JPWO2019182156A1 - 多入力・多出力型遺伝子スイッチ及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2018-057314号優先権を請求する。
代謝物や環境監視物質など、任意の物質の細胞内濃度をリアルタイムに検定できれば、生命科学の発展に大きく寄与できる。しかし、そのセンサとしての性能(感度)を調整することが困難である。
現在のところ、主に以下の動作原理でバイオセンサは構成されている。
「遺伝子誘導型」センサは、その標的化合物を誘導剤としてon/ offする転写制御機構の下流に、蛍光タンパク質などのレポーターを配置するものである。自然界には様々な分子に応答する転写因子が存在するが、代謝物の大多数について、それらに対するセンサモチーフは知られていない。さらに、該当するものが見つかっても、その応答濃度、S/N比、出力強度の点を考慮すると実用に耐える性能は持たないことが殆どである。
FRETセンサは、標的分子結合に伴って大きく構造変化するものがあれば、蛍光共鳴エネルギー(FRET)を利用したセンサが構築できる。しかし、構造変化という合理的設計が極めて困難であるという問題がある。
本発明者らは、「チミジンキナーゼ、好ましくはヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列とその上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列とを少なくとも含む発現ベクターをセレクタとして使用することを特徴とする、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法(参照:特許文献1)」を開示している。
しかし、前記遺伝子回路の選択方法は、本発明の多入力・多出力型遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子の製造方法とは原理が異なる。
しかし、前記遺伝子回路の選択方法は、本発明の多入力・多出力型遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子の製造方法とは原理が異なる。
しかし、前記遺伝子回路の選択方法は、本発明の多入力・多出力型遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子の製造方法とは原理が異なる。
本発明は、上記センサに必要な遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子の多入力・多出力型遺伝子スイッチ又は転写因子の製造方法並びに多入力・多出力型遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子を提供することである。
1.以下の工程を有する、多入力・多出力型遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子の製造方法、
(A)
(1)リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列及びリガンドL2に応答するバインダーB2又は転写因子T2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたバインダーB1又は転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2の融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T1によって制御されるプロモータP1をコードする遺伝子配列及び/又は転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及び該プロモータ配列P1及び/若しくはP2と機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを、細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Xは1以上の整数を意味する、
(2)リガンドL1及び/又はリガンドL2を(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
(3)レポーターの発現量を指標として、バインダーB1又は転写因子T1とバインダーB1又は転写因子T2の融合変異体を遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する工程、
又は、
(B)
(1)リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列、リガンドL2に応答するバインダーB2又は転写因子T2をコードする遺伝子配列及びリガンドLNに応答するバインダーBN又は転写因子TNをコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたバインダーB1又は転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2とバインダーBN又は転写因子TNの融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T1によって制御されるプロモータP1をコードする遺伝子配列、転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及び/若しくは転写因子TNによって制御されるプロモータPNをコードする遺伝子配列及び該プロモータ配列P1、P2及び/若しくはPNと機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを、細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Nは、3以上の整数を意味する、
(2)リガンドL1、リガンドL2及び/又はリガンドLNを(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に導入する工程、
(3)レポーターの発現量を指標として、バインダーB1又は転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2とバインダーBN又は転写因子TNの融合変異体を遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する工程。
2.前記(A)において、
リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1又はリガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体を2入力・AND型出力センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
3.前記(A)において、
転写因子T2によって制御されるプロモータP2を使用した場合、リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体を2入力・AND型出力センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
又は、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体を2入力・AND型出力センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
4.前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドなしのレポーターの発現量比が高い融合変異体を2入力・OR型センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
又は、
転写因子T2によって制御されるプロモータP2を使用した場合、リガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドなしのレポーターの発現量比が高い融合変異体を2入力・OR型センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
5.前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体をリガンドL1に特異的に応答する出力型センサの遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
又は、
転写因子T2によって制御されるプロモータP2を使用した場合、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体をリガンドL2に特異的に応答する出力型センサの遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
6.前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドなしのレポーターの発現量/リガンドL1の導入によるレポーターの発現量比が高く,かつリガンドなしのレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体を、NOR型センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
7.前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドなし又はリガンドL1若しくはリガンドL2の一方の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体を、NAND型センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
8.前記(A)において、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL2導入によるレポーターの発現量の両方が減少する融合変異体を2入力3段階出力低下型センサとしての機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
9.前記(A)において、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL2導入によるレポーターの発現量の両方が上昇する融合変異体を2入力3段階出力向上型センサとしての機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
10.前記(B)において、N=3であり、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL3導入によるレポーターの発現量が減少する融合変異体を3入力4段階出力低下型センサとしての機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
11.前記(B)において、N=3であり、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL3導入によるレポーターの発現量が上昇する融合変異体を3入力4段階出力向上型センサとしての機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
