JPWO2020045652A1 - A method for determining the cell activity or skin condition of skin cells, and a method for screening a skin cell activator. - Google Patents
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Abstract
真皮線維芽細胞の細胞活性を測定することを目的とする。また、細胞活性の変化をもとに、細胞賦活剤をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。真皮線維芽細胞同士の接着を指標とすることで、細胞活性の測定が可能となる。また、真皮線維芽細胞同士の接着を指標として、細胞賦活剤をスクリーニングする方法が可能となる。The purpose is to measure the cell activity of dermal fibroblasts. Another object of the present invention is to provide a method for screening a cell activator based on a change in cell activity. By using the adhesion between dermal fibroblasts as an index, cell activity can be measured. In addition, a method of screening a cell activator using the adhesion between dermal fibroblasts as an index becomes possible.
Description
本発明は、皮膚細胞の細胞活性や肌状態の決定方法、並びに当該細胞活性の変化を指標とすることによる、皮膚細胞賦活剤のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a method for determining the cell activity and skin condition of skin cells, and a method for screening a skin cell activator by using a change in the cell activity as an index.
血液細胞などの浮遊性の細胞を除いて、細胞は、生体内において、細胞同士又は細胞外マトリクスへと結合して存在している。細胞間接着としては、その細胞腫に応じて、密着結合、固定結合、及びギャップ結合が主に挙げられ、それぞれ関与する接着タンパク質の種類が異なる。真皮において、真皮線維芽細胞は細胞外マトリクスへの結合を介して散在して存在すると考えられていた。 Except for floating cells such as blood cells, cells exist in vivo in association with each other or in an extracellular matrix. Tight junctions, fixed junctions, and gap junctions are mainly mentioned as cell-cell adhesions, depending on the cell tumor, and the types of adhesion proteins involved in each are different. In the dermis, dermal fibroblasts were thought to be interspersed through binding to the extracellular matrix.
生体内に存在する各臓器の細胞は、常に一定の活性を保っているわけではなく、外部要因やストレスなどの内的要因に応じて、その活性は変動する。特に皮膚は、生体の最外層を構成していることから、温度変化、紫外線照射、物理的刺激などの外部要因の影響を受けやすく、また加齢やストレスなどの内的要因も皮膚の細胞活性に影響を与えることが知られている。細胞活性が低下すると、自身の細胞分裂能力が低下するとともに、老化因子と呼ばれる因子を分泌することで、周囲の細胞に対しても悪影響を及ぼしうる。また、細胞活性が悪化した真皮細胞では、コラーゲンやエラスチンといった細胞外マトリクス分子の産生量が低下する。真皮層における細胞外マトリクス分子の低下は、皮膚のたるみを引き起こし、美容上の問題となる。 The cells of each organ existing in the living body do not always maintain a constant activity, and their activities fluctuate according to external factors and internal factors such as stress. In particular, since the skin constitutes the outermost layer of the living body, it is easily affected by external factors such as temperature changes, ultraviolet irradiation, and physical stimuli, and internal factors such as aging and stress also cause skin cell activity. Is known to affect. When cell activity decreases, its own cell division ability decreases, and by secreting a factor called an aging factor, it can also have an adverse effect on surrounding cells. In addition, in dermal cells with deteriorated cell activity, the amount of extracellular matrix molecules such as collagen and elastin produced decreases. The decrease of extracellular matrix molecules in the dermis layer causes sagging of the skin and becomes a cosmetic problem.
美容分野又は医療分野では、皮膚の細胞活性を測定し、細胞活性に応じたケアを行うことが求められており、皮膚の細胞活性や肌状態を適切に決定することが求められている。また細胞活性を決定することが可能になると、細胞活性を亢進可能な細胞賦活剤のスクリーニング系の確立が可能になる。 In the field of beauty or medical care, it is required to measure the cell activity of the skin and perform care according to the cell activity, and it is required to appropriately determine the cell activity and the skin condition of the skin. Further, if it becomes possible to determine the cell activity, it becomes possible to establish a screening system for a cell activator capable of enhancing the cell activity.
本発明者らは、真皮線維芽細胞同士の接着と、細胞活性との関連性について研究を行ったところ、驚くべきことに真皮線維芽細胞における接着状態と、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現レベルとの関連を見出した。さらに、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現に影響を及ぼす細胞接着因子について検討を行ったところ、カドヘリン２（ＣＤＨ２）が、I型コラーゲン遺伝子の発現に寄与することを見出し、本発明に至った。 The present inventors studied the relationship between the adhesion between dermal fibroblasts and cell activity, and surprisingly, the adhesion state in dermal fibroblasts and the expression level of type I collagen gene were found. I found a connection. Furthermore, as a result of investigating cell adhesion factors that affect the expression of type I collagen gene, it was found that cadherin 2 (CDH2) contributes to the expression of type I collagen gene, leading to the present invention.
したがって、本発明は以下に関する：
［１］ 真皮線維芽細胞同士の接着を指標とした、真皮線維芽細胞の細胞活性の決定方法。
［２］ 前記接着を、細胞突起により決定する、項目１に記載の方法。
［３］ 前記突起を、細胞円形率により決定する、項目２に記載の方法。
［４］ 前記接着が、カドヘリン２を介した接着である、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
［５］ 前記細胞活性が、コラーゲン産生能である、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
［６］ 皮膚から採取された皮膚試料において、真皮線維芽細胞同士の接着を指標とした、肌状態の決定方法。
［７］ 前記接着を、細胞突起により決定する、項目６に記載の方法。
［８］ 前記突起を、細胞円形率により決定する、項目７に記載の方法。
［９］ 前記接着が、カドヘリン２を介した接着である、項目６〜８のいずれか一項に記載の方法。
［１０］ 前記細胞活性が、コラーゲン産生能である、項目６〜９のいずれか一項に記載の方法。
［１１］ 皮膚細胞賦活剤のスクリーニング方法であって、
線維芽細胞を、候補薬剤添加培地又は非添加対照培地中で培養する工程、
候補薬剤非添加の対照群と、候補薬剤添加群とにおいて、線維芽細胞同士の接着を決定する工程、及び
対照群に比較して、線維芽細胞同士の接着が亢進された群に添加した候補薬剤を、細胞賦活剤として決定する工程、
を含む、前記スクリーニング方法。
［１２］ 線維芽細胞の培養物の密度を、０．５〜８．０×１０３細胞／ｃｍ２で調製することを特徴とする、項目１１に記載の方法。
［１３］ 前記接着を、細胞突起により決定する、項目１１又は１２に記載の方法。
［１４］ 前記突起を、細胞円形率により決定する、項目１１又は１２に記載の方法。
［１５］ 前記接着が、カドヘリン２を介した接着である、項目１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
［１６］ コラーゲンゲル及び真皮線維芽細胞を含み、ハリが調節された３次元皮膚モデルの作成方法であって、前記真皮線維芽細胞において、カドヘリン２を介した細胞接着を制御することを含む、前記方法。
［１７］ カドヘリン２を介した細胞接着が、カドヘリン２遺伝子の発現調節により制御される、項目１６に記載の方法。
［１８］ カドヘリン２を介した細胞接着が、真皮線維芽細胞の播種密度を調節することにより制御される、項目１６に記載の方法。
［１９］ コラーゲンゲル及び真皮線維芽細胞を含み、ハリが強化された３次元皮膚モデルであって、カドヘリン２を介した細胞接着が、１細胞あたり１〜６個存在する、前記３次元皮膚モデル。
［２０］ 前記３次元皮膚モデルが、キュートメーターを用いて弾性を測定した場合に、Ｕｒ／Ｕｆ値が０．１〜１．０の弾性を有する、項目１９に記載の３次元皮膚モデル。
［２１］ カドヘリン２の遺伝子発現を増大された真皮線維芽細胞と、コラーゲンゲルとを含む、ハリが強化された３次元皮膚モデル。
［２２］ 前記真皮線維芽細胞が、カドヘリン２遺伝子発現増大するためのベクターを含む、項目２１に記載の３次元皮膚モデル。
［２３］ 前記３次元皮膚モデルが、キュートメーターを用いて弾性を測定した場合に、Ｕｒ／Ｕｆ値が０．１〜１．０の弾性を有する、項目２１又は２２に記載の３次元皮膚モデル。Therefore, the present invention relates to:
[1] A method for determining cell activity of dermal fibroblasts using adhesion between dermal fibroblasts as an index.
