JPWO2019236726A5 - - Google Patents

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本開示は以下の実施形態を含む。
実施形態１
核酸ライブラリを生成する方法であって、
一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成することと、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ、
第１のアダプターオリゴヌクレオチド、ならびに
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチド
を組み合わせることと、
を含み、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体を形成し、これにより、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記末端領域の末端に隣接する、方法。
実施形態２
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドおよびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記隣接する末端を共有結合させることをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態３
前記接触、組み合わせること、および共有結合のステップの合計持続時間が、３時間以下である、実施形態２に記載の方法。
実施形態４
前記複合体が、前記ＳＳＢと接触された前記ｓｓＮＡの８０％以上から形成される、実施形態１～３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態５
前記ｓｓＮＡが、分解された核酸試料からのものである、実施形態１～４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６
前記ｓｓＮＡが、古代核酸試料からのものである、実施形態５に記載の方法。
実施形態７
前記ｓｓＮＡが、法医学核酸試料からのものである、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態９
前記ｓｓＤＮＡは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来するものである、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０
前記ｓｓＤＮＡをＳＳＢと接触させる前に、前記ｄｓＤＮＡを変性させることによって前記ｓｓＤＮＡを生成することをさらに含む、実施形態９に記載の方法。
実施形態１１
前記複合体の形成後、前記ｓｓＤＮＡを再ハイブリダイズさせて、ｄｓＤＮＡを生成することをさらに含む、実施形態９または実施形態１０に記載の方法。
実施形態１２
前記生成されたｄｓＤＮＡを配列決定することをさらに含む、実施形態１１に記載の方法。
実施形態１３
前記生成されたｄｓＤＮＡのサブサンプルが配列決定される、実施形態１２に記載の方法。
実施形態１４
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１５
前記組み合わせることが、
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと
を組み合わせることを含む、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１６
前記組み合わせることが、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドと
を組み合わせることを含む、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１７
前記組み合わせることが、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、
第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
を組み合わせることをさらに含み、
前記形成された複合体が、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡのうち前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記末端領域とは反対側の末端領域に、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してハイブリダイズされた前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドと、前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドをさらに含み、これにより、前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡのうち前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドに隣接する前記末端とは反対側の末端に隣接する、実施形態１～１６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１８
前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドおよびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記隣接する末端を共有結合させることをさらに含む、実施形態１７に記載の方法。
実施形態１９
前記共有結合させることが、前記隣接する末端をライゲーションすることを含む、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２０
前記ライゲーションが、酵素ライゲーションによって行われる、実施形態１９に記載の方法。
実施形態２１
アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端が、ブロッキング修飾を含む、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２２
前記ブロッキング修飾が、ライゲーションをブロックする修飾である、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端における３’ＯＨの不在、および、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨからなる群から選択される、実施形態２１または実施形態２２に記載の方法。
実施形態２４
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨであり、前記ブロッキング修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、および３’ホスフェートからなる群から選択される、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２５
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、実施形態１～２４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２６
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ユニバーサル塩基を含む、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２７
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の長さが、１０ヌクレオチド以下である、実施形態１～２６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２８
前記アダプターオリゴヌクレオチドが、ＰＣＲ増幅のためのアダプターまたはその相補体を含む、実施形態１～２７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態２９
前記アダプターオリゴヌクレオチドが、部分的もしくは完全な配列決定アダプターまたはその相補体を含む、実施形態１～２８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３０
前記ｓｓＮＡまたはその誘導体の少なくとも一部分を配列決定することをさらに含む、実施形態１～２９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態３１
一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）と、
第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチドと
を含む、組成物。
実施形態３２
第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
をさらに含む、実施形態３１に記載の組成物。
実施形態３３
前記ｓｓＮＡが、分解された核酸試料からのものである、実施形態３１または実施形態３２に記載の組成物。
実施形態３４
前記ｓｓＮＡが、古代核酸試料からのものである、実施形態３３に記載の組成物。
実施形態３５
前記ｓｓＮＡが、法医学核酸試料からのものである、実施形態３１～３３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３６
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である、実施形態３１～３５のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３７
前記ｓｓＤＮＡが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来するものである、実施形態３６に記載の組成物。
実施形態３８
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である、実施形態３１～３５のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３９
アダプターオリゴヌクレオチド末端を、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端に共有結合させるための試薬をさらに含む、実施形態３１～３８のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態４０