12.前記(B)において、N=3であり、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1、プロモータ配列P1と機能的に連結されたレポーターR1、転写因子T2によって制御されるプロモータP2、プロモータ配列P2と機能的に連結されたレポーターR2、並びに転写因子T3によって制御されるプロモータP3、プロモータ配列P3と機能的に連結されたレポーターR3を使用し、
変異導入によってリガンド結合能を消失させたリガンドL1結合型の転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2とバインダーB3又は転写因子T3の融合変異体の核酸のライブラリを使用し、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量は向上せず、リガンドL3の導入によるレポーターの発現量が向上しかつレポーターR1、レポーターR2及びレポーターR3が発現する融合変異体をリガンドL3に特異的に応答する多出力型センサの遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
13.前記(B)において、N=3であり、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1、プロモータ配列P1と機能的に連結されたレポーターR1、転写因子T2によって制御されるプロモータP2、プロモータ配列P2と機能的に連結されたレポーターR2、並びに転写因子T3によって制御されるプロモータP3、プロモータ配列P3と機能的に連結されたレポーターR3を使用し、
変異導入によってリガンド結合能を消失させたバインダーB1又は転写因子T1と変異導入によってリガンド結合能を消失させたバインダーB2又は転写因子T2とバインダーB3又は転写因子T3の融合変異体の核酸のライブラリを使用し、
リガンドL2の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL3の導入によるレポーターの発現量が向上し、リガンドL1の導入によるレポーターの発現量は向上せず、かつレポーレポーターR2が発現する融合変異体をリガンドL2とリガンドL3に特異的に応答する多出力型センサの遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
14.バインダーB1、バインダーB2、バインダーB3及びバインダーBNは転写因子、酵素、抗体、ヒストン、シャペロン又はリボゾームから選択される前項1〜13のいずれか1に記載の方法。
15.バインダーB1、バインダーB2、バインダーB3及びバインダーBNは転写因子又は酵素である前項1〜13のいずれか1に記載の方法。
16.以下の工程を有する、リガンドL1検出用遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子の製造方法、
(1)リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列及び転写因子T2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたバインダーB1又は転写因子T1と転写因子T2の融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及びプロモータP2と機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持した発現ベクターを細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Xは1以上の整数を意味する、
(2)リガンドL1及び/又はリガンドL2を(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
(3)リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体又はリガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体をリガンドL1検出用遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する工程。
17.前記リガンドL1はヒ素である、前項16に記載の製造方法。
18.以下の工程を有する、リガンドL1による転写因子T2によって制御されるプロモータP2の発現を亢進させることが可能な転写因子の製造方法、
(1)リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列及びリガンドL2に応答するバインダーB2又は転写因子T2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたバインダーB1又は転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2の融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及びプロモータP2と機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Xは1以上の整数を意味する、
(2)リガンドL1及び/又はリガンドL2を(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
(3)リガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体をリガンドL1による転写因子T2によって制御されるプロモータP2の発現を亢進させることが可能な転写因子として選抜する工程。
19.前項1〜18のいずれか1以上の製造方法から得られた遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子。
20.前項1〜15のいずれか1以上の製造方法から得られた遺伝子融合変異体であって、
ここで、リガンドL1、L2及び/又はLN によって、T1、T2及び/又はTnによって制御されるプロモータP1、P2及び/又はPnの発現を亢進又は抑制させることができる遺伝子融合変異体。
21.前記遺伝子融合変異体は、以下のいずれか1である前項20に記載の遺伝子融合変異体。
(1)リガンドL1によって転写因子T2によって制御されるプロモータP2の発現を亢進させることが可能な遺伝子融合変異体、
(2)リガンドL1によって転写因子T2によって制御されるプロモータP2の発現を減少させることが可能な遺伝子融合変異体、
(3)リガンドL1によって転写因子T1、転写因子T2及び転写因子Tnによって制御されるプロモータP1、P2及びPnの発現を亢進又は抑制させることが可能な遺伝子融合変異体、
(4)リガンドL1によって転写因子T2及び転写因子Tnによって制御されるプロモータP2及びPnの発現を亢進又は抑制させることが可能な遺伝子融合変異体、
(5)リガンドL1及びL2によって転写因子T1、転写因子T2及び転写因子Tnによって制御されるプロモータP1、P2及びPnの発現を亢進又は抑制させることが可能な遺伝子融合変異体、
(6)リガンドL1及びL2によって転写因子T2及び転写因子Tnによって制御されるプロモータP2及びPnの発現を亢進又は抑制させることが可能な遺伝子融合変異体、
(7)リガンドL1、L2及びLN によって、T1、T2及びTnによって制御されるプロモータP1、P2及びPnの発現を亢進させることができる遺伝子融合変異体
(8)リガンドL1、L2及びLN によって、T1、T2及びTnによって制御されるプロモータP1、P2及びPnの発現を抑制させることができる遺伝子融合変異体
(9)リガンドL1よって転写因子T1に制御されるプロモータP1の発現が抑制され、かつ転写因子T2に制御されるプロモータP2の発現を亢進させかつ転写因子T3に制御されるプロモータP3の発現を亢進させる遺伝子融合変異体
22.前項1〜18のいずれか1以上の製造方法から得られた遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子、又は、前項19に記載の遺伝子スイッチ又は該スイッチをリガンドL1、リガンドL2及び/又はリガンドLNの検出用センサ,タンパク質合成、タンパク質分泌の誘導、生合成経路の誘導、生合成経路の流量調節、細胞増殖の誘導、生理機能の誘導又は生理機能の制御機構としての使用方法。
23.前項1〜18のいずれか1以上の製造方法から得られた遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子、又は、前項19に記載の遺伝子スイッチ又は該スイッチをリガンドL1、リガンドL2及び/又はリガンドLNの検出用センサとしての使用方法において、以下のリガンドL1、リガンドL2及び/又はリガンドLNの検出感度調整工程を含む使用方法。
(1)リガンドL1への応答感度を上げる場合には、リガンドL2及び/又はリガンドLNの添加濃度を上げる
(2)リガンドL1への応答感度を下げる場合には、リガンドL2及び/又はリガンドLNの添加濃度を下げる
(3)リガンドL2への応答感度を上げる場合には、リガンドL1及び/又はリガンドLN添加濃度を上げる
(4)リガンドL2への応答感度を下げる場合には、リガンドL1及び/又はリガンドLN添加濃度を下げる
(5)リガンドLNへの応答感度を上げる場合には、リガンドL1及び/又はリガンドL2の添加濃度を上げる
(6)リガンドLNへの応答感度を下げる場合には、リガンドL1及び/又はリガンドL2の添加濃度を下げる
24.(A)リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列及びリガンドL2に応答するバインダーB2又は転写因子T2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたバインダーB1又は転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2の融合変異体を含む遺伝子スイッチ、
又は
(B)リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列、リガンドL2に応答するバインダーB2又は転写因子T2をコードする遺伝子配列及びリガンドLNに応答するバインダーBN又は転写因子TNをコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたバインダーB1又は転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2とバインダーBN又は転写因子TNの融合変異体含む遺伝子スイッチ。
25.前記(A)において、
リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1又はリガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高くかつ2入力・AND型出力センサ機能を有することを特徴とする、前項24に記載の遺伝子スイッチ。
26.前記(A)において、