[2] The method according to
[3] The method according to
[4] The method according to any one of
[5] The method according to any one of
[6] A method for determining a skin condition using adhesion between dermal fibroblasts as an index in a skin sample collected from the skin.
[7] The method according to item 6, wherein the adhesion is determined by cell processes.
[8] The method according to item 7, wherein the protrusions are determined by the cell circularity.
[9] The method according to any one of items 6 to 8, wherein the adhesion is via
[10] The method according to any one of items 6 to 9, wherein the cell activity is collagen-producing ability.
[11] A method for screening a skin cell activator.
A step of culturing fibroblasts in a candidate drug-added medium or a non-added control medium,
In the control group to which the candidate drug was not added and the candidate drug-added group, the step of determining the adhesion between fibroblasts, and the candidate added to the group in which the adhesion between fibroblasts was enhanced as compared with the control group. The process of determining a drug as a cell activator,
The screening method comprising.
[12] The method according to item 11, wherein the density of the fibroblast culture is prepared at 0.5 to 8.0 × 10 3 cells / cm 2.
[13] The method according to item 11 or 12, wherein the adhesion is determined by cell processes.
[14] The method according to item 11 or 12, wherein the protrusions are determined by the cell circularity.
[15] The method according to any one of items 11 to 14, wherein the adhesion is via
[16] A method for creating a three-dimensional skin model containing collagen gel and dermal fibroblasts in which elasticity is regulated, which comprises controlling cell adhesion via
[17] The method according to item 16, wherein cell adhesion via
[18] The method of item 16, wherein cell adhesion via
[19] A three-dimensional skin model containing collagen gel and dermal fibroblasts with enhanced elasticity, wherein there are 1 to 6 cell adhesions mediated by
[20] The three-dimensional skin model according to item 19, wherein the three-dimensional skin model has elasticity with an Ur / Uf value of 0.1 to 1.0 when the elasticity is measured using a cute meter.
[21] A three-dimensional skin model with enhanced firmness, which comprises dermal fibroblasts with increased gene expression of
[22] The three-dimensional skin model according to item 21, wherein the dermal fibroblasts contain a vector for increasing
[23] The three-dimensional skin model according to item 21 or 22, wherein the three-dimensional skin model has elasticity with an Ur / Uf value of 0.1 to 1.0 when the elasticity is measured using a cute meter. ..
本発明により、皮膚における細胞活性を決定することが可能になる。これにより、細胞活性に応じたスキンケアの提供が可能になる。また、細胞活性の変化を確認することにより細胞賦活剤のスクリーニング方法を提供することができる。 The present invention makes it possible to determine cell activity in the skin. This makes it possible to provide skin care according to cell activity. In addition, a method for screening a cell activator can be provided by confirming a change in cell activity.
本発明は、真皮線維芽細胞同士の接着を指標とした、真皮線維芽細胞の細胞活性の決定方法に関する。 The present invention relates to a method for determining cell activity of dermal fibroblasts using adhesion between dermal fibroblasts as an index.
真皮線維芽細胞の細胞活性は、真皮線維芽細胞が有する各種の活性のことをいう。真皮は、主に間質成分と細胞成分から構成され、さらに脈管や神経が配置されている。真皮線維芽細胞の活性が高くなると、真皮線維芽細胞の分裂頻度や間質成分の産生量が高くなり、結果として真皮層の厚さが厚くなるとともにその弾力も高くなる。したがって、本発明の１の態様では、真皮線維芽細胞の細胞活性は、間質成分の産生能力を指す。細胞活性は、細胞の加齢度とも関係しており、加齢が進むと、細胞活性が低下する。さらに、細胞活性が低下していると、老化因子とよばれる、周囲の細胞に悪影響を及ぼす物質を分泌しうる。本発明の１の態様では、細胞活性は、間質成分の産生能力を指し、より好ましくは、コラーゲンの産生能力を指す。 The cell activity of dermal fibroblasts refers to various activities possessed by dermal fibroblasts. The dermis is mainly composed of stromal components and cellular components, and further vessels and nerves are arranged. When the activity of dermal fibroblasts is increased, the frequency of division of dermal fibroblasts and the amount of stromal components produced are increased, and as a result, the thickness of the dermis layer is increased and its elasticity is also increased. Therefore, in one aspect of the invention, the cellular activity of dermal fibroblasts refers to the ability to produce stromal components. Cell activity is also related to the degree of cell aging, and as aging progresses, cell activity decreases. Furthermore, when cell activity is reduced, it is possible to secrete a substance called an aging factor that adversely affects surrounding cells. In one aspect of the invention, cell activity refers to the ability to produce interstitial components, more preferably to the ability to produce collagen.
真皮の間質成分は、膠原線維、弾性線維、及び基質から主に構成されている。したがって、真皮線維芽細胞の細胞活性が亢進することにより、膠原線維、弾性線維、及び基質のうちの少なくとも１、好ましくは２、さらに好ましくは全ての成分の産生量が増大する。 The interstitial component of the dermis is mainly composed of collagen fibers, elastic fibers, and substrates. Therefore, the enhancement of cell activity of dermal fibroblasts increases the production of at least one, preferably two, and more preferably all components of collagen fibers, elastic fibers, and substrates.
