JPWO2019193703A1 - 酸解離平衡推定方法、酸解離平衡推定装置、酸解離平衡推定システム、およびユーザインタフェース装置 - Google Patents

Abstract

酸解離平衡推定方法は、培地に含まれるｐＨ指示薬の酸解離平衡状態を推定する酸解離平衡推定方法であって、ｐＨ指示薬が、培地中の水素イオン濃度に応じて酸型と塩基型との間で変化し、酸型のｐＨ指示薬および塩基型のｐＨ指示薬が相互に異なる光学スペクトルを有し、測定波長における培地の酸解離光学指標を取得し、酸解離光学指標がｐＨ指示薬の光学スペクトルの強度と相関する、工程（Ｓ１）と、酸解離光学指標に基づいて、培地中の酸型のｐＨ指示薬の濃度および塩基型のｐＨ指示薬の濃度を算出する工程（Ｓ２）とを含む。

Description

本発明は、酸解離平衡推定方法、酸解離平衡推定装置、酸解離平衡推定システム、およびユーザインタフェース装置に関するものである。

細胞培養用の培地には、フェノールレッド等のｐＨ指示薬が含まれていることが多い。ｐＨ指示薬は、培地のｐＨに応じた色を呈する。作業者は、培地の色から培地のｐＨを知り、ｐＨに基づいて細胞の増殖状態またはコンタミネーション等を予測することができる。

培地は、ｐＨ指示薬の他に、有色の成分、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含んでいることが多く、培地の色は、ｐＨ指示薬の色とＦＢＳの色との混合色となる。また、培地に含まれるＦＢＳの濃度は、細胞の種類および培養目的等に応じて異なる。そのため、目視による培地の色に基づいて、培地のｐＨを正確に判断することが難しい。そこで、培地の吸光度に基づいて培地のｐＨを算出する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）

特許文献１では、４つの波長において培地の吸光度を測定し、測定された吸光度を用いて４元連立方程式を解くことによって、培地のｐＨを算出している。
具体的には、培地の吸光度は、フェノールレッドの吸光度、ＦＢＳの吸光度およびオフセットの和である。すなわち、培地の吸光度は、フェノールレッドの濃度、ＦＢＳの濃度およびオフセットを未知数とする３元１次方程式として表される。ここで、ｐＨ７．０〜８．０において、フェノールレッドの吸光係数とｐＨとの関係は線形になる。特許文献１では、このフェノールレッドの吸光係数とｐＨとの線形関係を用いて、上記の３元１次方程式を、さらにｐＨを未知数とする４元１次方程式に変形している。

特開２０１２−２１５４２８号公報

しかしながら、特許文献１の方法の場合、正確な推定が可能なｐＨの範囲が、フェノールレッドの吸光係数とｐＨとの関係が線形になるｐＨ７．０〜８．０のみに限定されるという不都合がある。
特許文献１には、上記方法の他に、所定の４つの波長における吸光度を用いて、より広い範囲のｐＨを予測する方法が記載されている。ただし、この方法の場合、吸光度の測定波長が限定されるという不都合がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、測定波長が制限されず、かつ、培地のｐＨを広範囲にわたって正確に推定することができる酸解離平衡推定方法、酸解離平衡推定装置、酸解離平衡推定システム、およびユーザインタフェース装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、細胞培養用の液状の培地に含まれるｐＨ指示薬の酸解離平衡状態を推定する酸解離平衡推定方法であって、前記ｐＨ指示薬が、前記培地中の水素イオン濃度に応じて酸型と塩基型との間で変化し、前記酸型のｐＨ指示薬と前記塩基型のｐＨ指示薬との間で酸解離平衡が成立し、前記酸型のｐＨ指示薬および前記塩基型のｐＨ指示薬が相互に異なる光学スペクトルを有し、測定波長における前記培地の酸解離光学指標を取得し、該酸解離光学指標が前記ｐＨ指示薬の光学スペクトルの強度と相関する、工程と、取得された前記酸解離光学指標に基づいて、前記培地中の前記酸型のｐＨ指示薬の濃度および前記塩基型のｐＨ指示薬の濃度を算出する工程とを含む酸解離平衡推定方法である。

培地中のｐＨ指示薬の酸解離平衡状態は、培地中の水素イオン濃度（すなわち、ｐＨ）に応じて変化する。すなわち、培地が酸性に傾くにつれて、酸型のｐＨ指示薬の濃度が増加し、塩基型のｐＨ指示薬の濃度が減少する。また、培地が塩基性に傾くにつれて、酸型のｐＨ指示薬の濃度が減少し、塩基型のｐＨ指示薬の濃度が増加する。酸型のｐＨ指示薬の光学スペクトルと塩基型のｐＨ指示薬の光学スペクトルは相互に異なる。したがって、培地の酸解離光学指標に基づいて培地中の酸型のｐＨ指示薬および塩基型のｐＨ指示薬の各々の濃度を算出し、酸型および塩基型のｐＨ指示薬の濃度に基づいて培地の酸解離平衡状態を推定することができる。

上記態様においては、前記培地の酸解離光学指標を取得する工程において、単一の測定波長における前記酸解離光学指標を取得し、前記濃度を算出する工程において、前記酸解離光学指標に基づいて、前記酸型のｐＨ指示薬および前記塩基型のｐＨ指示薬の一方の濃度を算出し、前記培地に含まれる前記ｐＨ指示薬の全濃度から前記一方の濃度を減算することによって前記酸型のｐＨ指示薬および前記塩基型のｐＨ指示薬の他方の濃度を算出してもよい。
この構成によって、１つのみの酸解離光学指標から培地の酸解離平衡状態を推定することができる。