転写因子T2によって制御されるプロモータP2を使用した場合、リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高くかつ2入力・AND型出力センサ機能を有する、
又は、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1の導入によるレポーターの発現量比が高くかつ2入力・AND型出力センサ機能を有する、
ことを特徴とする、前項24に記載の遺伝子スイッチ。
27.前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドなしのレポーターの発現量比が高くかつ2入力・OR型センサ機能を有する、
又は、
転写因子T2によって制御されるプロモータP2を使用した場合、リガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドなしのレポーターの発現量比が高くかつ2入力・OR型センサ機能を有する、
ことを特徴とする、前項24に記載の遺伝子スイッチ。
28.前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高くかつリガンドL1に特異的に応答する出力型センサの機能を有する、
又は、
転写因子T2によって制御されるプロモータP2を使用した場合、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1の導入によるレポーターの発現量比が高くかつリガンドL2に特異的に応答する出力型センサの機能を有する、
ことを特徴とする、前項24に記載の遺伝子スイッチ。
29.前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドなしのレポーターの発現量/リガンドL1の導入によるレポーターの発現量比が高く,かつリガンドなしのレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高くかつNOR型センサ機能を有することを特徴とする、前項24に記載の遺伝子スイッチ。
30.前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドなし又はリガンドL1若しくはリガンドL2の一方の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高くかつNAND型センサ機能を有することを特徴とする、前項24に記載の遺伝子スイッチ。
31.前記(A)において、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL2導入によるレポーターの発現量の両方が減少しかつ2入力3段階出力低下型センサとしての機能を有することを特徴とする、前項24に記載の遺伝子スイッチ。
32.前記(A)において、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL2導入によるレポーターの発現量の両方が上昇しかつ2入力3段階出力向上型センサとしての機能を有することを特徴とする、前項24に記載の遺伝子スイッチ。
33.前記(B)において、N=3であり、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL3導入によるレポーターの発現量が減少しかつ3入力4段階出力低下型センサとしての機能を有することを特徴とする、前項24に記載の遺伝子スイッチ。
34.前記(B)において、N=3であり、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL3導入によるレポーターの発現量が上昇しかつ3入力4段階出力向上型センサとしての機能を有することを特徴とする、前項24に記載の遺伝子スイッチ。
35.前記(B)において、N=3であり、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量は向上せず、リガンドL3の導入によるレポーターの発現量が向上しかつレポーターR1、レポーターR2及びレポーターR3が発現しかつリガンドL3に特異的に応答する多出力型センサとしての機能を有することを特徴とする、前項24に記載の遺伝子スイッチ。
36.前記(B)において、N=3であり、
リガンドL2の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL3の導入によるレポーターの発現量が向上し、リガンドL1の導入によるレポーターの発現量は向上せず、かつレポーレポーターR2が発現しかつリガンドL2とリガンドL3に特異的に応答する多出力型センサとしての機能を有することを特徴とする、前項24に記載の遺伝子スイッチ。
37.バインダーB1、バインダーB2、バインダーB3及びバインダーBNは転写因子、酵素、抗体、ヒストン、シャペロン又はリボゾームから選択される前項24〜36のいずれか1に記載の遺伝子スイッチ。
38.バインダーB1、バインダーB2、バインダーB3及びバインダーBNは転写因子又は酵素である前項24〜36のいずれか1に記載の遺伝子スイッチ。
39.リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列及び転写因子T2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたリガンドL1検出用遺伝子スイッチであって、
ここで、リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い又はリガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高く、かつリガンドL1検出機能を有することを特徴とするリガンドL1検出用遺伝子スイッチ。
40.前記リガンドL1はヒ素である、前項39に記載の遺伝子スイッチ。
又は、以下の発明を例示することができる。
1.以下の工程を有する、多入力・多出力型遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子の製造方法、
(A)
(1)リガンドL1に応答する転写因子T1をコードする遺伝子配列及びリガンドL2に応答する転写因子T2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られた転写因子T1と転写因子T2の融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T1によって制御されるプロモータP1をコードする遺伝子配列及び/又は転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及び該プロモータ配列P1及び/若しくはP2と機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを、細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Xは1以上の整数を意味する、
(2)リガンドL1及び/又はリガンドL2を(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
(3)レポーターの発現量を指標として、転写因子T1と転写因子T2の融合変異体を遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する工程、
又は、
(B)
(1)リガンドL1に応答する転写因子T1をコードする遺伝子配列、リガンドL2に応答する転写因子T2をコードする遺伝子配列及びリガンドLNに応答する転写因子TNをコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られた転写因子T1と転写因子T2と転写因子TNの融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T1によって制御されるプロモータP1をコードする遺伝子配列、転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及び/若しくは転写因子TNによって制御されるプロモータPNをコードする遺伝子配列及び該プロモータ配列P1、P2及び/若しくはPNと機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを、細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Nは、3以上の整数を意味する、
(2)リガンドL1、リガンドL2及び/又はリガンドLNを(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に導入する工程、
(3)レポーターの発現量を指標として、転写因子T1と転写因子T2と転写因子TNの融合変異体を遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する工程。
2.前記(A)において、
リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1又はリガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体を2入力・AND型出力センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
3.前記(A)において、
転写因子T2によって制御されるプロモータP2を使用した場合、リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体を2入力・AND型出力センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
又は、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体を2入力・AND型出力センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
4.前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドなしのレポーターの発現量比が高い融合変異体を2入力・OR型センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
又は、
転写因子T2によって制御されるプロモータP2を使用した場合、リガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドなしのレポーターの発現量比が高い融合変異体を2入力・OR型センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
5.前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体をリガンドL1に特異的に応答する出力型センサの遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
又は、