膠原線維は、コラーゲンにより構成されている。コラーゲン分子は、α鎖の分子構造の違いにより、２０種ほどが知られている。本発明において、コラーゲンは、任意のコラーゲンであってよいが、真皮に主に存在するＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＩＶ型、ＶＩＩ型、１７型コラーゲンが好ましく、より好ましくは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンであり、最も好ましくは真皮において約８０％を占めるＩ型コラーゲンである。膠原線維の産生量は、コラーゲンの産生量又は発現量を測定することにより決定しうる。 Collagen fibers are composed of collagen. About 20 types of collagen molecules are known due to the difference in the molecular structure of the α chain. In the present invention, the collagen may be any collagen, but type I collagen, type III collagen, type V collagen, type IV, type VII, and type 17 collagen mainly present in the dermis are preferable, and more preferably. It is type I collagen, type III collagen, and type V collagen, and most preferably type I collagen which occupies about 80% in the dermis. The amount of collagen fiber produced can be determined by measuring the amount of collagen produced or expressed.
弾性線維の主成分は、エラスチンであり、さらにフィブリリンがエラスチンの周囲を取り巻いて構成される。弾性線維の産生量は、エラスチン又はフィブリリンの少なくとも１の産生量又は発現量を測定することにより決定しうる。 The main component of elastic fibers is elastin, and fibrillin surrounds elastin. The amount of elastic fibers produced can be determined by measuring the amount of production or expression of at least one of elastin or fibrillin.
基質は、主に細胞外マトリクスとして、糖タンパクや、プロテオグリカンなどにより構成される。糖タンパクとしては、糖を含むタンパク質で、真皮中ではフィブロネクチンなどが挙げられ、フィブロネクチンは、細胞表面タンパク質と結合し、細胞足場として機能するとともに、コラーゲンなどの他の高分子とも結合しうる。プロテオグリカンは、軸タンパク質にグリコサミノグリカンが結合した巨大分子であり、真皮中では、グリコサミノグリカンとしてヒアルロン酸やデルマタン硫酸が主に含まれる。プロテオグリカンは、主に真皮中での水分保持の機能を果たす。 The substrate is mainly composed of glycoprotein, proteoglycan, etc. as an extracellular matrix. Examples of glycoproteins include sugar-containing proteins such as fibronectin in the dermis. Fibronectin binds to cell surface proteins, functions as a cell scaffold, and can also bind to other macromolecules such as collagen. Proteoglycan is a macromolecule in which glycosaminoglycan is bound to an axial protein, and hyaluronic acid and dermatan sulfate are mainly contained as glycosaminoglycan in the dermis. Proteoglycans mainly serve to retain water in the dermis.
真皮線維芽細胞は、真皮中に存在する線維芽細胞であり、真皮中の間質成分を産生する細胞である。真皮は、間質成分で満たされており、真皮線維芽細胞は真皮中で散在して存在すると考えられている。特に真皮線維芽細胞の細胞膜に発現するインテグリンは、間質成分であるフィブロネクチンと結合することで、真皮線維芽細胞を真皮中で支えることに寄与する。一方で、真皮線維芽細胞同士が接着していることが見いだされ、さらに真皮線維芽細胞同士の接着と、真皮線維芽細胞の細胞活性との間に関連が見いだされた。具体的に老化した真皮線維芽細胞では、細胞同士の接着は少なくなるか、又はなくなる。 Dermis fibroblasts are fibroblasts present in the dermis and are cells that produce interstitial components in the dermis. The dermis is filled with stromal components, and dermal fibroblasts are thought to be scattered throughout the dermis. In particular, integrin expressed on the cell membrane of dermal fibroblasts contributes to supporting dermal fibroblasts in the dermis by binding to fibronectin, which is an stromal component. On the other hand, it was found that dermal fibroblasts were adhered to each other, and further, an association was found between the adhesion between dermal fibroblasts and the cell activity of dermal fibroblasts. Specifically, in aged dermal fibroblasts, cell-cell adhesion is reduced or eliminated.
真皮線維芽細胞同士の接着は、試料を顕微鏡写真における画像から判断することができる。真皮細胞同士の接着は、２次元写真から判定することもできるし、３次元写真から判定することができる。より好ましくは、３次元電子顕微鏡（ＳＢＦ−ＳＥＭ）を用いて観察をすることができる。接着は、１の細胞が接着する細胞の数、１の細胞が有する接着点の数、１の細胞が接着する接着面積、又はプレート当たりの接触細胞の割合により、定量することができる。試料は、生体試料、器官培養された試料、３次元皮膚モデルの試料、又はインビトロの試料であってもよい。一例として、接着点の数により、細胞活性を決定することができる。例えば、接着点の数が０の場合、細胞活性が低いと判定でき、接着点の数が、１〜２を、中程度の細胞活性と判定し、３以上の接着点を、細胞活性が高いと判定することができる。単位面積当たりの接着する細胞の割合基づいて、細胞活性を判定することもでき、１０％以下の場合、細胞活性が低いと判定でき、接着する細胞の数が５０％以下の場合に、中程度の細胞活性と判定し、接着する細胞の数が５０％以上の場合に、細胞活性が高いと判定することができる。 Adhesion between dermal fibroblasts can be determined from the images of the sample in micrographs. Adhesion between dermis cells can be determined from a two-dimensional photograph or a three-dimensional photograph. More preferably, observation can be performed using a three-dimensional electron microscope (SBF-SEM). Adhesion can be quantified by the number of cells to which 1 cell adheres, the number of adhesion points possessed by 1 cell, the adhesion area to which 1 cell adheres, or the ratio of contact cells per plate. The sample may be a biological sample, an organ-cultured sample, a three-dimensional skin model sample, or an in vitro sample. As an example, cell activity can be determined by the number of adhesion points. For example, when the number of adhesion points is 0, it can be determined that the cell activity is low, when the number of adhesion points is 1 to 2, it is determined that the cell activity is moderate, and when the number of adhesion points is 3 or more, the cell activity is high. Can be determined. Cell activity can also be determined based on the percentage of cells adhering per unit area, and if it is 10% or less, it can be determined that the cell activity is low, and if the number of adhering cells is 50% or less, it is moderate. When the number of cells to be adhered is 50% or more, it can be determined that the cell activity is high.