上記態様においては、前記酸解離光学指標を取得する工程において、第１測定波長における酸解離光学指標および第２測定波長における酸解離光学指標を取得し、前記第１測定波長および前記第２測定波長が相互に異なっていてもよい。
培地の酸解離光学指標は、酸型のｐＨ指示薬の濃度および塩基型のｐＨ指示薬の濃度を用いた式で表すことができる。２つの測定波長における２つの酸解離光学指標を用いて、酸型のｐＨ指示薬の濃度および塩基型のｐＨ指示薬の濃度を未知数とする２元連立方程式が得られる。この２元連立方程式を解くことによって、酸型のｐＨ指示薬の濃度および塩基型のｐＨ指示薬の濃度を算出することができる。

上記態様においては、前記酸解離光学指標を取得する工程において、第３測定波長における酸解離光学指標をさらに取得し、前記第３測定波長が、前記第１測定波長および前記第２測定波長とは異なり、前記濃度を算出する工程が、前記培地の酸解離光学指標に含まれるオフセットを算出する工程をさらに含んでいてもよい。
培地の酸解離光学指標は、酸型のｐＨ指示薬の濃度、塩基型のｐＨ指示薬の濃度およびオフセットを用いた式で表すことができる。オフセットとは、ｐＨ指示薬以外の物質に基づく酸解離光学指標の成分である。３つの測定波長における３つの酸解離光学指標を用いて、酸型のｐＨ指示薬の濃度、塩基型のｐＨ指示薬の濃度およびオフセットを未知数とする３元連立方程式が得られる。この３元連立方程式を解くことによって、酸型のｐＨ指示薬の濃度および塩基型のｐＨ指示薬の濃度に加えて、オフセットを算出することができる。

上記態様においては、前記酸解離光学指標を取得する工程において、第４測定波長における酸解離光学指標をさらに取得し、前記第４測定波長が、前記第１測定波長、前記第２測定波長および前記第３測定波長とは異なり、前記濃度を算出する工程が、前記培地に含まれる有色物質の濃度を算出する工程をさらに含んでいてもよい。
培地の酸解離光学指標は、酸型のｐＨ指示薬の濃度、塩基型のｐＨ指示薬の濃度、オフセットおよび有色物質の濃度を用いた式で表すことができる。有色物質とは、例えば、血清である。４つの測定波長における４つの酸解離光学指標を用いて、酸型のｐＨ指示薬の濃度、塩基型のｐＨ指示薬の濃度、オフセットおよび有色物質の濃度を未知数とする４元連立方程式が得られる。この４元連立方程式を解くことによって、酸型のｐＨ指示薬の濃度、塩基型のｐＨ指示薬の濃度およびオフセットに加えて、有色物質の濃度を算出することができる。

上記態様においては、前記酸解離光学指標が、前記培地の吸光度であってもよい。
この構成によって、簡易な方法および構成によって酸解離光学指標を測定することができる。

上記態様においては、前記培地の水素イオン指数（ｐＨ）を下式に基づいて算出する工程をさらに含んでいてもよい。
ｐＨ＝ｐＫａ＋ｌｏｇ（Ｃ_ｂａｓ／Ｃ_ａｃｉ）
ここで、ｐＫａは、前記ｐＨ指示薬の酸解離指数、Ｃ_ｂａｓは、前記培地中の前記塩基型のｐＨ指示薬の濃度、Ｃ_ａｃｉは、前記培地中の前記酸型のｐＨ指示薬の濃度である。
この構成によって、培地に含まれる有色物質の色の影響を受けることなく、培地のｐＨを正確に推定することができる。

上記態様においては、前記酸解離指数が、所定の標準温度における酸解離指数であり、前記酸解離光学指標を取得する工程において、前記所定の標準温度の前記培地の酸解離光学指標を取得してもよい。
酸解離指数は、温度に応じて変化する。したがって、同一の標準温度における酸解離指数および培地の酸解離光学指標を用いることによって、培地のｐＨのさらに正確な推定値を式（１）から算出することができる。

本発明の他の態様は、細胞培養用の液状の培地に含まれるｐＨ指示薬の酸解離平衡状態を推定する酸解離平衡推定装置であって、前記ｐＨ指示薬が、前記培地中の水素イオン濃度に応じて酸型と塩基型との間で変化し、前記酸型のｐＨ指示薬と前記塩基型のｐＨ指示薬との間で酸解離平衡が成立し、前記酸型のｐＨ指示薬および前記塩基型のｐＨ指示薬が相互に異なる光学スペクトルを有し、プロセッサを備え、該プロセッサが、測定波長における前記培地の酸解離光学指標を取得し、該酸解離光学指標が前記ｐＨ指示薬の光学スペクトルの強度と相関する、工程と、取得された前記酸解離光学指標に基づいて、前記培地中の前記酸型のｐＨ指示薬の濃度および前記塩基型のｐＨ指示薬の濃度を算出する工程と、を実行する酸解離平衡推定装置である。

上記態様においては、モニタリング装置と通信可能である通信部を備え、前記モニタリング装置が前記培地の酸解離光学指標を取得し、前記通信部が、前記モニタリング装置から前記培地の酸解離光学指標を受信してもよい。
この構成によって、酸解離平衡推定装置は、任意の場所においてモニタリング装置から酸解離光学指標を取得することができる。例えば、酸解離平衡推定装置は、インキュベータの外において、インキュベータ内のモニタリング装置から酸解離光学指標を取得することができる。

上記態様においては、前記通信部が、前記モニタリング装置から少なくとも１つの中継装置を経由して前記酸解離光学指標を受信してもよい。
この構成によって、酸解離平衡推定装置を、モニタリング装置から遠隔に設置されたサーバとして、例えばインターネット上のクラウドサーバとして、実現することができる。

本発明の他の態様は、上記いずれかに記載の酸解離平衡推定装置と、前記培地の酸解離光学指標を測定するモニタリング装置と、ユーザインタフェース装置とを備え、該ユーザインタフェース装置が、前記モニタリング装置に前記酸解離光学指標の測定を指示する信号を送信し、前記酸型のｐＨ指示薬の濃度および前記塩基型のｐＨ指示薬の濃度に基づいて算出された前記培地の水素イオン指数をユーザに通知する酸解離平衡推定システムである。

