JPWO2020004244A1 - Marker for determining pancreatic cancer - Google Patents
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Abstract
本発明の課題は、確度（正確度・精度）の高い、膵臓癌の判定用マーカーを提供することにある。本発明は、膵臓癌の判定用マーカー、膵臓癌の判定方法、膵臓癌の判定を行うためのデータを得る方法、膵臓癌の判定用キット等に関する。An object of the present invention is to provide a marker for determining pancreatic cancer with high accuracy (accuracy / accuracy). The present invention relates to a marker for determining pancreatic cancer, a method for determining pancreatic cancer, a method for obtaining data for determining pancreatic cancer, a kit for determining pancreatic cancer, and the like.
Description
本発明は、膵臓癌の判定用マーカーに関する。 The present invention relates to a marker for determining pancreatic cancer.
糖鎖とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸等の単糖及びこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。
糖鎖は、生体内ではタンパク質や脂質と結合した複合糖質の形態で主に細胞表面に存在しており、細胞の増殖、細菌やウイルスの感染、神経の伸長、炎症、免疫等の生理作用に関与している。The sugar chain is a general term for monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, and sialic acid, and molecules in which derivatives thereof are linked in a chain by glycosidic bonds.
Sugar chains are mainly present on the cell surface in the form of complex sugars bound to proteins and lipids in the living body, and have physiological actions such as cell proliferation, bacterial and viral infections, nerve elongation, inflammation, and immunity. Is involved in.
一方、糖鎖は、膵臓癌等の疾患に伴いその構造が変化することも知られており、近年、糖鎖を膵臓癌等の疾患の診断用マーカーとして用いるための研究が行われている。
糖鎖を有する膵臓癌等の疾患の診断用マーカーとしては、例えば、ＣＡ１９−９（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ １９−９：膵臓癌マーカー）、ハプトグロビン（ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ：膵臓癌マーカー）等が知られている（特許文献１）。On the other hand, it is also known that the structure of sugar chains changes with diseases such as pancreatic cancer, and in recent years, studies have been conducted for using sugar chains as diagnostic markers for diseases such as pancreatic cancer.
As diagnostic markers for diseases such as pancreatic cancer having sugar chains, for example, CA19-9 (carbohydrate antigen 19-9: pancreatic cancer marker), haptoglobin (haptoglobin: pancreatic cancer marker) and the like are known (Patent Documents). 1).
しかしながら、これら公知の糖鎖を有する膵臓癌マーカーは、確度（正確度・精度）の点で十分ではなかった。 However, these known pancreatic cancer markers having sugar chains were not sufficient in terms of accuracy (accuracy / accuracy).
本発明は、確度（正確度・精度）の高い、膵臓癌の判定用マーカーの提供を課題とする。 An object of the present invention is to provide a marker for determining pancreatic cancer with high accuracy (accuracy / accuracy).
本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであり、以下の構成よりなる。
［１］
下記（１）〜（５）から選ばれる糖鎖を含む、膵臓癌の判定用マーカー：
（１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、下記式５で表される糖鎖、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、下記式６で表される糖鎖、
（３）ビトロネクチンに存在する、下記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４）補体Ｃ４−Ａに存在する、下記式４で表される糖鎖、
（５）チロキシン結合グロブリンに存在する、下記式３表される糖鎖。
前記糖鎖が、下記（１−１）〜（５−１）の何れか１つで表される糖鎖である、［１］に記載のマーカー：
（１−１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３のアミノ酸配列のＮ末端より５８０番目のアスパラギン残基に結合している前記式５で表される糖鎖、
（２−１）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より１８６番目のアスパラギン残基に結合している前記式６で表される糖鎖、
（３−１）ビトロネクチンのアミノ酸配列のＮ末端より１６９番目のアスパラギン残基に結合している前記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４−１）補体Ｃ４−Ａのアミノ酸配列のＮ末端より１３２８番目のアスパラギン残基に結合している前記式４で表される糖鎖、
（５−１）チロキシン結合グロブリンのアミノ酸配列のＮ末端より３６番目のアスパラギン残基に結合している前記式３で表される糖鎖。
［３］
前記糖鎖が、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３のアミノ酸配列のＮ末端より５８０番目のアスパラギン残基に結合している前記式５で表される糖鎖である、［１］又は［２］に記載のマーカー。
［４］
前記糖鎖が、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より１８６番目のアスパラギン残基に結合している前記式６で表される糖鎖である、［１］〜［３］の何れか１つに記載のマーカー。
［５］
試料中の、下記（１）〜（５）から選ばれる糖鎖の量を測定し、得られた測定結果に基づいて膵臓癌を判定する、膵臓癌の判定方法：
（１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、下記式５で表される糖鎖、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、下記式６で表される糖鎖、
（３）ビトロネクチンに存在する、下記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４）補体Ｃ４−Ａに存在する、下記式４で表される糖鎖、
（５）チロキシン結合グロブリンに存在する、下記式３で表される糖鎖。
前記糖鎖が、下記（１−１）〜（５〜１）の何れか１つで表される糖鎖である、［５］に記載の判定方法：
（１−１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３のアミノ酸配列のＮ末端より５８０番目のアスパラギン残基に結合している前記式５で表される糖鎖、
（２−１）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より１８６番目のアスパラギン残基に結合している前記式６で表される糖鎖、
（３−１）ビトロネクチンのアミノ酸配列のＮ末端より１６９番目のアスパラギン残基に結合している前記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４−１）補体Ｃ４−Ａのアミノ酸配列のＮ末端より１３２８番目のアスパラギン残基に結合している前記式４で表される糖鎖、
（５−１）チロキシン結合グロブリンのアミノ酸配列のＮ末端より３６番目のアスパラギン残基に結合している前記式３で表される糖鎖。
［７］
前記糖鎖が、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３のアミノ酸配列のＮ末端より５８０番目のアスパラギン残基に結合している前記式５で表される糖鎖である、［５］又は［６］に記載の判定方法。
［８］
前記糖鎖が、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より１８６番目のアスパラギン残基に結合している前記式６で表される糖鎖である、［５］〜［７］の何れか１つに記載の判定方法。
［９］
前記試料が、全血、血清又は血漿である、［５］〜［８］の何れか１つに記載の判定方法。
［１０］
試料中の、下記（１）〜（５）から選ばれる糖鎖の量を測定することによりなされる、膵臓癌の判定を行うためのデータを得る方法：
（１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、下記式５で表される糖鎖、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、下記式６で表される糖鎖、
（３）ビトロネクチンに存在する、下記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４）補体Ｃ４−Ａに存在する、下記式４で表される糖鎖、
（５）チロキシン結合グロブリンに存在する、下記式３で表される糖鎖。
下記（１）〜（５）から選ばれる糖鎖に親和性を有する物質を含む、膵臓癌の判定用キット：
（１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、下記式５で表される糖鎖、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、下記式６で表される糖鎖、
（３）ビトロネクチンに存在する、下記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４）補体Ｃ４−Ａに存在する、下記式４で表される糖鎖、
（５）チロキシン結合グロブリンに存在する、下記式３で表される糖鎖。
[1]
Markers for determining pancreatic cancer containing sugar chains selected from the following (1) to (5):
(1) Interalpha trypsin inhibitor A sugar chain represented by the following formula 5 existing in the heavy chain H3.
(2) A sugar chain represented by the following formula 6 present in leucine-
(3) At least one sugar chain represented by the following formulas 1 to 3 present in vitronectin.
(4) A sugar chain represented by the following formula 4 existing in complement C4-A.
(5) A sugar chain represented by the following formula 3 present in thyroxine-binding globulin.
The marker according to [1], wherein the sugar chain is a sugar chain represented by any one of the following (1-1) to (5-1):
(1-1) The sugar chain represented by the above formula 5 which is bound to the 580th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3.
(2-1) A sugar chain represented by the above formula 6, which is bound to the 186th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of leucine-
(3-1) At least one sugar chain represented by the above formulas 1 to 3 which is bound to the asparagine residue at position 169 from the N-terminal of the amino acid sequence of vitronectin.
(4-1) A sugar chain represented by the above formula 4 which is bound to the asparagine residue at position 1328 from the N-terminal of the amino acid sequence of complement C4-A.
(5-1) A sugar chain represented by the above formula 3 which is bound to the 36th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of thyroxine-binding globulin.
[3]
[1] or [2], wherein the sugar chain is a sugar chain represented by the above formula 5 which is bound to the asparagine residue at position 580 from the N-terminal of the amino acid sequence of the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3. Described marker.
[4]
Any of [1] to [3], wherein the sugar chain is a sugar chain represented by the above formula 6 which is bound to the asparagine residue at the 186th position from the N-terminal of the amino acid sequence of leucine-
[5]
A method for determining pancreatic cancer, which measures the amount of sugar chains selected from the following (1) to (5) in a sample and determines pancreatic cancer based on the obtained measurement results:
(1) Interalpha trypsin inhibitor A sugar chain represented by the following formula 5 existing in the heavy chain H3.
(2) A sugar chain represented by the following formula 6 present in leucine-
(3) At least one sugar chain represented by the following formulas 1 to 3 present in vitronectin.
(4) A sugar chain represented by the following formula 4 existing in complement C4-A.
(5) A sugar chain represented by the following formula 3 present in thyroxine-binding globulin.
The determination method according to [5], wherein the sugar chain is a sugar chain represented by any one of the following (1-1) to (5-1).
(1-1) The sugar chain represented by the above formula 5 which is bound to the 580th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3.
(2-1) A sugar chain represented by the above formula 6, which is bound to the 186th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of leucine-
(3-1) At least one sugar chain represented by the above formulas 1 to 3 which is bound to the asparagine residue at position 169 from the N-terminal of the amino acid sequence of vitronectin.
(4-1) A sugar chain represented by the above formula 4 which is bound to the asparagine residue at position 1328 from the N-terminal of the amino acid sequence of complement C4-A.
(5-1) A sugar chain represented by the above formula 3 which is bound to the 36th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of thyroxine-binding globulin.
[7]
[5] or [6], wherein the sugar chain is a sugar chain represented by the above formula 5 which is bound to the asparagine residue at position 580 from the N-terminal of the amino acid sequence of the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3. Judgment method described.
[8]
Any of [5] to [7], wherein the sugar chain is a sugar chain represented by the above formula 6 which is bound to the asparagine residue at the 186th position from the N-terminal of the amino acid sequence of leucine-
[9]
The determination method according to any one of [5] to [8], wherein the sample is whole blood, serum or plasma.
[10]
A method for obtaining data for determining pancreatic cancer, which is performed by measuring the amount of sugar chains selected from the following (1) to (5) in a sample:
(1) Interalpha trypsin inhibitor A sugar chain represented by the following formula 5 existing in the heavy chain H3.
(2) A sugar chain represented by the following formula 6 present in leucine-
(3) At least one sugar chain represented by the following formulas 1 to 3 present in vitronectin.
(4) A sugar chain represented by the following formula 4 existing in complement C4-A.
(5) A sugar chain represented by the following formula 3 present in thyroxine-binding globulin.
A kit for determining pancreatic cancer, which contains a substance having an affinity for a sugar chain selected from the following (1) to (5):
(1) Interalpha trypsin inhibitor A sugar chain represented by the following formula 5 existing in the heavy chain H3.
(2) A sugar chain represented by the following formula 6 present in leucine-
(3) At least one sugar chain represented by the following formulas 1 to 3 present in vitronectin.
(4) A sugar chain represented by the following formula 4 existing in complement C4-A.
(5) A sugar chain represented by the following formula 3 present in thyroxine-binding globulin.
本発明の膵臓癌の判定用マーカー及びこれを用いた膵臓癌の判定方法、並びに膵臓癌の判定を行うためのデータを得る方法によれば、確度（正確度・精度）の高い、膵臓癌の判定（診断、検査）を行うことができる。 According to the marker for determining pancreatic cancer of the present invention, the method for determining pancreatic cancer using the same, and the method for obtaining data for determining pancreatic cancer, pancreatic cancer with high accuracy (accuracy / accuracy) can be obtained. Judgment (diagnosis, inspection) can be made.
＜本発明の膵臓癌の判定用マーカー＞
本発明の膵臓癌の判定用マーカー（以下、本発明のマーカーと略記する場合がある）は、下記（１）〜（５）から選ばれる糖鎖を含むものである。
（１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、上記式５で表される糖鎖（以下、本発明のマーカー（１）と略記する場合がある）、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、上記式６で表される糖鎖（以下、本発明のマーカー（２）と略記する場合がある）、
（３）ビトロネクチンに存在する、上記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖（以下、本発明のマーカー（３）と略記する場合がある）、
（４）補体Ｃ４−Ａに存在する、上記式４で表される糖鎖（以下、本発明のマーカー（４）と略記する場合がある）、
（５）チロキシン結合グロブリンに存在する、上記式３で表される糖鎖（以下、本発明のマーカー（５）と略記する場合がある）。
尚、本発明のマーカーは、本発明のマーカー（１）〜（５）の何れかを単独で含むものでも、或いは複数種を含むものであってもよい。<Marker for determining pancreatic cancer of the present invention>
The marker for determining pancreatic cancer of the present invention (hereinafter, may be abbreviated as the marker of the present invention) contains a sugar chain selected from the following (1) to (5).
(1) A sugar chain represented by the above formula 5 existing in the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3 (hereinafter, may be abbreviated as the marker (1) of the present invention),
(2) A sugar chain represented by the above formula 6 present in leucine-
(3) At least one sugar chain represented by the above formulas 1 to 3 present in vitronectin (hereinafter, may be abbreviated as the marker (3) of the present invention),
(4) A sugar chain represented by the above formula 4 existing in complement C4-A (hereinafter, may be abbreviated as the marker (4) of the present invention),
(5) A sugar chain represented by the above formula 3 present in thyroxine-binding globulin (hereinafter, may be abbreviated as the marker (5) of the present invention).
The marker of the present invention may contain any one of the markers (1) to (5) of the present invention alone, or may contain a plurality of types of markers.
以下に、本発明のマーカー（１）〜（５）についてそれぞれ説明する。 The markers (1) to (5) of the present invention will be described below.
［本発明のマーカー（１）］
本発明のマーカー（１）は、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、下記式５で表される糖鎖を含むものである。
尚、上記式５における、ＮｅｕＮＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｍａｎはマンノース、Ｆｕｃはフコースを表す。
以下、本明細書において同じ意味を表す。
尚、本発明のマーカー（１）としては、上記式５で表される何れかの糖鎖を単独で使用しても、複数種を組み合わせて使用してもよい。[Marker of the present invention (1)]
The marker (1) of the present invention contains a sugar chain represented by the following formula 5 present in the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3.
In the above formula 5, NeuNAc represents N-acetylneuraminic acid, Gal represents galactose, GlcNAc represents N-acetylglucosamine, Man represents mannose, and Fuc represents fucose.
Hereinafter, the same meanings are used in the present specification.
As the marker (1) of the present invention, any sugar chain represented by the above formula 5 may be used alone, or a plurality of types may be used in combination.
本発明のマーカー（１）に係るインターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３（Ｉｎｔｅｒ−ａｌｐｈａ−ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ Ｈ３）とは、血漿中に存在するプロテアーゼインヒビターファミリーの１つであり、その機能は明らかにされていないが、胎児の着床等に関与していることが報告されている。
また、該インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３のアミノ酸配列は、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ（アクセッション番号：Ｑ０６０３３）等のデータベースに登録されている。
本発明のマーカー（１）に係るインターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３は、上記データベースに登録されているもののみならず、生体内で生じ得る変異体等も含む。例えば、該インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３において１〜５個、好ましくは１又は２個のアミノ酸が欠失、置換又は／及び付加されたものであって多型性や突然変異等により生じるものである。
但し、変異体等であっても、後述する本発明のマーカー（１）における式５で表される糖鎖と該インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３との結合部位である、該インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３のアミノ酸配列のＮ末端より５８０番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）が保存されているものが好ましい。The interalpha-trypsin inhibitor heavy chain H3 according to the marker (1) of the present invention is one of the protease inhibitor families present in plasma, and its function has been clarified. Although not, it has been reported that it is involved in the implantation of the fetus.
In addition, the amino acid sequence of the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3 is registered in a database such as Uniprot (accession number: Q06033).
The interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3 according to the marker (1) of the present invention includes not only those registered in the above database but also mutants that can occur in vivo. For example, in the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3, 1 to 5, preferably 1 or 2 amino acids are deleted, substituted or / and added, which is caused by polymorphism, mutation, or the like. be.
However, even if it is a mutant or the like, the interalpha trypsin inhibitor weight, which is the binding site between the sugar chain represented by the formula 5 in the marker (1) of the present invention described later and the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3. It is preferable that the amino acid residue (trypsin residue) at the 580th position from the N-terminal of the amino acid sequence of chain H3 is conserved.