転写因子T2によって制御されるプロモータP2を使用した場合、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体をリガンドL2に特異的に応答する出力型センサの遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
6.前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるリプレッサー型のプロモータP1を使用した場合、リガンドL1の導入によるレポーターの発現量又はリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドなしのレポーターの発現量比が高い融合変異体を、NOR型センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
7.前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるリプレッサー型のプロモータP1を使用した場合、リガンドなし又はL1若しくはL2の一方の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体を、NAND型センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
8.前記(A)において、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL2導入によるレポーターの発現量の両方が減少する融合変異体を2入力3段階出力低下型センサとしての機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
9.前記(A)において、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL2導入によるレポーターの発現量の両方が上昇する融合変異体を2入力3段階出力向上型センサとしての機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
10.前記(B)において、N=3であり、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL3導入によるレポーターの発現量が減少する融合変異体を3入力4段階出力低下型センサとしての機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
11.前記(B)において、N=3であり、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL3導入によるレポーターの発現量が上昇する融合変異体を3入力4段階出力向上型センサとしての機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
12.前記(B)において、N=3であり、
転写因子T1によって制御されるリプレッサー型のプロモータP1、プロモータ配列P1と機能的に連結されたレポーターR1、転写因子T2によって制御されるアクチベータ型のプロモータP2、プロモータ配列P2と機能的に連結されたレポーターR2、並びに転写因子T3によって制御されるアクチベータ型のプロモータP3、プロモータ配列P3と機能的に連結されたレポーターR3を使用し、
変異導入によってリガンド結合能を消失させた転写因子T1と転写因子T2と転写因子T3の融合変異体の核酸のライブラリを使用し、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量は向上せず、リガンドL3の導入によるレポーターの発現量が向上しかつレポーターR1、レポーターR2及びレポーターR3が発現する融合変異体をリガンドL3に特異的に応答する多出力型センサの遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
13.前記(B)において、N=3であり、
転写因子T1によって制御されるリプレッサー型のプロモータP1、プロモータ配列P1と機能的に連結されたレポーターR1、転写因子T2によって制御されるアクチベータ型のプロモータP2、プロモータ配列P2と機能的に連結されたレポーターR2、並びに転写因子T3によって制御されるアクチベータ型のプロモータP3、プロモータ配列P3と機能的に連結されたレポーターR3を使用し、
変異導入によってリガンド結合能を消失させた転写因子T1と変異導入によってリガンド結合能を消失させた転写因子T2と転写因子T3の融合変異体の核酸のライブラリを使用し、
リガンドL2の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL3の導入によるレポーターの発現量が向上し、リガンドL1の導入によるレポーターの発現量は向上せず、かつレポーレポーターR2が発現する融合変異体をリガンドL2とリガンドL3に特異的に応答する多出力型センサの遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、前項1に記載の方法。
14.以下の工程を有する、リガンドL1検出用遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子の製造方法、
(1)リガンドL1に応答する転写因子T1をコードする遺伝子配列及び転写因子LuxRをコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られた転写因子T1と転写因子LuxRの融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子LuxRによって制御されるプロモータPluxをコードする遺伝子配列及びプロモータPluxと機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持した発現ベクターを細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Xは1以上の整数を意味する、
(2)リガンドL1及び/又はリガンドAHLを(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
(3)リガンドL1及びリガンドAHLの導入によるレポーターの発現量/リガンドAHLの導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体又はリガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドAHLの導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体をリガンドL1検出用遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する工程。
15.前記リガンドL1はヒ素である、前項14に記載の製造方法。
16.以下の工程を有する、リガンドL1による転写因子T2によって制御されるプロモータP2の発現を亢進させることが可能な転写因子の製造方法、
(1)リガンドL1に応答する転写因子T1をコードする遺伝子配列及びリガンドL2に応答する転写因子T2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られた転写因子T1と転写因子T2の融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及びプロモータP2と機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Xは1以上の整数を意味する、
(2)リガンドL1及び/又はリガンドL2を(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
(3)リガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体をリガンドL1による転写因子T2によって制御されるプロモータP2の発現を亢進させることが可能な転写因子として選抜する工程。
17.前項1〜16のいずれか1以上の製造方法から得られた遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子をリガンドL1、リガンドL2及び/又はリガンドLNの検出用センサとしての使用方法。
18.以下のリガンドL1、リガンドL2及び/又はリガンドLNの検出感度調整工程を含む、前項17に記載の使用方法。
(1)リガンドL1への応答感度を上げる場合には、リガンドL2及び/又はリガンドLNの添加濃度を上げる
(2)リガンドL1への応答感度を下げる場合には、リガンドL2及び/又はリガンドLNの添加濃度を下げる
(3)リガンドL2への応答感度を上げる場合には、リガンドL1及び/又はリガンドLN添加濃度を上げる
(4)リガンドL2への応答感度を下げる場合には、リガンドL1及び/又はリガンドLN添加濃度を下げる
(5)リガンドLNへの応答感度を上げる場合には、リガンドL1及び/又はリガンドL2の添加濃度を上げる
(6)リガンドLNへの応答感度を下げる場合には、リガンドL1及び/又はリガンドL2の添加濃度を下げる
19.配列番号15で表さるアミノ酸配列において、以下の(1)〜(5)のいずれか1から選択されるアミノ酸置換を有するAraC-LuxRN86K and C245Wの融合変異体。
(1)F74L、P86T、V249A及びN298I
(2)P39R、I197N及びN252S
(3)E295K
(4)M175K及びK491E
(5)H80F、H81K、Y82L、N393I、Y439H、R523L及びF541L
20.配列番号16で表さるアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換を有するTetR-AraC-LuxRN86Kand C245Wの融合変異体、
K46R、D95G、K108N、I134V、V145A、L204P、I214N、P216T、F217S、L409Q、T545A及びS569T。
21.配列番号17で表さるアミノ酸配列において、以下の(1)〜(2)のいずれか1から選択されるアミノ酸置換又は欠失を有するArsR-LuxRN86K and C245Wの融合変異体。
(1)E16D、T17-
(2)I84N、N102D、F240L、P277A
本発明の「多入力・多出力(gate)型」とは、複数のリガンドに対して、複数の種類の応答を示すことができることを意味する。
なお、本発明では、発明の内容を説明するために、「リガンドL1」、「リガンドL2」、「リガンドLN」、「転写因子T1」、「転写因子T2」、「転写因子TN」、「プロモータP1」、「プロモータP2」、「プロモータPN」、「レポーターRx」、「バインダーB1」、「バインダーB2」、「バインダーBN」等を使用している。Xは1以上の整数を意味し、Nは、3以上の整数を意味する。
加えて、リガンドにおいて、「N」は3を意味する場合、3つのリガンドであるリガンド1、リガンドL2及びリガンドL3を意味し、「N」は4を意味する場合、4つのリガンドであるリガンドL1、リガンドL2、リガンドL3及びリガンドL4を意味し、「N」は5を意味する場合、5つのリガンドであるリガンド1、リガンドL2、リガンドL3、リガンドL4及びリガンドL5を意味する。転写因子TNプロモータPN、バインダーBNも同様である。なお、これらの用語は、単なる例示であり、本発明の内容を限定するものではない。