本発明の他の態様は、上記いずれかに記載の酸解離平衡推定装置と通信可能であり、前記酸解離平衡推定装置に、前記酸型のｐＨ指示薬の濃度および前記塩基型のｐＨ指示薬の濃度の送信を要求する通信部と、前記酸型のｐＨ指示薬の濃度および前記塩基型のｐＨ指示薬の濃度に基づいて算出された前記培地の水素イオン指数をユーザに通知する通知部とを備えるユーザインタフェース装置である。

本発明によれば、測定波長が制限されず、かつ、培地のｐＨを広範囲にわたって正確に推定することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る酸解離平衡推定装置の外観図である。 図１の酸解離平衡推定装置の内部構成図である。 酸型および塩基型のフェノールレッドの化学構造式である。 ｐＨ４．０からｐＨ１１におけるフェノールレッドの光吸収スペクトルである。 本発明の一実施形態に係る酸解離平衡推定方法を示すフローチャートである。 図５の酸解離平衡推定方法によって算出されたｐＨの推定値と、ｐＨセンサによるｐＨの実測値との関係を示すグラフである。 フェノールレッドのみを含むサンプルとフェノールレッドおよび赤インクを含むサンプルのｐＨ６．５近傍における光吸収スペクトルである。 フェノールレッドのみを含むサンプルとフェノールレッドおよび赤インクを含むサンプルのｐＨ７．５近傍における光吸収スペクトルである。 本発明の他の実施形態に係る酸解離平衡推定システムの全体構成図である。 本発明の他の実施形態に係る酸解離平衡推定システムの全体構成図である。 本発明の他の実施形態に係る酸解離平衡推定システムの全体構成図である。 本発明の他の実施形態に係る酸解離平衡推定装置の吸光度測定デバイスの構成図である。 本発明の他の実施形態に係る酸解離平衡推定装置の全体構成図である。

以下に、本発明の一実施形態に係る酸解離平衡推定装置１および酸解離平衡推定方法について図面を参照して説明する。
本実施形態に係る酸解離平衡推定装置１は、図１に示されるように、培養容器２内の細胞および液状の培地Ｍをモニタリングするモニタリング装置である。モニタリング装置１は、密閉された箱型の筐体３を備えている。筐体３の天板３ａは、透明かつ平坦なステージであり、ステージ３ａ上に培養容器２が載置される。培地Ｍには、血清およびｐＨ指示薬が含まれている。モニタリング装置１は、ステージ３ａ上の培養容器２と一緒にインキュベータ内に配置され、細胞の画像の取得とｐＨ指示薬に基づく培地ＭのｐＨの推定とを行う。

モニタリング装置１は、図２に示されるように、撮像デバイス４と、吸光度測定デバイス５と、メモリ６と、プロセッサ７とを備えている。
培養容器２は、例えば、細胞培養用のディッシュである。培養容器２は、光学的に透明な材質から形成されている。撮像デバイス４は、撮像素子（図示略）によって、ステージ３ａおよび培養容器２の底板２ａ越しに培養容器２内の細胞を撮像し、細胞の画像を生成する。撮像デバイス４は、ステージ３ａおよび底板２ａを経由して細胞に照明光を照射する照明素子を備えていてもよい。

吸光度測定デバイス５は、培養容器２内の培地Ｍに測定光Ｌを照射する光源（図示略）と、培地Ｍを透過した測定光Ｌを検出する検出器（図示略）とを備える。光源から射出された測定光Ｌは、ステージ３ａ、底板２ａおよび培地Ｍを上方に向かって透過し、培養容器２の天板２ｂの内面において反射され、培地Ｍ、底板２ａおよびステージ３ａを下方に向かって透過する。検出器は、培地Ｍおよびステージ３ａを透過した測定光Ｌの強度を検出する。吸光度測定デバイス５は、光源が射出した測定光Ｌの強度と、検出器が検出した測定光Ｌの強度との比に基づいて、培地Ｍの吸光度を算出する。

ここで、培地Ｍの吸光度（酸解離光学指標）、培地ＭのｐＨ、およびｐＨ指示薬の関係について説明する。
図３および図４は、代表的なｐＨ指示薬であるフェノールレッド（ＰＲ）の分子構造および光吸収スペクトル（光学スペクトル）をそれぞれ示している。

図３に示されるように、ｐＨ指示薬は、酸型および塩基型のいずれかの分子構造を有し、培地Ｍ中の水素イオン濃度に応じて酸型と塩基との間で変化する。酸型のｐＨ指示薬と塩基型のｐＨ指示薬は共役酸塩基対であり、酸型のｐＨ指示薬と塩基型のｐＨ指示薬との間で酸解離平衡が成立する。培地ＭのｐＨは、式（ａ）によって表される。
ｐＨ＝ｐＫａ＋ｌｏｇ（Ｃ_ｂａｓ／Ｃ_ａｃｉ） …（ａ）
Ｃ_ａｃｉは、培地Ｍ中の酸型のｐＨ指示薬の濃度である。Ｃ_ｂａｓは、培地Ｍ中の塩基型のｐＨ指示薬の濃度である。ｐＫａは、ｐＨ指示薬の酸解離指数である。

一方、図４に示されるように、酸型のｐＨ指示薬の光吸収スペクトルと塩基型のｐＨ指示薬の光吸収スペクトルは、相互に異なる。したがって、培地Ｍの吸光度から培地中の濃度Ｃ_ａｃｉ，Ｃ_ａｃｉを算出することができる。さらに、算出された濃度Ｃ_ａｃｉ，Ｃ_ａｃｉを用いて、式（ａ）から培地ＭのｐＨの推定値を算出することができる。

吸光度測定デバイス５は、吸光度の測定波長を変更することができる。測定波長を変更する方法には、培地Ｍに照射される測定光Ｌの波長を変更する第１の方法と、検出器によって検出される光の波長を変更する第２の方法とがある。