本発明のマーカー（１）における式５で表される糖鎖（末端のＮ−アセチルグルコサミン）は、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３のアミノ酸配列のＮ末端より５８０番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）に結合（Ｎ−グリコシド結合）しているものが好ましい。
以下に、本発明のマーカー（１）における式５で表される糖鎖について説明する。The sugar chain (terminal N-acetylglucosamine) represented by the formula 5 in the marker (1) of the present invention is the 580th amino acid residue (asparagine residue) from the N-terminal of the amino acid sequence of the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3. ) Is bound (N-glycosidic bond).
The sugar chain represented by the formula 5 in the marker (1) of the present invention will be described below.
インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する式５で表される糖鎖
上記式５におけるｎ２は、０又は１を表し、式５はそれぞれ、ｎ２が０の場合、下記式５−１を表し、ｎ２が１の場合、下記式５−２を表す。
上記式５としては、下記式５−１で表されるもの、又は下記式５−１で表されるものと下記式５−２で表されるものとの組み合わせが好ましい。
N2 in the above formula 5 represents 0 or 1, respectively, when n2 is 0, it represents the following formula 5-1 and when n2 is 1, it represents the following formula 5-2.
As the above formula 5, it is preferable to use the one represented by the following formula 5-1 or the combination of the one represented by the following formula 5-1 and the one represented by the following formula 5-2.
本発明のマーカー（１）、即ち、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する式５で表される糖鎖を含む、マーカーとしては、（ｉ）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する（由来する）式５で表される糖鎖そのもの、（ｉｉ）式５で表される糖鎖が結合したインターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３、（ｉｉｉ）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３の一部分であって、式５で表される糖鎖が結合したペプチド断片等が挙げられ、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）が好ましい。
尚、上記ペプチド断片とは、式５で表される糖鎖とインターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３との結合部位である、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３のアミノ酸配列のＮ末端より５８０番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）を少なくとも有する任意の断片であるのが好ましい。該ペプチド断片としては、具体的には、例えば、生体内で生じるものや、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３をトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、ＡｓｐＮ等のプロテアーゼ処理に付した結果生じるものが挙げられ、より具体的には、例えば、２〜５０個のアミノ酸残基からなるもの等が挙げられ、配列番号３（アクセッション番号Ｑ０６０３３：５７２番〜５８４番）で表されるものが好ましい。The marker (1) of the present invention, that is, the sugar chain represented by the formula 5 present in the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3 is contained, and the marker is present in (i) the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3 (origin). The sugar chain itself represented by the formula 5 (ii), the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3 to which the sugar chain represented by the formula 5 is bound, and (iii) a part of the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3. Examples thereof include a peptide fragment to which a sugar chain represented by the formula 5 is bound, and (ii) or (iii) is preferable.
The peptide fragment is the residual amino acid at the 580th position from the N-terminal of the amino acid sequence of the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3, which is the binding site between the sugar chain represented by the formula 5 and the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3. It is preferably any fragment having at least a group (asparagine residue). Specific examples of the peptide fragment include those produced in vivo and those produced as a result of subjecting the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3 to protease treatment such as trypsin, lysyl endopeptidase, and AspN. Specifically, for example, those consisting of 2 to 50 amino acid residues and the like are mentioned, and those represented by SEQ ID NO: 3 (accession numbers Q06033: 572 to 584) are preferable.
［本発明のマーカー（２）］
本発明のマーカー（２）は、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、下記式６で表される糖鎖を含むものである。
The marker (2) of the present invention contains a sugar chain represented by the following formula 6 present in leucine-
本発明のマーカー（２）に係るロイシンリッチアルファ２グリコプロテイン（Ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ａｌｐｈａ−２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）とは、血液に含まれるタンパク質であり、炎症性腸疾患等種々の疾患に関与していることが報告されている。また、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列は、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ（アクセッション番号：Ｐ０２７５０）等のデータベースに登録されている。
本発明のマーカー（２）に係るロイシンリッチアルファ２グリコプロテインは、上記データベースに登録されているもののみならず、生体内で生じ得る変異体等も含む。例えば、該ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインにおいて１〜５個、好ましくは１又は２個のアミノ酸が欠失、置換又は／及び付加されたものであって多型性や突然変異等により生じるものである。
但し、変異体等であっても、後述する本発明のマーカー（２）における式６で表される糖鎖と該ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインとの結合部位である、該ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より１８６番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）が保存されているものが好ましい。The leucine-rich alpha-2 glycoprotein according to the marker (2) of the present invention is a protein contained in blood and is involved in various diseases such as inflammatory bowel disease. Has been reported. The amino acid sequence of leucine-
The leucine-
However, even if it is a mutant or the like, the leucine-
本発明のマーカー（２）における式６で表される糖鎖（末端のＮ−アセチルグルコサミン）は、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より１８６番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）に結合（Ｎ−グリコシド結合）しているものが好ましい。
以下に、本発明のマーカー（２）における式６で表される糖鎖について説明する。The sugar chain (terminal N-acetylglucosamine) represented by the formula 6 in the marker (2) of the present invention is the 186th amino acid residue (asparagine residue) from the N-terminal of the amino acid sequence of leucine-
The sugar chain represented by the formula 6 in the marker (2) of the present invention will be described below.
ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する式６で表される糖鎖
本発明のマーカー（２）、即ち、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する式６で表される糖鎖を含む、マーカーとしては、（ｉ）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する（由来する）式６で表される糖鎖そのもの、（ｉｉ）式６で表される糖鎖が結合したロイシンリッチアルファ２グリコプロテイン、（ｉｉｉ）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインの一部分であって、式６で表される糖鎖が結合したペプチド断片等が挙げられ、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）が好ましい。
尚、上記ペプチド断片とは、式６で表される糖鎖とロイシンリッチアルファ２グリコプロテインとの結合部位である、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より１８６番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）を少なくとも有する任意の断片である。該ペプチド断片としては、具体的には、例えば、生体内で生じるものや、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインをトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、ＡｓｐＮ等のプロテアーゼ処理に付した結果生じるものが挙げられ、より具体的には、例えば、２〜５０個のアミノ酸残基からなるもの等が挙げられ、配列番号４（アクセッション番号Ｐ０２７５０：１７９番〜１９１番）で表されるものが好ましい。The marker (2) of the present invention, that is, the marker containing the sugar chain represented by the formula 6 present in leucine-
The peptide fragment is the 186th amino acid residue from the N-terminal of the amino acid sequence of leucine-
［本発明のマーカー（３）］
本発明のマーカー（３）は、ビトロネクチンに存在する、下記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖を含むものである。
尚、本発明のマーカー（３）としては、上記式１〜３で表される何れかの糖鎖を単独で使用しても、複数種を組み合わせて使用してもよい。組み合わせる場合には、上記式１〜３から組み合わせても、上記式１のみの組み合わせ、上記式２のみの組み合わせ又は上記式３のみの組み合わせでもよい。[Marker of the present invention (3)]
The marker (3) of the present invention contains at least one sugar chain represented by the following formulas 1 to 3 present in vitronectin.
As the marker (3) of the present invention, any sugar chain represented by the above formulas 1 to 3 may be used alone, or a plurality of types may be used in combination. In the case of combination, it may be a combination from the above formulas 1 to 3, a combination of the above formula 1 only, a combination of the
本発明のマーカー（３）に係るビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）とは、血液や細胞外マトリックス等に存在する糖タンパク質であり、組織形成や神経細胞の分化等、生体において重要な役割を果たしている。また、該ビトロネクチンのアミノ酸配列は、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ（アクセッション番号：Ｐ０４００４）等のデータベースに登録されている。
本発明のマーカー（３）に係るビトロネクチンは、上記データベースに登録されているもののみならず、生体内で生じ得る変異体等も含む。例えば、該ビトロネクチンにおいて１〜５個、好ましくは１又は２個のアミノ酸が欠失、置換又は／及び付加されたものであって多型性や突然変異等により生じるものである。
但し、変異体等であっても後述する本発明のマーカー（３）における式１〜３で表される糖鎖と該ビトロネクチンとの結合部位である、該ビトロネクチンのアミノ酸配列のＮ末端より１６９番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）が保存されているものが好ましい。The vitronectin according to the marker (3) of the present invention is a glycoprotein present in blood, extracellular matrix, etc., and plays an important role in a living body such as tissue formation and differentiation of nerve cells. In addition, the amino acid sequence of the vitronectin is registered in a database such as Uniprot (accession number: P04004), for example.
The vitronectin according to the marker (3) of the present invention includes not only those registered in the above database but also mutants and the like that can occur in vivo. For example, 1 to 5, preferably 1 or 2 amino acids are deleted, substituted or / or added to the vitronectin, which is caused by polymorphism, mutation, or the like.
However, even if it is a mutant or the like, it is the 169th position from the N-terminal of the amino acid sequence of the vitronectin, which is the binding site between the sugar chain represented by the formulas 1 to 3 in the marker (3) of the present invention described later and the vitronectin. It is preferable that the amino acid residue (asparagine residue) of is conserved.
本発明のマーカー（３）における式１〜３で表される糖鎖（末端のＮ−アセチルグルコサミン）は、それぞれビトロネクチンのアミノ酸配列のＮ末端より１６９番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）に結合（Ｎ−グリコシド結合）しているものが好ましく、式１で表されるものがより好ましい。
以下に、本発明のマーカー（３）における式１〜３で表される糖鎖についてそれぞれ説明する。The sugar chains (terminal N-acetylglucosamine) represented by formulas 1 to 3 in the marker (3) of the present invention each bind to the 169th amino acid residue (asparagine residue) from the N-terminal of the amino acid sequence of vitronectin. Those having (N-glycoside bond) are preferable, and those represented by the formula 1 are more preferable.
The sugar chains represented by formulas 1 to 3 in the marker (3) of the present invention will be described below.
ビトロネクチンに存在する式１で表される糖鎖
上記式１におけるｍ１は、０〜２の整数を表し、式１はそれぞれ、ｍ１が０の場合、下記式１−１を表し、ｍ１が１の場合、下記式１−２を表し、ｍ１が２の場合、下記式１−３を表す。
上記式１としては、ｍ１が０の場合、即ち、下記式１−１で表されるものが好ましい。
In the above formula 1, m1 represents an integer of 0 to 2, and when m1 is 0, it represents the following formula 1-1, and when m1 is 1, it represents the following formula 1-2, where m1 is. In the case of 2, the following equation 1-3 is expressed.
As the above formula 1, the case where m1 is 0, that is, the one represented by the following formula 1-1 is preferable.
ビトロネクチンに存在する式２で表される糖鎖
上記式２におけるｍ２は、０又は１を表し、式２はそれぞれ、ｍ２が０の場合、下記式２−１を表し、ｍ２が１の場合、下記式２−２を表す。
M2 in the
ビトロネクチンに存在する式３で表される糖鎖
上記式３におけるｎ１は、０又は１を表し、式３はそれぞれ、ｎ１が０の場合、下記式３−１を表し、ｎ１が１の場合、下記式３−２を表す。
上記式３としては、ｎ１が１の場合、即ち、下記式３−２で表されるものが好ましい。
また、上記式３−１及び３−２で表される糖鎖としては、具体的には、例えば、下記式３−１’、３−２’等で表されるものが挙げられ、下記式３−２’で表されるものが好ましい。
N1 in the above formula 3 represents 0 or 1, respectively, when n1 is 0, it represents the following formula 3-1 and when n1 is 1, it represents the following formula 3-2.
As the above formula 3, it is preferable that n1 is 1, that is, the one represented by the following formula 3-2.
Specific examples of the sugar chains represented by the above formulas 3-1 and 3-2 include those represented by the following formulas 3-1' and 3-2', which are represented by the following formulas. The one represented by 3-2'is preferable.
本発明のマーカー（３）、即ち、ビトロネクチンに存在する式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖を含む、マーカーとしては、（ｉ）ビトロネクチンに存在する（由来する）式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖そのもの、（ｉｉ）式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖が結合したビトロネクチン、（ｉｉｉ）ビトロネクチンの一部分であって、式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖が結合したペプチド断片等が挙げられ、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）が好ましい。
尚、上記ペプチド断片とは、式１〜３で表される糖鎖とビトロネクチンとの結合部位である、ビトロネクチンのアミノ酸配列のＮ末端より１６９番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）を少なくとも有する任意の断片であるのが好ましい。該ペプチド断片としては、具体的には、例えば、生体内で生じるものや、ビトロネクチンをトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、ＡｓｐＮ等のプロテアーゼ処理に付した結果生じるものが挙げられ、より具体的には、例えば、２〜５０個のアミノ酸残基からなるもの等が挙げられ、配列番号１（アクセッション番号Ｐ０４００４：１６９番〜１７６番）で表されるものが好ましい。The marker (3) of the present invention, that is, the marker containing at least one sugar chain represented by the formulas 1 to 3 present in the vitronectin, is (i) formulas 1 to 3 existing in the vitronectin. At least one sugar chain represented by itself, a part of (iii) vitronectin to which at least one sugar chain represented by formulas (ii) and 1 to 3 is bound, and at least represented by formulas 1 to 3. Examples thereof include a peptide fragment to which one sugar chain is bound, and (ii) or (iii) is preferable.
The peptide fragment is arbitrary having at least the 169th amino acid residue (asparagin residue) from the N-terminal of the amino acid sequence of vitronectin, which is a binding site between the sugar chain represented by the formulas 1 to 3 and vitronectin. It is preferably a fragment of. Specific examples of the peptide fragment include those produced in vivo and those produced as a result of subjecting vitronectin to protease treatment such as trypsin, lysyl endopeptidase, and AspN, and more specifically, for example. , 2 to 50 amino acid residues and the like, and those represented by SEQ ID NO: 1 (accession numbers P04004: 169 to 176) are preferable.
［本発明のマーカー（４）］
本発明のマーカー（４）は、補体Ｃ４−Ａに存在する、下記式４で表される糖鎖を含むものである。
The marker (4) of the present invention contains a sugar chain represented by the following formula 4 present in complement C4-A.
本発明のマーカー（４）に係る補体Ｃ４−Ａ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ４−Ａ）とは、血漿タンパク質の１つであり、肝細胞等で生産され、細菌等の感染防御に重要な役割を果たしている。また、該補体Ｃ４−Ａのアミノ酸配列は、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ（アクセッション番号：Ｐ０Ｃ０Ｌ４）等のデータベースに登録されている。
本発明のマーカー（４）に係る補体Ｃ４−Ａは、上記データベースに登録されているもののみならず、生体内で生じ得る変異体等も含む。例えば、該補体Ｃ４−Ａにおいて１〜５個、好ましくは１又は２個のアミノ酸が欠失、置換又は／及び付加されたものであって多型性や突然変異等により生じるものである。
但し、変異体等であっても、後述する本発明のマーカー（４）における式４で表される糖鎖と該補体Ｃ４−Ａとの結合部位である、該補体Ｃ４−Ａのアミノ酸配列のＮ末端より１３２８番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）が保存されているものが好ましい。Complement C4-A (complement C4-A) according to the marker (4) of the present invention is one of plasma proteins, is produced by hepatocytes and the like, and plays an important role in protection against infection by bacteria and the like. .. Further, the amino acid sequence of the complement C4-A is registered in a database such as Uniprot (accession number: P0C0L4).
Complement C4-A according to the marker (4) of the present invention includes not only those registered in the above database but also mutants and the like that can occur in vivo. For example, 1 to 5, preferably 1 or 2 amino acids are deleted, substituted or / or added in the complement C4-A, which is caused by polymorphism, mutation, or the like.
However, even if it is a mutant or the like, the amino acid of the complement C4-A, which is the binding site between the sugar chain represented by the formula 4 in the marker (4) of the present invention described later and the complement C4-A. It is preferable that the 1328th amino acid residue (asparagine residue) from the N-terminal of the sequence is conserved.
本発明のマーカー（４）における式４で表される糖鎖（末端のＮ−アセチルグルコサミン）は、補体Ｃ４−Ａのアミノ酸配列のＮ末端より１３２８番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）に結合（Ｎ−グリコシド結合）しているものが好ましい。
以下に、本発明のマーカー（４）における式４で表される糖鎖について説明する。The sugar chain (terminal N-acetylglucosamine) represented by the formula 4 in the marker (4) of the present invention is located at the 1328th amino acid residue (asparagine residue) from the N-terminal of the amino acid sequence of complement C4-A. Those having a bond (N-glycoside bond) are preferable.
The sugar chain represented by the formula 4 in the marker (4) of the present invention will be described below.
