本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、記載されているが、そのような実施形態は単に例として提供されていることは当業者には明白である。当業者には、本発明から逸脱することなく多数の変形、変化および置換をすぐに想起される。本明細書に記載の発明の実施形態に対する種々の代替を本発明の実施に用いることができることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲により本発明の範囲が定義されること、ならびに、それにより、これらの特許請求の範囲内に入る方法および構造ならびにそれらの等価物が網羅されることが意図される。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップと、
前記鋳型核酸分子の３’末端を前記捕捉プローブの５’末端に結合させ、それにより、前記捕捉プローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップと、
第１のアダプタープライマーを前記捕捉プローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップと、
前記第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップと、
第２のアダプターを前記第１の伸長産物の３’末端に結合させ、それにより、前記第２のアダプターに結合した第１の伸長産物を生成するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記捕捉プローブが、分子バーコードをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第２のアダプターを結合させるステップの前に前記鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記第２のアダプターが二本鎖アダプターであり、前記第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が前記鋳型核酸分子に結合する、項目３に記載の方法。
（項目５）
第２のアダプタープライマーを前記第２のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目６に記載の方法。
（項目９）
捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップと、
前記鋳型核酸分子の３’末端を前記捕捉プローブの５’末端に結合させ、それにより、前記捕捉プローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップと、
前記捕捉プローブに結合した前記鋳型核酸分子をバイサルファイトで処理するステップと
を含む方法。
（項目１０）
第１のアダプタープライマーを前記捕捉プローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
第２のアダプターを前記第１の伸長産物の３’末端に結合させ、それにより、前記第２のアダプターに結合した第１の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記捕捉プローブが、分子バーコードをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記第２のアダプターを結合させるステップの前に前記鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記第２のアダプターが二本鎖アダプターであり、前記第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が前記鋳型核酸分子に結合する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
第２のアダプタープライマーを前記第２のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記第２のアダプターに結合した第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
標的特異的プライマーを前記第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目２１）
前記標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記標的特異的プライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップと、
前記鋳型核酸分子の３’末端を前記捕捉プローブの５’末端に結合させ、それにより、前記捕捉プローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップと、
前記捕捉プローブの３’末端を伸長させ、それにより、前記鋳型核酸分子に結合した第１の伸長産物を生成するステップと
を含む方法。
（項目２５）
前記捕捉プローブに結合した前記鋳型核酸分子をバイサルファイトで処理するステップをさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記捕捉プローブが、第１のアダプターを含む、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２７）
前記捕捉プローブが、分子バーコードをさらに含む、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２８）
前記鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２９）
第２のアダプターを前記鋳型核酸分子の５’末端に結合させるステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
前記第２のアダプターを結合させるステップの前に前記鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記第２のアダプターが、二本鎖アダプターである、項目２６に記載の方法。
（項目３２）
前記第１のアダプタープライマーを前記捕捉プローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
前記第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
第２のアダプタープライマーを前記第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
標的特異的プライマーを前記第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、項目３３に記載の方法。
（項目３９）
前記標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記標的特異的プライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４２）
捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップと、
前記鋳型核酸分子の３’末端を前記捕捉プローブの５’末端に結合させ、それにより、前記捕捉プローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップと、
前記標的特異的領域を脱離させるステップと
を含む方法。
（項目４３）
前記標的特異的領域を脱離させるステップの前に、前記捕捉プローブに結合した前記鋳型核酸分子をバイサルファイトで処理するステップをさらに含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記捕捉プローブが、分子バーコードをさらに含む、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４５）
第１のアダプタープライマーを前記捕捉プローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含む、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４６）
前記第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
第２のアダプターを前記第１の伸長産物の３’末端に結合させ、それにより、前記第２のアダプターに結合した第１の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
標的特異的プライマーを前記第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、項目４６に記載の方法。
（項目５２）
前記標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記標的特異的プライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域を鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、前記第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列がアダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合する、ステップと、
前記鋳型核酸分子の３’末端を前記アダプターアンカープローブの５’末端に結合させ、それにより、前記アダプターアンカープローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップと
を含む方法。
（項目５６）
前記アダプターアンカープローブに結合した前記鋳型核酸分子をバイサルファイトで処理するステップをさらに含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記アダプターアンカープローブが、分子バーコードをさらに含む、項目５５または５６に記載の方法。
（項目５８）
前記第１の架橋プローブの前記第１の標的特異的領域が前記第１の架橋プローブの３’部位に存在する、項目５５または５６に記載の方法。
（項目５９）
前記第１の架橋プローブの前記第１の標的特異的領域が前記第１の架橋プローブの５’部位に存在する、項目５５または５６に記載の方法。
（項目６０）
前記第１の架橋プローブが、前記第１の標的特異的領域と前記第１のアダプターランディング配列との間に第１のリンカーを含む、項目５５または５６に記載の方法。