第１の方法の場合、例えば、吸光度測定デバイス５は、相互に異なる波長の測定光を出力する複数の光源を備える。吸光度測定デバイス５は、広帯域の光を出力する光源と、光源から出力された光の中から特定の波長を選択する波長選択素子とを備え、波長選択素子によって選択される波長が変更可能であってもよい。あるいは、吸光度測定デバイス５は、広帯域の光を出力する光源と回折格子のような分光器とを備え、光源から出力された光を分光器によって分光し、特定の波長の光のみを分光器から培地Ｍに照射してもよい。あるいは、吸光度測定デバイス５は、光源から培地Ｍに照射される光の波長を変調する波長可変装置を備え、所定の波長に変調された光を波長可変装置から培地Ｍに照射してもよい。

第２の方法の場合、例えば、吸光度測定デバイス５は、検出器の前段に分光器を備え、培地Ｍを透過した光を分光器によって分光し、特定の波長の光のみを分光器から検出器に射出する。

メモリ６には、撮像プログラム、吸光度測定プログラムおよび計算プログラムが格納されている。
プロセッサ７は、撮像プログラムに従って撮像デバイス４を制御し、撮像デバイス４に細胞の撮像および画像の生成を実行させる。
プロセッサ７は、吸光度測定プログラムに従って吸光度測定デバイス５を制御し、吸光度測定デバイス５に培地Ｍの吸光度の測定を実行させる。さらに、プロセッサ７は、吸光度測定デバイス５から吸光度のデータを受け取り、計算プログラムに従って吸光度から濃度Ｃ_ａｃｉ，Ｃ_ｂａｓおよび培地ＭのｐＨを算出するための計算を実行する。

次に、本実施形態に係る酸解離平衡推定方法について、ｐＨ指示薬がフェノールレッド（ＰＲ）であり血清がＦＢＳである場合を例に挙げて説明する。
酸解離平衡推定方法は、フェノールレッド以外のｐＨ指示薬を含む培地にも適用することができる。また、酸解離平衡推定方法は、ＦＢＳ以外の血清を含む培地、および、血清以外の吸収物質を含む培地にも適用することができる。

酸解離平衡推定方法は、図５に示されるように、培地Ｍの吸光度を測定する測定工程Ｓ１と、培地Ｍの吸光度に基づいて、酸型のフェノールレッド（酸型ＰＲ）の濃度および塩基型のフェノールレッド（塩基型ＰＲ）の濃度を算出する濃度算出工程Ｓ２と、酸型ＰＲおよび塩基型ＰＲの濃度に基づいて培地ＭのｐＨを算出するｐＨ算出工程Ｓ３とを含む。

測定工程Ｓ１は、第１測定波長λ１における培地Ｍの吸光度Ａ_λ１を測定する工程Ｓ１１と、第２測定波長λ２における培地Ｍの吸光度Ａ_λ２を測定する工程Ｓ１２と、第３測定波長λ３における培地Ｍの吸光度Ａ_λ３を測定する工程Ｓ１３と、第４測定波長λ４における培地Ｍの吸光度Ａ_λ４を測定する工程Ｓ１４とを含む。第１測定波長λ１、第２測定波長λ２、第３測定波長λ３および第４測定波長λ４は、相互に異なる。

測定工程Ｓ１は、プロセッサ７が吸光度測定プログラムに従って吸光度測定デバイス５を制御することによって実現される。具体的には、工程Ｓ１１において、吸光度測定デバイス５は、培養容器２内の培地Ｍに第１測定波長λ１の測定光Ｌを照射し、培地Ｍを透過した測定光Ｌを検出し、吸光度Ａ_λ１を算出する。工程Ｓ１２，Ｓ１３，Ｓ１４において、吸光度測定デバイス５は、工程Ｓ１１と同様にして、測定波長λ２，λ３，λ４の測定光Ｌを用いて吸光度Ａ_λ２，Ａ_λ３，Ａ_λ４を順番に算出する。
測定光Ｌの波長を変更することに代えて、上述したように、検出器によって検出される波長を変更することによって、４つの測定波長λ１，λ２，λ３，λ４における吸光度Ａ_λ１，Ａ_λ２，Ａ_λ３，Ａ_λ４を測定してもよい。

濃度算出工程Ｓ２およびｐＨ算出工程Ｓ３は、プロセッサ７が計算プログラムに従って演算することによって実現される。
濃度算出工程Ｓ２において、プロセッサ７は、下式（１）に吸光度Ａ_λ１，Ａ_λ２，Ａ_λ３，Ａ_λ４を代入することによって、４つの未知数Ｃ_{ＰＲ＿ａｃｉ}，Ｃ_{ＰＲ＿ｂａｓ}，Ｃ_ＦＢＳ，Ａ_ｏｆｆを有する連立４元１次方程式を得る。次に、プロセッサ７は、連立４元１次方程式を解き、未知数Ｃ_{ＰＲ＿ａｃｉ}，Ｃ_{ＰＲ＿ｂａｓ}，Ｃ_ＦＢＳ，Ａ_ｏｆｆの値を算出する。

式（１）において、Ｃ_{ＰＲ＿ａｃｉ}は、培地Ｍ中の酸型ＰＲの濃度である。Ｃ_{ＰＲ＿ｂａｓ}は、培地Ｍ中の塩基型ＰＲの濃度である。Ｃ_ＦＢＳは、培地Ｍ中のＦＢＳの濃度である。Ａ_ｏｆｆは、オフセットである。
α_{ＦＢＳ＿λｉ}（ｉ＝１，２，３，４）は、測定波長λｉにおけるＦＢＳの吸光係数である。α_{ＰＲ＿ａｃｉ}は、酸型ＰＲの吸光係数である。α_{ＰＲ＿ｂａｓ}は、塩基型ＰＲの吸光係数である。Ｓ_λｉ（ｉ＝１，２，３，４）は、測定波長λｉにおけるオフセット係数である。Ｄは、培地Ｍを透過する測定光Ｌの光路長である。吸光係数α_{ＦＢＳ＿λｉ}，α_{ＰＲ＿ａｃｉ}，α_{ＰＲ＿ｂａｓ}，Ｓ_λｉおよび光路長Ｄは、既知の値である。