前記試薬が、リガーゼである、実施形態３９に記載の組成物。
実施形態４１
一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と、
第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、
前記ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、および第１のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するための指示と
を含む、キット。
実施形態４２
第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
をさらに含み、
前記指示が、前記ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、第１のスプリントオリゴヌクレオチド、第２のアダプターオリゴヌクレオチド、および第２のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するためのものである、実施形態４１に記載のキット。
実施形態４３
前記ＳＳＢが、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質である、実施形態４１または４２に記載のキット。
実施形態４４
前記ＳＳＢが、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質である、実施形態４１または４２に記載のキット。
実施形態４５
アダプターオリゴヌクレオチドの末端を、一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）の末端に連結するための試薬をさらに含む、実施形態４１～４４のいずれか一項に記載のキット。
実施形態４６
前記試薬が、リガーゼである、実施形態４５に記載のキット。
実施形態４７
アダプターオリゴヌクレオチドの末端が、ブロッキング修飾を含む、実施形態４１～４６のいずれか一項に記載のキット。
実施形態４８
前記ブロッキング修飾が、ライゲーションをブロックする修飾である、実施形態４７に記載のキット。
実施形態４９
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端における３’ＯＨの不在、および、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨからなる群から選択される、実施形態４７または実施形態４８に記載のキット。
実施形態５０
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨであり、前記ブロッキング修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、および３’ホスフェートからなる群から選択される、実施形態４７または実施形態４８に記載のキット。
実施形態５１
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、実施形態４１～５０に記載のキット。
実施形態５２
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ユニバーサル塩基を含む、実施形態４１～５１に記載のキット。
実施形態５３
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の長さが、１０ヌクレオチド以下である、実施形態４１～５２に記載のキット。
以下の実施例は例示のために提供され、限定するものではない。
 The disclosure includes the following embodiments:
Embodiment 1
A method of generating a nucleic acid library
Contacting a single-stranded nucleic acid (ssNA) with a single-stranded nucleic acid-binding protein (SSB) to generate SSB-bound ssNA,
The SSB-bound ssNA,
First adapter oligonucleotide, as well
A first sprint oligonucleotide containing an SSB-bound ssNA hybridization region and a first adapter oligonucleotide hybridization region.
And to combine
Including
The first sprint oligonucleotide hybridized to the terminal region of the SSB-bound ssNA via the SSB-bound ssNA hybridization region and the first adapter oligonucleotide via the first adapter oligonucleotide hybridization region. A method of forming a complex comprising the first sprint oligonucleotide hybridized to a nucleotide, whereby the end of the first adapter oligonucleotide is flanked by the end of the terminal region of the SSB-bound ssNA.
Embodiment 2
The method according to embodiment 1, further comprising covalently attaching the first adapter oligonucleotide and the adjacent end of the SSB-bound ssNA.
Embodiment 3
The method of embodiment 2, wherein the total duration of the contact, combination, and covalent steps is 3 hours or less.
Embodiment 4
The method according to any one of embodiments 1 to 3, wherein the complex is formed from 80% or more of the ssNA in contact with the SSB.
Embodiment 5
The method according to any one of embodiments 1 to 4, wherein the ssNA is from a degraded nucleic acid sample.
Embodiment 6
The method of embodiment 5, wherein the ssNA is from an ancient nucleic acid sample.
Embodiment 7
The method according to any one of embodiments 1 to 6, wherein the ssNA is from a forensic nucleic acid sample.
8th embodiment
The method according to any one of embodiments 1 to 7, wherein the ssNA is a single-stranded DNA (ssDNA).
Embodiment 9
The method according to embodiment 8, wherein the ssDNA is derived from double-stranded DNA (dsDNA).
Embodiment 10
9. The method of embodiment 9, further comprising producing the ssDNA by denaturing the dsDNA prior to contacting the ssDNA with the SSB.
Embodiment 11
The method according to embodiment 9 or 10, further comprising rehybridizing the ssDNA after formation of the complex to produce dsDNA.
Embodiment 12
11. The method of embodiment 11, further comprising sequencing the generated dsDNA.
Embodiment 13
12. The method of embodiment 12, wherein the generated dsDNA subsamples are sequenced.
Embodiment 14
The method according to any one of embodiments 1 to 6, wherein the ssNA is a single-strand RNA (ssRNA).
Embodiment 15
The combination mentioned above
A complex comprising the first sprint oligonucleotide hybridized to the first adapter oligonucleotide via the first adapter oligonucleotide hybridization region.
With the SSB-bound ssNA
The method according to any one of embodiments 1 to 14, comprising combining the above.
Embodiment 16
The combination mentioned above
A complex comprising the first sprint oligonucleotide hybridized to the SSB-bound ssNA via the SSB-bound ssNA hybridization region.
With the first adapter oligonucleotide
The method according to any one of embodiments 1 to 14, comprising combining the above.