（項目６１）
前記結合させるステップが、前記鋳型核酸分子の前記３’末端を前記アダプターアンカープローブの前記５’末端にリガーゼを用いてライゲーションすることを含む、項目５５または５６に記載の方法。
（項目６２）
第１のアダプタープライマーを前記アダプターアンカープローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含む、項目５５または５６に記載の方法。
（項目６３）
前記第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
第２のアダプターを前記第１の伸長産物の３’末端に結合させ、それにより、前記第２のアダプターに結合した第１の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記第２のアダプターを結合させるステップの前に前記鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６６）
前記第２のアダプターが二本鎖アダプターであり、前記第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が前記鋳型核酸分子に結合する、項目６４に記載の方法。
（項目６７）
第２のアダプタープライマーを、前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物内の前記第２のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含む、項目６４に記載の方法。
（項目６８）
前記第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目６８に記載の方法。
（項目７１）
標的特異的プライマーを前記第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、項目６３に記載の方法。
（項目７２）
前記標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記標的特異的プライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
第１の架橋結合配列を脱離させるステップをさらに含む、項目５５または５３に記載の方法。
（項目７６）
前記第１の架橋プローブの３’末端を伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目５５または５６に記載の方法。
（項目７７）
前記アダプターアンカープローブが、第１のアダプターを含む、項目５５または５６に記載の方法。
（項目７８）
第２のアダプターを前記鋳型核酸分子の５’末端に結合させるステップをさらに含む、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記第２のアダプターを結合させるステップの前に前記鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記アダプターが二本鎖アダプターである、項目７８に記載の方法。
（項目８１）
第１のアダプタープライマーを前記アダプターアンカープローブの前記第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含む、項目７８に記載の方法。
（項目８２）
前記第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
第２のアダプタープライマーを前記第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目８４に記載の方法。
（項目８７）
標的特異的プライマーを前記第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、項目８２に記載の方法。
（項目８８）
前記標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記標的特異的プライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目８８に記載の方法。
（項目９１）
第２の架橋プローブの第２の標的配列領域を前記鋳型核酸分子の第２の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、前記第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列が前記アダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合する、ステップをさらに含む、項目５５または５６に記載の方法。
（項目９２）
前記第２の架橋プローブの前記第２の標的特異的領域が前記第２の架橋プローブの３’部位に存在する、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
前記第２の架橋プローブの前記第２の標的特異的領域が前記第２の架橋プローブの５’部位に存在する、項目９１に記載の方法。
（項目９４）
前記第２の架橋プローブが、前記第２の標的特異的領域と前記第２のアダプターランディング配列との間に第２のリンカーを含む、項目９１に記載の方法。
（項目９５）
ｉ）前記第１の架橋プローブの前記第１の標的特異的領域が前記第１の架橋プローブの３’部位に存在し、前記第２の架橋プローブの前記第２の標的特異的領域が前記第２の架橋プローブの３’部位に存在する；ｉｉ）前記第１の架橋プローブの前記第１の標的特異的領域が前記第１の架橋プローブの５’部位に存在し、前記第２の架橋プローブの前記第２の標的特異的領域が前記第２の架橋プローブの５’部位に存在する；ｉｉｉ）前記第１の架橋プローブの前記第１の標的特異的領域が前記第１の架橋プローブの３’部位に存在し、前記第２の架橋プローブの前記第２の標的特異的領域が前記第２の架橋プローブの５’部位に存在する；またはｉｖ）前記第１の架橋プローブの前記第１の標的特異的領域が前記第１の架橋プローブの５’部位に存在し、前記第２の架橋プローブの前記第２の標的特異的領域が前記第２の架橋プローブの３’部位に存在する、項目９１に記載の方法。
（項目９６）
前記第１の架橋プローブの前記第１の標的特異的領域が前記第１の架橋プローブの３’部位に存在し、前記第２の架橋プローブの前記第２の標的特異的領域が前記第２の架橋プローブの５’部位に存在し、前記第１の架橋プローブの第１のリンカーと前記第２の架橋プローブの第２のリンカーが、互いにハイブリダイズする、項目９１に記載の方法。
（項目９７）
捕捉プローブまたは前記架橋プローブの標的配列領域が、前記鋳型核酸分子の前記標的配列に基づいて設計されたものであり、前記鋳型核酸の前記標的配列が、前記バイサルファイト処理後にメチル化されていないシトシンを保持する、項目９、２５、４３、または５６に記載の方法。
（項目９８）
核酸分子をバイサルファイトで処理し、それにより、項目１、２４、４２、または５５に記載の鋳型核酸分子を生成するステップであって、項目１、２４、４２、または５５に記載の鋳型核酸分子が、前記バイサルファイト処理の産物である、ステップをさらに含む、項目１、２４、４２または５５に記載の方法。
（項目９９）
捕捉プローブまたは前記架橋プローブの標的配列領域が、前記バイサルファイト処理後の前記鋳型核酸分子の前記標的配列に基づいて設計されたものであり、鋳型核酸内のメチル化されていないシトシンが、前記バイサルファイト処理中にウラシルに変換される、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
核酸分子の５’末端を脱リン酸化し、それにより、項目１、９、２４、４２または５５に記載の鋳型核酸分子を生成するステップをさらに含む、項目１、９、２４、４２または５５に記載の方法。
（項目１０１）
前記捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブが、標識をさらに含む、項目１、９、２４、４２または５５に記載の方法。
（項目１０２）
前記標識によって前記架橋プローブを捕捉するステップをさらに含む、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
前記標識がビオチンである、項目１０１に記載の方法。
（項目１０４）
前記標識を固体支持体上に捕捉する、項目１０２に記載の方法。
（項目１０５）
前記固体支持体がビーズである、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記ビーズが、前記標識を標的とする捕捉用部分を含む、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記捕捉用部分がストレプトアビジンである、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
前記鋳型核酸分子の前記３’末端を項目１、９、２４、４２または５５に記載の捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブの前記５’末端に結合させた後、核酸分子を３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させるステップであって、前記核酸分子が、前記捕捉プローブおよび前記鋳型核酸分子を含む、ステップをさらに含む、項目１、９、２４、４２または５５に記載の方法。
（項目１０９）
前記増幅産物の配列決定を行うステップをさらに含む、項目１８、２２、３６、４０、６９、７３、８５、または８９に記載の方法。
（項目１１０）
前記配列決定が次世代シーケンシングを含む、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記鋳型核酸分子が一本鎖ＤＮＡを含む、項目１、９、２４、４２、または５５に記載の方法。
（項目１１２）
前記鋳型核酸分子がＲＮＡを含む、項目１、９、２４、４２、または５５に記載の方法。
（項目１１３）
前記鋳型核酸分子が損傷ＤＮＡを含む、項目１、９、２４、４２、または５５に記載の方法。
（項目１１４）
前記鋳型核酸分子が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料に由来する、項目１、９、２４、４２、または５５に記載の方法。
（項目１１５）
前記鋳型核酸分子が、生体試料由来の無細胞核酸を含む、項目１、９、２４、４２、または５５に記載の方法。
（項目１１６）
前記無細胞核酸が無細胞ＤＮＡを含む、項目１１５に記載の方法。
（項目１１７）