式（１）について説明する。
培地Ｍの吸光度は、酸型ＰＲの吸光度、塩基型ＰＲの吸光度、ＦＢＳの吸光度およびオフセットの和である。測定光Ｌの光路には、培地Ｍ中のＰＲおよびＦＢＳの他にも、測定光Ｌを吸収する吸収物質が存在する。吸収物質は、例えば、培養容器２の底板２ａ、ステージ３ａ、ＰＲおよびＦＢＳ以外の培地Ｍの成分である。オフセットとは、ＰＲおよびＦＢＳ以外の吸収物質に基づく吸光度である。

一方、吸光度Ａは、吸光係数α、試料の濃度Ｃおよび測定光の試料内の光路長Ｄを用いて、式（ｂ）で表される。
Ａ＝αＤＣ …（ｂ）
式（ｂ）を用いて、測定波長λｉ（ｉ＝１，２，３，４）における培地Ｍの吸光度Ａ_λ１，Ａ_λ２，Ａ_λ３，Ａ_λ４は、下式（ｃ）で表される。式（ｃ）を変形することによって、式（１）が得られる。

次に、ｐＨ算出工程Ｓ３において、プロセッサ７は、下式（２）に濃度Ｃ_{ＰＲ＿ａｃｉ}，Ｃ_{ＰＲ＿ｂａｓ}を代入することによって、培地ＭのｐＨを算出する。
ｐＨ＝ｐＫａ ＋ ｌｏｇ（Ｃ_{ＰＲ＿ｂａｓ}／Ｃ_{ＰＲ＿ａｃｉ}） …（２）
ｐＫａは、ＰＲの酸解離指数である。ｐＫａは、温度に応じて変化し、３７℃におけるＰＲのｐＫａは、約７．７である。ｐＨの計算には、所定の標準温度におけるｐＫａの値が使用される。

一般的に、培地ＭのｐＨは、培地Ｍの見た目の色に基づいて推定される。ただし、ＦＢＳのような有色物質が培地Ｍに含まれている場合、培地Ｍの色は、ＰＲの色と有色物質の色との混合色になる。したがって、培地Ｍの見た目の色に基づいて培地Ｍの正確なｐＨを知ることは難しい。

一方、培地ＭのｐＨは、酸型のｐＨ指示薬の濃度と塩基型のｐＨ指示薬の濃度との比によって決まる。本実施形態によれば、４つの吸光度Ａ_λ１，Ａ_λ２，Ａ_λ３，Ａ_λ４を用いて式（１）の連立４元１次方程式を解くことによって、ＰＲ以外の吸収物質が培地Ｍ中に存在する状況においても、培地Ｍ中の酸型ＰＲおよび塩基型ＰＲの各々の正確な濃度Ｃ_{ＰＲ＿ａｃｉ}，Ｃ_{ＰＲ＿ｂａｓ}を算出することができ、培地Ｍ中のＰＲの酸解離平衡状態を推定することができる。そして、濃度Ｃ_{ＰＲ＿ａｃｉ}，Ｃ_{ＰＲ＿ｂａｓ}を用いることによって、ＦＢＳのような有色物質の色の影響を受けることなく、培地ＭのｐＨを正確に推定することができるという利点がある。

また、培地ＭのｐＨと培地Ｍの吸光度との関係が線形になるｐＨ範囲に限らず、培地Ｍの広範囲のｐＨを正確に算出することができるという利点がある。
また、濃度Ｃ_{ＰＲ＿ａｃｉ}，Ｃ_{ＰＲ＿ｂａｓ}の算出に使用される測定波長λ１，λ２，λ３，λ４は、ＰＲが吸収を示す波長であればどのような波長であってもよい。すなわち、広い波長域の中から任意の測定波長λ１，λ２，λ３，λ４を選択することができるという利点がある。

図６は、本実施形態の酸解離平衡推定方法によるｐＨの推定精度の評価実験の結果を表している。図６のグラフにおいて、横軸（Ｘ軸）はｐＨセンサによって測定されたｐＨの実測値であり、縦軸（Ｙ軸）は、本実施形態の酸解離平衡推定方法によって算出されたｐＨの推定値であり、破線はＹ＝Ｘのグラフを示している。

評価実験において、３種類のサンプルＡ，Ｂ，Ｃを用意した。サンプルＡは、ＰＲのみを含む溶液である。サンプルＢは、ＰＲおよび低濃度の赤インクを含む溶液である。サンプルＣは、ＰＲおよび高濃度の赤インクを含む溶液である。サンプルＢおよびサンプルＣについては、ｐＨが異なる３つの溶液を用意した。
図７Ａは、ＰＲのみを含む溶液と、ＰＲおよび赤インクを含む溶液の、ｐＨ６．５近傍での光吸収スペクトルである。図７Ｂは、ＰＲのみを含む溶液と、ＰＲおよび赤インクを含む溶液の、ｐＨ７．５近傍での光吸収スペクトルである。
図６から分かるように、サンプルＡ，Ｂ，Ｃの全てについて、実測値に近い推定値が得られた。

上述したように、ｐＫａは、培地Ｍの温度に応じて異なる。したがって、測定工程Ｓ１において、培地Ｍの温度をｐＫａの所定の標準温度に調整し、所定の標準温度の培地Ｍの吸光度Ａ_λ１，Ａ_λ２，Ａ_λ３，Ａ_λ４を測定してもよい。この場合、培地Ｍの温度を所定の標準温度に制御する温度制御装置がさらに設けられる。
このように、培地Ｍの温度をｐＫａの標準温度に一致させることで、ｐＨのより正確な推定値を式（１）から算出することができる。
測定工程Ｓ１における培地Ｍの温度が標準温度とは異なる場合、標準温度におけるｐＫａを培地Ｍの温度に基づいて補正し、補正されたｐＫａをｐＨの計算に用いてもよい。