真皮線維芽細胞同士の接着は、顕微鏡写真における画像からの判断の他に、別の態様として、細胞接着に関与するタンパク質に基づいて判断することもできる。細胞接着に関与するタンパク質としては、任意の細胞接着タンパク質であってよい。細胞接着タンパク質としては、一例としてカドヘリンスーパーファミリーのタンパク質が挙げられる。具体的には、E‐カドヘリン、N‐カドヘリン、P‐カドヘリン、T‐カドヘリン、VE‐カドヘリンなどが挙げられるが、真皮線維芽細胞において発現がみられる観点から、特にN‐カドヘリン（カドヘリン２）、カドヘリン６、カドヘリン１１、カドヘリン１３が好ましい。免疫染色により細胞接着タンパク質の存在を確認することにより、真皮線維芽細胞同士の接着を測定することができるし、単に細胞接着タンパク質のタンパク質量や遺伝子発現量を測定することにより、真皮線維芽細胞同士の接着を判断しうる。 Adhesion between dermal fibroblasts can be determined based on proteins involved in cell adhesion as another embodiment, in addition to the determination from images in micrographs. The protein involved in cell adhesion may be any cell adhesion protein. Examples of cell adhesion proteins include proteins of the cadherin superfamily. Specific examples include E-cadherin, N-cadherin, P-cadherin, T-cadherin, VE-cadherin, etc., but from the viewpoint of expression in dermal fibroblasts, N-cadherin (cadherin 2) in particular. , Cadherin 6, cadherin 11, and cadherin 13 are preferred. Adhesion between dermal fibroblasts can be measured by confirming the presence of cell adhesion proteins by immunostaining, and dermal fibroblasts can be measured simply by measuring the protein amount and gene expression level of cell adhesion proteins. It is possible to judge the adhesion between each other.
本発明者らにより、真皮線維芽細胞における細胞接着タンパク質の遺伝子発現抑制と、真皮線維芽細胞の活性との関係が調べられた。具体的に、真皮線維芽細胞に発現しているカドヘリン２の遺伝子発現を抑制することにより、真皮線維芽細胞によるＩ型コラーゲンの発現が抑制された（図５）。Ｉ型コラーゲンは、細胞接着によりその発現量が変化し（図３）、真皮線維芽細胞の細胞活性の指標となる。細胞接着タンパク質であるカドヘリン２の遺伝子発現の抑制により、真皮線維芽細胞の活性が低下したことから、カドヘリン２を細胞接着の指標として使用しうる。カドヘリン２は、N−カドヘリンとしても知られ、神経細胞での存在が知られているカドヘリンである。各細胞の細胞膜に存在するカドヘリン２がホモフィリックに結合することで、細胞間を接着させる。
The present inventors investigated the relationship between the suppression of cell adhesion protein gene expression in dermal fibroblasts and the activity of dermal fibroblasts. Specifically, by suppressing the gene expression of
真皮線維芽細胞同士の接着は、真皮線維芽細胞から伸びた細胞突起により接着される。よって、真皮線維芽細胞同士の接着は、細胞突起により接着されているかを検出することで検出することができる。細胞突起が存在すると、細胞の円形率が低くなる。したがって、真皮線維芽細胞の円形率をもとに接着を評価することもできる。細胞円形率は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて計算することができ、ヒトの生体内の細胞では、５０％以上を接着がないと判定し、５０％以下を接着があると判定できる。また、培養細胞上では、８０％以上を接触無しと判定し、５０〜８０％を軽度接触、３０〜５０％を中程度接触、１０〜３０％を高度接触、１０％以下を過度接触と判定することができる。 Adhesion between dermal fibroblasts is carried out by cell processes extending from dermal fibroblasts. Therefore, adhesion between dermal fibroblasts can be detected by detecting whether or not they are adhered by cell processes. The presence of cell processes reduces the roundness of the cells. Therefore, adhesion can also be evaluated based on the circularity of dermal fibroblasts. The cell roundness can be calculated using ImageJ software, and in human in vivo cells, 50% or more can be determined to be non-adherent, and 50% or less can be determined to be adherent. On cultured cells, 80% or more was judged to be no contact, 50 to 80% was judged to be mild contact, 30 to 50% was judged to be moderate contact, 10 to 30% was judged to be high contact, and 10% or less was judged to be excessive contact. can do.
生体試料は、対象の皮膚から採取された皮膚試料である。本発明の１の態様では、皮膚試料を用いて真皮線維芽細胞同士の接着を指標とすることで、肌状態を決定する方法に関する。肌状態とは、特に真皮に起因する肌の状態をいう。真皮の間質成分のうち、弾性繊維や膠原繊維は弾力に寄与し、一方で基質は、水分保持に寄与する。したがって、真皮に起因する肌状態は、主にたるみ、しわ、はりが挙げられる。一例として、対象から取得された皮膚試料中の真皮線維芽細胞において、１の細胞あたり平均で３〜５個の細胞と接着している場合に、たるみやしわが少なく、はりが優れていると決定することができ、１の細胞あたり平均で２〜３個の細胞と接着している場合に、たるみ、しわ、はりが普通であると決定することができ、１の細胞あたり平均で０〜２個の細胞と接着している場合に、たるみやしわが多く、はりが劣ると決定することができる。肌状態を、肌年齢として表すこともできる。 The biological sample is a skin sample collected from the target skin. One aspect of the present invention relates to a method for determining a skin condition by using a skin sample as an index of adhesion between dermal fibroblasts. The skin condition refers to the condition of the skin caused by the dermis in particular. Of the interstitial components of the dermis, elastic fibers and collagen fibers contribute to elasticity, while substrates contribute to water retention. Therefore, the skin condition caused by the dermis mainly includes sagging, wrinkles, and swelling. As an example, in the dermal fibroblasts in the skin sample obtained from the subject, when it adheres to an average of 3 to 5 cells per cell, it is said that there is little sagging and wrinkles and the elasticity is excellent. It can be determined that sagging, wrinkles, and swelling are normal when adhering to 2-3 cells on average per cell, from 0 to 0 per cell on average. When adhering to two cells, it can be determined that there is a lot of sagging and wrinkles, and the beam is inferior. The skin condition can also be expressed as skin age.
インビトロの試料の場合、接着は、細胞密度から判定することができる。一例として、０．２５×１０4細胞／ｍｌの密度で、６穴プレートｍｍディッシュあたり２．５ｍｌを播種した場合を、接触無しと判定することができる。０．５×１０4細胞／ｍｌの密度で、６穴プレートあたり２．５ｍｌを播種した場合を、軽度接触と判定することができる。１．０×１０4細胞／ｍｌの密度で、６穴プレートｍｍディッシュあたり２．５ｍｌを播種した場合を、中程度接触と判定することができる。２．０×１０4細胞／ｍｌの密度で、６穴プレートｍｍディッシュあたり２．５ｍｌを播種した場合を、高度接触と判定することができる。４．０×１０4細胞／ｍｌの密度で、６穴プレートあたり２．５ｍｌを播種した場合を、過度接触と判定することができる。したがって、０〜１．０×１０3細胞／ｃｍ2の密度を接触無し、１．０〜２．０×１０3細胞／ｃｍ2の密度を軽度接触、２．０〜４．０×１０3細胞／ｃｍ2を中程度接触と判定することができ、４．０〜８．０×１０3細胞／ｃｍ2を高度接触と判定することができ、８．０×１０3細胞／ｃｍ2以上を過度接触と判定することができる。使用するディッシュ及び播種細胞数からの顕微鏡画像に応じ、適宜接触を判定することができる。For in vitro samples, adhesion can be determined from cell density. As an example, when 2.5 ml per 6-well plate mm dish is seeded at a density of 0.25 × 10 4 cells / ml, it can be determined that there is no contact. When 2.5 ml per 6-well plate is seeded at a density of 0.5 × 10 4 cells / ml, it can be judged as mild contact. When 2.5 ml per 6-well plate mm dish is seeded at a density of 1.0 × 10 4 cells / ml, it can be determined to be moderate contact. High contact can be determined when 2.5 ml is seeded per 6-well plate mm dish at a density of 2.0 × 10 4 cells / ml. When 2.5 ml is seeded per 6-well plate at a density of 4.0 × 10 4 cells / ml, it can be determined that the contact is excessive. Therefore, a density of 0 to 1.0 × 10 3 cells / cm 2 without contact, a density of 1.0 to 2.0 × 10 3 cells / cm 2 with mild contact, 2.0 to 4.0 × 10 3 Cells / cm 2 can be determined to be moderate contact, 4.0-8.0 × 10 3 cells / cm 2 can be determined to be high contact, 8.0 × 10 3 cells / cm 2 or more. Can be determined to be excessive contact. Contact can be determined as appropriate according to the dish used and the microscopic image from the number of seeded cells.