前記無細胞ＤＮＡが循環腫瘍ＤＮＡを含む、項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ修復ステップが項目１、９、２４、４２、または５５の前には前記鋳型核酸分子に実施されない、項目１、９、２４、４２、または５５に記載の方法。
（項目１１９）
プローブを使用して標的配列を捕捉するステップであって、前記プローブが前記標的配列にハイブリダイズし、前記プローブが前記標的配列を含む鋳型に結合する、ステップと、
前記プローブに結合した前記標的配列をバイサルファイトで処理するステップと
を含む方法。
（項目１２０）
架橋プローブを使用して標的配列を捕捉するステップであって、前記架橋プローブにより、アンカープローブの前記標的配列への結合が容易になる、ステップを含む方法。
（項目１２１）
前記アンカープローブに結合した前記標的配列をバイサルファイトで処理するステップをさらに含む、項目１２０に記載の方法。
（項目１２２）
鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズする標的特異的領域および前記鋳型核酸分子の３’末端に結合する５’末端を含む捕捉プローブと、
前記捕捉プローブの第１のアダプターにハイブリダイズする第１のアダプタープライマーであって、それが伸長することにより、第１の伸長産物が生成される、前記第１のアダプタープライマーと、
前記第１の伸長産物に結合する第２のアダプターと、
前記第２のアダプターにハイブリダイズする第２のアダプタープライマーと
を含むキット。
（項目１２３）
鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズする標的特異的領域を含む架橋プローブと、
前記架橋プローブのアダプターランディング配列にハイブリダイズする架橋結合配列および前記鋳型核酸分子の３’末端に結合する５’末端を含むアダプターアンカープローブと
を含むキット。
（項目１２４）
捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、前記捕捉プローブが、前記標的特異的領域の５’末端に位置する第１のアダプターをさらに含む、ステップと、
前記鋳型核酸分子を、前記標的特異的領域をハイブリダイズさせた後に、３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させるステップと、
前記鋳型核酸分子の３’末端を前記第１のアダプターを鋳型として使用して伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップと
を含む方法。
（項目１２５）
前記捕捉プローブの３’末端を伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
前記第１のアダプターを含むプライマーを前記第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、前記第１のアダプターを含む前記プライマーの３’末端を伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップとをさらに含む、項目１２４に記載の方法。
（項目１２７）
第２のアダプターを前記第１の伸長産物の５’末端に結合させるステップをさらに含む、項目１２５または１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記第２のアダプターを前記結合させるステップの前に、前記第１の伸長産物の前記５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、項目１２７に記載の方法。
（項目１２９）
前記第２のアダプターが二本鎖アダプターであり、前記第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が前記第２の伸長産物に結合する、項目１２７または１２８に記載の方法。
（項目１３０）
前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目１２９に記載の方法。
（項目１３１）
標的特異的プライマーを前記第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップであって、前記標的特異的プライマーが第２のアダプターに結合する、ステップと、
前記標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップと
をさらに含む、項目１２５または１２６に記載の方法。
（項目１３２）
前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
前記捕捉プローブが、分子バーコードをさらに含む、項目１２４に記載の方法。
（項目１３４）
前記捕捉プローブが、結合性部分をさらに含む、項目１２４に記載の方法。
（項目１３５）
前記結合性部分が、支持体に結合する、項目１３４に記載の方法。
（項目１３６）
前記支持体がビーズである、項目１３５に記載の方法。
（項目１３７）
前記ビーズがストレプトアビジンビーズである、項目１３６に記載の方法。
（項目１３８）
前記結合性部分がビオチンである、項目１３４に記載の方法。
（項目１３９）
第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域を鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、前記第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列がアダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合する、ステップと、
第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域を前記鋳型核酸分子の第２の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、前記第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列が前記アダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合する、ステップと、
前記第１の架橋プローブの３’末端を伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップと
を含む方法。
（項目１４０）
前記第１の架橋プローブが、第１のアダプターを含む、項目１３９に記載の方法。
（項目１４１）
第２のアダプターを前記第１の伸長産物の３’末端に結合させるステップをさらに含む、項目１４０に記載の方法。
（項目１４２）
前記第２のアダプターが二本鎖アダプターであり、前記第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が前記鋳型核酸分子に結合する、項目１４１に記載の方法。
（項目１４３）
前記第２のアダプターを結合させるステップの前に、前記鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、項目１４２に記載の方法。
（項目１４４）
標的特異的プライマーを前記第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、前記標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップとをさらに含む、項目１４０に記載の方法。
（項目１４５）
前記標的特異的プライマーを第２のアダプターに結合させる、項目１４４に記載の方法。
（項目１４６）
前記第１のアダプターを含むプライマーを前記第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、前記第１のアダプターを含む前記プライマーの３’末端を伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップとをさらに含む、項目１４５に記載の方法。
（項目１４７）
前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目１４６に記載の方法。
（項目１４８）
前記第１の架橋プローブが、分子バーコードをさらに含む、項目１３９に記載の方法。
（項目１４９）
前記第１の架橋プローブが、結合性部分をさらに含む、項目１３９に記載の方法。
（項目１５０）
前記結合性部分が、支持体に結合する、項目１４９に記載の方法。
（項目１５１）
前記支持体がビーズである、項目１５０に記載の方法。
（項目１５２）
前記ビーズがストレプトアビジンビーズである、項目１５１に記載の方法。
（項目１５３）
前記結合性部分がビオチンである、項目１４９に記載の方法。
（項目１５４）
第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域を鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、前記第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合し、前記第１の架橋プローブが、前記標的特異的領域の５’末端に位置する第１のアダプターをさらに含む、ステップと、
前記鋳型核酸分子を、前記第１の標的特異的領域をハイブリダイズさせた後に、３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させるステップと、
前記鋳型核酸分子の３’末端を前記第１のアダプターを鋳型として使用して伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップと
を含む方法。
（項目１５５）
前記第１のアダプターを含むプライマーを前記第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、前記第１のアダプターを含む前記プライマーの３’末端を伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップとをさらに含む、項目１５４に記載の方法。
（項目１５６）
第２のアダプターを前記第１の伸長産物の５’末端に結合させるステップをさらに含む、項目１５５に記載の方法。
（項目１５７）
前記第２のアダプターを結合させるステップの前に、前記第１の伸長産物の前記５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、項目１５６に記載の方法。
（項目１５８）