細胞の培養中に同一の培地ＭのｐＨを複数回推定する場合には、２回目以降のｐＨの推定において、培地Ｍの吸光度の測定波長は２つのみであってもよい。
１回目のｐＨの推定時に、ＦＢＳの濃度Ｃ_ＦＢＳおよびオフセットＡ_ｏｆｆが算出される。培地Ｍおよび吸光度の測定位置が同一である場合、ＦＢＳの濃度Ｃ_ＦＢＳおよびオフセットＡ_ｏｆｆは変化しない。したがって、２回目以降は、２つの測定波長における吸光度を測定し、濃度Ｃ_{ＰＲ＿ａｃｉ}，Ｃ_{ＰＲ＿ｂａｓ}のみを式（１）から算出してもよい。

本実施形態においては、４つの測定波長における培地Ｍの吸光度を測定し、４元連立方程式から４つの未知数を算出することとしたが、測定波長の数および算出する未知数の数は、培地Ｍの成分および目的に応じて適宜変更可能である。
例えば、培地Ｍに含まれる有色物質がＰＲのみである場合には、３つの測定波長における培地Ｍの吸光度を測定し、３元連立方程式から３つの未知数Ｃ_{ＰＲ＿ａｃｉ}，Ｃ_{ＰＲ＿ｂａｓ}，Ａ_ｏｆｆを算出してもよい。

一方、ＰＲおよびＦＢＳに加えて他の有色物質が培地Ｍ中に含まれている場合には、測定波長の数および連立方程式における未知数の数を増やし、他の有色物質の濃度も算出してもよい。例えば、他の有色物質が１種類である場合、５つの測定波長における培地Ｍの吸光度を測定し、未知数として他の有色物質の濃度がさらに加えられた５元連立方程式を解くことによって、酸型ＰＲ、塩基型ＰＲ、ＦＢＳおよび他の有色物質の濃度と、オフセットとを算出することができる。

培地ＭのｐＨの推定に必要な値は、酸型のｐＨ指示薬の濃度Ｃ_ａｃｉおよび塩基型のｐＨ指示薬の濃度Ｃ_ｂａｓである。したがって、２つの測定波長における培地Ｍの吸光度を測定し、２元連立方程式からｐＨ指示薬の濃度Ｃ_ａｃｉ，Ｃ_ｂａｓのみを算出してもよい。この方法は、培地Ｍ中のＦＢＳの濃度Ｃ_ＦＢＳおよびオフセットＡ_ｏｆｆが既知である場合に、特に有効である。

培地Ｍに含まれるｐＨ指示薬の全濃度が既知である場合には、吸光度の測定波長は１つのみであってもよい。
この場合には、培地Ｍの吸光度は、濃度Ｃ_ａｃｉ，Ｃ_ｂａｓの一方のみを未知数とする一元方程式で表される。したがって、濃度Ｃ_ａｃｉ，Ｃ_ｂａｓの一方を、１つの測定波長における吸光度に基づいて算出し、濃度Ｃ_ａｃｉ，Ｃ_ｂａｓの他方を、ｐＨ指示薬の全濃度と一方の濃度との差として算出することができる。

本実施形態においては、酸解離光学指標が、ｐＨ指示薬の吸光度であることとしたが、これに代えて、酸解離光学指標が、以下の２つの条件を満たす他の種類の指標であってもよい。
条件１：光学的に測定可能な量である
条件２：ｐＨに応じて変化する量である

条件１および２を満たす好ましい指標は、例えば、ｐＨ感受性の蛍光色素（ｐＨ指示薬）の蛍光強度である。フェノールレッドと同様に、ｐＨ感受性の蛍光色素は、水素イオン濃度に応じて酸型と塩基型との間で変化する。酸型の蛍光色素の蛍光スペクトル（光学スペクトル）と塩基型の蛍光色素の蛍光スペクトル（光学スペクトル）は、相互に異なる。したがって、複数の測定波長における蛍光色素の蛍光強度から酸型の蛍光色素の濃度および塩基型の蛍光色素の濃度を算出し、酸型の蛍光色素の濃度および塩基型の蛍光色素の濃度から培地ＭのｐＨを推定することができる。

本実施形態においては、酸解離平衡推定方法がモニタリング装置１によって実現されることとしたが、酸解離平衡推定方法を実現するための装置構成はこれに限定されない。図８から図１２は、酸解離平衡推定方法を実現するための装置およびシステムの他の実施形態を示している。

図８に示される酸解離平衡推定システム１００は、モニタリング装置１０と、インキュベータの外に設置される画像処理装置２０とを備えている。モニタリング装置１０および画像処理装置２０は通信装置８，２０ａ（図１０参照。）をそれぞれ備え、無線または有線の通信ネットワークを経由して相互に通信可能である。
モニタリング装置１０は、吸光度測定デバイス５によって培地Ｍの吸光度を測定する。

画像処理装置２０は、メモリ（図示略）と、プロセッサ２０ｂ（図１０参照。）とを備える。画像処理装置２０の通信装置（通信部）２０ａは、モニタリング装置１０の通信装置８と通信することによって、モニタリング装置１０から細胞の画像のデータおよび吸光度のデータを受信する。
メモリには、画像処理プログラムおよび計算プログラムが格納されている。プロセッサ２０ｂは、画像処理プログラムに従って画像に画像処理を施す。また、プロセッサ２０ｂは、吸光度のデータを用い、計算プログラムに従って濃度Ｃ_ａｃｉ，Ｃ_ｂａｓおよび培地ＭのｐＨを計算する。すなわち、酸解離平衡推定装置は、画像処理装置２０として実現される。