2つのリガンドL1、リガンドL2に応答する多出力(gate)型としては、以下を例示することができる(参照:図17)。なお、本発明の多入力・多出力型遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子は、下記の実施例の結果から明らかなように、単に、「0」又は「1」の出力だけではなく、リガンドLの量(特に、環境中のリガンドLの濃度)に依存して、出力量を変化させることができる。出力量は、X1<X2<X3であり、X1は実質的に0以上の出力値を意味する。
(1)OR gate
(2)AND gate
(3)NOR gate
(4)NAND gate
(5)リガンドL1に応答するgate
(6)リガンドL2に応答するgate
(7)2入力型3段階出力低下型gate(リガンド数(量)が多ければ、出力が下がる)
(8)2入力型3段階出力向上型gate(リガンド数(量)が多ければ、出力が上がる)
(1)3入力型4段階出力低下型gate(リガンド数(量)が多ければ、出力が下がる)
(2)3入力型4段階出力向上型gate(リガンド数(量)が多ければ、出力が上がる)
(3)リガンドL3に応答するgate
(4)リガンドL2及びL3に応答するgate
出力量は、X1<X2<X3<X4であり、X1は実質的に0以上の出力値を意味する。
(1)N入力型N+1段階出力低下型gate(リガンド数(量)が多ければ、出力が下がる)
(2)N入力型N+1段階出力向上型gate(リガンド数(量)が多ければ、出力が上がる)
(3)N入力型2段階出力向上型gate(リガンドがN個の場合とそれ以外では出力が異なる。)
(4)N入力型2段階出力低下型gate(リガンドがN個の場合とそれ以外では出力が異なる。)
多入力・多出力型遺伝子スイッチとして機能する遺伝子融合変異体は、リガンドL1、L2及び/又はLNによって、T1、T2及び/又はTNによって制御されるプロモータP1、P2及び/又はPNの発現を亢進又は抑制させることができる。
より詳しくは、以下を例示することができる。
(1)リガンドL1によって転写因子T2によって制御されるプロモータP2の発現を亢進させることが可能な遺伝子融合変異体
(2)リガンドL1によって転写因子T2によって制御されるプロモータP2の発現を減少させることが可能な遺伝子融合変異体
(3)リガンドL1によって転写因子T1、転写因子T2及び転写因子TN によって制御されるプロモータP1、P2及びPNの発現を亢進又は抑制させることが可能な遺伝子融合変異体
(4)リガンドL1によって転写因子T2及び転写因子TNによって制御されるプロモータP2及びPNの発現を亢進又は抑制させることが可能な遺伝子融合変異体
(5)リガンドL1及びL2によって転写因子T1、転写因子T2及び転写因子TNによって制御されるプロモータP1、P2及びPNの発現を亢進又は抑制させることが可能な遺伝子融合変異体
(6)リガンドL1及びL2によって転写因子T2及び転写因子TNによって制御されるプロモータP2及びPNの発現を亢進又は抑制させることが可能な遺伝子融合変異体
(7)リガンドリガンドL1、L2及びLNによって、転写因子T1、T2及びTNによって制御されるプロモータP1、P2及びPNの発現を亢進させることができる遺伝子融合変異体
(8)リガンドL1、L2及びLNによって、転写因子T1、T2及びTNによって制御されるプロモータP1、P2及びPNの発現を抑制させることができる遺伝子融合変異体
(9)リガンドL1よって転写因子T1、転写因子T2及び転写因子T3によって制御されるプロモータP1の発現が抑制され、かつプロモータP2及びプロモータP3の発現を亢進させる遺伝子融合変異体
より詳しくは、下記実施例により、以下の遺伝子融合変異体を例示することができる。
(1)AND(AHL/Arabinose)、OR(AHL/Arabinose)、Ignore-AHL(Arabinose-only)及びIgnore-arabinose (AHL-only) 型応答をする転写因子T1−T2(AraC-LuxR)遺伝子融合変異体は、プロモータP1及びプロモータP2に対して作用して、さらに、該プロモータの下流の遺伝子を同時に制御することができる。
(2)転写因子T1−T2−T3(TraR-AraC-LuxR)遺伝子融合変異体は、リガンドL1(aTc)、リガンドL2(arabinose)、リガンドL3(AHL)に応答して、プロモータP1(TetP)、プロモータP2(pBAD)及びプロモータP3(pLux)下流の遺伝子(operon含む)を同時に制御することができる。
本発明の「多入力・多出力型遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子の製造方法」(以後、「本発明の製造方法(本発明の方法)」と略する場合がある)では、「2以上の転写因子遺伝子又は1以上の転写因子と1以上のバインダーを融合する」及び「該融合型転写因子遺伝子に変異を導入する」ことを必須工程としているが、その他の工程は特に限定されない。例えば、以下の工程又は以下の工程と実質的に同じ工程を含む。
また、本発明者らがすでに発表した文献「PLoS ONE 10(3):e0120243.」に記載の方法を参照することができる。
以下の工程を有する、多入力・多出力型遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子の製造方法、
(A)
(1)リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列及びリガンドL2に応答するバインダーB2又は転写因子T2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたバインダーB1又は転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2の融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T1によって制御されるプロモータP1をコードする遺伝子配列及び/又は転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及び該プロモータ配列P1及び/若しくはP2と機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを、細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Xは1以上の整数を意味する、
(2)リガンドL1及び/又はリガンドL2を(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
(3)レポーターの発現量を指標として、バインダーB1又は転写因子T1とバインダーB1又は転写因子T2の融合変異体を遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する工程、
又は、
(B)
(1)リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列、リガンドL2に応答するバインダーB2又は転写因子T2をコードする遺伝子配列及びリガンドLNに応答するバインダーBN又は転写因子TNをコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたバインダーB1又は転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2とバインダーBN又は転写因子TNの融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T1によって制御されるプロモータP1をコードする遺伝子配列、転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及び/若しくは転写因子TNによって制御されるプロモータPNをコードする遺伝子配列及び該プロモータ配列P1、P2及び/若しくはPNと機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを、細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Nは、3以上の整数を意味する、
(2)リガンドL1、リガンドL2及び/又はリガンドLNを(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に導入する工程、
(3)レポーターの発現量を指標として、バインダーB1又は転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2とバインダーBN又は転写因子TNの融合変異体を遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する工程。
より詳しくは、以下の通りである。
(A)
(1)リガンドL1に応答する転写因子T1をコードする遺伝子配列及びリガンドL2に応答する転写因子T2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られた転写因子T1と転写因子T2の融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T1によって制御されるプロモータP1をコードする遺伝子配列及び/又は転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及び該プロモータ配列P1及び/若しくはP2と機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを、細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Xは1以上の整数を意味する。
(2)リガンドL1及び/又はリガンドL2を(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程。
(3)レポーターの発現量を指標として、転写因子T1と転写因子T2の融合変異体を遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する工程。
(B)
(1)リガンドL1に応答する転写因子T1をコードする遺伝子配列、リガンドL2に応答する転写因子T2をコードする遺伝子配列及びリガンドLNに応答する転写因子TNをコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られた転写因子T1と転写因子T2と転写因子TNの融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T1によって制御されるプロモータP1をコードする遺伝子配列、転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及び/若しくは転写因子TNによって制御されるプロモータPNをコードする遺伝子配列及び該プロモータ配列P1、P2及び/若しくはPNと機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを、細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Nは、3以上の整数を意味する。