前記第２のアダプターが二本鎖アダプターであり、前記第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が前記第２の伸長産物に結合する、項目１５７に記載の方法。
（項目１５９）
標的特異的プライマーを前記第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、前記標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップとをさらに含む、項目１５８に記載の方法。
（項目１６０）
前記標的特異的プライマーを第２のアダプターに結合させる、項目１５９に記載の方法。
（項目１６１）
前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、項目１５９に記載の方法。
（項目１６２）
前記鋳型核酸分子を前記３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させるステップにより、前記鋳型核酸分子の前記３’末端において１つまたは複数のヌクレオチドが切断される、項目１５４に記載の方法。
（項目１６３）
前記第１の架橋プローブが、分子バーコードをさらに含む、項目１５４に記載の方法。
（項目１６４）
前記第１の架橋プローブが、結合性部分をさらに含む、項目１５４に記載の方法。
（項目１６５）
前記結合性部分が、支持体に結合する、項目１６４に記載の方法。
（項目１６６）
前記支持体がビーズである、項目１６５に記載の方法。
（項目１６７）
前記ビーズがストレプトアビジンビーズである、項目１６６に記載の方法。
（項目１６８）
結合性部分がビオチンである、項目１６４に記載の方法。
While preferred embodiments of the present invention have been shown and described herein, it will be apparent to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. Numerous variations, changes and substitutions will readily occur to those skilled in the art without departing from the invention. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be used in practicing the invention. It is intended that the following claims define the scope of the invention and that methods and structures falling within the scope of these claims and their equivalents be covered thereby.
In certain embodiments, for example, the following items are provided.
(Item 1)
hybridizing the target-specific region of the capture probe to the target sequence of the template nucleic acid molecule;
binding the 3′ end of the template nucleic acid molecule to the 5′ end of the capture probe, thereby producing a template nucleic acid molecule bound to the capture probe;
hybridizing a first adapter primer to a first adapter of said capture probe;
extending the first adapter primer, thereby generating a first extension product;
attaching a second adapter to the 3′ end of said first extension product, thereby producing a first extension product attached to said second adapter;
method including.
(Item 2)
The method of item 1, wherein said capture probe further comprises a molecular barcode.
(Item 3)
2. The method of item 1, further comprising phosphorylating the 5' end of the template nucleic acid molecule prior to binding the second adapter.
(Item 4)
4. The method of item 3, wherein said second adapter is a double-stranded adapter and one of the two strands of said second adapter binds to said template nucleic acid molecule.
(Item 5)
2. The method of item 1, further comprising hybridizing a second adapter primer to said second adapter.
(Item 6)
6. The method of item 5, further comprising extending said second adapter primer, thereby generating a second extension product.
(Item 7)
7. The method of item 6, further comprising amplifying said first extension product and said second extension product bound to said second adapter, thereby generating an amplification product.
(Item 8)
amplifying said first extension product and said second extension product bound to said second adapter using said first adapter primer and said second adapter primer, thereby generating an amplification product; 7. The method of item 6, further comprising:
(Item 9)
hybridizing the target-specific region of the capture probe to the target sequence of the template nucleic acid molecule;
binding the 3′ end of the template nucleic acid molecule to the 5′ end of the capture probe, thereby producing a template nucleic acid molecule bound to the capture probe;
treating the template nucleic acid molecule bound to the capture probe with bisulfite;
method including.
(Item 10)
10. The method of item 9, further comprising hybridizing a first adapter primer to the first adapter of said capture probe.
(Item 11)
11. The method of item 10, further comprising extending said first adapter primer, thereby generating a first extension product.
(Item 12)
12. The method of item 11, further comprising attaching a second adapter to the 3' end of said first extension product, thereby producing a first extension product attached to said second adapter.
(Item 13)
10. The method of item 9, wherein said capture probe further comprises a molecular barcode.
(Item 14)
13. The method of item 12, further comprising phosphorylating the 5' end of the template nucleic acid molecule prior to binding the second adapter.
(Item 15)
15. The method of item 14, wherein said second adapter is a double-stranded adapter and one of the two strands of said second adapter binds to said template nucleic acid molecule.
(Item 16)
13. The method of item 12, further comprising hybridizing a second adapter primer to said second adapter.
(Item 17)
17. The method of item 16, further comprising extending said second adapter primer, thereby generating a second extension product.