補体Ｃ４−Ａに存在する式４で表される糖鎖
本発明のマーカー（４）、即ち、補体Ｃ４−Ａに存在する式４で表される糖鎖を含む、マーカーとしては、（ｉ）補体Ｃ４−Ａに存在する（由来する）式４で表される糖鎖そのもの、（ｉｉ）式４で表される糖鎖が結合した補体Ｃ４−Ａ、（ｉｉｉ）補体Ｃ４−Ａの一部分であって、式４で表される糖鎖が結合したペプチド断片等が挙げられ、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）が好ましい。
尚、上記ペプチド断片とは、式４で表される糖鎖と補体Ｃ４−Ａとの結合部位である、補体Ｃ４−Ａのアミノ酸配列のＮ末端より１３２８番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）を少なくとも有する任意の断片であるのが好ましい。該ペプチド断片としては、具体的には、例えば、生体内で生じるものや、補体Ｃ４−Ａをトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、ＡｓｐＮ等のプロテアーゼ処理に付した結果生じるものが挙げられ、より具体的には、例えば、２〜５０個のアミノ酸残基からなるもの等が挙げられ、配列番号２（アクセッション番号Ｐ０Ｃ０Ｌ４：１３２６番〜１３３６番）で表されるものが好ましい。The marker (4) of the present invention, that is, the sugar chain represented by the formula 4 present in the complement C4-A is contained, and the marker is (i) the formula 4 existing (derived from) in the complement C4-A. The sugar chain itself represented by, the complement C4-A to which the sugar chain represented by the formula (ii) is bound, and the sugar chain represented by the formula 4 which is a part of the complement C4-A (iii). Examples thereof include a peptide fragment to which is bound, and (ii) or (iii) is preferable.
The peptide fragment is the 1328th amino acid residue (asparagine residue) from the N-terminal of the amino acid sequence of complement C4-A, which is the binding site between the sugar chain represented by the formula 4 and complement C4-A. It is preferably any fragment having at least a group). Specific examples of the peptide fragment include those produced in vivo and those produced as a result of subjecting complement C4-A to protease treatment such as trypsin, lysyl endopeptidase, and AspN, and more specifically. Examples thereof include those consisting of 2 to 50 amino acid residues, and those represented by SEQ ID NO: 2 (accession number P0C0L4: 1326 to 1336) are preferable.
［本発明のマーカー（５）］
本発明のマーカー（５）は、チロキシン結合グロブリンに存在する、下記式３で表される糖鎖を含むものである。
尚、本発明のマーカー（５）としては、上記式３で表される何れかの糖鎖を単独で使用しても、複数種を組み合わせて使用してもよい。[Marker of the present invention (5)]
The marker (5) of the present invention contains a sugar chain represented by the following formula 3 present in thyroxine-binding globulin.
As the marker (5) of the present invention, any sugar chain represented by the above formula 3 may be used alone, or a plurality of types may be used in combination.
本発明のマーカー（５）に係るチロキシン結合グロブリン（Ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ）とは、チロキシンに結合するタンパク質のことであり、甲状腺ホルモンの輸送等に関与していることが報告されている。また、チロキシン結合グロブリンのアミノ酸配列は、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ（アクセッション番号：Ｐ０５５４３）等のデータベースに登録されている。
本発明のマーカー（５）に係るチロキシン結合グロブリンは、上記データベースに登録されているもののみならず、生体内で生じ得る変異体等も含む。例えば、該チロキシン結合グロブリンにおいて１〜５個、好ましくは１又は２個のアミノ酸が欠失、置換又は／及び付加されたものであって多型性や突然変異等により生じるものである。
但し、変異体等であっても後述する本発明のマーカー（５）における式３で表される糖鎖と該チロキシン結合グロブリンとの結合部位である、該チロキシン結合グロブリンのアミノ酸配列のＮ末端より３６番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）が保存されているものが好ましい。The thyroxine-binding globulin according to the marker (5) of the present invention is a protein that binds to thyroxine, and has been reported to be involved in the transport of thyroid hormone and the like. The amino acid sequence of thyroxine-binding globulin is registered in a database such as Uniprot (accession number: P05543), for example.
The thyroxine-binding globulin according to the marker (5) of the present invention includes not only those registered in the above database but also mutants and the like that can occur in vivo. For example, 1 to 5, preferably 1 or 2 amino acids are deleted, substituted or / or added to the thyroxine-binding globulin, which is caused by polymorphism, mutation, or the like.
However, even if it is a mutant or the like, from the N-terminal of the amino acid sequence of the thyroxine-binding globulin, which is the binding site between the sugar chain represented by the formula 3 in the marker (5) of the present invention described later and the thyroxine-binding globulin. Those in which the 36th amino acid residue (asparagine residue) is conserved are preferable.
本発明のマーカー（５）における式３で表される糖鎖（末端のＮ−アセチルグルコサミン）は、チロキシン結合グロブリンのアミノ酸配列のＮ末端より３６番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）に結合（Ｎ−グリコシド結合）しているものが好ましい。
尚、本発明のマーカー（５）における式３で表される糖鎖については、前述の通りであり、その具体例は同じであるが好ましい例としては、式上記３−１で表されるものが挙げられ、より好ましい例としては、上記式３−１’で表されるものが挙げられる。The sugar chain (terminal N-acetylglucosamine) represented by the formula 3 in the marker (5) of the present invention binds to the 36th amino acid residue (asparagine residue) from the N-terminal of the amino acid sequence of the tyrosin-binding globulin (asparagine residue). Those having an N-glycoside bond) are preferable.
The sugar chain represented by the formula 3 in the marker (5) of the present invention is as described above, and the specific examples thereof are the same, but a preferable example is the one represented by the formula 3-1. As a more preferable example, the one represented by the above formula 3-1'can be mentioned.
本発明のマーカー（５）、即ち、チロキシン結合グロブリンに存在する式３で表される糖鎖を含む、マーカーとしては、（ｉ）チロキシン結合グロブリンに存在する（由来する）式３で表される糖鎖そのもの、（ｉｉ）式３で表される糖鎖が結合したチロキシン結合グロブリン、（ｉｉｉ）チロキシン結合グロブリンの一部分であって、式３で表される糖鎖が結合したペプチド断片等が挙げられ、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）が好ましい。
尚、上記ペプチド断片とは、式３で表される糖鎖とチロキシン結合グロブリンとの結合部位である、チロキシン結合グロブリンのアミノ酸配列のＮ末端より３６番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）を少なくとも有する任意の断片であるのが好ましい。該ペプチド断片としては、具体的には、例えば、生体内で生じるものや、チロキシン結合グロブリンをトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、ＡｓｐＮ等のプロテアーゼ処理に付した結果生じるものが挙げられ、より具体的には、例えば、２〜５０個のアミノ酸残基からなるものが挙げられ、配列番号５（アクセッション番号Ｐ０５５４３：２７番〜４１番）で表されるものが好ましい。The marker (5) of the present invention, that is, the marker containing the sugar chain represented by the formula 3 present in the thyroxine-binding globulin, is represented by the formula 3 (derived from) present in the (i) thyroxine-binding globulin. Examples include the sugar chain itself, a thyroxine-binding globulin to which the sugar chain represented by the formula (ii) is bound, and a peptide fragment to which the sugar chain represented by the formula 3 is bound, which is a part of the (iii) thyroxine-binding globulin. (Ii) or (iii) is preferable.
The peptide fragment is at least the 36th amino acid residue (asparagine residue) from the N-terminal of the amino acid sequence of thyroxine-binding globulin, which is the binding site between the sugar chain represented by the formula 3 and the thyroxine-binding globulin. It is preferably any fragment having. Specific examples of the peptide fragment include those produced in vivo and those produced as a result of subjecting thyroxine-binding globulin to protease treatment such as trypsin, lysyl endopeptidase, and AspN, and more specifically. For example, those consisting of 2 to 50 amino acid residues are mentioned, and those represented by SEQ ID NO: 5 (accession numbers P05543: 27 to 41) are preferable.
本発明のマーカーとしては、（ｉ）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、式５で表される糖鎖又は（ｉｉ）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、式６で表される糖鎖が好ましく、（ｉｉｉ）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、式５で表される糖鎖がより好ましく、（ｉｖ）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３のアミノ酸配列のＮ末端より５８０番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）に結合している式５で表される糖鎖が特に好ましい。
The markers of the present invention include (i) the sugar chain represented by the formula 5 present in the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3 or (ii) the sugar represented by the formula 6 present in the leucine-
［本発明に係る膵臓癌］
本発明に係る膵臓癌とは、膵臓から発生した癌のことである。
本発明に係る膵臓癌には、具体的には、例えば、浸潤性膵管癌、膵腺房細胞癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍等の外分泌性膵臓癌、神経内分泌腫瘍等の内分泌性膵臓癌等が含まれる。[Pancreatic cancer according to the present invention]
The pancreatic cancer according to the present invention is cancer originating from the pancreas.
Specific examples of the pancreatic cancer according to the present invention include invasive pancreatic duct cancer, pancreatic acinic cell carcinoma, exocrine pancreatic cancer such as intraductal papillary mucinous tumor, and endocrine pancreatic cancer such as neuroendocrine tumor. Is included.
＜本発明の膵臓癌の判定方法＞
本発明の膵臓癌の判定方法（以下、本発明の判定方法と略記する場合がある）は、試料中の、下記（１）〜（５）から選ばれる糖鎖の量を測定し（以下、本発明に係る測定工程と略記する場合がある）、得られた測定結果に基づいて膵臓癌を判定する（以下、本発明に係る判定工程と略記する場合がある）ことによりなされる。
（１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、上記式５で表される糖鎖（本発明のマーカー（１））、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、上記式６で表される糖鎖（本発明のマーカー（２））、
（３）ビトロネクチンに存在する、上記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖（本発明のマーカー（３））、
（４）補体Ｃ４−Ａに存在する、上記式４で表される糖鎖（本発明のマーカー（４））、
（５）チロキシン結合グロブリンに存在する、上記式３で表される糖鎖（本発明のマーカー（５））
尚、本発明の判定方法としては、本発明のマーカー（１）〜（５）の何れか単独を用いてなされても、或いは複数種を用いてなされてもよい。<Method for determining pancreatic cancer of the present invention>
The method for determining pancreatic cancer of the present invention (hereinafter, may be abbreviated as the determination method of the present invention) measures the amount of sugar chains selected from the following (1) to (5) in a sample (hereinafter, hereinafter, It is performed by determining pancreatic cancer based on the obtained measurement results (hereinafter, may be abbreviated as the determination step according to the present invention).
(1) A sugar chain represented by the above formula 5 (marker (1) of the present invention) present in the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3.
(2) A sugar chain represented by the above formula 6 (marker (2) of the present invention) present in leucine-
(3) At least one sugar chain represented by the above formulas 1 to 3 (marker (3) of the present invention) present in vitronectin.
(4) A sugar chain represented by the above formula 4 (marker (4) of the present invention) present in complement C4-A.
(5) A sugar chain represented by the above formula 3 present in thyroxine-binding globulin (marker (5) of the present invention).
As the determination method of the present invention, any one of the markers (1) to (5) of the present invention may be used alone, or a plurality of types may be used.
［本発明に係る試料］
本発明に係る試料としては、被検動物由来のものであればよく、例えば、血清、血漿、全血、尿、唾液、脳脊髄液、組織液、汗、涙、羊水、骨髄液、胸水、腹水、間接液、眼房水、硝子体液等の生体由来試料が挙げられ、血清、血漿、全血等の血液由来試料が好ましく、血清がより好ましい。
上記被検動物としては、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、チンパンジー等の哺乳動物が挙げられ、ヒト、サル、マウス又はラットが好ましく、ヒトがより好ましい。[Sample of the present invention]
The sample according to the present invention may be derived from a test animal, and may be, for example, serum, plasma, whole blood, urine, saliva, cerebrospinal fluid, tissue fluid, sweat, tears, sheep water, bone marrow fluid, pleural fluid, and ascites. , Indirect fluid, ocular fluid, vitreous body fluid and the like, and blood-derived samples such as serum, plasma and whole blood are preferable, and serum is more preferable.
Examples of the test animal include mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, pigs, rabbits, and chimpanzees. Humans, monkeys, mice, or rats are preferable, and humans are more preferable.
本発明に係る試料を被検動物から得る（採取する）方法は、特に限定されず、例えば、自体公知の方法に基づいて、該被検動物から該試料を得る（採取する）ことによりなされればよく、要すれば自体公知の方法に従って、分離、濃縮、精製等を行ってもよい。
尚、上記試料は、被検動物から得られた（採取された）直後のものであっても、該試料を保存したものであってもよい。試料を保存する方法としては、通常この分野で行われている方法であれば何れでもよい。The method for obtaining (collecting) the sample according to the present invention from the test animal is not particularly limited, and is performed, for example, by obtaining (collecting) the sample from the test animal based on a method known per se. If necessary, separation, concentration, purification and the like may be carried out according to a method known per se.
The sample may be the one immediately after being obtained (collected) from the test animal or the one in which the sample is stored. As a method for storing the sample, any method usually used in this field may be used.
［本発明に係る測定工程］
本発明に係る測定工程は、下記（１）〜（５）から選ばれる糖鎖の量を測定することによりなされる。
（１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、上記式５で表される糖鎖、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、上記式６で表される糖鎖、
（３）ビトロネクチンに存在する、上記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４）補体Ｃ４−Ａに存在する、上記式４で表される糖鎖、
（５）チロキシン結合グロブリンに存在する、上記式３で表される糖鎖
尚、本発明に係る測定工程としては、本発明のマーカー（１）〜（５）の何れか単独を測定することによりなされても、或いは複数種を測定することによりなされてもよい。[Measurement step according to the present invention]
The measuring step according to the present invention is performed by measuring the amount of sugar chains selected from the following (1) to (5).
(1) The sugar chain represented by the above formula 5 existing in the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3.
(2) A sugar chain represented by the above formula 6 present in leucine-
(3) At least one sugar chain represented by the above formulas 1 to 3 present in vitronectin.
(4) The sugar chain represented by the above formula 4 existing in complement C4-A.
(5) Sugar chain represented by the above formula 3 present in thyroxine-binding globulin In the measurement step according to the present invention, any one of the markers (1) to (5) of the present invention is measured alone. It may be done, or it may be done by measuring a plurality of species.
本発明に係る測定工程における上記（１）〜（５）から選ばれる糖鎖の量の測定とは、本発明のマーカー（１）〜（５）から選ばれる１つを測定することであり、具体的には、例えば、（ｉ）本発明のマーカーにおけるタンパク質に存在する（由来する）糖鎖そのものの量の測定、（ｉｉ）本発明のマーカーにおける糖鎖が結合したタンパク質の量の測定、（ｉｉｉ）本発明のマーカーにおけるタンパク質の一部分であって、糖鎖が結合したペプチド断片の量の測定等が挙げられ、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）が好ましい。
上記本発明のマーカーにおけるタンパク質とは、本発明のマーカーにおける糖鎖以外の部分を意味し、本発明のマーカー（１）であれば、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３を意味し、本発明のマーカー（２）であれば、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインを意味し、本発明のマーカー（３）であれば、ビトロネクチンを意味し、本発明のマーカー（４）であれば、補体Ｃ４−Ａを意味し、本発明のマーカー（５）であれば、チロキシン結合グロブリンを意味する。
尚、上記「量」とは、容量、質量等の絶対値又は濃度、イオン強度、吸光度、蛍光強度、濁度、ピーク面積等から算出された値等の相対値の何れであってもよい。The measurement of the amount of sugar chains selected from the above (1) to (5) in the measurement step according to the present invention is to measure one selected from the markers (1) to (5) of the present invention. Specifically, for example, (i) measurement of the amount of sugar chain itself present (derived) in the protein in the marker of the present invention, (ii) measurement of the amount of protein to which the sugar chain is bound in the marker of the present invention, (Iii) A part of the protein in the marker of the present invention, such as measurement of the amount of a peptide fragment to which a sugar chain is bound, and the like, (iii) or (iii) is preferable.
The protein in the marker of the present invention means a portion other than the sugar chain in the marker of the present invention, and in the case of the marker (1) of the present invention, it means the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3, and the marker of the present invention. If it is (2), it means leucine-
The "amount" may be any of an absolute value such as volume and mass or a relative value such as a value calculated from ionic strength, absorbance, fluorescence intensity, turbidity, peak area and the like.
本発明に係る測定工程における測定方法としては、通常この分野で行われているものであれば何れでもよく、具体的には、例えば、（Ａ）本発明のマーカーに対して親和性を有する物質（例えば、抗体、レクチン等）を用いる方法、（Ｂ）質量分析法を利用する方法等が挙げられ、（Ａ）が好ましい。
以下に、上記（Ａ）及び（Ｂ）についてそれぞれ具体的に説明する。As the measuring method in the measuring step according to the present invention, any method usually used in this field may be used. Specifically, for example, (A) a substance having an affinity for the marker of the present invention. Examples thereof include a method using (for example, antibody, lectin, etc.), (B) a method using mass spectrometry, and the like, and (A) is preferable.