本発明において、対象は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ、マウスなどであってよいが、美容上の目的から好ましくはヒトである。スクリーニング方法に用いる場合、線維芽細胞であれば、任意の種由来であってよいが、美容上の目的から好ましくはヒトである。 In the present invention, the subject may be any mammal, such as humans, monkeys, pigs, cows, horses, mice, etc., but is preferably human for cosmetic purposes. When used in a screening method, fibroblasts may be derived from any species, but are preferably human for cosmetic purposes.
本発明の対象において、真皮線維芽細胞における細胞間の接着が少なく皮膚細胞の細胞活性が低いと判定された対象に対しては、真皮線維芽細胞の活性を高めるスキンケアや治療工程が行われる。真皮線維芽細胞の活性を高めるために、公知の真皮細胞賦活剤の投与や、真皮線維芽細胞又は皮膚幹細胞の活性化の処置が行われうる。 In the subject of the present invention, a skin care or treatment step for enhancing the activity of dermal fibroblasts is performed on a subject determined to have low cell-cell adhesion in dermal fibroblasts and low cell activity of skin cells. In order to enhance the activity of dermal fibroblasts, administration of known dermal cell activators or treatment of activation of dermal fibroblasts or skin stem cells can be performed.
本発明の別の態様は、皮膚細胞賦活剤のスクリーニング方法に関する。本発明の皮膚細胞賦活剤のスクリーニング方法は、線維芽細胞同士の接着について、候補薬剤の影響を調べることで、皮膚細胞賦活剤をスクリーニングが可能になる。より具体的に、本発明の皮膚細胞賦活剤のスクリーニング方法は、以下の：
線維芽細胞を、候補薬剤添加培地又は非添加対照培地中で培養する工程、
候補薬剤非添加の対照群と、候補薬剤添加群とにおいて、線維芽細胞同士の接着を決定する工程、及び
対照群に比較して、線維芽細胞同士の接着が亢進された群に添加した候補薬剤を、細胞賦活剤として決定する工程、
を含む。Another aspect of the present invention relates to a method for screening a skin cell activator. The method for screening a skin cell activator of the present invention enables screening of a skin cell activator by examining the influence of a candidate drug on adhesion between fibroblasts. More specifically, the screening method for the skin cell activator of the present invention is as follows:
A step of culturing fibroblasts in a candidate drug-added medium or a non-added control medium,
In the control group to which the candidate drug was not added and the candidate drug-added group, the step of determining the adhesion between fibroblasts, and the candidate added to the group in which the adhesion between fibroblasts was enhanced as compared with the control group. The process of determining a drug as a cell activator,
including.
対照群は、候補薬剤を含まないことを除いて、候補薬剤添加群と同一条件で実験された培養物である。対照群については、候補薬剤添加群と同じ条件下で並行して実験がされてもよいし、別途実験が行われていてもよい。候補薬剤は、化合物ライブラリー、医薬品ライブラリー、化粧品素材ライブラリー、抽出物ライブラリーなどに含まれる物質を使用することができる。 The control group is a culture tested under the same conditions as the candidate drug-added group, except that it does not contain the candidate drug. For the control group, the experiment may be conducted in parallel under the same conditions as the candidate drug addition group, or a separate experiment may be conducted. As the candidate drug, a substance contained in a compound library, a pharmaceutical library, a cosmetic material library, an extract library, or the like can be used.
皮膚細胞賦活剤は、真皮細胞において細胞間接着を亢進させることを介して、皮膚細胞、特に真皮細胞の細胞活性を亢進できる薬剤をいう。皮膚細胞賦活剤により、細胞増殖や間質成分の発現促進が図られ、特にコラーゲン産生の促進することができる。本発明のスクリーニング方法により選択された皮膚細胞賦活剤は、細胞接着タンパク質の発現促進剤ということもできる。細胞接着タンパク質の中でも、カドヘリンファミリーのタンパク質、特にカドヘリン２タンパク質の発現促進剤ということができる。本発明のスクリーニング方法により選択された皮膚細胞賦活剤は化粧品又は医薬品に配合することができる。本発明において選択された皮膚細胞賦活剤は、コラーゲン産生促進剤、しわ改善剤、たるみ改善剤、はり改善剤ということもできる。
The skin cell activator refers to an agent capable of enhancing the cell activity of skin cells, particularly dermis cells, by enhancing cell-cell adhesion in the dermis cells. The skin cell activator promotes cell proliferation and expression of interstitial components, and can particularly promote collagen production. The skin cell activator selected by the screening method of the present invention can also be said to be an expression promoter of cell adhesion protein. Among the cell adhesion proteins, it can be said that it is an expression promoter of cadherin family proteins, particularly
スクリーニング方法において、接着の決定は細胞活性の測定方法にもちいた手法と同じ手法により決定することができる。具体的に、顕微鏡下での細胞の接着や突起形状の観察が行われる。形状に基づいて、接着を判定する場合、細胞の円形率を求めることで接着を測定することができる。顕微鏡下の観察の際に、細胞接着タンパク質、例えばカドヘリン２を特異的に染色することでより正確に細胞同士の接着を判定することができる。また別の態様では、細胞同士の接着の指標として、細胞接着タンパク質の量又は遺伝子発現量を使用することで、スクリーニングすることもできる。
In the screening method, the determination of adhesion can be determined by the same method as that used in the method for measuring cell activity. Specifically, cell adhesion and protrusion shape observation are performed under a microscope. When determining adhesion based on shape, adhesion can be measured by determining the circularity of the cells. By specifically staining a cell adhesion protein, for example,
線維芽細胞の培養は、線維芽細胞を培養する通常の方法で行われうる。接着を判定する観点から、接触無し〜過度接触が達成される密度、例えば０．１〜１０×１０３細胞／ｃｍ２で培養されうる。好ましくは、接触無し〜高度接触が達成される密度、例えば０．５〜８．０×１０３細胞／ｃｍ２であり、より好ましくは中程度接触が達成される密度、例えば２．０〜４．０×１０3細胞／ｃｍ２の細胞培養物を用いることが好ましい。また、一の態様では、細胞が増殖することで、細胞の接触状態の判別が難しくなることから、増殖が抑制された条件下、例えば増殖因子の量を低減させた培地を用いて、スクリーニング方法を行うこともできる。Fibroblast culture can be performed in the usual way of culturing fibroblasts. From the viewpoint of determining adhesion, the cells can be cultured at a density at which no contact to excessive contact is achieved, for example 0.1 to 10 × 10 3 cells / cm 2. Preferably, the density at which no contact to high contact is achieved, eg 0.5-8.0 × 10 3 cells / cm 2 , more preferably the density at which moderate contact is achieved, eg 2.0-4. It is preferable to use a cell culture of 0.0 × 10 3 cells / cm 2. Further, in one embodiment, since it becomes difficult to determine the contact state of cells due to cell proliferation, a screening method using a medium in which the amount of growth factor is reduced, for example, under conditions in which proliferation is suppressed. Can also be done.