(Item 18)
18. The method of item 17, further comprising amplifying said first extension product and said second extension product bound to said second adapter, thereby generating amplification products.
(Item 19)
amplifying the first extension product bound to the second adapter and the second extension product using the first adapter primer and the second adapter primer, thereby generating an amplification product; 18. The method of item 17, further comprising.
(Item 20)
12. The method of item 11, further comprising hybridizing a target-specific primer to said first extension product.
(Item 21)
21. The method of item 20, further comprising extending said target-specific primer thereby generating a second extension product.
(Item 22)
22. The method of item 21, further comprising amplifying said first extension product and said second extension product bound to said second adapter, thereby generating amplification products.
(Item 23)
amplifying said first extension product and said second extension product bound to said second adapter with said first adapter primer and said target-specific primer, thereby generating an amplification product; 20. The method of item 19, further comprising.
(Item 24)
hybridizing the target-specific region of the capture probe to the target sequence of the template nucleic acid molecule;
binding the 3′ end of the template nucleic acid molecule to the 5′ end of the capture probe, thereby producing a template nucleic acid molecule bound to the capture probe;
extending the 3′ end of said capture probe, thereby producing a first extension product bound to said template nucleic acid molecule;
method including.
(Item 25)
25. The method of item 24, further comprising treating the template nucleic acid molecule bound to the capture probe with bisulfite.
(Item 26)
26. Method according to item 24 or 25, wherein said capture probe comprises a first adapter.
(Item 27)
26. The method of item 24 or 25, wherein said capture probe further comprises a molecular barcode.
(Item 28)
26. The method of item 24 or 25, further comprising phosphorylating the 5' end of said template nucleic acid molecule.
(Item 29)
27. The method of item 26, further comprising attaching a second adapter to the 5' end of said template nucleic acid molecule.
(Item 30)
30. The method of item 29, further comprising phosphorylating the 5' end of the template nucleic acid molecule prior to binding the second adapter.
(Item 31)
27. The method of item 26, wherein said second adapter is a double-stranded adapter.
(Item 32)
30. The method of item 29, further comprising hybridizing said first adapter primer to a first adapter of said capture probe.
(Item 33)
33. The method of item 32, further comprising extending said first adapter primer, thereby generating a second extension product.
(Item 34)
34. The method of item 33, further comprising hybridizing a second adapter primer to said second extension product.
(Item 35)
35. The method of item 34, further comprising extending said second adapter primer, thereby generating a third extension product.
(Item 36)
36. The method of item 35, further comprising amplifying said second extension product and said third extension product, thereby generating amplified products.
(Item 37)
35. The method of item 34, further comprising amplifying said second extension product and said third extension product with said first adapter primer and said second adapter primer, thereby generating an amplification product. the method of.
(Item 38)
34. The method of item 33, further comprising hybridizing a target-specific primer to said second extension product.
(Item 39)
39. The method of item 38, further comprising extending said target-specific primer thereby generating a third extension product.
(Item 40)
40. The method of item 39, further comprising amplifying said second extension product and said third extension product, thereby generating amplified products.
(Item 41)
39. The method of item 38, further comprising amplifying said second extension product and said third extension product with said first adapter primer and said target-specific primer, thereby generating an amplification product. Method.
(Item 42)
hybridizing the target-specific region of the capture probe to the target sequence of the template nucleic acid molecule;
binding the 3′ end of the template nucleic acid molecule to the 5′ end of the capture probe, thereby producing a template nucleic acid molecule bound to the capture probe;
releasing said target-specific region;
method including.
(Item 43)
43. The method of item 42, further comprising treating the template nucleic acid molecule bound to the capture probe with bisulfite prior to releasing the target-specific region.
(Item 44)
44. The method of item 42 or 43, wherein said capture probe further comprises a molecular barcode.
(Item 45)
44. The method of item 42 or 43, further comprising hybridizing a first adapter primer to the first adapter of said capture probe.
(Item 46)
46. The method of item 45, further comprising extending said first adapter primer, thereby generating a first extension product.
(Item 47)
47. The method of item 46, further comprising attaching a second adapter to the 3' end of said first extension product, thereby producing a first extension product attached to said second adapter.
(Item 48)
48. The method of item 47, further comprising extending said second adapter primer, thereby generating a second extension product.
(Item 49)
49. The method of item 48, further comprising amplifying said first extension product and said second extension product bound to said second adapter, thereby generating an amplification product.
(Item 50)
amplifying said first extension product and said second extension product bound to said second adapter using said first adapter primer and said second adapter primer, thereby generating an amplification product; 49. The method of item 48, further comprising:
(Item 51)
47. The method of item 46, further comprising hybridizing a target-specific primer to said first extension product.
(Item 52)
52. The method of item 51, further comprising extending said target-specific primer, thereby generating a second extension product.
(Item 53)
53. The method of item 52, further comprising amplifying said first extension product and said second extension product, thereby generating an amplification product.
(Item 54)
53. The method of item 52, further comprising amplifying said first extension product and said second extension product with said first adapter primer and said target-specific primer, thereby generating an amplification product. Method.
(Item 55)
hybridizing a first target-specific region of a first bridging probe to a first target sequence of a template nucleic acid molecule, wherein the first adapter landing sequence of said first bridging probe is an adapter anchor probe; binding to the first cross-linking sequence;
ligating the 3′ end of the template nucleic acid molecule to the 5′ end of the adapter anchor probe, thereby producing a template nucleic acid molecule bound to the adapter anchor probe;
method including.
(Item 56)
56. The method of item 55, further comprising treating the template nucleic acid molecule bound to the adapter anchor probe with bisulfite.