The above (A) and (B) will be specifically described below.
（Ａ）本発明のマーカーに対して親和性を有する物質を用いる方法
本発明のマーカーに対して親和性を有する物質を用いる方法としては、具体的には、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＥＩＡ法）、免疫比濁法、免疫比ろう法、ラテックス凝集法、イムノクロマト法、ウェスタンブロット法、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｏｘｙｇｅｎ ＣｈａｎｎｅｌｉｎｇＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＬＯＣＩ法）、Ｌｉｑｕｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ−ＥｌｅｃｔｒｏＫｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｔｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ａｓｓａｙ（ＬＢＡ−ＥＡＴＡ法）等の免疫学的測定法に準じた方法が挙げられる。(A) Method of using a substance having an affinity for the marker of the present invention Specific examples of the method of using a substance having an affinity for the marker of the present invention include an enzyme-linked immunosorbent assay (A). ELISA method), enzyme immunoassay (EIA method), radiation immunoassay (RIA method), fluorescence immunoassay (FIA method), chemoluminescent enzyme immunoassay (CLEIA method), electrochemical luminescence immunoassay (ECLEIA method) Method), immunoturbidimetric method, immunoassay wax method, latex agglutination method, immunochromatography method, western blot method, Luminescent Oxygen Channel Immunoassay (LOCI method), Liquid-phase Binding Assay-ElectroKinetic Analyte Analyte Analyte Trant A method similar to the immunoassay method can be mentioned.
上記免疫学的測定法に準じた方法としては、具体的には、例えば、本発明のマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のマーカーとを接触させて、本発明のマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のマーカーとの複合体を形成させ、該複合体の量を測定することによりなされればよい。 As a method according to the above immunoassay, specifically, for example, a substance having an affinity for the marker of the present invention is brought into contact with the marker of the present invention to the marker of the present invention. It may be done by forming a complex of an affinity substance and the marker of the present invention and measuring the amount of the complex.
上記本発明のマーカーに対して親和性を有する物質とは、本発明のマーカーにおけるタンパク質（又はペプチド断片）に特異的に結合する抗体や、本発明のマーカーにおける糖鎖に特異的に結合するレクチンや抗体等が挙げられる。 The substance having an affinity for the marker of the present invention is an antibody that specifically binds to a protein (or peptide fragment) in the marker of the present invention, or a lectin that specifically binds to a sugar chain in the marker of the present invention. And antibodies.
上記本発明のマーカーにおけるタンパク質（又はペプチド断片）に特異的に結合する抗体としては、具体的には、例えば、本発明のマーカー（１）であれば、抗インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３抗体、本発明のマーカー（２）であれば、抗ロイシンリッチアルファ２グリコプロテイン抗体、本発明のマーカー（３）であれば、抗ビトロネクチン抗体、本発明のマーカー（４）であれば、抗補体Ｃ４−Ａ抗体、本発明のマーカー（５）であれば、抗チロキシン結合グロブリン抗体等が挙げられる。
上記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよく、これらを単独で或いは組み合わせて用いてもよい。
上記抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’２）、Ｆｖ、ｓＦｖ等の抗体フラグメントやダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ等の合成抗体等であってもよい。
また、上記抗体は、市販の抗体を用いても、自体公知の方法に従って調製したものを用いてもよい。
尚、自体公知の方法に従って、上記抗体を調製する場合には、例えば、「免疫測定法」（生物化学的測定研究会編集、講談社、２０１４年）等に記載の方法に従ってなされればよい。Specific examples of the antibody that specifically binds to the protein (or peptide fragment) in the marker of the present invention include, for example, the marker (1) of the present invention being an anti-interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3 antibody. The marker (2) of the present invention is an anti-leucine-
The antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and these may be used alone or in combination.
The antibody may be an antibody fragment such as Fab, F (ab'2), Fv, sFv, or a synthetic antibody such as diabody, triabody, or tetrabody.
Further, as the above-mentioned antibody, a commercially available antibody may be used, or an antibody prepared according to a method known per se may be used.
When the above antibody is prepared according to a method known per se, for example, it may be carried out according to the method described in "Immunoassay" (edited by Biochemical Measurement Study Group, Kodansha, 2014).
また、上記抗体は、標識物質で標識されたものであってもよい。該標識物質としては、具体的には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素、９９ｍＴｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓ等の放射性同位元素、フルオレセイン、フルオレセインイソチアシネート（ＦＩＴＣ）、４−メチルウンベリフェロン、ローダミン或いはこれらの誘導体等の蛍光性物質、ルシフェリン、ルミノール、ルテニウム錯体等の発光性物質、フェノール、ナフトール、アントラセン或いはこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、４−アミノ−２，２，６，−テトラメチルピぺリジン−１−オキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質、ＨｉＬｙｔｅ系色素、Ａｌｅｘａ系色素、ＣｙＤｙｅ系色素等の色素、金コロイド、量子ドット等のナノ粒子等が挙げられる。
尚、上記標記物質を抗体に結合させる方法としては、自体公知の方法に従ってなされればよい。Moreover, the said antibody may be labeled with a labeling substance. Specific examples of the labeling substance include horseradish peroxidase (HRP), bovine small intestinal alkaline phosphatase, β-galactosidase and other enzymes, 99 m Tc, 131 I, 125 I, 14 C, 3 H, 32 P, and the like. Radioisotopes such as 35 S, fluorescent substances such as fluorescein, fluorescein isothiocyanate (FITC), 4-methylumbelliferone, rhodamine or derivatives thereof, luminescent substances such as luciferin, luminol, ruthenium complex, phenol, Spin-labeling agents typified by substances having ultraviolet absorption such as naphthol, anthracein or derivatives thereof, and compounds having an oxyl group such as 4-amino-2,2,6, -tetramethylpiperidin-1-oxyl. Examples thereof include substances having the above-mentioned properties, dyes such as HiLyte dyes, Alexa dyes and CyDye dyes, and nanoparticles such as gold colloids and quantum dots.
As a method for binding the above-mentioned substance to an antibody, a method known per se may be used.
上記本発明のマーカーにおける糖鎖に特異的に結合するレクチンとしては、具体的には、例えば、本発明のマーカー（１）であれば、上記式５で表される糖鎖のＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）に結合するＰｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌｅｕｃｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＨＡ−Ｌ）等、本発明のマーカー（２）であれば、上記式６で表される糖鎖のＭａｎ（マンノース）に結合するＧＮＬ、ＬＣＡ、ＰＳＡ、Ｃｏｎ Ａ等、本発明のマーカー（３）であれば、上記式１で表される糖鎖のＭａｎ（マンノース）に結合するＧａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ Ｌｅｃｔｉｎ（ＧＮＬ）、Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＬＣＡ）、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＳＡ）、Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ（Ｃｏｎ Ａ）等、上記式２で表される糖鎖のＦｕｃ（フコース）に結合するＡｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ Ｌｅｃｔｉｎ（ＡＡＬ）、Ｌｏｔｕｓ Ｔｅｔｒａｇｏｌｏｎｏｂｕｓ Ｌｅｃｔｉｎ（ＬＴＬ）等、上記式３で表される糖鎖のＮｅｕＮＡｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）に結合するＳａｍｂｕｃｕｓ Ｎｉｇｒａ Ｌｅｃｔｉｎ（ＳＮＬ）、Ｍａａｃｋｉａ ａｍｒｅｎｓｉｓ Ｌｅｃｔｉｎ ＩＩ（ＭＡＬ ＩＩ）等、本発明のマーカー（４）であれば、上記式４で表される糖鎖のＦｕｃ（フコース）に結合するＡＡＬ、ＬＴＬ等、本発明のマーカー（５）であれば、上記式３で表される糖鎖のＮｅｕＮＡｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）に結合するＭＡＬ ＩＩ等が挙げられる。
Specific examples of the lectin that specifically binds to the sugar chain in the marker of the present invention include GlcNAc (N-) of the sugar chain represented by the above formula 5 in the case of the marker (1) of the present invention. In the case of the marker (2) of the present invention, such as Phaseolus vulgaris Lectin (PHA-L) that binds to acetylglucosamine), GNL, LCA, PSA, which binds to Man (mannose) of the sugar chain represented by the above formula 6, In the case of the marker (3) of the present invention such as Con A, Galanthus vivalis Lectin (GNL), Lens CUlinaris Agglutinin (LCA), and Pisum sativum Aglutin (LCA) that bind to Man (mannose) of the sugar chain represented by the above formula 1 PSA), Concanavalin A (Con A), etc., Aleuria aurantia Lectin (AAL), which binds to Fuc (fucose) of the sugar chain represented by the
上記レクチンは、標識物質で標識されたものであってもよく、該標識物質としては、上記本発明のマーカーにおけるタンパク質（又はペプチド断片）に特異的に結合する抗体にて説明した通りであり、具体例等も同じである。また、上記標識物質をレクチンに結合させる方法としては、自体公知の方法に従ってなされればよい。 The lectin may be labeled with a labeling substance, and the labeling substance is as described for the antibody that specifically binds to the protein (or peptide fragment) in the marker of the present invention. The same applies to specific examples. Further, as a method for binding the above-mentioned labeling substance to the lectin, a method known per se may be used.
上記本発明のマーカーにおける糖鎖に特異的に結合する抗体としては、具体的には、例えば、本発明のマーカー（１）であれば、上記式５で表される糖鎖に特異的に結合する抗体、本発明のマーカー（２）であれば、上記式６で表される糖鎖に特異的に結合する抗体、本発明のマーカー（３）であれば、上記式１で表される糖鎖に特異的に結合する抗体、上記式２で表される糖鎖に特異的に結合する抗体、上記式３で表される糖鎖に特異的に結合する抗体、本発明のマーカー（４）であれば、上記式４で表される糖鎖に特異的に結合する抗体、本発明のマーカー（５）であれば、上記式３で表される糖鎖に特異的に結合する抗体等が挙げられる。
Specific examples of the antibody that specifically binds to the sugar chain in the marker of the present invention include, for example, the marker (1) of the present invention that specifically binds to the sugar chain represented by the above formula 5. An antibody that specifically binds to the sugar chain represented by the above formula 6 in the case of the marker (2) of the present invention, and a sugar represented by the above formula 1 in the case of the marker (3) of the present invention. An antibody that specifically binds to a chain, an antibody that specifically binds to a sugar chain represented by the
上記抗体は、標識物質で標識されたものであってもよく、該標識物質としては、上記本発明のマーカーにおけるタンパク質（又はペプチド断片）に特異的に結合する抗体にて説明した通りであり、具体例等も同じである。
また、上記標識物質をレクチンに結合させる方法としては、自体公知の方法に従ってなされればよい。The antibody may be labeled with a labeling substance, and the labeling substance is as described for the antibody that specifically binds to the protein (or peptide fragment) in the marker of the present invention. The same applies to specific examples.
Further, as a method for binding the above-mentioned labeling substance to the lectin, a method known per se may be used.
上記本発明のマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のマーカーとの複合体の量を測定する方法としては、該複合体の量を測定し得る方法であれば何れでもよく、具体的には、例えば、本発明のマーカーに対して親和性を有する物質に結合した標識物質に由来するシグナルを検出する方法、本発明のマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のマーカーとの複合体に由来する性質を利用する方法等が挙げられ、本発明のマーカーに対して親和性を有する物質に結合した標識物質に由来するシグナルを検出する方法が好ましい。 The method for measuring the amount of the complex of the substance having an affinity for the marker of the present invention and the marker of the present invention may be any method as long as it can measure the amount of the complex, and is specific. For example, a method for detecting a signal derived from a labeling substance bound to a substance having an affinity for the marker of the present invention, a substance having an affinity for the marker of the present invention and the marker of the present invention. Examples thereof include a method utilizing the property derived from the complex, and a method for detecting a signal derived from a labeling substance bound to a substance having an affinity for the marker of the present invention is preferable.
上記本発明のマーカーに対して親和性を有する物質に結合した標識物質に由来するシグナルを検出する方法としては、具体的には、例えば、本発明のマーカーに対して親和性を有する物質に結合した標識物質に由来するシグナルを自体公知の方法により検出することによりなされればよい。例えば、標識物質が酵素の場合には、免疫測定法の常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質 核酸 酵素 別冊 Ｎｏ.３１、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、５１〜６３,共立出版、１９８７）等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、標識物質が放射性物質の場合には、例えばＲＩＡで行われている常法に従い、該放射性物質の出す放射線の種類および強さに応じて液浸型ＧＭカウンター、液体シンチレーションカウンター、井戸型シンチレーションカウンター、ＨＰＬＣ用カウンター等の測定機器を適宜選択して使用し、測定を行えばよい（例えば医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、１９７１等参照）。また、標識物質が蛍光物質の場合には、例えば蛍光光度計等の測定機器を用いるＦＩＡで行われている常法、例えば「図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、ソフトサイエンス社、１９８３」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、標識物質が発光物質の場合にはフォトカウンター等の測定機器を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質 核酸 酵素 別冊 Ｎｏ.３１、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、２５２〜２６３、共立出版、１９８７）等に記載された方法に準じて測定を行えばよい。さらに、標識物質が紫外部に吸収を有する物質の場合には分光光度計等の測定機器を用いる常法によって測定を行えばよく、標識物質がスピンの性質を有する場合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質 核酸 酵素 別冊 Ｎｏ.３１、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、２６４〜２７１、共立出版、１９８７）等に記載された方法に準じてそれぞれ測定を行えばよい。 As a method for detecting a signal derived from a labeling substance bound to a substance having an affinity for the marker of the present invention, specifically, for example, binding to a substance having an affinity for the marker of the present invention. It may be done by detecting the signal derived from the labeled substance by a method known per se. For example, when the labeling substance is an enzyme, a conventional method of immunoassay, for example, "enzyme scintillation counter" (protein nucleic acid enzyme separate volume No. 31, edited by Tsunehiro Kitagawa, Toshio Minamihara, Akio Tsuji, Eiji Ishikawa, 51- The measurement may be carried out according to the method described in 63, Kyoritsu Shuppan, 1987), etc., and when the labeling substance is a radioactive substance, for example, according to the conventional method performed by RIA, the radiation emitted by the radioactive substance is emitted. Measurements may be performed by appropriately selecting and using measuring instruments such as a immersion type GM counter, a liquid scintillation counter, a well type scintillation counter, and an HPLC counter according to the type and strength (for example, Medical Chemistry Experiment Course, No. 1). 8 volumes, supervised by Yuichi Yamamura, 1st edition, Nakayama Shoten, 1971, etc.). When the labeling substance is a fluorescent substance, for example, a conventional method used in FIA using a measuring device such as a fluorometer, for example, "Illustrated Fluorescent Antibody, by Akira Kawao, 1st Edition, Soft Science Co., Ltd., The measurement may be carried out according to the method described in "1983" or the like, and when the labeling substance is a luminescent substance, a conventional method using a measuring device such as a photo counter, for example, "enzyme immunoassay" (protein nucleic acid enzyme separate volume No. The measurement may be performed according to the method described in .31, edited by Tsunehiro Kitagawa, Toshio Minamihara, Akio Tsuji, Eiji Ishikawa, 252 to 263, Kyoritsu Shuppan, 1987). Further, when the labeling substance is a substance having absorption in the ultraviolet, the measurement may be performed by a conventional method using a measuring device such as a spectrophotometer, and when the labeling substance has spin properties, an electron spin resonance device may be used. For example, the method described in "Enzyme Immunity Measurement Method" (Protein Nucleic Acid Enzyme Separate Volume No. 31, edited by Tsunehiro Kitagawa, Toshio Minamihara, Akio Tsuji, Eiji Ishikawa, 264-271, Kyoritsu Shuppan, 1987). Each measurement may be performed according to the above.
上記本発明のマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のマーカーとの複合体に由来する性質を利用する方法としては、具体的には、例えば、表面プラズモン共鳴法等のホモジニアスイムノアッセイ系等の方法等が挙げられる。
尚、上記方法の具体的な手法については、自体公知の手法に従ってなされればよい。Specific examples of the method for utilizing the property derived from the complex of the substance having an affinity for the marker of the present invention and the marker of the present invention include, for example, a homogenia swimnoassay system such as a surface plasmon resonance method. The method and the like can be mentioned.
The specific method of the above method may be performed according to a method known per se.