Embodiment 17
The combination mentioned above
With the SSB-bound ssNA,
With the second adapter oligonucleotide,
With a second sprint oligonucleotide, including an SSB-bound ssNA hybridization region and a second adapter oligonucleotide hybridization region.
Including further combining
The formed complex hybridizes to the terminal region of the SSB-bound ssNA opposite to the terminal region hybridized to the first sprint oligonucleotide via the SSB-bound ssNA hybridization region. It further comprises the second sprint oligonucleotide that has been hybridized to the second adapter oligonucleotide via the second adapter oligonucleotide hybridization region, thereby further comprising the second sprint oligonucleotide. In any one of Embodiments 1 to 16, the end of the second adapter oligonucleotide is adjacent to the end of the SSB-bound ssNA adjacent to the first adapter oligonucleotide on the opposite side of the terminal. The method described.
Embodiment 18
17. The method of embodiment 17, further comprising covalently attaching the second adapter oligonucleotide and the adjacent terminal of the SSB-bound ssNA.
Embodiment 19
13. The method of any one of embodiments 1-18, wherein the covalent bond comprises ligating the adjacent ends.
20th embodiment
19. The method of embodiment 19, wherein the ligation is performed by enzyme ligation.
21st embodiment
The method according to any one of embodiments 1 to 20, wherein the terminal of the adapter oligonucleotide on the side not adjacent to the SSB-bound ssNA comprises a blocking modification.
Embodiment 22
21. The method of embodiment 21, wherein the blocking modification is a modification that blocks ligation.
23rd Embodiment
The blocking modification is the absence of 3'OH at the end of the adapter oligonucleotide not adjacent to the SSB-bound ssNA, and inaccessible at the end of the adapter oligonucleotide not adjacent to the SSB-bound ssNA. 21. The method of embodiment 22, which is selected from the group consisting of 3'OH.
Embodiment 24
The blocking modification is an inaccessible 3'OH at the end of the adapter oligonucleotide not adjacent to the SSB-binding ssNA, and the blocking modification is an amino modifier, spacer, dideoxy base, inverted dideoxy base, 23. The method of embodiment 23, selected from the group consisting of and 3'phosphates.
25th embodiment
The method according to any one of embodiments 1 to 24, wherein the SSB-bound ssNA hybridization region comprises a random sequence.
Embodiment 26
The method according to any one of embodiments 1 to 25, wherein the SSB-bound ssNA hybridization region comprises a universal base.
Embodiment 27
The method according to any one of embodiments 1 to 26, wherein the length of the SSB-bound ssNA hybridization region is 10 nucleotides or less.
Embodiment 28
The method according to any one of embodiments 1-27, wherein the adapter oligonucleotide comprises an adapter for PCR amplification or a complement thereof.
Embodiment 29
The method according to any one of embodiments 1-28, wherein the adapter oligonucleotide comprises a partial or complete sequencing adapter or a complement thereof.
30th embodiment
The method of any one of embodiments 1-29, further comprising sequencing at least a portion of the ssNA or derivative thereof.
Embodiment 31
Single-stranded nucleic acid bound to a single-stranded nucleic acid-binding protein (SSB-bound ssNA) and
The first adapter oligonucleotide,
With a first sprint oligonucleotide containing an SSB-bound ssNA hybridization region and a first adapter oligonucleotide hybridization region
A composition comprising.
Embodiment 32
With the second adapter oligonucleotide,
With a second sprint oligonucleotide, including an SSB-bound ssNA hybridization region and a second adapter oligonucleotide hybridization region.
31. The composition according to embodiment 31.
Embodiment 33
The composition according to embodiment 31 or 32, wherein the ssNA is from a degraded nucleic acid sample.
Embodiment 34
33. The composition of embodiment 33, wherein the ssNA is from an ancient nucleic acid sample.
Embodiment 35
The composition according to any one of embodiments 31 to 33, wherein the ssNA is from a forensic nucleic acid sample.
Embodiment 36
The composition according to any one of embodiments 31 to 35, wherein the ssNA is a single-stranded DNA (ssDNA).
Embodiment 37
The composition according to embodiment 36, wherein the ssDNA is derived from double-stranded DNA (dsDNA).
Embodiment 38
The composition according to any one of embodiments 31 to 35, wherein the ssNA is a single-strand RNA (ssRNA).
Embodiment 39
The composition according to any one of embodiments 31 to 38, further comprising a reagent for covalently attaching the adapter oligonucleotide terminal to the terminal of the SSB-bonded ssNA.
Embodiment 40
The composition according to embodiment 39, wherein the reagent is ligase.