(Item 57)
57. The method of item 55 or 56, wherein said adapter anchor probe further comprises a molecular barcode.
(Item 58)
57. The method of item 55 or 56, wherein said first target-specific region of said first cross-linking probe is at the 3' portion of said first cross-linking probe.
(Item 59)
57. The method of item 55 or 56, wherein said first target-specific region of said first cross-linking probe is at the 5' portion of said first cross-linking probe.
(Item 60)
57. The method of item 55 or 56, wherein said first bridging probe comprises a first linker between said first target-specific region and said first adapter landing sequence.
(Item 61)
57. The method of items 55 or 56, wherein said joining step comprises ligating said 3' end of said template nucleic acid molecule to said 5' end of said adapter anchor probe using a ligase.
(Item 62)
57. The method of item 55 or 56, further comprising hybridizing a first adapter primer to the first adapter of said adapter anchor probe.
(Item 63)
63. The method of item 62, further comprising extending said first adapter primer, thereby generating a first extension product.
(Item 64)
64. The method of item 63, further comprising attaching a second adapter to the 3' end of said first extension product, thereby producing a first extension product attached to said second adapter.
(Item 65)
2. The method of item 1, further comprising phosphorylating the 5' end of the template nucleic acid molecule prior to binding the second adapter.
(Item 66)
65. The method of item 64, wherein said second adapter is a double-stranded adapter and one of the two strands of said second adapter binds to said template nucleic acid molecule.
(Item 67)
65. The method of item 64, further comprising hybridizing a second adapter primer to said second adapter within said first extension product bound to said second adapter.
(Item 68)
68. The method of item 67, further comprising extending said second adapter primer, thereby generating a second extension product.
(Item 69)
69. The method of item 68, further comprising amplifying said first extension product and said second extension product bound to said second adapter, thereby generating an amplification product.
(Item 70)
amplifying said first extension product and said second extension product bound to said second adapter using said first adapter primer and said second adapter primer, thereby generating an amplification product; 69. The method of item 68, further comprising:
(Item 71)
64. The method of item 63, further comprising hybridizing a target-specific primer to said first extension product.
(Item 72)
72. The method of item 71, further comprising extending said target-specific primer, thereby generating a second extension product.
(Item 73)
73. The method of item 72, further comprising amplifying said first extension product and said second extension product, thereby generating an amplification product.
(Item 74)
73. The method of item 72, further comprising amplifying said first extension product and said second extension product with said first adapter primer and said target-specific primer, thereby generating an amplification product. Method.
(Item 75)
54. The method of item 55 or 53, further comprising releasing the first cross-linking sequence.
(Item 76)
57. The method of item 55 or 56, further comprising extending the 3' end of said first bridging probe, thereby generating a first extension product.
(Item 77)
57. Method according to item 55 or 56, wherein said adapter anchor probe comprises a first adapter.
(Item 78)
78. The method of item 77, further comprising attaching a second adapter to the 5' end of said template nucleic acid molecule.
(Item 79)
79. The method of item 78, further comprising phosphorylating the 5' end of the template nucleic acid molecule prior to attaching the second adapter.
(Item 80)
79. The method of item 78, wherein said adapter is a double-stranded adapter.
(Item 81)
79. The method of item 78, further comprising hybridizing a first adapter primer to said first adapter of said adapter anchor probe.
(Item 82)
82. The method of item 81, further comprising extending said first adapter primer, thereby generating a second extension product.
(Item 83)
83. The method of item 82, further comprising hybridizing a second adapter primer to said second extension product.
(Item 84)
84. The method of item 83, further comprising extending said second adapter primer, thereby generating a third extension product.
(Item 85)
85. The method of item 84, further comprising amplifying said second extension product and said third extension product, thereby generating amplified products.
(Item 86)
85. The method of item 84, further comprising amplifying said second extension product and said third extension product with said first adapter primer and said second adapter primer, thereby generating an amplification product. the method of.
(Item 87)
83. The method of item 82, further comprising hybridizing a target-specific primer to said second extension product.
(Item 88)
88. The method of item 87, further comprising extending said target-specific primer thereby generating a third extension product.
(Item 89)
89. The method of item 88, further comprising amplifying said second extension product and said third extension product, thereby generating amplified products.
(Item 90)
89. The claim of item 88, further comprising amplifying said second extension product and said third extension product with said first adapter primer and said target-specific primer, thereby generating an amplification product. Method.
(Item 91)
hybridizing a second target sequence region of a second bridging probe to a second target sequence of said template nucleic acid molecule, wherein the second adapter landing sequence of said second bridging probe comprises said adapter anchor probe 57. A method according to item 55 or 56, further comprising the step of binding to the second cross-linking sequence of
(Item 92)
92. The method of item 91, wherein said second target-specific region of said second cross-linking probe is at the 3' portion of said second cross-linking probe.
(Item 93)
92. The method of item 91, wherein said second target-specific region of said second cross-linking probe is at the 5' portion of said second cross-linking probe.
(Item 94)
92. The method of item 91, wherein said second bridging probe comprises a second linker between said second target-specific region and said second adapter landing sequence.
(Item 95)
i) said first target-specific region of said first cross-linking probe is at the 3′ portion of said first cross-linking probe and said second target-specific region of said second cross-linking probe is located at said second cross-linking probe; ii) said first target-specific region of said first cross-linking probe is present at the 5' portion of said first cross-linking probe; is at the 5' portion of said second cross-linking probe; iii) said first target-specific region of said first cross-linking probe is located at 3 of said first cross-linking probe ' site and said second target-specific region of said second cross-linking probe is present at the 5' site of said second cross-linking probe; or iv) said first cross-linking probe of said first cross-linking probe wherein a target-specific region is present at the 5' portion of said first cross-linking probe and said second target-specific region of said second cross-linking probe is present at the 3' portion of said second cross-linking probe; 91. The method described in 91.