以下に、（Ａ）本発明のマーカーに対して親和性を有する物質を用いる方法について、より具体的に説明する。
尚、下記説明において、本発明のマーカーにおけるタンパク質（又はペプチド断片）を「標的タンパク質（又は標的ペプチド断片）」、本発明のマーカーにおける糖鎖を「標的糖鎖」と表記する。
例えば、本発明のマーカー（１）を測定する場合、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３が「標的タンパク質（又は標的ペプチド断片）」を、式５で表される糖鎖が「標的糖鎖」を意味し、本発明のマーカー（２）を測定する場合、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインが「標的タンパク質（又は標的ペプチド断片）」を、式６で表される糖鎖が「標的糖鎖」、本発明のマーカー（３）を測定する場合、ビトロネクチンが「標的タンパク質（又は標的ペプチド断片）」、式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖が「標的糖鎖」を意味し、本発明のマーカー（４）を測定する場合、補体Ｃ４−Ａが「標的タンパク質（又は標的ペプチド断片）」を、式４で表される糖鎖が「標的糖鎖」を意味し、本発明のマーカー（５）を測定する場合、チロキシン結合グロブリンが「標的タンパク質（又は標的ペプチド断片）」を、式３で表される糖鎖が「標的糖鎖」を意味する。Hereinafter, (A) a method using a substance having an affinity for the marker of the present invention will be described in more detail.
In the following description, the protein (or peptide fragment) in the marker of the present invention is referred to as "target protein (or target peptide fragment)", and the sugar chain in the marker of the present invention is referred to as "target sugar chain".
For example, when measuring the marker (1) of the present invention, the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3 means "target protein (or target peptide fragment)", and the sugar chain represented by the formula 5 means "target sugar chain". When measuring the marker (2) of the present invention, the leucine-
上記（Ａ）本発明のマーカーに対して親和性を有する物質を用いる方法としては、具体的には、例えば、下記工程１及び２を含む方法が挙げられる。
（工程１）試料から標的糖鎖が結合した標的タンパク質（本発明のマーカー）を分離する工程、
（工程２）前記工程１で分離された標的糖鎖が結合した標的タンパク質の量を測定する工程Specific examples of the method (A) of using a substance having an affinity for the marker of the present invention include a method including the following
(Step 1) A step of separating a target protein (marker of the present invention) to which a target sugar chain is bound from a sample.
(Step 2) A step of measuring the amount of the target protein to which the target sugar chain separated in the step 1 is bound.
工程１としては、試料から標的糖鎖が結合した標的タンパク質を分離し得る方法であれば何れでもよく、具体的には、例えば、試料中に存在する標的糖鎖が結合した標的タンパク質と他の成分とを分離する方法が挙げられる。このような方法としては、具体的には、例えば、２種以上の親和性を有する物質、即ち、標的糖鎖に特異的に結合する物質、及び標的タンパク質に特異的に結合する物質を用いて、標的糖鎖が結合した標的タンパク質と親和性を有する物質との複合体（標的タンパク質に特異的に結合する物質−本発明のマーカー−標的糖鎖に特異的に結合する物質）を形成させ、自体公知の方法により、標的糖鎖が結合した標的タンパク質を分離すればよい。
尚、標識物質で標識された親和性を有する物質を用いる場合には、標的糖鎖が結合した標的タンパク質の分離は、標識物質で標識された親和性を有する物質と本発明のマーカーとの複合体の分離と言い換えてもよく、この場合、標識物質で標識された親和性を有する物質と本発明のマーカー以外の成分との複合体又は／及び遊離の標識物質で標識された親和性を有する物質とを分離すればよい。標識物質で標識された親和性を有する物質を構成成分として含まない成分との分離は不要である。
また、上記糖鎖に特異的に結合する親和性を有する物質及びタンパク質に特異的に結合する親和性を有する物質については、上述の通りであり、具体例等も同じである。The step 1 may be any method as long as it can separate the target protein to which the target sugar chain is bound from the sample. Specifically, for example, the target protein to which the target sugar chain present in the sample is bound and another target protein are used. Examples include a method of separating the components. Specifically, as such a method, for example, a substance having two or more kinds of affinity, that is, a substance that specifically binds to a target sugar chain and a substance that specifically binds to a target protein are used. , A complex (a substance that specifically binds to the target protein-a marker of the present invention-a substance that specifically binds to the target sugar chain) is formed by forming a complex (a substance that specifically binds to the target protein-a substance that specifically binds to the target sugar chain) with the target protein to which the target sugar chain is bound. The target protein to which the target sugar chain is bound may be separated by a method known per se.
When a substance having an affinity labeled with a labeling substance is used, the separation of the target protein to which the target sugar chain is bound is a combination of the substance having the affinity labeled with the labeling substance and the marker of the present invention. It may be paraphrased as separation of the body, and in this case, it has an affinity labeled with a complex and / or a free labeling substance of a substance having an affinity labeled with a labeling substance and a component other than the marker of the present invention. You just have to separate it from the substance. Separation from a component that does not contain a substance having an affinity labeled with a labeling substance as a constituent component is not necessary.
Further, the substances having an affinity for specifically binding to the sugar chain and the substances having an affinity for specifically binding to the protein are as described above, and specific examples and the like are also the same.
工程２としては、前記工程１で分離された標的糖鎖が結合した標的タンパク質を測定し得る方法であれば何れでもよく、具体例等は上述の通りである。
The
上記方法において、工程１を行う前に、予め試料中の全タンパク質（標的タンパク質を含む）をペプチド断片化し、工程１で標的糖鎖が結合した標的ペプチド断片を分離し、工程２で該標的糖鎖が結合した標的ペプチド断片を測定してもよい。
該断片化処理としては、具体的には、例えば、工程１を行う前に、試料にトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、ＡｓｐＮ等のプロテアーゼを加えることによりなされればよく、工程１で標的糖鎖に結合する物質、及び標的ペプチド断片に結合する物質をそれぞれ用いて、標的糖鎖が結合した標的ペプチド断片と親和性を有する物質との複合体（標的ペプチド断片に特異的に結合する物質−本発明のマーカー−標的糖鎖に特的に結合する物質）を形成させ、該複合体を上述の如く分離した後、該複合体の量を測定すればよい。In the above method, before performing step 1, all proteins (including the target protein) in the sample are peptide-fragmented in advance, the target peptide fragment to which the target sugar chain is bound is separated in step 1, and the target sugar is separated in
Specifically, the fragmentation treatment may be carried out, for example, by adding a protease such as trypsin, lysylendopeptidase, or AspN to the sample before performing step 1, and binds to the target sugar chain in step 1. A complex of a substance that binds to a target peptide fragment and a substance that has an affinity for the target peptide fragment to which the target sugar chain is bound (a substance that specifically binds to the target peptide fragment-the substance of the present invention). A marker-a substance that specifically binds to the target sugar chain) may be formed, the complex may be separated as described above, and then the amount of the complex may be measured.
また、上記全タンパク質の断片化を行った場合、該断片化に引き続いて、レクチンカラム等のカラムによる濃縮を行ってもよい。該濃縮は自体公知の方法に従ってなされればよく、市販のレクチンカラム等のカラムを用いればよい。 In addition, when the above-mentioned total protein is fragmented, the fragmentation may be followed by concentration by a column such as a lectin column. The concentration may be carried out according to a method known per se, and a column such as a commercially available lectin column may be used.
更に、上記方法において、工程２のかわりに、工程１で分離された標的糖鎖が結合した標的タンパク質から標的糖鎖を分離し、該標的糖鎖のみを測定してもよい。
具体的には、例えば、工程１で分離された標的糖鎖が結合した標的タンパク質を、グリカナーゼ、ヒドラジン等にて処理することにより標的糖鎖を分離した後、該糖鎖の量のみを上述の如く測定すればよい。Further, in the above method, instead of
Specifically, for example, after separating the target sugar chain by treating the target protein to which the target sugar chain separated in step 1 is bound with glycanase, hydrazine, or the like, only the amount of the sugar chain is described above. It may be measured as follows.
（Ｂ）質量分析法を利用する方法
質量分析法を利用する方法としては、具体的には、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）、キャピラリー電気泳動質量分析計（ＣＥ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィータンデム型質量分析計（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）等を利用する方法が挙げられる。
上記方法としては、具体的には、例えば、液体クロマトグラフ等のクロマトグラフを有する分離部にて、試料中の成分を分離し、分離された種々の成分を質量分析部にてイオン化させ、更に質量電荷比（ｍ／ｚ）毎に分離することによりなされればよい。
尚、上記質量分析法を利用する方法における具体的な手法は自体公知の手法やＷＯ２０１４／０３８５２４、ＷＯ２０１７／１９５８８、ＷＯ２０１８／０３４３４６等に記載の手法に従ってなされればよい。(B) Method Using Mass Spectrometry Specific examples of the method using mass spectrometry include a liquid chromatography mass spectrometer (LC / MS) and a capillary electrophoresis mass spectrometer (CE / MS). , A method using a gas chromatography mass spectrometer (GC / MS), a liquid chromatography tandem mass spectrometer (LC / MS / MS), or the like can be mentioned.
Specifically, as the above method, specifically, for example, a component in a sample is separated by a separation unit having a chromatograph such as a liquid chromatograph, and various separated components are ionized by a mass spectrometer, and further. It may be done by separating each mass-to-charge ratio (m / z).
The specific method in the method using the above-mentioned mass spectrometry may be a method known per se or a method described in WO2014 / 038524, WO2017 / 19588, WO2018 / 034346 and the like.
上記質量分析法を利用する方法において、試料から予め全タンパク質を抽出してもよく、その方法としては、具体的には、例えば、試料に、アセトン、メタノール、エタノール、トリクロロ酢酸、塩酸水溶液等の溶媒を用いて全タンパク質を沈殿させることによりなされればよい。 In the method using the above mass spectrometry, the total protein may be extracted from the sample in advance, and specifically, for example, the sample may be prepared with acetone, methanol, ethanol, trichloroacetic acid, an aqueous solution of hydrochloric acid or the like. It may be done by precipitating all proteins with a solvent.
また、必要に応じ、試料から全タンパク質を抽出する前又は後に、全タンパク質を断片化してもよく、断片化を行った場合、該断片化に引き続いて、レクチンカラム等のカラムによる濃縮を行ってもよい。該断片化及び濃縮については、上述の通りである。 Further, if necessary, the total protein may be fragmented before or after the total protein is extracted from the sample. When fragmentation is performed, the fragmentation is followed by concentration by a column such as a lectin column. May be good. The fragmentation and concentration are as described above.
［好ましい測定工程］
本発明に係る測定工程では、（ｉ）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、式５で表される糖鎖の量又は（ｉｉ）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、式６で表される糖鎖の量を測定することが好ましく、（ｉｉｉ）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、式５で表される糖鎖の量を測定することがより好ましく、（ｖｉ）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３のアミノ酸配列のＮ末端より５８０番目のアミノ酸残基（アスパラギン残基）に結合している式５で表される糖鎖の量を測定することが更に好ましい。
また、上記測定を行う場合には、本発明のマーカーに対して親和性を有する物質を用いる方法が好ましく、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ＦＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法、ＥＣＬＥＩＡ法、免疫比濁法、免疫比ろう法、ラテックス凝集法、イムノクロマト法、ウェスタンブロット法、ＬＯＣＩ法、ＬＢＡ−ＥＡＴＡ法等の免疫学的測定法に準じた方法がより好ましく、本発明のマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のマーカーとを接触させて、本発明のマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のマーカーとの複合体を形成させ、該複合体の量を測定する方法が更に好ましく、本発明のマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のマーカーとを接触させて、本発明のマーカーに対して親和性を有する物質と本発明のマーカーとの複合体を形成させ、該複合体に結合した標識物質に由来するシグナルを検出する方法が特に好ましい。[Preferable measurement step]
In the measurement step according to the present invention, (i) the amount of the sugar chain represented by the formula 5 present in the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3 or (ii) the amount of the sugar chain present in the leucine-
Further, when performing the above measurement, a method using a substance having an affinity for the marker of the present invention is preferable, and the ELISA method, the EIA method, the RIA method, the FIA method, the CLEIA method, the ECLEIA method, and the immunoblotting method are used. , Immunoassay, Latex Aggregation, Immunochromatography, Western Blotting, LOCI, LBA-EATA and other immunoassays are more preferred and have affinity for the markers of the invention. A method of contacting a substance with the marker of the present invention to form a complex of the substance having an affinity for the marker of the present invention and the marker of the present invention and measuring the amount of the complex is more preferable. A substance having an affinity for the marker of the present invention and the marker of the present invention are brought into contact with each other to form a complex of the substance having an affinity for the marker of the present invention and the marker of the present invention. A method of detecting a signal derived from a labeling substance bound to the body is particularly preferable.
［本発明に係る判定工程］
本発明に係る判定工程は、本発明に係る測定工程により得られた測定結果に基づいて膵臓癌を判定する工程である。[Determination step according to the present invention]
The determination step according to the present invention is a step of determining pancreatic cancer based on the measurement result obtained by the measurement step according to the present invention.
本発明に係る判定工程は、具体的には、例えば、被検動物由来の試料を用いて本発明に係る測定工程により得られた値（以下、被検動物由来の値と略記する場合がある）と予め設定した基準値（カットオフ値等）とを用いてなされる。
即ち、（ｉ）被検動物由来の値が、予め設定した基準値（カットオフ値等）以上の場合、「被検動物が膵臓癌に罹患しているおそれがある、或いは被検動物が膵臓癌に罹患しているおそれが高い」等の判定を下すことができ、（ｉｉ）被検動物由来の値が、予め設定した基準値（カットオフ値等）未満の場合、「被検動物が膵臓癌に罹患しているおそれはない、或いは膵臓癌に罹患しているおそれが低い」等の判定を下すことができる。
また、別の態様として、（ｉ）被検動物由来の値が、予め設定した基準値（カットオフ値等）以下の場合、「被検動物が膵臓癌に罹患しているおそれがある、或いは被検動物が膵臓癌に罹患しているおそれが高い」等の判定を下すことができ、（ｉｉ）被検動物由来の値が、予め設定した基準値（カットオフ値等）超の場合、「被検動物が膵臓癌に罹患しているおそれはない、或いは膵臓癌に罹患しているおそれが低い」等の判定を下すことができる。
尚、上記基準値（カットオフ値等）は、膵臓癌に罹患している動物由来の試料を用いて本発明に係る測定工程により得られた測定値と健常動物由来の試料を用いて本発明に係る測定工程により得られた値（以下、健常動物由来の値と略記する場合がある）とを用いてＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線解析等の統計解析に基づいて決定することができる。
また、上記基準値（カットオフ値等）の感度又は／特異度は、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上である。Specifically, the determination step according to the present invention may be abbreviated as, for example, a value obtained by a measurement step according to the present invention using a sample derived from a test animal (hereinafter, abbreviated as a value derived from a test animal). ) And a preset reference value (cutoff value, etc.).
That is, (i) when the value derived from the test animal is equal to or higher than a preset reference value (cutoff value, etc.), "the test animal may have pancreatic cancer, or the test animal is pancreatic. It is possible to make a judgment such as "there is a high risk of having cancer", and (ii) if the value derived from the test animal is less than the preset standard value (cutoff value, etc.), "the test animal is It is possible to make a judgment such as "there is no risk of suffering from pancreatic cancer, or the risk of suffering from pancreatic cancer is low".
In another aspect, when (i) the value derived from the test animal is equal to or less than a preset reference value (cutoff value, etc.), "the test animal may be suffering from pancreatic cancer, or It is possible to make a judgment such as "the test animal is likely to have pancreatic cancer", and (ii) when the value derived from the test animal exceeds a preset standard value (cutoff value, etc.). It is possible to make a judgment such as "the test animal is unlikely to have pancreatic cancer or is unlikely to have pancreatic cancer".
The above reference values (cutoff value, etc.) are the measurement values obtained by the measurement step according to the present invention using a sample derived from an animal suffering from pancreatic cancer and the present invention using a sample derived from a healthy animal. It can be determined based on statistical analysis such as ROC (Receiver Operating Characteristic) curve analysis using the value obtained by the measurement step according to the above (hereinafter, may be abbreviated as a value derived from a healthy animal).
The sensitivity or specificity of the reference value (cutoff value, etc.) is, for example, 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and further preferably 90% or more.
別の形態として、被検動物由来の値と健常動物由来の値とを比較し、（ｉ）被検動物由来の値が、健常動物由来の値より多い場合、「被検動物が膵臓癌に罹患しているおそれがある、或いは被検動物が膵臓癌に罹患しているおそれが高い」等の判定を下すことができ、（ｉｉ）被検動物由来の値と、健常動物由来の値との間に顕著な差が認められない場合、「被検動物が膵臓癌に罹患しているおそれはない、或いは膵臓癌に罹患しているおそれが低い」等の判定を下すことができる。 As another form, the value derived from the test animal is compared with the value derived from the healthy animal, and (i) when the value derived from the test animal is larger than the value derived from the healthy animal, "the test animal develops pancreatic cancer. It is possible to make a judgment such as "there is a possibility of being affected, or the test animal is likely to be suffering from pancreatic cancer", and (ii) the value derived from the test animal and the value derived from the healthy animal. If no significant difference is observed between the two, it is possible to make a judgment such as "the test animal is unlikely to have pancreatic cancer or is unlikely to have pancreatic cancer".