図９に示される酸解離平衡推定システム１０１は、モニタリング装置１１と、インキュベータの外に設置される画像処理装置２１と、サーバ３０と、ユーザインタフェース（ＵＩ）装置４０とを備えている。
画像処理装置２１は、モニタリング装置１１、サーバ３０およびＵＩ装置４０と、無線または有線の通信ネットワークを経由して通信可能である。

画像処理装置（中継装置）２１は、モニタリング装置１１から吸光度のデータを受信し、吸光度のデータをサーバ３０に送信する。
サーバ３０は、例えば、インターネット上のクラウドサーバ、または、任意の場所に設置されたコンピュータである。濃度Ｃ_ａｃｉ，Ｃ_ｂａｓおよび培地ＭのｐＨの計算は、サーバ３０において実行される。すなわち、酸解離平衡推定装置は、サーバ３０として実現される。サーバ３０は、複数台の画像処理装置２１と通信可能であってもよい。

ＵＩ装置４０は、例えば汎用のタブレット型コンピュータである。ＵＩ装置４０は、モニタリング装置１１およびサーバ３０と通信可能な通信装置４０ａと、表示デバイス（通知部）４０ｂとを備えている。また、ＵＩ装置４０には、モニタリング装置１１およびサーバ３０と通信したり、サーバ３０から取得した情報を表示したりするための専用のアプリケーションソフトウェアがインストールされている。

ユーザは、専用のアプリケーションソフトウェアを使用して、モニタリング装置１１およびサーバ３０に各種の指示を送信することができる。具体的には、ユーザは、ＵＩ装置４０からモニタリング装置１１に吸光度の測定の指示を送信し、吸光度測定デバイス５を遠隔制御することができる。また、ユーザは、ＵＩ装置４０からサーバ３０に、濃度Ｃ_ａｃｉ，Ｃ_ｂａｓおよび培地ＭのｐＨの少なくとも一方の送信を要求し、濃度Ｃ_ａｃｉ，Ｃ_ｂａｓおよび培地ＭのｐＨの少なくとも一方のデータをサーバ３０から取得することができる。
また、ユーザは、専用のアプリケーションソフトウェアを使用して、培地ＭのｐＨの値を表示デバイス４０ｂに表示させることができる。

図１０に示される酸解離平衡推定システム１０２は、モニタリング装置１，１０，１１に搭載される培地交換装置５０を備えている。
培地交換装置５０は、培養容器２内から使用済みの培地Ｍを排出し、未使用の培地Ｍを培養容器２内へ供給する。培地交換装置５０は、使用済みの培地Ｍの排出量および未使用の培地Ｍの供給量を調整することによって、培養容器２内の培地Ｍの高さ（培養容器２の底面から培地Ｍの液面までの鉛直方向の距離）を調整することができる。
式（１）における測定光Ｌの光路長Ｄは、培養容器２内の培地Ｍの高さによって決まる。モニタリング装置１，１０，１１に培地交換装置５０を組み合わせることによって、光路長Ｄを制御することができる。

図１１に示されるように、吸光度測定デバイス５が、モニタリング装置１，１０，１１に代えて、培地交換装置５０に搭載されていてもよい。具体的には、培養容器２内の培地Ｍに向かって測定光Ｌを射出する光源５ａと、培地Ｍを透過した測定光Ｌを検出する検出器５ｂが、培地交換装置５０に設けられる。検出器５ｂは、例えば、培養容器２の底面において反射された測定光Ｌを検出する。測定波長の変更は、光源５ａの波長変調または検出器５ｂの波長選択によって行われる。

図１２に示される酸解離平衡推定装置１２は、顕微鏡本体１３と、顕微鏡本体１３と接続されるプロセッサ１４とを備える光学顕微鏡装置である。
顕微鏡本体１３は、白色光源１３ａと、波長選択素子１３ｂと、カメラ１３ｃとを備える。白色光源１３ａから発せられた白色光は、波長選択素子１３ｂを透過し、測定光として培養容器２内の培地Ｍおよび細胞に照射される。波長選択素子１３ｂは、透過させる光の波長を変更可能である。すなわち、波長選択素子１３ｂによって、培地Ｍに照射される測定光の波長を変更することができる。

カメラ１３ｃは、測定光が照射されているときに培養容器２内の培地Ｍおよび細胞を撮像し、培地Ｍおよび細胞の画像をプロセッサ１４に送信する。
プロセッサ１４は、培地Ｍに照射される測定光の強度と画像の輝度値とに基づいて、測定波長における培地Ｍの吸光度を算出する。また、プロセッサ１４は、酸型のｐＨ指示薬および塩基型のｐＨ指示薬の各々の濃度を算出し、培地のｐＨを算出する。

酸解離平衡推定装置の他の実施形態において、吸光度測定デバイス５の光源および検出器は、別々に配置されていてもよい。例えば、光源は、インキュベータ内の培養容器２の隣に配置されてもよく、インキュベータ内の棚に配置されてもよい。コンタミネーションを防止するために、光源は、他の培養容器内に収容されていてもよい。
酸解離平衡推定装置の他の実施形態において、吸光度測定デバイス５の光源および検出器は、培養容器２の周囲の他の装置に設けられていてもよい。例えば、光源および検出器の両方が、インキュベータ内の棚に配置されていてもよい。

１ モニタリング装置、酸解離平衡推定装置
２ 培養容器
３ 筐体
３ａ ステージ
４ 撮像デバイス
５ 吸光度測定デバイス
６ メモリ
７，１４，２０ｂ プロセッサ
８，４０ａ 通信装置（通信部）
１０，１１ モニタリング装置
１２ 顕微鏡装置、酸解離平衡推定装置
２０ 画像処理装置、酸解離平衡推定装置
２１ 画像処理装置（中継装置）
３０ サーバ、酸解離平衡推定装置
４０ ユーザインタフェース装置
４０ｂ 表示デバイス（通知部）
５０ 培地交換装置
１００，１０１，１０２ 酸解離平衡推定システム