(Item 96)
said first target-specific region of said first cross-linking probe is at the 3′ portion of said first cross-linking probe and said second target-specific region of said second cross-linking probe is located at said second cross-linking probe 92. The method of item 91, wherein the first linker of said first cross-linking probe and the second linker of said second cross-linking probe, present at the 5' portion of the cross-linking probe, hybridize to each other.
(Item 97)
The target sequence region of the capture probe or the cross-linking probe is designed based on the target sequence of the template nucleic acid molecule, and the target sequence of the template nucleic acid contains unmethylated cytosines after the bisulfite treatment. 57. The method of item 9, 25, 43, or 56, holding
(Item 98)
treating a nucleic acid molecule with bisulfite, thereby producing a template nucleic acid molecule according to items 1, 24, 42 or 55, wherein the template nucleic acid molecule according to items 1, 24, 42 or 55 is a product of said bisulfite treatment.
(Item 99)
The target sequence region of the capture probe or the cross-linking probe is designed based on the target sequence of the template nucleic acid molecule after the bisulfite treatment, and unmethylated cytosines in the template nucleic acid are bisulfite-treated. 99. A method according to item 98, which is converted to uracil during phytoprocessing.
(Item 100)
according to items 1, 9, 24, 42 or 55, further comprising the step of dephosphorylating the 5' end of the nucleic acid molecule, thereby generating the template nucleic acid molecule according to items 1, 9, 24, 42 or 55 described method.
(Item 101)
56. The method of items 1, 9, 24, 42 or 55, wherein said capture probe or adapter anchor probe further comprises a label.
(Item 102)
102. The method of item 101, further comprising capturing the bridging probe by the label.
(Item 103)
102. The method of item 101, wherein said label is biotin.
(Item 104)
103. The method of item 102, wherein said label is captured on a solid support.
(Item 105)
105. The method of item 104, wherein said solid support is a bead.
(Item 106)
106. The method of item 105, wherein said bead comprises a capturing moiety that targets said label.
(Item 107)
107. The method of item 106, wherein said capturing moiety is streptavidin.
(Item 108)
After binding the 3′ end of the template nucleic acid molecule to the 5′ end of the capture probe or adapter anchor probe of item 1, 9, 24, 42 or 55, the nucleic acid molecule is ligated from the 3′ to 5′ exo 56. The method of items 1, 9, 24, 42 or 55, further comprising the step of contacting with a nuclease, wherein said nucleic acid molecule comprises said capture probe and said template nucleic acid molecule.
(Item 109)
90. The method of items 18, 22, 36, 40, 69, 73, 85, or 89, further comprising sequencing said amplification products.
(Item 110)
110. The method of item 109, wherein said sequencing comprises next generation sequencing.
(Item 111)
56. The method of items 1, 9, 24, 42, or 55, wherein said template nucleic acid molecule comprises single-stranded DNA.
(Item 112)
56. The method of items 1, 9, 24, 42, or 55, wherein said template nucleic acid molecule comprises RNA.
(Item 113)
56. The method of items 1, 9, 24, 42, or 55, wherein said template nucleic acid molecule comprises damaged DNA.
(Item 114)
56. The method of items 1, 9, 24, 42, or 55, wherein said template nucleic acid molecule is derived from a formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) sample.
(Item 115)
56. The method of items 1, 9, 24, 42, or 55, wherein said template nucleic acid molecule comprises a cell-free nucleic acid derived from a biological sample.
(Item 116)
116. The method of item 115, wherein said cell-free nucleic acid comprises cell-free DNA.
(Item 117)
117. The method of item 116, wherein said cell-free DNA comprises circulating tumor DNA.
(Item 118)
56. The method of items 1, 9, 24, 42, or 55, wherein no in vitro DNA repair step is performed on said template nucleic acid molecule prior to items 1, 9, 24, 42, or 55.
(Item 119)
capturing a target sequence using a probe, wherein the probe hybridizes to the target sequence and the probe binds to a template containing the target sequence;
treating the target sequence bound to the probe with bisulfite;
method including.
(Item 120)
A method comprising the step of capturing a target sequence using a bridging probe, said bridging probe facilitating binding of an anchor probe to said target sequence.
(Item 121)
121. The method of item 120, further comprising treating the target sequence bound to the anchor probe with bisulfite.
(Item 122)
a capture probe comprising a target-specific region that hybridizes to a target sequence of a template nucleic acid molecule and a 5' end that binds to the 3' end of said template nucleic acid molecule;
a first adapter primer that hybridizes to a first adapter of said capture probe, said first adapter primer being extended to produce a first extension product;
a second adapter that binds to the first extension product;
a second adapter primer that hybridizes to the second adapter;
kit containing.
(Item 123)
a bridging probe comprising a target-specific region that hybridizes to a target sequence of a template nucleic acid molecule;
an adapter anchor probe comprising a cross-linking sequence that hybridizes to the adapter landing sequence of said cross-linking probe and a 5′ end that binds to the 3′ end of said template nucleic acid molecule;
kit containing.
(Item 124)
hybridizing a target-specific region of a capture probe to a target sequence of a template nucleic acid molecule, said capture probe further comprising a first adapter located at the 5′ end of said target-specific region; ,
contacting said template nucleic acid molecule with a 3' to 5' exonuclease after hybridizing said target specific region;
extending the 3′ end of said template nucleic acid molecule using said first adapter as a template, thereby generating a first extension product;
method including.
(Item 125)
125. The method of item 124, further comprising extending the 3' end of said capture probe, thereby generating a second extension product.