更に別の形態として、同一の被検動物において、ある時点における被検動物由来の値と、異なる時点での被検動物由来の値とを比較し、該値の有無又は／及び増減の程度を評価することにより、膵臓癌の進行度、悪性度の診断、術後の予後診断等が可能である。即ち、（ｉ）値の増加が認められた場合、膵臓癌へ病態が進行した（或いは膵臓癌の悪性度が増した）、又は膵臓癌への病態の進行の兆候が認められる（或いは膵臓癌の悪性度が増す兆候が認められる）等の判定を下すことができ、（ｉｉ）値の減少が認められた場合、膵臓癌の病態が改善した、又は膵臓癌の病態の改善の兆候が認められる等の判定を下すことができる。 As yet another form, in the same test animal, the value derived from the test animal at a certain time point is compared with the value derived from the test animal at a different time point, and the presence / absence or / and the degree of increase / decrease of the value are determined. By evaluation, it is possible to diagnose the degree of progression and malignancy of pancreatic cancer, and to diagnose the prognosis after surgery. That is, (i) When an increase in the value is observed, there is a sign that the condition has progressed to pancreatic cancer (or the malignancy of pancreatic cancer has increased), or there is a sign that the condition has progressed to pancreatic cancer (or pancreatic cancer). If a decrease in (ii) value is observed, there is a sign that the condition of pancreatic cancer has improved, or there is a sign that the condition of pancreatic cancer has improved. It is possible to make a judgment such as being done.
尚、本発明に係る測定工程にて本発明のマーカーを複数種測定した場合は、得られた複数の値を用いて上述の通りに本発明に係る判定工程を行えばよく、より確度（正確度・精度）の高い判定が可能となる。 When a plurality of types of markers of the present invention are measured in the measurement step according to the present invention, the determination step according to the present invention may be performed as described above using the obtained plurality of values, and the accuracy (accuracy) is higher. High degree / accuracy) can be determined.
＜本発明の膵臓癌の判定を行うためのデータを得る方法＞
本発明の膵臓癌の判定を行うためのデータを得る方法（以下、本発明のデータを得る方法と略記する場合がある）は、試料中の下記（１）〜（５）から選ばれる糖鎖の量を測定することによりなされる。
（１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、上記式５で表される糖鎖、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、上記式６で表される糖鎖、
（３）ビトロネクチンに存在する、上記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４）補体Ｃ４−Ａに存在する、上記式４で表される糖鎖、
（５）チロキシン結合グロブリンに存在する、上記式３で表される糖鎖
即ち、本発明のデータを得る方法は、本発明のマーカー、言い換えると、本発明のマーカー（１）〜（５）から選ばれるものを測定することによりなされる。
尚、本発明のデータを得る方法としては、本発明のマーカー（１）〜（５）の何れか単独を用いてなされても、或いは複数種を用いてなされてもよい。<Method of obtaining data for determining pancreatic cancer of the present invention>
The method for obtaining data for determining pancreatic cancer of the present invention (hereinafter, may be abbreviated as the method for obtaining the data of the present invention) is a sugar chain selected from the following (1) to (5) in a sample. It is done by measuring the amount of.
(1) The sugar chain represented by the above formula 5 existing in the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3.
(2) A sugar chain represented by the above formula 6 present in leucine-
(3) At least one sugar chain represented by the above formulas 1 to 3 present in vitronectin.
(4) The sugar chain represented by the above formula 4 existing in complement C4-A.
(5) Sugar chain represented by the above formula 3 present in thyroxine-binding globulin That is, the method for obtaining the data of the present invention is derived from the markers of the present invention, in other words, the markers (1) to (5) of the present invention. It is done by measuring what is chosen.
As a method for obtaining the data of the present invention, any one of the markers (1) to (5) of the present invention may be used alone, or a plurality of types may be used.
本発明のデータを得る方法におけるデータとしては、（ｉ）本発明のデータを得る方法により得られた本発明のマーカーの量の値、（ｉｉ）該値を更に多重ロジスティック回帰分析、判別分析、ポアソン回帰分析、重回帰分析、コックスの比例ハザードモデル、パス解析等の多変量解析に付して得られる値、（ｉｉｉ）本発明のデータを得る方法により得られた本発明のマーカーの量の値と前述の基準値（カットオフ値等）との大小関係を示すデータ（比較結果）、（ｉｖ）被験動物が膵臓癌に罹患しているおそれがある、或いは被検動物が膵臓癌に罹患しているおそれが高い等を示唆するデータ等が挙げられ、（ｉ）又は（ｉｉｉ）が好ましく、（ｉ）がより好ましい。
尚、本発明のデータを得る方法における、本発明のマーカー、該マーカーの測定、膵臓癌及び試料については、＜本発明のマーカー＞及び＜本発明の判定方法＞にて説明した通りであり、具体例、好ましい例等も同じである。The data in the method for obtaining the data of the present invention include (i) the value of the amount of the marker of the present invention obtained by the method for obtaining the data of the present invention, and (ii) further multiplying the value by multiple logistic regression analysis and discriminant analysis. Values obtained by multivariate analysis such as Poisson regression analysis, multiple regression analysis, Cox's proportional hazard model, path analysis, (iii) of the amount of markers of the present invention obtained by the method of obtaining the data of the present invention. Data showing the magnitude relationship between the value and the above-mentioned reference value (cutoff value, etc.) (comparison result), (iv) The test animal may have pancreatic cancer, or the test animal has pancreatic cancer. Examples include data suggesting that there is a high possibility that (i) or (iii) is preferable, and (i) is more preferable.
The markers of the present invention, the measurement of the markers, pancreatic cancer and the sample in the method for obtaining the data of the present invention are as described in <Marker of the present invention> and <Determination method of the present invention>. The same applies to specific examples, preferred examples, and the like.
＜本発明の膵臓癌の判定用キット＞
本発明の膵臓癌の判定用キット（以下、本発明のキットと略記する場合がある）は、下記（１）〜（５）から選ばれる糖鎖に親和性を有する物質を含むものである。
（１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、上記式５で表される糖鎖、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、上記式６で表される糖鎖、
（３）ビトロネクチンに存在する、上記式１〜３で表される少なくとも1つの糖鎖、
（４）補体Ｃ４−Ａに存在する、上記式４で表される糖鎖、
（５）チロキシン結合グロブリンに存在する、上記式３で表される糖鎖
本発明のキットは、本発明のマーカー、言い換えると、本発明のマーカー（１）〜（５）にそれぞれ親和性を有する物質を含むものである。
尚、本発明のキットにおける、本発明のマーカー及び膵臓癌については、＜本発明のマーカー＞及び＜本発明の判定方法＞にて説明した通りであり、具体例、好ましい例等も同じである。<Kit for determining pancreatic cancer of the present invention>
The kit for determining pancreatic cancer of the present invention (hereinafter, may be abbreviated as the kit of the present invention) contains a substance having an affinity for a sugar chain selected from the following (1) to (5).
(1) The sugar chain represented by the above formula 5 existing in the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3.
(2) A sugar chain represented by the above formula 6 present in leucine-
(3) At least one sugar chain represented by the above formulas 1 to 3 present in vitronectin.
(4) The sugar chain represented by the above formula 4 existing in complement C4-A.
(5) Sugar chain represented by the above formula 3 present in thyroxine-binding globulin The kit of the present invention has an affinity for the marker of the present invention, in other words, the markers (1) to (5) of the present invention, respectively. It contains substances.
The marker of the present invention and pancreatic cancer in the kit of the present invention are as described in <Marker of the present invention> and <Determination method of the present invention>, and specific examples, preferred examples and the like are also the same. ..
上記親和性を有する物質とは、本発明のマーカーにおける糖鎖やタンパク質（又はペプチド断片）に特異的に結合するものであり、レクチン、抗体等が挙げられる。
上記親和性を有する物質については、＜本発明の判定方法＞にて説明した通りであり、具体例、好ましい例等も同じである。The substance having the above affinity is a substance that specifically binds to a sugar chain or protein (or peptide fragment) in the marker of the present invention, and examples thereof include lectins and antibodies.
The substance having the above affinity is as described in <Determination method of the present invention>, and specific examples, preferred examples and the like are also the same.
本発明のキットには、更に、通常この分野で用いられる試薬類、例えば、トリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、ＡｓｐＮ等のペプチド断片化用試薬、レクチンカラム等の濃縮用カラム、タンパク質抽出用溶媒、緩衝剤、洗浄剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤、試料を希釈するための液、レクチン固定化固相、抗体固定化固相、抗原固定化固相等の固定化固相、標識物質で標識された二次抗体又は該二次抗体の断片、標識物質検出用試薬等であって、共存する試薬等の安定性を阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度、pHも通常この分野で用いられている範囲であればよい。 The kit of the present invention further includes reagents usually used in this field, for example, reagents for peptide fragmentation such as trypsin, lysylendopeptidase, AspN, columns for concentration such as lectin columns, solvents for protein extraction, and buffers. , Cleaning agents, reaction accelerators, sugars, proteins, salts, stabilizers such as surfactants, preservatives, solutions for diluting samples, lectin-immobilized solid phase, antibody-immobilized solid phase, antigen-immobilized solids. It includes the same immobilized solid phase, a secondary antibody labeled with a labeling substance or a fragment of the secondary antibody, a reagent for detecting a labeling substance, etc., which does not impair the stability of coexisting reagents, etc. You may. Further, the concentration and pH may be in the range usually used in this field.
上記レクチン固定化固相、抗体固定化固相、抗原固定化固相等の固定化固相としては、磁性シリカ粒子等の磁性粒子、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ガラス、セラミック等の素材に、本発明のマーカーにおけるタンパク質（又はペプチド断片）や糖鎖に特異的に結合する親和性を有する物質（レクチン、抗体又は該抗体の断片等）を固相化したものであれば何れでもよい。
尚、上記レクチン固定化固相、抗体固定化固相、抗原固定化固相等の固定化固相における素材については、自体公知の方法により製造されたものを用いても、市販のものを用いてもよい。例えば、自体公知の方法により上記磁性シリカ粒子等の磁性粒子を製造する場合、ＷＯ２０１２／１７３００２に記載の方法により製造することができる。Examples of the immobilized solid phase such as the lectin-immobilized solid phase, antibody-immobilized solid phase, and antigen-immobilized solid phase include magnetic particles such as magnetic silica particles, polystyrene, polycarbonate, polyvinyltoluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, and the like. A substance (lectin, which has an affinity for specifically binding to a protein (or peptide fragment) or sugar chain in the marker of the present invention to a material such as nylon, polymethacrylate, gelatin, agarose, cellulose, polyethylene terephthalate, glass, and ceramic. Any antibody or fragment of the antibody) may be immobilized.
As for the material in the immobilized solid phase such as the lectin-immobilized solid phase, the antibody-immobilized solid phase, and the antigen-immobilized solid phase, a commercially available material may be used even if it is produced by a method known per se. You may. For example, when magnetic particles such as the magnetic silica particles are produced by a method known per se, they can be produced by the method described in WO2012 / 173002.
上記標識物質で標識された二次抗体又はその抗体断片とは、上記固相化された親和性を有する物質（レクチン、抗体又は該抗体の断片等）にそれぞれ結合する抗体又はその抗体断片である。
尚、上記標識物質で標識された二次抗体又はその抗体断片における、標識物質及び標識物質を結合させる方法については、＜本発明の判定方法＞にて説明した通りであり、好ましい例、具体例等も同じである。The secondary antibody labeled with the above-mentioned labeling substance or an antibody fragment thereof is an antibody or an antibody fragment thereof that binds to each of the above-immobilized substances having an affinity (lectin, antibody, fragment of the antibody, etc.). ..
The method for binding the labeling substance and the labeling substance in the secondary antibody labeled with the above-mentioned labeling substance or the antibody fragment thereof is as described in <Determination method of the present invention>, and preferred examples and specific examples. Etc. are the same.
上記標識物質検出用試薬とは、レクチン、抗体又は該抗体の断片等の親和性を有する物質が標識物質で標識されている場合、標識物質で標識されたレクチン、抗体又は該抗体の断片等の親和性を有する物質中の標識又は／及び上記標識された二次抗体又は該二次抗体の断片中の標識を検出するものであり、テトラメチルベンジジン、オルトフェニレンジアミン等の吸光度測定用基質、ヒドロキシフェニルプロピオン酸、ヒドロキシフェニル酢酸等の蛍光基質、ルミノール等の発光物質が挙げられ、4-ニトロフェニルフォスフェート等の吸光度測定用試薬、4-メチルウンベリフェリルフォスフェート等の蛍光基質等が挙げられる。 When a substance having an affinity such as a lectin, an antibody or a fragment of the antibody is labeled with the labeling substance, the reagent for detecting the labeling substance is a reagent such as a lectin, an antibody or a fragment of the antibody labeled with the labeling substance. It detects a label in a substance having affinity and / and a label in the above-labeled secondary antibody or a fragment of the secondary antibody, and is a substrate for measuring absorbance such as tetramethylbenzidine and orthophenylenediamine, hydroxy. Fluorescent substrates such as phenylpropionic acid and hydroxyphenylacetic acid, luminescent substances such as luminol, and reagents for measuring absorbance such as 4-nitrophenyl phosphate, fluorescent substrates such as 4-methylumbelliferyl phosphate, and the like can be mentioned. ..
更に、本発明のキットには、本発明の判定方法又は／及びデータを得る方法を行うための説明書等を含まれていてもよい。当該「説明書」とは、本発明の判定方法又は／及びデータを得る方法の特徴、原理、操作手順、判定手順等が文章又は／及び図表により実質的に記載されている本発明に係る試薬の取扱い説明書、添付文書、パンフレット（リーフレット）等を意味する。 Further, the kit of the present invention may include an instruction manual or the like for performing the determination method of the present invention and / or the method of obtaining data. The "instruction manual" is a reagent according to the present invention in which the features, principles, operating procedures, determination procedures, etc. of the determination method and / and the method for obtaining data of the present invention are substantially described in text and / and in figures and tables. Means the instruction manual, package insert, pamphlet (leaflet), etc.
このように本発明のキットによれば、本発明の判定方法又は／及び本発明のデータを得る方法を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。 As described above, according to the kit of the present invention, the determination method of the present invention and / and the method of obtaining the data of the present invention can be performed easily, in a short time and with high accuracy.
＜本発明に係る膵臓癌の判定を行うための装置＞
本発明に係る膵臓癌の判定を行うための装置（以下、本発明に係る判定装置と略記する場合がある）は、少なくとも（１）測定部を備えている。更に、（２）判定部、（３）出力部及び（４）入力部を備えていてもよい。<Device for determining pancreatic cancer according to the present invention>
The device for determining pancreatic cancer according to the present invention (hereinafter, may be abbreviated as the determination device according to the present invention) includes at least (1) a measuring unit. Further, it may include (2) a determination unit, (3) an output unit, and (4) an input unit.
本発明に係る判定装置における（１）測定部は、試料中の上記本発明のマーカー（１）〜（５）から選ばれる糖鎖の量を測定するように構成されている。具体的には、例えば、本発明に係る測定工程にて用いられる各種質量分析計、免疫学的測定法に準じた方法に用いられる装置等の測定装置が挙げられる。
尚、要すれば、（１）測定部では、測定された測定値に基づいて、上記本発明のマーカー（１）〜（５）の量を算出するように構成されていてもよい。The (1) measuring unit in the determination device according to the present invention is configured to measure the amount of sugar chains selected from the markers (1) to (5) of the present invention in the sample. Specific examples thereof include measuring devices such as various mass spectrometers used in the measuring step according to the present invention and devices used in a method based on an immunological measuring method.
If necessary, the (1) measuring unit may be configured to calculate the amounts of the markers (1) to (5) of the present invention based on the measured measured values.
本発明に係る判定装置における（２）判定部は、（１）測定部にて得られる結果に基づいて膵臓癌を判定するように構成されている。 The (2) determination unit in the determination device according to the present invention is configured to determine pancreatic cancer based on the results obtained by (1) the measurement unit.
本発明に係る判定装置における（３）出力部は、（１）測定部にて得られる結果又は／及び（２）判定部にて得られる結果を出力するよう構成されている。 The (3) output unit in the determination device according to the present invention is configured to output (1) the result obtained by the measurement unit and / and (2) the result obtained by the determination unit.
本発明に係る判定装置における（４）入力部は、操作する者の操作を受けて、（１）測定部へ、当該（１）測定部を作動させるための信号を送るよう構成されている。 The (4) input unit in the determination device according to the present invention is configured to send a signal for operating the (1) measurement unit to (1) the measurement unit in response to the operation of the operator.
