JPWO2020232635A5

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Publication number: JPWO2020232635A5
Application number: JP2022502317A
Authority: JP
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2039-05-21

Description

本発明のいくつかの実施例において、ステップ（１）は、ユニバーサル配列が埋め込まれたトランスポザーゼを使用して前記ＤＮＡのサンプルに対して切断と転置処理を行い、ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するステップと、重亜硫酸水素塩を使用して前記ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを処理し、前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するステップと、をさらに含む。 In some embodiments of the present invention, step (1) uses a universal sequence-embedded transposase to cleave and transpose the DNA sample to obtain a universal sequence-bearing DNA sample. and treating the sample of universal sequence-bearing DNA using bisulfite to obtain the converted sample of universal sequence-bearing DNA.

詳しくは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）はＴｎ５トランスポゾンによって転置され、切断されたｇＤＮＡまたは遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子がリンカーによって接続されるか、またはＤＮＡがランダムに元のＤＮＡに複製されて一部のユニバーサル配列を導入し、ユニバーサル配列を導入したＤＮＡに重亜硫酸塩処理（ＢＳ処理）を行い、重亜硫酸塩変換後のＤＮＡ配列（元のＤＮＡ非メチル化修飾されたシトシン（Ｃ）がウラシル（Ｕ）に変換される）を取得する。導入されたユニバーサル配列に対してユニバーサルプライマーを設計し、変換されたＤＮＡ配列の標的領域の上流に特異的プライマーを設計し、特異的プライマーはＤＮＡテンプレート上の１本の鎖のみに対して設計され、ユニバーサルプライマーと特異的プライマーを介してＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ産物を取得する。同時に、増幅の特異性を増加するために、上記の特異的プライマーの下流にネストされたプライマーを設計するか、標的領域の下流に特異的プライマーを設計し、ネストされたプライマーまたは特異的プライマーはＤＮＡテンプレート上の１本の鎖のみに対して設計され、ネストされたプライマーまたは下流の特異的プライマーとユニバーサルプライマーを介して第１のステップのＰＣＲ産物に対して第２のステップの増幅を行い、最終に、重亜硫酸塩処理後のテンプレートに対するＰＣＲ増幅産物（ＢＳ－ＰＣＲ）を取得する。 Specifically, genomic DNA (gDNA) is transposed by a Tn5 transposon, cleaved gDNA or free DNA (cfDNA) molecules are connected by linkers, or the DNA is randomly replicated back to the original DNA and some universal The sequence was introduced, and the DNA into which the universal sequence was introduced was subjected to bisulfite treatment (BS treatment), and the DNA sequence after bisulfite conversion (original DNA unmethylated modified cytosine (C) was changed to uracil (U) ). A universal primer is designed for the introduced universal sequence, a specific primer is designed upstream of the target region of the converted DNA sequence, and the specific primer is designed for only one strand on the DNA template. , PCR amplification is performed via universal primers and specific primers to obtain PCR products. At the same time, to increase the specificity of amplification, design nested primers downstream of the above specific primers, or design specific primers downstream of the target region, the nested primers or specific primers are performing a second step amplification on the first step PCR product via nested primers or downstream specific primers and universal primers designed for only one strand on the DNA template; Finally, a PCR amplification product (BS-PCR) is obtained for the template after bisulfite treatment.

変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得するプロセス中に、ユニバーサル配列と重亜硫酸塩処理の順序に従って、必要に応じて、異なる方法を採用できる。
本発明の少なくともいくつかの実施形態において、以下のような方法によってユニバーサル配列を導入する。
ｇＤＮＡ、切断されたｇＤＮＡまたはｃｆＤＮＡは、最初に、重亜硫酸塩でＤＮＡ分子を処理し、次に、第１のシーケンシングプライマー、即ち３’端に６－１２個のランダムＮ塩基（Ａ／Ｔ／Ｃ／Ｇからなる縮重塩基）または６－１２個のランダムＨ塩基（Ａ／Ｔ／Ｃからなる縮重塩基）が付き、５’端に一部、全部のシーケンシングリンカー配列または固定配列（配列のシトシンにはメチル化修飾されたシトシンを優先的に使用する）が付くプライマー及びＤＮＡポリメラーゼを使用してテンプレートを複製し、５’端にユニバーサル配列付きの重亜硫酸塩処理後のＤＮＡテンプレート（図１に示す）を取得する。使用可能なシーケンシングリンカー配列はＭＧＩプラットフォームのシーケンシングリンカーを含み、ｉｌｌｕｍｉｎａとｐｒｏｔｏｎプラットフォームのシーケンシングリンカー配列も含むが、これらに制限されない。少なくともいくつかの実施例において、使用可能なＤＮＡポリメラーゼは通常のｒＴａｑ、Ｆｕｓｉｏｎであってもよいし、Ｂｓｔまたはｐｈｉ２９等であってもよい。 During the process of obtaining a sample of converted universal sequence-bearing DNA, different methods can be employed, as needed, according to the order of universal sequence and bisulfite treatment.
In at least some embodiments of the invention, universal sequences are introduced by methods such as the following.
gDNA, cleaved gDNA or cfDNA, is first treated with bisulfite to treat the DNA molecule and then treated with the first sequencing primer, 6-12 random N bases (A/T Degenerate bases consisting of /C/G) or 6-12 random H bases (degenerate bases consisting of A/T/C) with partial or complete sequencing linker sequence or fixed sequence at the 5' end (preferentially use methylation-modified cytosines for cytosines in the sequence) and DNA polymerase to replicate the template, bisulfite-treated DNA template with a universal sequence at the 5' end (shown in FIG. 1). Sequencing linker sequences that can be used include, but are not limited to, those of the MGI platform, and also those of the illumina and proton platforms. In at least some embodiments, the DNA polymerase that can be used can be conventional rTaq, Fusion, Bst or phi29, or the like.