Claims (13)

1. 細胞培養用の液状の培地に含まれるｐＨ指示薬の酸解離平衡状態を推定する酸解離平衡推定方法であって、前記ｐＨ指示薬が、前記培地中の水素イオン濃度に応じて酸型と塩基型との間で変化し、前記酸型のｐＨ指示薬と前記塩基型のｐＨ指示薬との間で酸解離平衡が成立し、前記酸型のｐＨ指示薬および前記塩基型のｐＨ指示薬が相互に異なる光学スペクトルを有し、
   測定波長における前記培地の酸解離光学指標を取得し、該酸解離光学指標が前記ｐＨ指示薬の光学スペクトルの強度と相関する、工程と、
   取得された前記酸解離光学指標に基づいて、前記培地中の前記酸型のｐＨ指示薬の濃度および前記塩基型のｐＨ指示薬の濃度を算出する工程とを含む酸解離平衡推定方法。
2. 前記培地の酸解離光学指標を取得する工程において、単一の測定波長における前記酸解離光学指標を取得し、
   前記濃度を算出する工程において、
   前記酸解離光学指標に基づいて、前記酸型のｐＨ指示薬および前記塩基型のｐＨ指示薬の一方の濃度を算出し、
   前記培地に含まれる前記ｐＨ指示薬の全濃度から前記一方の濃度を減算することによって前記酸型のｐＨ指示薬および前記塩基型のｐＨ指示薬の他方の濃度を算出する請求項１に記載の酸解離平衡推定方法。
3. 前記酸解離光学指標を取得する工程において、第１測定波長における酸解離光学指標および第２測定波長における酸解離光学指標を取得し、前記第１測定波長および前記第２測定波長が相互に異なる請求項１に記載の酸解離平衡推定方法。
4. 前記酸解離光学指標を取得する工程において、第３測定波長における酸解離光学指標をさらに取得し、前記第３測定波長が、前記第１測定波長および前記第２測定波長とは異なり、
   前記濃度を算出する工程が、前記培地の酸解離光学指標に含まれるオフセットを算出する工程をさらに含む請求項３に記載の酸解離平衡推定方法。
5. 前記酸解離光学指標を取得する工程において、第４測定波長における酸解離光学指標をさらに取得し、前記第４測定波長が、前記第１測定波長、前記第２測定波長および前記第３測定波長とは異なり、
   前記濃度を算出する工程が、前記培地に含まれる有色物質の濃度を算出する工程をさらに含む請求項４に記載の酸解離平衡推定方法。
6. 前記酸解離光学指標が、前記培地の吸光度である請求項１から請求項５のいずれかに記載の酸解離平衡推定方法。
7. 前記培地の水素イオン指数を下式に基づいて算出する工程をさらに含む請求項１から請求項６のいずれかに記載の酸解離平衡推定方法。
   水素イオン指数＝ｐＫａ＋ｌｏｇ（Ｃ_ｂａｓ／Ｃ_ａｃｉ）
   ここで、
   ｐＫａは、前記ｐＨ指示薬の酸解離指数、
   Ｃ_ｂａｓは、前記培地中の前記塩基型のｐＨ指示薬の濃度、
   Ｃ_ａｃｉは、前記培地中の前記酸型のｐＨ指示薬の濃度
   である。
8. 前記酸解離指数が、所定の標準温度における酸解離指数であり、
   前記酸解離光学指標を取得する工程において、前記所定の標準温度の前記培地の酸解離光学指標を取得する請求項７に記載の酸解離平衡推定方法。
9. 細胞培養用の液状の培地に含まれるｐＨ指示薬の酸解離平衡状態を推定する酸解離平衡推定装置であって、前記ｐＨ指示薬が、前記培地中の水素イオン濃度に応じて酸型と塩基型との間で変化し、前記酸型のｐＨ指示薬と前記塩基型のｐＨ指示薬との間で酸解離平衡が成立し、前記酸型のｐＨ指示薬および前記塩基型のｐＨ指示薬が相互に異なる光学スペクトルを有し、
   プロセッサを備え、
   該プロセッサが、
   測定波長における前記培地の酸解離光学指標を取得し、該酸解離光学指標が前記ｐＨ指示薬の光学スペクトルの強度と相関する、工程と、
   取得された前記酸解離光学指標に基づいて、前記培地中の前記酸型のｐＨ指示薬の濃度および前記塩基型のｐＨ指示薬の濃度を算出する工程と、を実行する酸解離平衡推定装置。
10. モニタリング装置と通信可能である通信部を備え、前記モニタリング装置が前記培地の酸解離光学指標を測定し、
    前記通信部が、前記モニタリング装置から前記培地の酸解離光学指標を受信する請求項９に記載の酸解離平衡推定装置。
11. 前記通信部が、前記モニタリング装置から少なくとも１つの中継装置を経由して前記酸解離光学指標を受信する請求項１０に記載の酸解離平衡推定装置。
12. 請求項１０または請求項１１に記載の酸解離平衡推定装置と、
    前記培地の酸解離光学指標を測定するモニタリング装置と、
    ユーザインタフェース装置とを備え、
    該ユーザインタフェース装置が、前記モニタリング装置に前記酸解離光学指標の測定を指示する信号を送信し、前記酸型のｐＨ指示薬の濃度および前記塩基型のｐＨ指示薬の濃度に基づいて算出された前記培地の水素イオン指数をユーザに通知する酸解離平衡推定システム。
13. 請求項９から請求項１１のいずれかに記載の酸解離平衡推定装置と通信可能であり、
    前記酸解離平衡推定装置に、前記酸型のｐＨ指示薬の濃度および前記塩基型のｐＨ指示薬の濃度の送信を要求する通信部と、
    前記酸型のｐＨ指示薬の濃度および前記塩基型のｐＨ指示薬の濃度に基づいて算出された前記培地の水素イオン指数をユーザに通知する通知部とを備えるユーザインタフェース装置。

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