尚、上記本発明に係る判定装置の（１）測定部及び（２）判定部によりなされる測定、判定等については、＜本発明の判定方法＞にて説明した通りであり、好ましい例、具体例等も同じである。 The measurement, determination, etc. performed by the (1) measuring unit and (2) determining unit of the determination device according to the present invention are as described in <Determining method of the present invention>, and are preferable examples and specific examples. The same applies to the examples.
上記本発明に係る判定装置によれば、本発明の判定方法又は／及び本発明のデータを得る方法を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。 According to the determination device according to the present invention, the determination method of the present invention and / and the method of obtaining the data of the present invention can be performed easily, in a short time, and with high accuracy.
＜本発明に係る膵臓癌の判定を補助する方法＞
本発明に係る膵臓癌の判定を補助する方法（以下、本発明に係る補助方法と略記する場合がある）は、試料中の上記本発明のマーカー（１）〜（５）から選ばれる糖鎖の量を測定し、得られた測定結果に基づいて膵臓癌の判定を補助することによりなされる。
本発明に係る補助方法は、医師等による膵臓癌の診断を補助する方法として用いることができる。
尚、本発明に係る補助方法における試料、マーカー、測定、判定等については、＜本発明の判定方法＞にて説明した通りであり、好ましい例、具体例等も同じである。<Method for assisting determination of pancreatic cancer according to the present invention>
The method for assisting the determination of pancreatic cancer according to the present invention (hereinafter, may be abbreviated as the auxiliary method according to the present invention) is a sugar chain selected from the markers (1) to (5) of the present invention in a sample. It is done by measuring the amount of pancreatic cancer and assisting the determination of pancreatic cancer based on the obtained measurement result.
The assisting method according to the present invention can be used as a method for assisting a doctor or the like in diagnosing pancreatic cancer.
The sample, marker, measurement, determination, etc. in the auxiliary method according to the present invention are as described in <Determining method of the present invention>, and preferred examples, specific examples, and the like are also the same.
＜本発明に係る膵臓癌を判定し、治療する方法＞
本発明に係る膵臓癌を判定し、治療する方法（以下、本発明に係る治療方法と略記する場合がある）は、試料中の本発明のマーカー（１）〜（５）から選ばれる糖鎖の量を測定し、得られた測定結果に基づいて膵臓癌を判定し、その判定結果に基づいて膵臓癌のおそれがある又は膵臓癌のおそれが高いと判定された患者に適切な治療を施すことによりなされる。
尚、本発明に係る治療方法における試料、マーカー、測定、判定等については、＜本発明の判定方法＞にて説明した通りであり、好ましい例、具体例等も同じである。
本発明に係る治療方法における適切な治療としては、具体的には、例えば、膵頭十二指腸切除術、膵体尾部切除術、膵全摘術、バイパス手術等の外科療法、化学放射線療法等の放射線治療、ユーエフティ（商品名）等の薬剤を投与することによりなされる薬物療法等が挙げられる。<Method for determining and treating pancreatic cancer according to the present invention>
The method for determining and treating pancreatic cancer according to the present invention (hereinafter, may be abbreviated as the therapeutic method according to the present invention) is a sugar chain selected from the markers (1) to (5) of the present invention in a sample. Is measured, pancreatic cancer is determined based on the obtained measurement results, and appropriate treatment is given to patients who are determined to have a risk of pancreatic cancer or a high risk of pancreatic cancer based on the determination results. It is done by.
The sample, marker, measurement, determination, etc. in the treatment method according to the present invention are as described in <Determining method of the present invention>, and preferred examples, specific examples, and the like are also the same.
Specific examples of the appropriate treatment in the treatment method according to the present invention include surgical therapy such as pancreaticoduodenectomy, pancreatoduodenectomy, total pancreatic resection, bypass surgery, and radiotherapy such as chemoradiotherapy. Examples thereof include drug therapy performed by administering a drug such as UFT (trade name).
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例によって何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on Examples, but the present invention is not limited to any of the Examples.
実施例１．膵臓癌マーカーの選別
［（１）検体（サンプル）］
横浜市立大学センター病院及び横浜市立大学先端医科学研究センターバイオバンクより提供された、膵臓癌患者由来の血清（１０検体）及び健常者由来の血清（１１検体）を検体（サンプル）として用いた。Example 1. Selection of pancreatic cancer markers [(1) Specimen (sample)]
Serum (10 samples) derived from pancreatic cancer patients and serum (11 samples) derived from healthy subjects provided by Yokohama City University Center Hospital and Advanced Medical Research Center Biobank of Yokohama City University were used as samples (samples).
［（２）糖ペプチドの調製］
上記（１）の膵臓癌患者由来の血清及び健常者由来の血清 １０μＬを、Ｈｉｇｈ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｔｏｐ１４ Ａｂｕｎｄａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｒｅｓｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にそれぞれ入れ、２５℃で１０分間インキュベートすることにより、ａｌｂｕｍｉｎ、ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ等の血清中に存在する夾雑タンパク質を除去した。次いで、アセトン ４０μＬをそれぞれ加え、−２０℃で１６時間インキュベートした後、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を除去後、沈殿物に８Ｍ尿素含有５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０） ５０μＬをそれぞれ加え溶解し、プロテインアッセイＢＣＡキット（富士フイルム和光純薬社製）にてタンパク質濃度をそれぞれ測定した。測定後、タンパク質試料 ２０μｇに、５００ｍＭジチオスレイトール １μＬをそれぞれ加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、５００ｍＭヨードアセトアミド ２．８μＬをそれぞれ加え、３７℃で３０分間インキュベートすることにより、還元アルキル化を行った（尚、該還元アルキル化は、５００ｍＭジチオスレイトール ０．５μＬを加えることにより、その反応を停止させた）。その後、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ（０．５ｍＬ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０） １３０μＬに溶媒置換し、変性剤及び還元剤をそれぞれ除去した。次いで、タンパク質試料 １μｇに、Ｔｒｙｐｓｉｎ／Ｌｙｓ−Ｃ Ｍｉｘ（プロメガ社製）をそれぞれ加え、３７℃で１６時間インキュベートした。その後、Ｏａｓｉｓ ＰＲｉＭＥ ＨＬＢ固相抽出カラム（Ｗａｔｅｒｓ社製）にて脱塩を行い、遠心エバポレーターにて乾固し、糖ペプチドを得た。[(2) Preparation of glycopeptide]
10 μL of serum derived from a pancreatic cancer patient and 10 μL of serum derived from a healthy person in (1) above are placed in High-Select Top14 Abandant Protein Depletion Resin (manufactured by Thermo Fisher Scientific) and incubated at 25 ° C. for 10 minutes to albumin. Contaminating proteins present in serum such as immunoglobulin were removed. Then, 40 μL of acetone was added, and the mixture was incubated at −20 ° C. for 16 hours and then centrifuged at 14000 rpm. After removing the supernatant, 50 μL of 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0) containing 8 M urea was added to the precipitate to dissolve them, and the protein concentration was measured with a protein assay BCA kit (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After the measurement, 1 μL of 500 mM dithiothreitol was added to 20 μg of the protein sample, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Then, 2.8 μL of 500 mM iodoacetamide was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes for reduction alkylation (the reduction alkylation was carried out by adding 0.5 μL of 500 mM dithiothreitol. The reaction was stopped). Then, the solvent was replaced with 130 μL of 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0) with Zeba Spin Desalting collagen (0.5 mL; manufactured by Thermo Fisher Scientific) to remove the denaturant and the reducing agent, respectively. Then, Trypsin / Lys-C Mix (manufactured by Promega) was added to 1 μg of the protein sample, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 16 hours. Then, desalting was performed on an Oasis PRiME HLB solid-phase extraction column (manufactured by Waters), and the mixture was dried on a centrifugal evaporator to obtain a glycopeptide.
［（３）糖ペプチドの濃縮］
上記（２）で調製した２１検体分（膵臓癌患者：１０検体、健常者：１１検体）の各糖ペプチド １０μｇについて、下記手順に従い、濃縮した。
（Ａ）ＷＯ２０１７／１９５８８７記載の糖ペプチド濃縮カラムに、０．１％ＴＦＡ溶液 １００μＬを入れ、２００μＬチップ専用の卓上遠心機にセットし、該溶液をカラムに通過させ、ポリマー性ポリオール層を洗浄した。
（Ｂ）カラムに、８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液 １００μＬを入れ、２００μＬチップ専用の卓上遠心機にセットし、該溶液をカラムに通過させ、固相抽出担体相を洗浄した。
（Ｃ）カラムに、８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液 １００μＬを入れ、２００μＬチップ専用の卓上遠心機にセットし、２秒間遠心することによりカラム内の空気を除いた。
（Ｄ）カラム内の８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液に、上記（２）で調製した糖ペプチド試料 １０μｇを加え、２００μＬチップ専用の卓上遠心機にセットし、２０秒間遠心した。
（Ｅ）カラムに、８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液 １００μＬを加え、２００μＬチップ専用の卓上遠心機にセットし、２０秒間遠心し、夾雑物を除去した。
（Ｆ）上記（Ｅ）を更に２回繰り返した。
（Ｇ）カラムに、０．１％ＴＦＡ １００μＬを加え、２００μＬチップ専用の卓上遠心機にセットし、３０秒間遠心し、固相抽出担体相に糖ペプチドを濃縮させた。
（Ｈ）カラムに、８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ溶液 １００μＬを加え、アダプター付きのシリンジを用いて１．５ｍＬチューブに糖ペプチドを溶出させた後、遠心エバポレーターにて乾燥し、濃縮した糖ペプチドを得た。[(3) Concentration of glycopeptides]
10 μg of each glycopeptide of 21 samples (pancreatic cancer patients: 10 samples, healthy subjects: 11 samples) prepared in (2) above was concentrated according to the following procedure.
(A) 100 μL of 0.1% TFA solution was placed in the glycopeptide concentration column described in WO2017 / 195887, set in a tabletop centrifuge dedicated to a 200 μL chip, and the solution was passed through the column to wash the polymer polyol layer. ..
(B) 100 μL of 80% acetonitrile / 0.1% TFA solution was placed in the column, set in a tabletop centrifuge dedicated to a 200 μL chip, and the solution was passed through the column to wash the solid-phase extraction carrier phase.
(C) 100 μL of 80% acetonitrile / 0.1% TFA solution was placed in the column, set in a desktop centrifuge dedicated to a 200 μL chip, and centrifuged for 2 seconds to remove air in the column.
(D) To the 80% acetonitrile / 0.1% TFA solution in the column, 10 μg of the glycopeptide sample prepared in (2) above was added, set in a desktop centrifuge dedicated to a 200 μL chip, and centrifuged for 20 seconds.
To the column (E), 100 μL of 80% acetonitrile / 0.1% TFA solution was added, set in a desktop centrifuge dedicated to a 200 μL chip, and centrifuged for 20 seconds to remove impurities.
(F) The above (E) was repeated twice more.
To the column (G), 100 μL of 0.1% TFA was added, set in a desktop centrifuge dedicated to a 200 μL chip, and centrifuged for 30 seconds to concentrate the glycopeptide in the solid-phase extraction carrier phase.
(H) Add 100 μL of 80% acetonitrile / 0.1% TFA solution to the column, elute the glycopeptide in a 1.5 mL tube using a syringe with an adapter, dry with a centrifugal evaporator, and concentrate the sugar. A peptide was obtained.
［（４）脱糖鎖ペプチドの調製］
上記（３）で調製した濃縮糖ペプチド試料 ５μｇを、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４） １０μＬに溶解し、１ＵのＰＮＧａｓｅ Ｆ（ロシュ社製） １μＬ加え、３７℃にて１６時間インキュベートすることにより、Ｎ結合型糖鎖を切断した。次いで、Ｏａｓｉｓ ＰＲｉＭＥ ＨＬＢ固相抽出カラム（Ｗａｔｅｒｓ社製）にて脱塩した後、遠心エバポレーターで乾固し、脱糖鎖ペプチドを得た。[(4) Preparation of glycosylated chain peptide]
Dissolve 5 μg of the concentrated glycopeptide sample prepared in (3) above in 10 μL of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), add 1 μL of 1 U PNGase F (manufactured by Roche), and incubate at 37 ° C. for 16 hours. As a result, the N-linked sugar chain was cleaved. Then, after desalting with an Oasis PRiME HLB solid-phase extraction column (manufactured by Waters), it was dried to dryness with a centrifugal evaporator to obtain a sugar-free chain peptide.
［（５）ナノ液体クロマトグラフィー質量分析（ｎａｎｏＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）による解析］
上記（３）で調製した濃縮糖ペプチドを、０．１％ギ酸 ４μＬに２．５μｇ／μＬとなるようにそれぞれ溶解し、糖ペプチド試料とした。また、上記（４）で調製した脱糖鎖ペプチドを、０．１％ギ酸 ４μＬに１．２５μｇ／μＬとなるようにそれぞれ溶解し、脱糖鎖ペプチド試料とした。
上記糖ペプチド試料及び脱糖鎖ペプチド試料について、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析（ｎａｎｏＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）による解析（分離／分析）を行った。
具体的には、分析カラム（Ｎａｎｏ ＨＰＬＣ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｃｏｌｕｍｎ；日京テクノス社製）を装着したナノ液体クロマトグラフ（ＥＡＳＹ−ｎＬＣ １０００；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を、ハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計（Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に接続し、上記糖ペプチド試料 ４μＬを分析カラムにインジェクションした後、流速３００ｎＬ／ｍｉｎで該糖ペプチド試料の分離を行った。
尚、Ａ溶媒として、０．１％ギ酸水溶液、Ｂ溶媒として、０．１％ギ酸アセトニトリルを用い、０分〜７０分でＢ溶媒０％からＢ溶媒３５％のリニアグラジエント、７０分〜７５分でＢ溶媒３５％からＢ溶媒１００％のリニアグラジエントを用いた。また、全測定を通して、ポジティブイオンモード（印加電圧：１９００Ｖ）とした。
上記脱糖鎖ペプチドについては、上記と同様にしてそれぞれ分離した後、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて該脱糖鎖ペプチドにおける糖鎖結合部位を同定した。
更に、上記情報を基に、糖ペプチドの質量と保持時間より、糖ペプチドの構造を確認した。[(5) Analysis by nano liquid chromatography mass spectrometry (nanoLC / MS / MS)]
The concentrated glycopeptide prepared in (3) above was dissolved in 4 μL of 0.1% formic acid at 2.5 μg / μL, respectively, to prepare a glycopeptide sample. Further, the glycanide chain peptide prepared in (4) above was dissolved in 4 μL of 0.1% formic acid so as to be 1.25 μg / μL, respectively, to prepare a glycanide chain peptide sample.
The glycopeptide sample and the desglycan peptide sample were analyzed (separated / analyzed) by nanoliquid chromatography-mass spectrometry (nanoLC / MS / MS).
Specifically, a nano liquid chromatograph (EASY-nLC 1000; Thermo Fisher Scientific) equipped with an analysis column (Nano HPLC capillary sample; manufactured by Nikkyo Technos Co., Ltd.) was used as a hybrid quadrupole orbittrap mass spectrometer (Q). It was connected to Executive (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and 4 μL of the above glycopeptide sample was injected into an analysis column, and then the glycopeptide sample was separated at a flow velocity of 300 nL / min.
Using 0.1% formic acid aqueous solution as A solvent and 0.1% formic acid acetonitrile as B solvent, linear gradient from 0% to 35% of B solvent in 0 to 70 minutes, 70 minutes to 75 minutes. A linear gradient from 35% B solvent to 100% B solvent was used. In addition, the positive ion mode (applied voltage: 1900V) was set throughout all measurements.
The above-mentioned glycan peptide was separated in the same manner as above, and then the sugar chain binding site in the glycan peptide was identified using Proteome Discoverer 1.4 (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
Furthermore, based on the above information, the structure of the glycopeptide was confirmed from the mass and retention time of the glycopeptide.
［（６）結果］
上記（１）〜（５）により、下記表１に示す通り、ビトロネクチン、補体Ｃ４−Ａ、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテイン及びチロキシン結合グロブリンにそれぞれ由来する糖ペプチドＡ〜Ｌが同定された。
また、上記糖ペプチドＡ〜Ｌのピーク面積値について、健常者（１１検体）の平均値及び膵臓癌患者（１０検体）の平均値を図１〜７にそれぞれ示す。[(6) Result]
According to the above (1) to (5), as shown in Table 1 below, glycopeptide A derived from vitronectin, complement C4-A, interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3, leucine-
Regarding the peak area values of the glycopeptides A to L, the average value of healthy subjects (11 samples) and the average value of pancreatic cancer patients (10 samples) are shown in FIGS. 1 to 7, respectively.