Embodiment 41
Single-stranded nucleic acid binding protein (SSB) and
The first adapter oligonucleotide,
A first sprint oligonucleotide comprising an SSB-bound ssNA hybridization region and a first adapter oligonucleotide hybridization region,
With instructions for generating a nucleic acid library using the SSB, the first adapter oligonucleotide, and the first sprint oligonucleotide.
Including, kit.
42nd embodiment
With the second adapter oligonucleotide,
With a second sprint oligonucleotide, including an SSB-bound ssNA hybridization region and a second adapter oligonucleotide hybridization region.
Including
The instructions are for using the SSB, a first adapter oligonucleotide, a first sprint oligonucleotide, a second adapter oligonucleotide, and a second sprint oligonucleotide to generate a nucleic acid library. The kit according to embodiment 41.
Embodiment 43
The kit according to embodiment 41 or 42, wherein the SSB is a single-stranded DNA binding protein.
Embodiment 44
The kit according to embodiment 41 or 42, wherein the SSB is a single-stranded RNA-binding protein.
Embodiment 45
13. kit.
Embodiment 46
The kit according to embodiment 45, wherein the reagent is ligase.
Embodiment 47
The kit according to any one of embodiments 41 to 46, wherein the end of the adapter oligonucleotide comprises a blocking modification.
Embodiment 48
The kit according to embodiment 47, wherein the blocking modification is a modification that blocks ligation.
Embodiment 49
The blocking modification is the absence of 3'OH at the end of the adapter oligonucleotide not adjacent to the SSB-bound ssNA, and inaccessible at the end of the adapter oligonucleotide not adjacent to the SSB-bound ssNA. The kit according to embodiment 47 or 48, which is selected from the group consisting of 3'OH.
Embodiment 50
The blocking modification is an inaccessible 3'OH at the end of the adapter oligonucleotide not adjacent to the SSB-binding ssNA, and the blocking modification is an amino modifier, spacer, dideoxy base, inverted dideoxy base, The kit according to embodiment 47 or 48, selected from the group consisting of and 3'phosphates.
Embodiment 51
The kit according to embodiments 41-50, wherein the SSB-bound ssNA hybridization region comprises a random sequence.
52nd embodiment
The kit according to embodiments 41-51, wherein the SSB-bound ssNA hybridization region comprises a universal base.
Embodiment 53
The kit according to embodiments 41-52, wherein the SSB-bound ssNA hybridization region has a length of 10 nucleotides or less.
The following examples are provided for illustration purposes only and are not limiting.

Claims (17)

核酸ライブラリを生成する方法であって、
一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成することと、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ、
第１のアダプターオリゴヌクレオチド、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチド
第２のアダプターオリゴヌクレオチド、ならびに
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチド
を組み合わせることと、
を含んで、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡのうち前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記末端領域とは反対側の末端領域に、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してハイブリダイズされた前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドと、前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
を含む複合体を形成し、これにより、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記末端領域の末端に隣接し、前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡのうち前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドに隣接する前記末端とは反対側の末端に隣接する、
方法。 A method of generating a nucleic acid library
Contacting a single-stranded nucleic acid (ssNA) with a single-stranded nucleic acid-binding protein (SSB) to generate SSB-bound ssNA,
The SSB-bound ssNA,
First adapter oligonucleotide,
A first sprint oligonucleotide containing an SSB-bound ssNA hybridization region and a first adapter oligonucleotide hybridization region.
Second adapter oligonucleotide, as well
A second sprint oligonucleotide containing an SSB-bound ssNA hybridization region and a second adapter oligonucleotide hybridization region.
And to combine
Including
The first sprint oligonucleotide hybridized to the terminal region of the SSB-bound ssNA via the SSB-bound ssNA hybridization region and the first adapter oligonucleotide via the first adapter oligonucleotide hybridization region. The first sprint oligonucleotide hybridized to the nucleotide and
The second sprint oligo hybridized to the terminal region of the SSB-bound ssNA opposite to the terminal region hybridized to the first sprint oligonucleotide via the SSB-bound ssNA hybridization region. The nucleotide and the second sprint oligonucleotide hybridized to the second adapter oligonucleotide via the second adapter oligonucleotide hybridization region.
The terminal of the first adapter oligonucleotide is adjacent to the end of the terminal region of the SSB-bound ssNA, and the end of the second adapter oligonucleotide is adjacent to the end of the SSB-bound ssNA. Adjacent to the end opposite to the end adjacent to the first adapter oligonucleotide.
