recording tag;
(e) correlating the sequence of the probe tag determined in step (d) with the molecular probe and/or the spatial location evaluated in step (b);
Thereby associating information from the sequence of the extended recording tag or portion thereof determined in step (d) with the spatial location evaluated in step (b).

1. A method for analyzing a macromolecule, comprising:
(a) providing a spatial sample comprising a macromolecule associated with a recording tag;
(b1) providing a spatial probe to the spatial sample, the spatial probe comprising a spatial tag;
(b2) evaluating the spatial tag in situ to obtain the spatial location of the spatial tag within the spatial sample; and
(b3) decompressing the recording tag by transferring information from the spatial tag in the spatial probe to the recording tag;
(c1) binding a molecular probe comprising a probe tag to the macromolecule or a portion of the macromolecule proximate to the macromolecule within the spatial sample;
(c2) extending the recording tag by transferring information from the probe tag in the molecular probe to the recording tag, where transferring information from the spatial tag and/or probe tag to the recording tag generates an extended recording tag; and
(d) determining the sequence of the probe tags and spatial tags within at least the extended recording tag;
(e) correlating the sequence of the probe tag determined in step (d) with the spatial tag evaluated in step (b2);
Thereby associating information from the sequence of the extended recording tag or part thereof determined in step (d) with the spatial location of the spatial probe evaluated in step (b2).

assessing in situ the spatial location of the macromolecule within the spatial sample;
(b1) providing a spatial probe to the spatial sample, the spatial probe comprising a spatial tag;
(b2) evaluating the spatial tag in situ to obtain the spatial location of the spatial tag within the spatial sample; and
(b3) decompressing the recording tag by transferring information from the spatial tag in the spatial probe to the recording tag;
The method of claim 1 , further comprising determining the sequence of the spatial tags within the extended recording tag in step (d).

The method of claim 1, wherein the molecular probe further comprises a detectable label, and the method further comprises evaluating or observing the detectable label in step (b) to assess in situ the spatial location of the macromolecule within the spatial sample.

The method of any one of claims 1, 3, and 4, further comprising repeating steps (c1) and (c2) sequentially two or more times.

The method of claim 3, wherein the spatial probe comprises a solid support and a spatial tag comprising a nucleic acid.

The method of claim 3, wherein the spatial tag comprises a sequence complementary to the recording tag or a portion thereof.

The method of claim 3, wherein performing step (b2) includes acquiring an image of the spatial sample or a portion thereof.

The method of claim 3, wherein the spatial tag is evaluated in step (b2) using a decoder, the decoder comprising a detectable label and a sequence complementary to the spatial tag or a portion thereof, the detectable label comprising a radioisotope, a fluorescent label, a colorimetric label, or an enzyme substrate label.

The method of claim 3, wherein extending the recording tag by transferring information from the spatial tag to the recording tag comprises contacting the spatial sample with a polymerase and a nucleotide mixture, thereby adding one or more nucleotides to the recording tag.

The method of claim 1, further comprising performing a polymer analysis assay on the polymer associated with the recording tag, the polymer being directly or indirectly coupled to a solid support prior to performing the polymer analysis assay.

The polymer analysis assay comprises:
contacting the macromolecule with a binding agent capable of binding to the macromolecule, the binding agent comprising a coding tag having identifying information regarding the binding agent;
and extending the recording tag associated with the macromolecule by transferring information of the coding tag to the recording tag.

contacting the macromolecule with an additional binding agent capable of binding to the macromolecule, the additional binding agent comprising a coding tag having identifying information regarding the additional binding agent;
Extending the recording tag associated with the macromolecule by transferring the identification information of the coding tag for the additional binding agent to the recording tag one or more times.

1. A method for analyzing a macromolecule, comprising:
(a) providing a spatial sample comprising macromolecules associated with recording tags at spatial locations ;
(b1 ) binding a molecular probe comprising a probe tag to the macromolecule or a portion proximate to the macromolecule within the spatial sample, the molecular probe further comprising a detectable label ;
(b2) evaluating or observing the detectable label using an imaging method to evaluate in situ the spatial location of the macromolecule within the spatial sample; and
(b3 ) extending the recording tag by transferring information from the probe tag in the molecular probe to the recording tag , where the information transferred from the probe tag to the recording tag creates an extended recording tag; and
(c) repeating steps (b1) through (b3) by binding a second molecular probe having a second detectable label, transferring information from the probe tag of the second molecular probe to the extended recording tag associated with the macromolecule, and evaluating or observing the second detectable label;
( d ) determining the sequence of at least the probe tag within the extended recording tag;
( e ) correlating the sequence of the probe tag determined in step ( d ) with the spatial location of the macromolecule evaluated in step (b2) ;
Thereby, information from the sequence of the extended recording tag or part thereof determined in step ( d ) is associated with the spatial location evaluated in step ( b2 ).