上記表１及び図１より、ビトロネクチンに由来する、（ｉ）式１−１’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＡ（健常者平均ピーク面積値：７３９０７２３、膵臓癌患者平均ピーク面積値：１８５３１３５８）、（ｉｉ）式１−２’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＢ（健常者平均ピーク面積値：１４８６９１６７、膵臓癌患者平均ピーク面積値：３２７９５９４０）及び（ｉｉｉ）式１−３’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＣ（健常者平均ピーク面積値：３９３７７５９、膵臓癌患者平均ピーク面積値：８９１００１９）の発現量は、健常者と比べて、膵臓癌患者において顕著に増加していることが分かった。
また、上記式１−１’、式１−２’及び式１−３’で表される糖鎖は、ビトロネクチンのアミノ酸配列のＮ末端より１６９番目のアスパラギン残基にそれぞれ結合していることを確認した。From Table 1 and FIG. 1, glycopeptide A (healthy subject average peak area value: 7390723, pancreatic cancer patient average peak area value: 7390723, which is derived from vitronectin and has a sugar chain represented by (i) formula 1-1': 18531358), Glycopeptide B having a sugar chain represented by the formula 1-2'(healthy subject average peak area value: 14869167, pancreatic cancer patient average peak area value: 327959940) and (iii) formula 1-3 The expression level of glycopeptide C (average peak area value of healthy subjects: 3937759, average peak area value of pancreatic cancer patients: 8910019) having a sugar chain represented by'is significantly increased in pancreatic cancer patients as compared with healthy subjects. I found out that I was doing it.
In addition, the sugar chains represented by the above formulas 1-1', 1-2' and 1-3'are bound to the 169th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of vitronectin, respectively. confirmed.
上記表１及び図２より、ビトロネクチンに由来する、（ｉ）式２−１’又は式２−１’’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＤ（健常者平均ピーク面積値：４８６２６、膵臓癌患者平均ピーク面積値：６５７１１８並びに（ｉｉ）式２−２’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＥ（健常者平均ピーク面積値：０、膵臓癌患者平均ピーク面積値：６３４０８５）の発現量は、健常者と比べて、膵臓癌患者において顕著に増加していることが分かった。特に、（ｉｉ）式２−２’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＥについては、健常者では全く発現していないことが分かった。
また、上記式２−１’、式２−１’’及び式２−２’で表される糖鎖は、ビトロネクチンのアミノ酸配列のＮ末端より１６９番目のアスパラギン残基にそれぞれ結合していることを確認した。From Table 1 and FIG. 2 above, glycopeptide D (healthy subject average peak area value: 48626, pancreatic cancer) having a sugar chain represented by (i) formula 2-1'or formula 2-1'' derived from vitronectin. Expression of glycopeptide E (healthy subject average peak area value: 0, pancreatic cancer patient average peak area value: 634085) having a sugar chain represented by the cancer patient average peak area value: 657118 and (ii) formula 2-2'). It was found that the amount was significantly increased in patients with pancreatic cancer as compared with healthy subjects. In particular, the glycopeptide E having a sugar chain represented by the formula (ii) 2-2'was found to be significantly increased in healthy subjects. It turned out that it was not expressed at all.
In addition, the sugar chains represented by the above formulas 2-1', 2-1' and 2-2'are bound to the 169th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of vitronectin, respectively. It was confirmed.
上記表１及び図３より、ビトロネクチンに由来する、（ｉ）式３−１’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＦ（健常者平均ピーク面積値：４０４３３７３、膵臓癌患者平均ピーク面積値：１３０３８７２０）及び（ｉｉ）式３−２’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＧ（健常者平均ピーク面積値：０、膵臓癌患者平均ピーク面積値：６３４０８５）の発現量は、健常者と比べて、膵臓癌患者において顕著に増加していることが分かった。特に、（ｉｉ）式３−２’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＧについては、健常者では全く発現していないことが分かった。
また、上記式３−１’及び式３−２’で表される糖鎖は、ビトロネクチンのアミノ酸配列のＮ末端より１６９番目のアスパラギン残基にそれぞれ結合していることを確認した。From Tables 1 and 3 above, glycopeptide F derived from vitronectin and having a sugar chain represented by formula (i) 3-1'(average peak area value of healthy subjects: 40433373, average peak area value of pancreatic cancer patients: The expression levels of glycopeptide G (average peak area value of healthy subjects: 0, average peak area value of pancreatic cancer patients: 634085) having a sugar chain represented by 13038720) and (ii) formula 3-2'are higher than those of healthy subjects. In comparison, it was found to be significantly increased in patients with pancreatic cancer. In particular, it was found that the glycopeptide G having a sugar chain represented by the formula (ii) 3-2'was not expressed at all in healthy subjects.
Further, it was confirmed that the sugar chains represented by the above formulas 3-1'and 3-2' were bound to the 169th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of vitronectin, respectively.
上記表１及び図４より、補体Ｃ４−Ａに由来する、（ｉ）式４−１で表される糖鎖を有する糖ペプチドＨ（健常者平均ピーク面積値：３０７５２５７、膵臓癌患者平均ピーク面積値：２６７０３３６２）の発現量は、健常者と比べて、膵臓癌患者において顕著に増加していることが分かった。
また、上記式４−１で表される糖鎖は、補体Ｃ４−Ａのアミノ酸配列のＮ末端より１３２８番目のアスパラギン残基にそれぞれ結合していることを確認した。From Tables 1 and 4 above, glycopeptide H (healthy subject average peak area value: 3075257, pancreatic cancer patient average peak) derived from complement C4-A and having a sugar chain represented by formula (i) 4-1. It was found that the expression level of the area value: 267033362) was significantly increased in patients with pancreatic cancer as compared with healthy subjects.
Further, it was confirmed that the sugar chain represented by the above formula 4-1 was bound to the asparagine residue at position 1328 from the N-terminal of the amino acid sequence of complement C4-A.
上記表１及び図５より、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に由来する、（ｉ）式５−１’、式５−１’’、式５−２’又は式５−２’’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＩ（健常者平均ピーク面積値：６４４３４３、膵臓癌患者平均ピーク面積値：９８８６９９６）の発現量は、健常者と比べて、膵臓癌患者において顕著に増加していることが分かった。
また、上記式５−１’、式５−１’’、式５−２’及び式５−２’’で表される糖鎖は、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３のアミノ酸配列のＮ末端より５８０番目のアスパラギン残基にそれぞれ結合していることを確認した。From Table 1 and FIG. 5, it is represented by (i) formula 5-1', formula 5-1', formula 5-2'or formula 5-2', which is derived from the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3. The expression level of glycopeptide I (average peak area value of healthy subjects: 644343, average peak area value of pancreatic cancer patients: 9886996) having a sugar chain is significantly increased in pancreatic cancer patients as compared with healthy subjects. I found out.
The sugar chains represented by the above formulas 5-1', 5-1', 5-2'and 5-2' are from the N-terminal of the amino acid sequence of the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3. It was confirmed that each of them was bound to the 580th asparagine residue.
上記表１及び図６より、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに由来する、（ｉ）式６−１で表される糖鎖を有する糖ペプチドＪ（健常者平均ピーク面積値：６３９６９３、膵臓癌患者平均ピーク面積値：１７０７０３１６）の発現量は、健常者と比べて、膵臓癌患者において顕著に増加していることが分かった。
また、上記式６−１で表される糖鎖は、ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より１８６番目のアスパラギン残基に結合していることを確認した。From Table 1 and FIG. 6, the glycopeptide J having a sugar chain represented by the formula (i) 6-1 derived from leucine-
Further, it was confirmed that the sugar chain represented by the above formula 6-1 was bound to the asparagine residue at the 186th position from the N-terminal of the amino acid sequence of leucine-
上記表１及び図７より、チロキシン結合グロブリンに由来する、（ｉ）式３−１’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＫ（健常者平均ピーク面積値：２０９２３６９１、膵臓癌患者平均ピーク面積値：１２４８２５０７０）及び（ｉｉ）式３−２’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＬ（健常者平均ピーク面積値：０、膵臓癌患者平均ピーク面積値：４８０８１３４）の発現量は、健常者と比べて、膵臓癌患者において顕著に増加していることが分かった。特に、式３−２’で表される糖鎖を有する糖ペプチドＬについては、健常者では全く発現していないことが分かった。
また、上記式３−１’及び式３−２’で表される糖鎖は、チロキシン結合グロブリンのアミノ酸配列のＮ末端より３６番目のアスパラギン残基にそれぞれ結合していることを確認した。From Table 1 and FIG. 7, glycopeptide K (healthy subject average peak area value: 20923691, pancreatic cancer patient average peak area) derived from tyrosin-binding globulin and having a sugar chain represented by formula (i) 3-1'. Value: 12482070) and (ii) The expression level of glycopeptide L (average peak area value of healthy subjects: 0, average peak area value of pancreatic cancer patients: 4808134) having a sugar chain represented by the formula 3-2'is healthy. It was found that there was a marked increase in patients with pancreatic cancer compared to those in the above. In particular, it was found that the glycopeptide L having a sugar chain represented by the formula 3-2'was not expressed at all in healthy subjects.
Further, it was confirmed that the sugar chains represented by the above formulas 3-1'and 3-2' were bound to the 36th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of the thyroxine-binding globulin, respectively.
更に、上記糖ペプチドＡ〜Ｌの発現量について、ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線解析によりＡＵＣ値（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ：曲線面積値）を算出した。
その結果を下記表２に示す。尚、ＡＵＣ値については、０．７５以上が好ましく、０．８０以上となれば極めて高い判定能があると考える。Further, for the expression levels of the glycopeptides A to L, an AUC value (Area Under the Curve: curve area value) was calculated by ROC (Receiver Operating Characteristic) curve analysis.
The results are shown in Table 2 below. The AUC value is preferably 0.75 or more, and if it is 0.80 or more, it is considered that the determination ability is extremely high.
上記表２より、上記糖ペプチドＡ〜Ｌは、何れも良好なＡＵＣ値を示した。 From Table 2 above, the glycopeptides A to L all showed good AUC values.
以上のことより、上記糖ペプチドＡ〜Ｌをマーカーとして用いることにより、検体（サンプル）が膵臓癌であるか否かが判定可能であることが分かった。 From the above, it was found that by using the above glycopeptides A to L as markers, it is possible to determine whether or not the sample is pancreatic cancer.
本発明の膵臓癌の判定用マーカー及びこれを用いた膵臓癌の判定方法、並びに膵臓癌の判定を行うためのデータを得る方法によれば、確度（正確度・精度）の高い、膵臓癌の判定（診断、検査）を行うことができる。 According to the marker for determining pancreatic cancer of the present invention, the method for determining pancreatic cancer using the same, and the method for obtaining data for determining pancreatic cancer, pancreatic cancer with high accuracy (accuracy / accuracy) can be obtained. Judgment (diagnosis, inspection) can be made.
Claims (11)
（１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、下記式５で表される糖鎖、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、下記式６で表される糖鎖、
（３）ビトロネクチンに存在する、下記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４）補体Ｃ４−Ａに存在する、下記式４で表される糖鎖、
（５）チロキシン結合グロブリンに存在する、下記式３で表される糖鎖。
(1) Interalpha trypsin inhibitor A sugar chain represented by the following formula 5 existing in the heavy chain H3.
(2) A sugar chain represented by the following formula 6 present in leucine-rich alpha 2 glycoprotein.
(3) At least one sugar chain represented by the following formulas 1 to 3 present in vitronectin.
(4) A sugar chain represented by the following formula 4 existing in complement C4-A.
(5) A sugar chain represented by the following formula 3 present in thyroxine-binding globulin.
（１−１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３のアミノ酸配列のＮ末端より５８０番目のアスパラギン残基に結合している前記式５で表される糖鎖、
（２−１）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より１８６番目のアスパラギン残基に結合している前記式６で表される糖鎖、
（３−１）ビトロネクチンのアミノ酸配列のＮ末端より１６９番目のアスパラギン残基に結合している前記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４−１）補体Ｃ４−Ａのアミノ酸配列のＮ末端より１３２８番目のアスパラギン残基に結合している前記式４で表される糖鎖、
（５−１）チロキシン結合グロブリンのアミノ酸配列のＮ末端より３６番目のアスパラギン残基に結合している前記式３で表される糖鎖。The marker according to claim 1, wherein the sugar chain is a sugar chain represented by any one of the following (1-1) to (5-1):
(1-1) The sugar chain represented by the above formula 5 which is bound to the 580th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3.
(2-1) A sugar chain represented by the above formula 6, which is bound to the 186th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of leucine-rich alpha 2 glycoprotein.
(3-1) At least one sugar chain represented by the above formulas 1 to 3 which is bound to the asparagine residue at position 169 from the N-terminal of the amino acid sequence of vitronectin.
(4-1) A sugar chain represented by the above formula 4 which is bound to the asparagine residue at position 1328 from the N-terminal of the amino acid sequence of complement C4-A.
(5-1) A sugar chain represented by the above formula 3 which is bound to the 36th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of thyroxine-binding globulin.
（１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、下記式５で表される糖鎖、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、下記式６で表される糖鎖、
（３）ビトロネクチンに存在する、下記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４）補体Ｃ４−Ａに存在する、下記式４で表される糖鎖、
（５）チロキシン結合グロブリンに存在する、下記式３で表される糖鎖。
(1) Interalpha trypsin inhibitor A sugar chain represented by the following formula 5 existing in the heavy chain H3.
(2) A sugar chain represented by the following formula 6 present in leucine-rich alpha 2 glycoprotein.
(3) At least one sugar chain represented by the following formulas 1 to 3 present in vitronectin.
(4) A sugar chain represented by the following formula 4 existing in complement C4-A.
(5) A sugar chain represented by the following formula 3 present in thyroxine-binding globulin.
（１−１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３のアミノ酸配列のＮ末端より５８０番目のアスパラギン残基に結合している前記式５で表される糖鎖、
（２−１）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインのアミノ酸配列のＮ末端より１８６番目のアスパラギン残基に結合している前記式６で表される糖鎖、
（３−１）ビトロネクチンのアミノ酸配列のＮ末端より１６９番目のアスパラギン残基に結合している前記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４−１）補体Ｃ４−Ａのアミノ酸配列のＮ末端より１３２８番目のアスパラギン残基に結合している前記式４で表される糖鎖、
（５−１）チロキシン結合グロブリンのアミノ酸配列のＮ末端より３６番目のアスパラギン残基に結合している前記式３で表される糖鎖。The determination method according to claim 5, wherein the sugar chain is a sugar chain represented by any one of the following (1-1) to (5-1).
(1-1) The sugar chain represented by the above formula 5 which is bound to the 580th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of the interalpha trypsin inhibitor heavy chain H3.
(2-1) A sugar chain represented by the above formula 6, which is bound to the 186th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of leucine-rich alpha 2 glycoprotein.
(3-1) At least one sugar chain represented by the above formulas 1 to 3 which is bound to the asparagine residue at position 169 from the N-terminal of the amino acid sequence of vitronectin.
(4-1) A sugar chain represented by the above formula 4 which is bound to the asparagine residue at position 1328 from the N-terminal of the amino acid sequence of complement C4-A.
(5-1) A sugar chain represented by the above formula 3 which is bound to the 36th asparagine residue from the N-terminal of the amino acid sequence of thyroxine-binding globulin.
（１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、下記式５で表される糖鎖、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、下記式６で表される糖鎖、
（３）ビトロネクチンに存在する、下記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４）補体Ｃ４−Ａに存在する、下記式４で表される糖鎖、
（５）チロキシン結合グロブリンに存在する、下記式３で表される糖鎖。
(1) Interalpha trypsin inhibitor A sugar chain represented by the following formula 5 existing in the heavy chain H3.
(2) A sugar chain represented by the following formula 6 present in leucine-rich alpha 2 glycoprotein.
(3) At least one sugar chain represented by the following formulas 1 to 3 present in vitronectin.
(4) A sugar chain represented by the following formula 4 existing in complement C4-A.
(5) A sugar chain represented by the following formula 3 present in thyroxine-binding globulin.
（１）インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ３に存在する、下記式５で表される糖鎖、
（２）ロイシンリッチアルファ２グリコプロテインに存在する、下記式６で表される糖鎖、
（３）ビトロネクチンに存在する、下記式１〜３で表される少なくとも１つの糖鎖、
（４）補体Ｃ４−Ａに存在する、下記式４で表される糖鎖、
（５）チロキシン結合グロブリンに存在する、下記式３で表される糖鎖。
(1) Interalpha trypsin inhibitor A sugar chain represented by the following formula 5 existing in the heavy chain H3.
(2) A sugar chain represented by the following formula 6 present in leucine-rich alpha 2 glycoprotein.
(3) At least one sugar chain represented by the following formulas 1 to 3 present in vitronectin.
(4) A sugar chain represented by the following formula 4 existing in complement C4-A.
(5) A sugar chain represented by the following formula 3 present in thyroxine-binding globulin.
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