Method. 前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドおよびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記隣接する末端を共有結合させること、および前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドおよびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記隣接する末端を共有結合させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。 A claim further comprising covalently binding the adjacent ends of the first adapter oligonucleotide and the SSB-bound ssNA, and covalently binding the adjacent ends of the second adapter oligonucleotide and the SSB-bound ssNA. The method according to 1. 前記接触、組み合わせること、および共有結合のステップの合計持続時間が、３時間以下である、請求項２に記載の方法。 The method of claim 2, wherein the total duration of the contact, combination, and covalent steps is 3 hours or less. 前記ｓｓＮＡが、分解された核酸試料および／または法医学核酸試料からのものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3 , wherein the ssNA is from a degraded nucleic acid sample and / or a forensic nucleic acid sample . 前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であり、前記ｓｓＤＮＡは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来するものであり、前記方法は、前記ｓｓＤＮＡをＳＳＢと接触させる前に、前記ｄｓＤＮＡを変性させることによって前記ｓｓＤＮＡを生成することをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。 The ssNA is a single-stranded DNA (ssDNA), the ssDNA is derived from a double-stranded DNA (dsDNA), and the method denatures the dsDNA before contacting the ssDNA with the SSB. The method according to any one of claims 1 to 4 , further comprising producing the ssDNA by causing the ssDNA to be generated . 前記組み合わせることが、
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと
を組み合わせることを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。 The combination mentioned above
A complex comprising the first sprint oligonucleotide hybridized to the first adapter oligonucleotide via the first adapter oligonucleotide hybridization region.
A complex comprising the second sprint oligonucleotide hybridized to the second adapter oligonucleotide via the second adapter oligonucleotide hybridization region.
The method according to any one of claims 1 to 5 , comprising combining with the SSB-bound ssNA. 前記組み合わせることが、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡにハイブリダイズされた前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドと
前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドと
を組み合わせることを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。 The combination mentioned above
A complex comprising the first sprint oligonucleotide hybridized to the SSB-bound ssNA via the SSB-bound ssNA hybridization region.
A complex comprising the second sprint oligonucleotide hybridized to the SSB-bound ssNA via the SSB-bound ssNA hybridization region.
With the first adapter oligonucleotide
With the second adapter oligonucleotide
The method according to any one of claims 1 to 5 , which comprises combining the above. 前記共有結合させることが、前記隣接する末端をライゲーションすることを含む、請求項２～７のいずれか一項に記載の方法。 The method of any one of claims 2-7 , wherein the covalent bond comprises ligating the adjacent ends. 前記ライゲーションが、酵素ライゲーションによって行われる、請求項８に記載の方法。 The method of claim 8 , wherein the ligation is performed by enzyme ligation. アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端が、ブロッキング修飾を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 9 , wherein the terminal of the adapter oligonucleotide on the side not adjacent to the SSB-bound ssNA comprises a blocking modification. 前記ブロッキング修飾が、ライゲーションをブロックする修飾である、請求項１０に記載の方法。 The method of claim 10 , wherein the blocking modification is a modification that blocks ligation. 前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端における３’ＯＨの不在、および、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨからなる群から選択される、請求項１０または請求項１１に記載の方法。 The blocking modification is the absence of 3'OH at the end of the adapter oligonucleotide not adjacent to the SSB-bound ssNA, and inaccessible at the end of the adapter oligonucleotide not adjacent to the SSB-bound ssNA. The method according to claim 10 or 11 , which is selected from the group consisting of 3'OH. 前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨであり、前記ブロッキング修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、および３’ホスフェートからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。 The blocking modification is an inaccessible 3'OH at the end of the adapter oligonucleotide not adjacent to the SSB-binding ssNA, and the blocking modification is an amino modifier, spacer, dideoxy base, inverted dideoxy base, 12. The method of claim 12 , selected from the group consisting of 3'phosphates and 3'phosphates. 前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 13 , wherein the SSB-bound ssNA hybridization region comprises a random sequence. 前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ユニバーサル塩基を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 14 , wherein the SSB-bound ssNA hybridization region comprises a universal base. 前記アダプターオリゴヌクレオチドが、
ＰＣＲ増幅のためのアダプターまたはその相補体を含み、および／または
部分的もしくは完全な配列決定アダプターまたはその相補体を含む、
請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。 The adapter oligonucleotide is
Includes adapter or complement thereof for PCR amplification and / or
Includes a partial or complete sequencing adapter or its complement,
The method according to any one of claims 1 to 15 . 前記ｓｓＮＡまたはその誘導体の少なくとも一部分を配列決定することをさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。 The method of any one of claims 1-16 , further comprising sequencing at least a portion of the ssNA or derivative thereof .
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