(Item 126)
hybridizing a primer comprising said first adapter to said first extension product, and extending a 3′ end of said primer comprising said first adapter, thereby generating a second extension product 125. The method of item 124, further comprising:
(Item 127)
127. The method of item 125 or 126, further comprising the step of attaching a second adapter to the 5' end of said first extension product.
(Item 128)
128. The method of item 127, further comprising phosphorylating the 5' end of the first extension product prior to the binding of the second adapter.
(Item 129)
129. The method of item 127 or 128, wherein said second adapter is a double-stranded adapter and one of the two strands of said second adapter binds to said second extension product.
(Item 130)
130. The method of item 129, further comprising amplifying said first extension product and said second extension product, thereby generating an amplification product.
(Item 131)
hybridizing a target-specific primer to said second extension product, said target-specific primer binding to a second adapter;
extending said target-specific primer, thereby generating a third extension product;
127. The method of item 125 or 126, further comprising:
(Item 132)
132. The method of item 131, further comprising amplifying said second extension product and said third extension product, thereby generating amplified products.
(Item 133)
125. The method of item 124, wherein said capture probe further comprises a molecular barcode.
(Item 134)
125. The method of item 124, wherein said capture probe further comprises a binding moiety.
(Item 135)
135. The method of item 134, wherein the binding moiety binds to a support.
(Item 136)
136. The method of item 135, wherein said support is a bead.
(Item 137)
137. The method of item 136, wherein said beads are streptavidin beads.
(Item 138)
135. The method of item 134, wherein said binding moiety is biotin.
(Item 139)
hybridizing a first target-specific region of a first bridging probe to a first target sequence of a template nucleic acid molecule, wherein the first adapter landing sequence of said first bridging probe is an adapter anchor probe; binding to the first cross-linking sequence;
hybridizing a second target-specific region of a second bridging probe to a second target sequence of said template nucleic acid molecule, wherein a second adapter landing sequence of said second bridging probe comprises said adapter anchor; binding to the second cross-linking sequence of the probe;
extending the 3′ end of said first bridging probe, thereby generating a first extension product;
method including.
(Item 140)
140. The method of item 139, wherein said first cross-linking probe comprises a first adapter.
(Item 141)
141. The method of item 140, further comprising attaching a second adapter to the 3' end of said first extension product.
(Item 142)
142. The method of item 141, wherein said second adapter is a double-stranded adapter and one of the two strands of said second adapter binds to said template nucleic acid molecule.
(Item 143)
143. The method of item 142, further comprising phosphorylating the 5' end of the template nucleic acid molecule prior to attaching the second adapter.
(Item 144)
141. The method of item 140, further comprising hybridizing a target-specific primer to said first extension product and extending said target-specific primer thereby generating a second extension product. .
(Item 145)
145. The method of item 144, wherein said target-specific primer is attached to a second adapter.
(Item 146)
hybridizing a primer comprising said first adapter to said second extension product, and extending the 3′ end of said primer comprising said first adapter, thereby generating a third extension product 146. The method of item 145, further comprising:
(Item 147)
147. The method of item 146, further comprising amplifying said second extension product and said third extension product, thereby generating amplified products.
(Item 148)
140. The method of item 139, wherein said first cross-linking probe further comprises a molecular barcode.
(Item 149)
140. The method of item 139, wherein said first cross-linking probe further comprises a binding moiety.
(Item 150)
149. The method of item 149, wherein said binding moiety binds to a support.
(Item 151)
151. The method of item 150, wherein said support is a bead.
(Item 152)
152. The method of item 151, wherein said beads are streptavidin beads.
(Item 153)
149. The method of item 149, wherein said binding moiety is biotin.
(Item 154)
hybridizing a first target-specific region of a first bridging probe to a first target sequence of a template nucleic acid molecule, wherein the first adapter landing sequence of the first bridging probe is an adapter anchor probe wherein said first bridging probe further comprises a first adapter located at the 5' end of said target-specific region;
contacting the template nucleic acid molecule with a 3' to 5' exonuclease after hybridizing to the first target-specific region;
extending the 3′ end of said template nucleic acid molecule using said first adapter as a template, thereby generating a first extension product;
method including.
(Item 155)
hybridizing a primer comprising said first adapter to said first extension product, and extending a 3′ end of said primer comprising said first adapter, thereby generating a second extension product 155. The method of item 154, further comprising:
(Item 156)
156. The method of item 155, further comprising attaching a second adapter to the 5' end of said first extension product.
(Item 157)
157. The method of item 156, further comprising phosphorylating the 5' end of the first extension product prior to binding the second adapter.
(Item 158)
158. The method of item 157, wherein said second adapter is a double-stranded adapter and one of the two strands of said second adapter binds to said second extension product.
(Item 159)
159. The method of item 158, further comprising hybridizing a target-specific primer to said second extension product and extending said target-specific primer thereby generating a third extension product. .
(Item 160)
160. The method of item 159, wherein said target-specific primer is conjugated to a second adapter.
(Item 161)
160. The method of item 159, further comprising amplifying said second extension product and said third extension product, thereby generating amplified products.
(Item 162)
155. The method of item 154, wherein the step of contacting the template nucleic acid molecule with the 3' to 5' exonuclease cleaves one or more nucleotides at the 3' end of the template nucleic acid molecule.
(Item 163)
155. The method of item 154, wherein said first cross-linking probe further comprises a molecular barcode.
(Item 164)
155. The method of item 154, wherein said first cross-linking probe further comprises a binding moiety.
(Item 165)
165. The method of item 164, wherein the binding moiety binds to a support.
(Item 166)
166. The method of item 165, wherein said support is a bead.
(Item 167)
167. The method of item 166, wherein said beads are streptavidin beads.
(Item 168)
165. The method of item 164, wherein the binding moiety is biotin.