(2)リガンドL1、リガンドL2及び/又はリガンドLNを(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に導入する工程。
(3)レポーターの発現量を指標として、転写因子T1と転写因子T2と転写因子TNの融合変異体を遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する工程。
本発明での「遺伝子スイッチ」は、タンパク質に発現した時にスイッチ機能を有しかつ「2以上の転写因子又は1以上の転写因子と1以上のバインダーが融合した遺伝子(融合型転写因子遺伝子)」を意味し、特に、タンパク質に発現した時にスイッチ機能を有しかつ「変異が導入された融合型転写因子遺伝子」又は「遺伝子融合変異体」を意味する。
なお、各転写因子間又は転写因子及びバインダー間には必要に応じて、スペーサーを導入しても良い。好ましくは、制限酵素の認識配列を挿入されていても良い。例えば、制限酵素XbaIを使用する場合には、該酵素認識由来のアミノ酸配列SR(塩基配列TCTAGA)、制限酵素SpeIを使用する場合には該酵素認識配列由来のアミノ酸配列TS(塩基配列ACTAGT)を例示することができる。
本発明の遺伝子スイッチは、上記記載したように各gate機能を有する。
本発明での「リガンドL」は、転写因子に結合することにより遺伝子スイッチの機能を変化させ、その結果、遺伝子または多数の遺伝子の直接的または間接的な発現の調節を誘導する物質、例えばそのような化合物を意味する。「リガンド」は、「遺伝子スイッチを活性化する化合物」と言うこともできる。活性化物質は、遺伝子スイッチにより異なる。
本発明での「バインダーB」は、転写因子、酵素、抗体、ヒストン、シャペロン又はリボゾームから選択されるが、好ましくは、転写因子又は酵素である。
本発明での「プロモータP」は、転写因子によって制御されるプロモータ活性を有する核酸配列を意味する。プロモータは、レポーターR遺伝子をコードする遺伝子またはその活性部分の翻訳開始の5'上流に位置する核酸配列であって、レポーターRの転写を制御する核酸配列を意味する。
プロモータは、使用する宿主細胞の種によって適宜選択して使用される。細菌を宿主として使用する場合、プロモータとして、大腸菌などの宿主細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを使用してもよい。例えば、λPRプロモータ、PLプロモータ、trpプロモータ、およびlacプロモータなどの、大腸菌やファージに由来するプロモータを例示できる。tacプロモータなどの人為的に設計改変されたプロモータを使用してもよい。酵母を宿主とする場合、プロモータとして、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを使用してもよい。例えば、gal1プロモータ、gal10プロモータ、ヒートショックタンパク質プロモータ、MFα1プロモータ、PHO5プロモータ、PGKプロモータ、GAPプロモータ、ADHプロモータ、およびAOX1プロモータなどを例示できる。動物細胞を宿主とする場合は、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモータ、RNAスプライス部位、目的遺伝子、ポリアデニル化部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモータとして、SRαプロモータ、SV40プロモータ、LTRプロモータ、およびCMVプロモータなどを使用することができ、また、サイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモータなどを使用してもよい。
リガンドL、該リガンドLに応答する転写因子T及び該転写因子Tによって制御されるプロモータPの組合せは以下を例示することができる。
〇アクチベータ型のプロモータ
Arabinose、AraC、PBAD(アラビノースオペロン)
オペレーター DNA にアクチベータータンパク質が結合していないと転写が起こらない。環境中にArabinoseが存在すると、アラビノース・アクチベーターのコンフォメーションが変化する。コンフォメーションが変化したアラビノース・アクチベーターがオペレーターに結合する。これにより、RNA ポリメラーゼはオペロンを転写できるようになり、PBAD下流のレポーターR遺伝子が発現する。
AHL、LuxR、Plux
環境中にAHLが存在すると、転写因子(転写調節因子)であるLuxRと結合する。そして、AHL-LUxR複合体がpluXプロモーターを活性化させることにより、下流の遺伝子であるレポーター遺伝子Rが発現する。
Xylose、XylR、Pxyl
〇リプレッサー型のプロモータ
aTc、TetR、Ptet
ヒ素、ArsR、Pars
IPTG、LacI、Plac
本発明での「融合変異体の核酸のライブラリ」は、リガンドL1に応答する転写因子T1又はバインダーB1をコードする遺伝子配列及びリガンドL2に応答する転写因子T2又はバインダーB2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物(発現用ベクターを含む)又はリガンドL1に応答する転写因子T1又はバインダーB1をコードする遺伝子配列、リガンドL2に応答する転写因子T2又はバインダーB2をコードする遺伝子配列及びリガンドLNに応答する転写因子TN又はバインダーBNをコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物(発現用ベクターを含む)に、自体公知の変異(例、ランダム変異、Fold-X等の安定性予測ソフトウエアを使用した部位特異的変異)を導入して、得られた複数の種類の変異を有する転写因子T1又はバインダーB1と転写因子T2又はバインダーB2の融合変異体(転写因子T1又はバインダーB1と転写因子T2又はバインダーB2と転写因子TN又はバインダーBNの融合変異体)である。
なお、転写因子T1と転写因子T2の融合方法は、特に限定されず、タンデムなin-frame融合、転写因子のループ部分にもう一方の遺伝子を挿入する融合方式でも良い。
加えて、本発明の変異の好ましい例として、タンパク質(融合変異体)の不安定化を起すことである。まず、タンパク質の安定性とは、フォールディング状態の安定性、すなわち、そのタンパク質をなすポリペプチド鎖が、機能構造を形成するとき(フォールディングするとき)に生じる自由エネルギー変化(ΔGfold)である。そして、「不安定化」とは、フォールディングエネルギーに伴う自由エネルギー変化(ΔGfold)を減らし、そして最終的にはキャンセルしてしまうことを意味する。例えば、あるアミノ酸置換によって、機能構造(フォールド)の安定性が低下する場合、そのアミノ酸置換は「不安定化をもたらす変異(不安定化変異)」である。詳しくは、変異により適度な不安定化を誘導できれば、リガンドが存在する時のみ、融合変異体のフォールド状態を保持できる(つまりΔGfold<0となる)。
本発明での「レポーターRx」は、融合変異体を選抜するための指標となれば特に限定されないが、例えば、蛍光タンパク質(GFP)、チミジンキナーゼ(参照:特開2013-17473)、アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(参照:国際公報WO2012/060407)、色素合成タンパク質(参照:特開2014-223038号公報)、色素タンパク質(amilCP)等を例示することができる。
詳しくは、蛍光タンパク質や色素タンパク質を用いた場合は、リガンドLを培地中へ添加・非添加したときの培養液の呈色をもとに融合変異体を選択する。チミジンキナーゼやアルキルアデニンDNAグリコシラーゼ、各種薬剤トランスポータや薬剤耐性マーカー、トキシン・アンチトキシンペアなどを用いた場合は、細胞の生死や増殖の可否を指標として、融合変異体を選択する。
さらに、レポーターRは、各プロモータPと機能的に連結されていれば特に限定されないが、プロモータP毎にレポーターRの種類を変えることができる。例えば、プロモータP1−レポーターR1、プロモータP2−レポーターR2、プロモータP3−レポーターR3等の組合せを例示することができる。
本発明での「レポーター用発現ベクター」は、転写因子T1によって制御されるプロモータP1をコードする遺伝子配列及び/又は転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列並びにプロモータP1配列と機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列及び/又はプロモータP2配列と機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列、又は、転写因子T1によって制御されるプロモータP1をコードする遺伝子配列、転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列、及び/又は転写因子TNによって制御されるプロモータPNをコードする遺伝子配列及びプロモータP1配列と機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列、プロモータP2配列と機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列及び/又はプロモータP3配列と機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持する。なお、レポーターRXは、複数種類存在しても良いし、各プロモータの下流に1又は複数個存在しても良い。
ベクターDNAに目的遺伝子を組み込む方法は、自体公知の遺伝子工学的技術を適用できる。例えば、目的遺伝子を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターDNAと混合し、リガーゼにより再結合する方法が用いられる。あるいは、目的遺伝子に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても所望のベクターDNAが得られる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法は、宿主細胞にベクターDNAを導入して宿主細胞中で目的遺伝子を発現させ得る導入方法であれば特に限定されず、宿主細胞の種により適宜選択した公知の方法のいずれを使用してもよい。例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などを例示できる。
本発明での「細胞又は無細胞タンパク質合成系」は、転写因子T、プロモータP及びレポーターRXがタンパク質発現できる環境であれば特に限定されない。例えば、細胞は、原核細胞および単離された真核細胞のいずれであってもよいが、細胞周期が短く増殖速度の速い原核細胞が好ましい。このような性質を有する細胞は、遺伝子スイッチの迅速な製造方法に有用である。例えば、無細胞タンパク質合成系は、タンパク質合成に必須な成分を含む公知の無細胞タンパク質合成系(コムギ、大腸菌等)を例示することができる。