別の態様では、本発明は、ハリが調節された３次元皮膚モデルの作成方法に関する。３次元皮膚モデルは、間質成分と細胞成分とを含む培養物であり、生体の真皮を模した構造を有する。３次元皮膚モデルは、間質成分として、膠原繊維、弾性繊維、細胞外マトリックスのうちの少なくとも１を含み、特に膠原繊維としてコラーゲンを含む。弾性繊維として、エラスチンやフィブリンを含んでもよい。細胞外もマトリクス成分として、糖タンパク質やプロテオグリカンを含んでもよい。一例として、コラーゲン含有培地中で、真皮線維芽細胞を分散させて培養することで、３次元皮膚モデルを作成することができる。カドヘリン２遺伝子の発現と、コラーゲンの収縮又は成熟との関係が見出すことができた。したがって、３次元皮膚モデルの作成の際に、カドヘリン２を介した細胞接着を制御することで、３次元皮膚モデルのハリを調節することができる。
In another aspect, the invention relates to a method of creating a three-dimensional skin model with adjusted firmness. The three-dimensional skin model is a culture containing an interstitial component and a cellular component, and has a structure imitating the dermis of a living body. The three-dimensional skin model contains at least one of collagen fibers, elastic fibers, and extracellular matrix as an interstitial component, and particularly collagen as collagen fibers. The elastic fibers may contain elastin and fibrin. Extracellular may also contain glycoproteins and proteoglycans as matrix components. As an example, a three-dimensional skin model can be created by dispersing and culturing dermal fibroblasts in a collagen-containing medium. A relationship between the expression of the
カドヘリン２を介した細胞接着は、カドヘリン２遺伝子の調節により制御することができる。具体的に、カドヘリン２遺伝子は、ノックダウンの作成、ｓｉＲＮＡ、抗体などにより、発現抑制や機能阻害することができ、さらには上述のスクリーニング方法にて得られた皮膚賦活剤をカドヘリン２遺伝子の活性促進剤として使用することもできる。
Cell adhesion via
さらに別の態様では、間質成分における真皮線維芽細胞の播種密度を調節することにより、カドヘリン２を介した細胞接着を制御することができる。播種密度が高くなるほど、細胞間の接着数が増加する。この接着は主にカドヘリン２を介した接着である。播種密度は、ゲルの体積あたりの細胞数で表すことができ、５００００個／ｃｍ3以上、好ましくは１０００００個／ｃｍ3以上、さらに好ましくは２０００００個／ｃｍ3以上で播種することにより、３次元皮膚モデルのハリを高めることができる。In yet another embodiment,
本発明のさらに別の態様では、本発明の３次元皮膚モデルの作成方法により作成されたハリが高められた３次元皮膚モデルに関してもよい。このような３次元皮膚モデルは、カドヘリン２の遺伝子発現を増大された真皮線維芽細胞と、間質成分としてコラーゲンゲルとを含んでもよい。カドヘリン２の遺伝子発現を増大された真皮線維芽細胞は、カドヘリン２遺伝子発現を増大するためのベクターを含んでいてもよい。このような３次元皮膚モデルは、細胞接着の数が、１細胞あたり平均で２〜３個、好ましくは３〜５個であり、かかる細胞接着は好ましくはカドヘリン２を介した細胞接着である。また、３次元皮膚モデルに含まれる細胞は、５００００個／ｃｍ3以上、好ましくは１０００００個／ｃｍ3以上、さらに好ましくは２０００００個／ｃｍ3以上の密度で存在する。このような細胞密度を達成することで、３次元皮膚モデルのハリを高めることができる。３次元皮膚モデルのハリは、キュートメーター、ダーマトルクメーターなどの市販の皮膚の張り測定器を用いることで測定することができる。一例として、キュートメーターを用いた場合に、本発明の３次元皮膚モデルが、Ｕｒ／Ｕｆの値で０．１〜１．０、より好ましくは０．２〜０．８の張りを有することが好ましい。キュートメーターを用いた皮膚の張りの測定方法については、Skin Research and Technology (2010); 16: 332-338を参照すること実行することができる。In still another aspect of the present invention, the three-dimensional skin model with enhanced elasticity created by the method for creating the three-dimensional skin model of the present invention may be used. Such a three-dimensional skin model may include dermal fibroblasts with increased
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。 All references referred to herein are incorporated herein by reference in their entirety.
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。 The examples of the present invention described below are for purposes of illustration only and do not limit the technical scope of the present invention. The technical scope of the present invention is limited only by the description of the claims. Modifications of the present invention, for example, addition, deletion and replacement of the constituent elements of the present invention, can be made on condition that the gist of the present invention is not deviated.
３次元顕微鏡による観察
若齢対象（２０歳）及び高齢対象（８０歳）の皮膚切片を、導電性樹脂で処理し、３次元電子顕微鏡（ＳＢＦ−ＳＥＭ）観察に供した。３次元リモデリングした図を示す（図１）。ＳＢＦ‐ＳＥＭによるサンプル調製及び観察方法は下記のとおりである。Observation with a three-dimensional microscope Young subjects (20 years old) and elderly subjects (80 years old) were treated with a conductive resin and subjected to observation with a three-dimensional electron microscope (SBF-SEM). A three-dimensional remodeled diagram is shown (Fig. 1). The sample preparation and observation method by SBF-SEM is as follows.
シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡（ＳＢＦ−ＳＥＭ）
ヒト皮膚サンプルを、２％グルタルアルデヒド及び２％パラホルムアルデヒドの緩衝溶液中で４℃で数日間固定した。サンプルを２％四酸化オスミウム（Nisshin EM, Tokyo, Japan)及び１．５％フェロシアン化カリウム (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)のリン酸緩衝生理食塩水で４℃にて１時間処理し、１％チオカルボヒドラジド（Sigma, St. Louis, Mo, USA)で室温にて２０分間処理し、２％四酸化オスミウム水溶液で３０分間室温にて処理し、２％酢酸ウラニル溶液で４℃１２時間以上処理し、そして室温で１時間処理した。サンプルを、０．６７％硝酸鉛(ｐＨ５．０〜５．５、TAAB、Berkshire,UK)、０．０３Ｍ Ｌ-アスパラギン酸（Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)の溶液中で６５℃にて３０分間インキュベートした。次にサンプルを段階的エタノール系列で脱水し、脱水アセトンで処理し、３５℃にて、Quetol812エポキシ樹脂（Nisshin EM, Tokyo, Japan)を浸透させ、そしてKejen black powder含有Quetol812（Nguyen et al. Sci Rep. 2016)に包埋した。樹脂を７０℃で７夜超インキュベートして、重合化を確実にした。３Viewチャンバー内ウルトラマイクトロームシステム（Gatan, Pleasanton, CA)を備えた電界放出走査型電子顕微鏡 (Merlin, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)を用いてSBF-SEMでの観察を行った。８０〜９０μｍ×８０〜９０μｍ幅（１１〜１２ｎｍ／ピクセル）で、６０μｍの深さにわたり８０ｎｍのステップで連続イメージシーケンスを取得した。連続イメージを、FIJI（https://fiji.sc/)を用いて処理した。Amira (Maxnet Co., Ltd, Tokyo, Japan)を用いて、セグメンテーション及び３次元リコンストラクションを行った。Serial Block Face Scanning Electron Microscope (SBF-SEM)
Human skin samples were fixed at 4 ° C. for several days in a buffer solution of 2% glutaraldehyde and 2% paraformaldehyde. Samples were treated with 2% osmium tetroxide (Nisshin EM, Tokyo, Japan) and 1.5% potassium ferrocyanide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in phosphate buffered saline at 4 ° C. for 1 hour to 1%. Treated with thiocarbhydrazide (Sigma, St. Louis, Mo, USA) at room temperature for 20 minutes, treated with 2% osmium tetroxide aqueous solution at room temperature for 30 minutes, and treated with 2% uranyl acetate solution at 4 ° C. for 12 hours or more. And treated at room temperature for 1 hour. Samples are placed in a solution of 0.67% lead nitrate (pH 5.0-5.5, TAAB, Berkshire, UK), 0.03ML-aspartic acid (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) at 65 ° C. for 30 minutes. Incubated. The sample was then dehydrated in a stepwise ethanol series, treated with dehydrated acetone, impregnated with Quetol812 epoxy resin (Nisshin EM, Tokyo, Japan) at 35 ° C., and Quetol812 containing Kejen black powder (Nguyen et al. Sci). Embedded in Rep. 2016). The resin was incubated at 70 ° C. for over 7 nights to ensure polymerization. Observation with SBF-SEM was performed using a field emission scanning electron microscope (Merlin, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) equipped with an ultra-mictrome system (Gatan, Pleasanton, CA) in a 3View chamber. Continuous image sequences were acquired in steps of 80 nm over a depth of 60 μm with a width of 80-90 μm × 80-90 μm (11-12 nm / pixel). Continuous images were processed using FIJI (https://fiji.sc/). Segmentation and 3D reconstruction were performed using Amira (Maxnet Co., Ltd, Tokyo, Japan).
培養実験
ヒトの皮膚試料から、定法にしたがってヒト初代培養線維芽細胞を取得した。細胞の数を計測し、（１０％ ＦＢＳを含む）DMEM培地中に、１ｍｌあたり、０．２５×１０4細胞（接触無し）、０．５×１０4細胞（軽度接触）、１．０×１０4細胞（中程度接触）、２．０×１０4細胞（高度接触）、及び４．０×１０4細胞（過度接触）に調製した。かかる細胞懸濁液を、６穴プレート（ファルコン社製）に２．５ｍｌ滴下し、３７℃５％ＣＯ2雰囲気下で２日間培養した。培養後の細胞の顕微鏡写真を図２に示す。Culture experiment Human primary cultured fibroblasts were obtained from human skin samples according to a conventional method. The number of cells was counted and in DMEM medium (containing 10% FBS), 0.25 × 10 4 cells (no contact), 0.5 × 10 4 cells (mild contact), 1.0 × per ml. 104 cells (medium contact), 2.0 × 10 4 cells (altitude contact), and 4.0 were prepared × 10 4 cells (excessive contact). 2.5 ml of such a cell suspension was added dropwise to a 6-well plate (manufactured by Falcon), and the cells were cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere for 2 days. A photomicrograph of the cultured cells is shown in FIG.
接着の程度の違いに伴う遺伝子発現の変化
接触度の異なる培養物から細胞を回収し、マイクロアレイ解析に付したところ、細胞接触度に応じて、Ｉ型コラーゲンの発現が変化することを見出した（データ未掲載）。そこで、下記のプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲにより、Ｉ型コラーゲンの発現量を決定した（図３）。発現量の決定には、内部標準として、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を用いた。
Ｉ型コラーゲンの発現に寄与する因子を決定することを目的として、培養線維芽細胞において、細胞接着タンパク質の発現をｓｉＲＮＡ法により抑制した。ＣＤＨ２、ＣＤＨ１１、及びＣＤＨ１３のｓｉＲＮＡを、キアゲン社より入手した。これらのｓｉＲＮＡを定法にしたがって用いて培養真皮線維芽細胞において各遺伝子の発現を抑制した。１×１０4細胞／ｍｌの密度の細胞懸濁液０．５ｍｌを２４穴プレート（面積：２ｃｍ２）の各ウェルに播種し、２日間３７℃５％ＣＯ2雰囲気下で培養した。培養線維芽細胞を採取し、各細胞接着タンパク質の遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲで決定し、目的タンパク質の発現抑制を確認した（図４）。次に、採取された細胞において、Ｉ型コラーゲンの発現を測定したところ、ＣＤＨ２の遺伝子発現を抑制した際に、Ｉ型コラーゲンの発現量が低下することが示された（図５）。For the purpose of determining the factors contributing to the expression of type I collagen, the expression of cell adhesion protein was suppressed by the siRNA method in cultured fibroblasts. SiRNAs of CDH2, CDH11, and CDH13 were obtained from Qiagen. These siRNAs were used according to a conventional method to suppress the expression of each gene in cultured dermal fibroblasts. 0.5 ml of a cell suspension having a density of 1 × 10 4 cells / ml was seeded in each well of a 24-well plate (area: 2 cm 2 ) and cultured in a 37 ° C. 5% CO 2 atmosphere for 2 days. Cultured fibroblasts were collected, and the gene expression of each cell adhesion protein was determined by real-time PCR, and suppression of expression of the target protein was confirmed (Fig. 4). Next, when the expression of type I collagen was measured in the collected cells, it was shown that the expression level of type I collagen decreased when the gene expression of CDH2 was suppressed (FIG. 5).