本発明の少なくともいくつかの実施形態において、以下のような方法によってユニバーサル配列を導入する。
切断されたｇＤＮＡまたはｃｆＤＮＡに対して末端修復して塩基Ａを追加し、次に、特定のリンカー配列を追加し、配列は一部、全部のシーケンシングリンカー配列または修飾されたシーケンシングリンカー配列であってもよく、これらの修飾されたシーケンシングリンカー配列は、１本の鎖の３端塩基が非ヒドロキシル基によって修飾されている固定配列付きのシーケンシングリンカー配列、または固定配列付きのシーケンシングリンカー配列、または１本の鎖の３’端の塩基が非ヒドロキシル基によって修飾されている固定配列付きのシーケンシングリンカー配列であってもよく、図４に示すような符号１、符号２、符号３及び符号４に示す。精製後、亜硫酸塩を使用してユニバーサル配列を加えた産物を処理して、変換されたＤＮＡテンプレート（図２）を取得する。 In at least some embodiments of the invention, universal sequences are introduced by methods such as the following.
The cleaved gDNA or cfDNA is end-repaired to add base A, and then a specific linker sequence is added, the sequence is partially, wholly or with a modified sequencing linker sequence. These modified sequencing linker sequences are sequencing linker sequences with fixed sequences in which the 3 terminal bases of one strand are modified with non-hydroxyl groups, or sequencing linkers with fixed sequences sequence, or a sequencing linker sequence with a fixed sequence in which the base at the 3′ end of one strand is modified by a non-hydroxyl group, 1, 2, 3 as shown in FIG. and 4. After purification, sulfite is used to treat the universal sequence plus product to obtain the converted DNA template (FIG. 2).

本発明の少なくともいくつかの実施形態において、前記ユニバーサル変換モジュールは、図１２に示すように、転置ユニットと転置ユニットに接続される変換ユニットを備える。前記転置ユニットは、トランスポザーゼを使用して前記ＤＮＡのサンプルに対して切断と転置処理を行い、ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得する。前記トランスポザーゼにはユニバーサル配列が埋め込まれている。前記変換ユニットは、重亜硫酸水素塩を使用して前記ユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを処理し、前記変換されたユニバーサル配列付きのＤＮＡのサンプルを取得する。 In at least some embodiments of the invention, the universal transform module comprises a transpose unit and a transform unit connected to the transpose unit, as shown in FIG. The transposition unit uses transposase to cleave and transpose the DNA sample to obtain a DNA sample with a universal sequence. The transposase is embedded with universal sequences. The conversion unit treats the sample of universal sequence-bearing DNA using bisulfite to obtain the converted sample of universal sequence-bearing DNA.

実施例２メチル化マルチＰＣＲライブラリー構築シーケンシング
実験設計
２００－３００ｂｐに切断されたＹａｎｈｕａｎｇゲノムＤＮＡを使用して、次に、本発明によって提供された方法に従ってＤＮＡターゲットを絞ったメチル化ライブラリーを調製し、ライブラリーをＭＧＩＳＥＱ－２０００シーケンサーにオンマシンシーケンシングを行い、シーケンシングタイプがＰＥ１００であり、そして、データ利用率、比較率、アンプリコン特異性、均一性などの性能を含むデータ分析を行った。 Example 2 Methylation Multi-PCR Library Construction Sequencing Experimental Design Yanhuang genomic DNA cleaved to 200-300 bp was then used to construct a DNA-targeted methylation library according to the method provided by the present invention. prepared and subjected to on-machine sequencing of the library on an MGISEQ-2000 sequencer, the sequencing type being PE100, and data analysis including performance such as data utilization, comparability, amplicon specificity, homogeneity, etc. gone.

Claims

Step (1) is
cleaving and transposing the DNA sample using a universal sequence-embedded transposase to obtain a universal sequence-attached DNA sample;
treating the sample of universal sequence-bearing DNA using bisulfite to obtain the converted sample of universal sequence-bearing DNA. described method.