なお、「リガンドL1及び/又はリガンドL2を細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程」とは、リガンドL1及び/又はリガンドL2の細胞又は無細胞タンパク質合成系への添加は、融合変異体の核酸のライブラリ及び/又はレポーター用発現ベクターを細胞に添加した前、後又は実質的に同時でも良い。
本発明での「遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する工程」は、レポーターRXの発現量を指標として、目的とする多入力・多出力型遺伝子スイッチ型の性質を示す融合変異体を選抜する。
なお、選抜した融合体の遺伝子配列及び/又はアミノ酸配列を自体公知の方法により解析する。これにより、多入力・多出力型遺伝子スイッチ又は転写因子の情報(塩基配列、アミノ酸配列)を得ることができる。
さらに、該情報により、自体公知のタンパク質合成システムを使用すれば、容易に、多入力・多出力型遺伝子スイッチ又は転写因子を得ることができる。
本発明での「遺伝子回路」は、少なくとも以下を有する。
〇リガンドL1に応答する転写因子T1をコードする遺伝子配列
〇リガンドL2に応答する転写因子T2をコードする遺伝子配列
〇転写因子T1によって制御されるプロモータP1をコードする遺伝子配列及び/又は転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列
〇プロモータP1配列と機能的に連結されたレポーターRX及び/又はプロモータP2配列と機能的に連結されたレポーターRX
なお、上記すべてが、同一の遺伝構築物に含まれていても良いし、複数の遺伝子構築物に分けて含まれても良い。
さらに必要に応じて、リボソーム結合配列、ターミネータ、シグナル配列、エンハンサなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー(セレクタ:ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子など)等を含んでも良い。
さらに、オペレーター(リプレッサーやアクチベーターが結合する DNA 領域)配列や調節遺伝子配列も含んでも良い。
本発明での「バイオセンサ」は、複数のリガンドに対して複数の種類の応答を示すことができれば、特に構成は限定されないが、転写因子、プロモータ及びレポーターがタンパク質として発現可能な系である(遺伝子回路を発現可能な系である)細胞又は遺伝子回路を含む無細胞タンパク質合成系を例示することができる。
本発明の多入力・多出力型遺伝子スイッチでは、図16及び図17に記載の方法により、目的の多入力・多出力型遺伝子スイッチ又は転写因子を選抜することができる。
本発明の製造方法において、2回以上の変異導入回数を実施する例として、リガンドL2に特異的に応答する出力型センサの遺伝子スイッチ又は転写因子の製造方法を示す。
(i)転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体を第2世代の親として取得する工程、
(ii)前記第2世代の親にランダム変異を導入して、融合変異体の核酸又はタンパク質の第2世代ライブラリを取得する工程、
(iii)前記第2世代ライブラリ、並びに、転写因子T1によって制御されるプロモータP1をコードする遺伝子配列及び該プロモータ配列と機能的に連結されたレポーターをコードする遺伝子配列を担持した発現ベクターを細胞に導入する工程、
(iV)リガンドL1及び/又はリガンドL2を(iii)の細胞に導入する工程、
(V)リガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドなしのレポーターの発現量リ比が高い融合変異体をリガンドL2に特異的に応答する2入力・1方出力型センサの遺伝子スイッチとして選抜する工程。
なお、必要に応じて、(i)〜(V)を繰り返すことにより、変異導入回数及び選抜回数を増やすことができる。
変異融合体に含まれる転写因子の種類を増やした場合には、予め特定の転写因子のみに部分変異を実施することもできる(参照:実施例3)。これにより、転写因子Tのリガンド結合部位を機能不全にすることができる。
本発明の製造方法では、リガンドL1検出用遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子を以下の工程から得ることができる。
(1)リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列及び転写因子T2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたバインダーB1又は転写因子T1と転写因子T2の融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及びプロモータP2と機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持した発現ベクターを細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Xは1以上の整数を意味する、
(2)リガンドL1及び/又はリガンドL2を(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
(3)リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体又はリガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体をリガンドL1検出用遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する工程。
より詳しくは、下記の実施例6により、リガンドであるAHL、転写因子であるLuxR及びプロモータであるPluxを使用することにより、高感度リガンド検出用遺伝子スイッチ又は転写因子を得ることができる。製造例は、以下の通りである。
(1)リガンドL1に応答する転写因子T1をコードする遺伝子配列及び転写因子LuxRをコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られた転写因子T1と転写因子LuxRの融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子LuxRによって制御されるプロモータPluxをコードする遺伝子配列及び該プロモータ配列と機能的に連結されたレポーターRXをコードする遺伝子配列を担持した発現ベクターを細胞又は無細胞タンパク質合成系に導入する工程、
(2)リガンドL1及び/又はリガンドAHLを(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
(3)リガンドL1及びリガンドAHLの導入によるレポーターの発現量/リガンドAHLの導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体又はリガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドAHLの導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体をリガンドL1検出用遺伝子スイッチ又は転写因子として選抜する工程。
リガンドとしては、ヒ素を例示することができる。
本発明のバイオセンサにおいて、リガンドL1、リガンドL2及び/又はリガンドLNの検出感度を下記記載のように容易に調整することができる。
(1)リガンドL1への応答感度を上げる場合には、リガンドL2及び/又はリガンドLNの添加濃度を上げる。
(2)リガンドL1への応答感度を下げる場合には、リガンドL2及び/又はリガンドLNの添加濃度を下げる。
(3)リガンドL2への応答感度を上げる場合には、リガンドL1及び/又はリガンドLN添加濃度を上げる。
(4)リガンドL2への応答感度を下げる場合には、リガンドL1及び/又はリガンドLN添加濃度を下げる。
(5)リガンドLNへの応答感度を上げる場合には、リガンドL1及び/又はリガンドL2の添加濃度を上げる。
(6)リガンドLNへの応答感度を下げる場合には、リガンドL1及び/又はリガンドL2の添加濃度を下げる。
本発明の製造方法では、リガンドL1と転写因子T1の組合せが、融合パートナーである転写因子T2の制御配列下であるプロモータP2の遺伝子の発現を亢進・抑制(ON/ OFF)することができる融合変異体を得ることができる。例えば、以下の方法を例示することができる。
(1)リガンドL1に応答する転写因子T1をコードする遺伝子配列及びリガンドL2に応答する転写因子T2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られた転写因子T1と転写因子T2の融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及び該プロモータ配列と機能的に連結されたレポーターRXをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを細胞又は無細胞タンパク質合成系に導入する工程。
(2)リガンドL1及び/又はリガンドL2を(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程。
(3)リガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体をリガンドL1による転写因子T2によって制御されるプロモータP2の発現を向上させることが可能な転写因子として選抜する工程。
(1)F74L、P86T、V249A及びN298I
(2)P39R、I197N及びN252S
(3)E295K
(4)M175K及びK491E
(5)H80F、H81K、Y82L、N393I、Y439H、R523L及びF541L
上記(2)のAraC-LuxRN86K and C245Wの融合変異体は、AND gate型転写活性を有する(アラビノースとホモセリンラクトンが両方存在している時に応答する)。
上記(3)のAraC-LuxRN86K and C245Wの融合変異体は、OR gate型転写活性を有する(アラビノース又はホモセリンラクトンが存在している時に応答する)。
上記(4)のAraC-LuxRN86K and C245Wの融合変異体は、L1 only gate型転写活性を有する(アラビノースに特異的に応答する)。
上記(5)のAraC-LuxRN86Kand C245Wの融合変異体は、L2 only gate型転写活性を有する(AHLに特異的に応答する)。
本発明のAraC-LuxRN86K and C245Wの融合変異体は、上記(1)〜(5)に記載のアミノ酸置換配列において、1〜20個、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び/又は付加しておりかつ上記(1)〜(5)の置換体が有する転写活性と実質的同等の活性を有するアミノ酸配列、並びに、上記(1)〜(5)に記載のアミノ酸置換配列と90%以上(又は、92%以上、94%以上、96%以上、98%以上、99%以上)の相同性を有しかつ上記(1)〜(5)の置換体が有する転写活性と実質的同等の活性を有するアミノ酸配列を、含む。