カドヘリン２発現が抑制された真皮線維芽細胞と、対照の真皮線維芽細胞とを、それぞれ１×１０4細胞／ｍｌの密度の細胞懸濁液０．５ｍｌを２４穴プレート（面積：２ｃｍ2）の各ウェルに播種し、２日間３７℃５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。培養細胞を計数し、細胞の増殖性について比較した（図６Ａ）。また、各培養細胞についてＣＤＫファミリーの阻害タンパク質であるｐ２１の遺伝子発現を、下記のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより測定した。さらに、細胞老化アッセイキット（Biovision社）を用いて、Ｘ−Ｇａｌによりβガラクトシダーゼ活性に応じて細胞を染色し、顕微鏡下で撮影した（図７）。対照細胞では、培養真皮線維芽細胞は扁平な形状であり、細胞同士の接着がみられたが、カドヘリン２の遺伝子発現の抑制（Knockout)により、細胞同士の接着が減少し、またそれにともない細胞形状が対照に比較して球形を示した。また、カドヘリン２の遺伝子発現の抑制された真皮線維芽細胞において、細胞老化の指標となる細胞内βガラクトシダーゼ活性が高かった。
カドヘリン２の遺伝子発現が抑制された真皮線維芽細胞では、コラーゲン遺伝子の発現及び細胞増殖がともに抑制された。また、カドヘリン２の遺伝子発現が抑制された真皮線維芽細胞では、サイクリンの抑制により細胞周期の停止を引き起こすｐ２１の遺伝子発現が増加することが示され、さらに細胞の老化の指標である細胞内βガラクトシダーゼ活性が高いことも示された。以上の結果より、細胞接着タンパク質であるカドヘリン２を介して、真皮線維芽細胞が、細胞間の接触を形成しており、このような接触が失われることで、細胞が老化し、細胞活性が低下することが示された。
In dermal fibroblasts in which cadherin 2 gene expression was suppressed, both collagen gene expression and cell proliferation were suppressed. In addition, in dermal fibroblasts in which the gene expression of
コラーゲンゲル収縮活性
線維芽細胞を、３×１０5細胞となるように７５ｃｍ2フラスコに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で１２時間培養を行った。次に、キアゲン社より入手したＣＤＨ２のｓｉＲＮＡを定法に従って導入し、２４時間後に細胞を回収した。０．１％コラーゲンゲルとなるように、ｓｉＲＮＡを導入された細胞を２×１０５細胞／ｍｌ（終濃度）でコラーゲンゲルと混合して播種し、２４時間培養した。２４時間後にプレート上から撮影し、コラーゲンゲルの収縮を測定した（図８）。ＣＤＨ２の遺伝子発現の抑制により、コラーゲン収縮活性が低下していることが示された。コラーゲンは、線維芽細胞がひきつけて、収縮することにより弾力が増加する。ＣＤＨ２遺伝子の発現が抑制されると、コラーゲンの収縮が妨げられることから、皮膚のたるみやはりの減少につながることが示された。Collagen gel contractile active fibroblasts were seeded in 75 cm 2 flasks so as to be 3 × 10 5 cells, and cultured in DMEM containing 10% FBS for 12 hours. Next, siRNA of CDH2 obtained from Qiagen was introduced according to a conventional method, and cells were collected 24 hours later. Such that 0.1% collagen gel, the siRNA was introduced cells at 2 × 10 5 cells / ml (final concentration) were seeded mixed with collagen gel and cultured for 24 hours. After 24 hours, the image was taken from the plate to measure the shrinkage of the collagen gel (Fig. 8). It was shown that the collagen contractile activity was reduced by suppressing the gene expression of CDH2. Collagen increases its elasticity by attracting and contracting fibroblasts. It has been shown that when the expression of the CDH2 gene is suppressed, the contraction of collagen is hindered, which leads to the reduction of the sagging of the skin.
スクリーニング実験
真皮線維芽細胞を、ＤＭＥＮ培地中に１．０×１０4細胞／ｍｌの濃度で調製し、２．５ｍｌを、６穴プレートに播種した。２日間培養後、候補薬剤を含む培地、候補薬剤非添加の対照培地で、培地をそれぞれ置換し、さらに２日間培養を行った。培養物を、ＰＦＡで固定し、抗カドヘリン２ラビット抗体（セルシグナリング社）)を反応させ、次いで蛍光標識された抗ラビットＩｇＧ抗体（セルシグナリング社）を反応させた。蛍光顕微鏡下で観察を行い、カドヘリン２の発現を確認するとともに、細胞の突起部の形態を確認し、１細胞あたりの細胞の接着数を確認した。対照と比較して、接着数が増加した場合に、候補薬剤を皮膚細胞賦活剤としてスクリーニングすることができる。Screening Experiments Dermal fibroblasts were prepared in DMEN medium at a concentration of 1.0 × 10 4 cells / ml and 2.5 ml was seeded on a 6-well plate. After culturing for 2 days, the medium was replaced with a medium containing the candidate drug and a control medium to which the candidate drug was not added, and the cells were further cultured for 2 days. Cultures were fixed with PFA and reacted with an
スクリーニング実験
真皮線維芽細胞を、ＤＭＥＮ培地中に１．０×１０4細胞／ｍｌの濃度で調製し、２．５ｍｌを、６穴プレートに播種した。２日間培養後、候補薬剤を含む培地、候補薬剤非添加の対照培地で、培地をそれぞれ置換し、さらに２日間培養を行った。培養物におけるカドヘリン２の遺伝子発現又はタンパク質量を測定し、対照と比較して増加した場合に、皮膚細胞賦活剤としてスクリーニングすることができる。このようにして取得された皮膚細胞賦活剤は、カドヘリン２遺伝子発現促進剤ということもできる。Screening Experiments Dermal fibroblasts were prepared in DMEN medium at a concentration of 1.0 × 10 4 cells / ml and 2.5 ml was seeded on a 6-well plate. After culturing for 2 days, the medium was replaced with a medium containing the candidate drug and a control medium to which the candidate drug was not added, and the cells were further cultured for 2 days. The gene expression or protein level of
Claims (23)
線維芽細胞を、候補薬剤添加培地又は非添加対照培地中で培養する工程、
候補薬剤非添加の対照群と、候補薬剤添加群とにおいて、線維芽細胞同士の接着を決定する工程、及び
対照群に比較して、線維芽細胞同士の接着が亢進された群に添加した候補薬剤を、細胞賦活剤として決定する工程、
を含む、前記スクリーニング方法。A screening method for skin cell activators
A step of culturing fibroblasts in a candidate drug-added medium or a non-added control medium,
In the control group to which the candidate drug was not added and the candidate drug-added group, the step of determining the adhesion between fibroblasts, and the candidate added to the group in which the adhesion between fibroblasts was enhanced as compared with the control group. The process of determining a drug as a cell activator,
The screening method comprising.
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