なお、ペプチドの変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質(物性、機能、生理活性又は免疫学的活性等)を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸(極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等)の間での相互の置換は容易に想定される。
また、本発明のTetR-AraC-LuxRN86Kand C245Wの融合変異体は、3入力型4段階出力低下型転写活性を有する(3つのリガンドの種類及び量が多ければ応答が小さくなる)。
本発明のTetR-AraC-LuxRN86Kand C245Wの融合変異体は、上記に記載のアミノ酸置換体のアミノ酸配列において、1〜20個、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び/又は付加しており、かつ該置換体が有する転写活性と実質的同等の活性を有するアミノ酸配列、並びに、上記に記載のアミノ酸置換体のアミノ酸配列と90%以上(又は、92%以上、94%以上、96%以上、98%以上、99%以上)の相同性を有しかつ上記の置換体が有する転写活性と実質的同等の活性を有するアミノ酸配列を、含む。
(1)E16D、T17-(“-“は欠損を意味する)。
(2)I84N、N102D、F240L、P277A
上記(1)のArsR-LuxRN86K and C245Wの融合変異体は、緊縮性の高いAND型ヒ素スイッチである。
上記(2)のArsR-LuxRN86K and C245Wの融合変異体は、高感度AND型ヒ素スイッチである。
本発明のArsR-LuxRN86Kand C245Wの融合変異体は、上記(1)〜(2)に記載のアミノ酸置換・欠失配列において、1〜20個、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び/又は付加しておりかつ上記(1)〜(2)の置換・欠失体が有する転写活性と実質的同等の活性を有するアミノ酸配列、並びに、上記(1)〜(2)に記載のアミノ酸置換・欠失配列と90%以上(又は、92%以上、94%以上、96%以上、98%以上、99%以上)の相同性を有しかつ上記(1)〜(2)の置換・欠失体が有する転写活性と実質的同等の活性を有するアミノ酸配列を、含む。
下記実施例2及び実施例3で使用した試薬等は以下の通りである。
下記組成表を基にして、プラスミドを鋳型に一度PCRを行い、DNAを線形状にした。
下記組成表を基にして、線形状のDNAを鋳型としてEP-PCRを行なった。増幅率は100倍、1,000倍又は10,000倍で、MnCl2濃度は10 μM又は50 μMとした。MnCl2は10倍濃縮されたストック溶液を希釈して使用した。
下記組成表を基にして、AL(AraC-LuxRN86K and C245W、参照:図9)及びTAL(TetR-AraC- LuxRN86K and C245W:参照図10)の両方は、NcoI-HF(New England Biolabs社製品)及びBamHI-HF(New England Biolabs社製品)でdigestionを行った。なお、ベクターのdigestionではrSAP(ShrimpAlkaline Phosphatase、NewEngland Biolabs社製品)も同時に添加した。鋳型DNAは、50 μLの反応系あたり約1 μgを用意した。反応h=条件は37℃、3時間とした。
下記組成表を基にして、ALではベクター100 ngとインサート約100 ng、TALではベクター100 ngとインサート約150 ngで反応を行なった。反応条件は16℃で一晩とした。
本実施例では、多入力・多出力センサの製造の一例として、arabinose(アラビノース)応答性の転写因子AraC(大腸菌MG1655からPCR取得)とAHL(ホモセリンラクトン)応答型転写因子LuxRの変異体{N86K、C245W:Kimura et al., J.Gen. Appl. Microbiol., 62, 240-247 (2016)}を使用した。
図2(a)に示すように、自体公知の方法を基にして、AraC-LuxRN86K and C245Wの融合体(配列番号15)を作成した。L-arabinose及び/又はAHLを該融合体が存在する培地に添加した結果を図2(b)に示す。
AraC-LuxRN86K and C245Wは、2つの転写因子タンパク質をタンデムに融合した構造であるので、それぞれの転写因子の機能は変わらないことを確認した。より詳しくは、該融合タンパク質は、アラビノースプロモータ下流の遺伝子をアラビノースのみ応答して亢進したが、AHLはこれに一切干渉しなかった。同様に、Luxプロモータ下流の遺伝子の発現は、この融合タンパク質によって、AHL依存的に亢進したが、アラビノースには亢進しなかった。
図2(c)及び(d)に示すように、公知のEP-PCR法によって、AraC-LuxRN86K and C245Wにランダム変異を導入して、AraC-LuxRN86K and C245Wの変異体を作製した。詳細は、下記の通りである。
AraC-LuxRN86K and C245W(プラスミド:図9)の全長をEP-PCR(50 μM MnCl2、増幅率10,000倍)にかけ、ランダム変異の導入された変異体プールを作製した(ライブラリサイズは3 x 106であった)。Plux-GFPをレポーターとして、10 μM AHL及び13 mM L-arabinoseを含む固体培地上で蛍光を示すコロニーを90個ピックした。これらのリガンド応答性を評価した(参照:図2)。詳しくは、「10 μM AHLのみ」及び「10 μM AHL + 13 mML-arabinose」に分けて培養して、BOTH(L-arabinose+AHL)/AHL比が2倍以上に向上した変異体が15個得られた。該変異体の中でも、AHLのみ添加したときの緊縮性が高く、かつレポーターをPBAD7-GFPに変更してもAND(論理積)ゲート(2入力・AND型センサ)としての機能を有する変異体を得ることができた(参照:図2 (d) )。
わずか1ラウンドのEP-PCR/スクリーニングにより、AraC-LuxRN86Kand C245Wの変異体(表5参照:F74L、P86T、V249A及びN298I)を得ることができた。
より詳しくは、Plux制御下のGFP発現が、アラビノースとAHLの両者があるときのみ応答するANDゲートとして作用することを確認した。さらに、Luxプロモータのみならず、アラビノースプロモータ{araP(PBAD)}でも同様に作用することを確認した。すなわち、得られたAraC-LuxRN86Kand C245Wの変異体(表5参照:F74L、P86T、V249A及びN298I)は、2つの異なるプロモータに、それぞれ独立にAND応答させることができた。よって、本変異体は、アラビノースプロモータとLuxプロモータにそれぞれ独立に「アラビノース/AHLのAND型出力ができる、「2入力・AND型」のセンサとして機能できることを確認した。
なお、上記のリガンド応答性の評価方法は、詳しくは、以下の通りである。
培養液を生理食塩水で10倍希釈した測定サンプル200 μLをマイクロウェルプレート(Nunc社製品)へ打ち込み、FilterMaxF5(市販の吸光度・蛍光検出装置、MOLECULAR DEVICES社製品)を用いて、595 nmを照射したときの細胞密度および485 nmで励起したときの535 nmの蛍光を測定した。また、ブランク試料として菌を含まない液体培地を生理食塩水で10倍希釈したブランクサンプル200 μLも同時に測定した。サンプルの測定値からブランク試料の値を減算し、希釈率を補正した値でデータ解析を行った。なお、下記の実施例2-2、2-3、2-4、および2-5も同様である。
AraC-LuxRN86K and C245Wの全長をEP-PCR(50 μM MnCl2、増幅率10,000倍)にかけ、ランダム変異の導入された変異体プールを作製した(ライブラリサイズ3 x 106であった)。上記実施例2−1とは異なり、PBAD7-GFPをレポーターとし、ランダムにコロニーを90個ピックした(参照:図3)。これらのリガンド応答性を評価した。詳しくは、「13 mM L-arabinoseのみ」および「13 mM L-arabinose + 100μM AHL」に分けて培養して、BOTH(L-arabinose+AHL)/L-arabinose比が2倍以上に向上した変異体7個を得た。中でも、最も高いBOTH/L-arabinose比を示した変異体の蛍光強度測定結果を図3(a) に示す。
わずか1ラウンドのEP-PCR/スクリーニングにより、AraC-LuxRN86K and C245Wの変異体(表5参照:P39R、I197N及びN252S)を得ることができた。
図2(c)で示されるライブラリの中には、さまざまな変異を有するAraC-LuxRN86K and C245Wの変異体が混在している。本実施例では、PBAD7下流に配置したGFPレポーターを使用してスクリーニングを実施し、上記2入力・AND型(図2(d))とは異なり、アラビノース/AHLどちらか一方があればPBAD下のレポーター遺伝子を亢進する「OR型(論理和型)」のバイオセンサを取得できることを確認した。詳しくは、以下の通りである。
AraC-LuxRN86K and C245Wの全長をEP-PCR(50 μM MnCl2、増幅率10,000倍)にかけ、ランダム変異の導入された変異体プールを作製した(ライブラリサイズ3 x 106であった)。PBAD7-GFPをレポーターとし、10 μM AHLを含む固体培地上で蛍光を示すコロニーを90個ピックした。これらのリガンド応答性を評価した。詳しくは、「リガンドなし」および「10μM AHL」に分けて培養して、AHL/none比が3倍以上に向上した変異体が2個得られた。中でも、最も高いAHL/none比を示した変異体の蛍光強度測定結果を図3 (b) に示す。
わずか1ラウンドのEP-PCR/スクリーニングにより、AraC-LuxRN86Kand C245Wの変異体(表5参照:E295K)が得られた。
すなわち、2入力・OR型センサを開発することができた。
本実施例では、2入力・1方出力型センサの例であるAHLには応答せず、アラビノースのみで活性(濃度依存的に応答を示す)「アラビノース-Only」ゲートとしてPBADを使用した遺伝子スイッチを開発した。詳しくは、以下の通りである。
AraC-LuxRN86K and C245Wの全長をEP-PCR(50 μM MnCl2、増幅率10,000倍)にかけ、ランダム変異の導入された変異体プールを作製した(ライブラリサイズ3 x 106であった)。PBAD7-GFPをレポーターとし、13 mM L-arabinoseを含む固体培地上で蛍光を示すコロニーを90個ピックした。これらのリガンド応答性を評価した。詳しくは、「13 mM L-arabinose」および「10 μM AHL」に分けて培養し、L-arabinose/AHL比が2倍以上に向上した変異体が46個得られた。中でも、L-arabinose/AHL比が高くかつAHLのみにおける漏出発現の低かった変異体の蛍光強度測定結果を図3 (c) に示す。
わずか1ラウンドのEP-PCR/スクリーニングにより、AraC-LuxRN86Kand C245Wの変異体(表5参照:M175K andK491E)が得られた。
すなわち、2入力・1方出力型センサを開発することができた。
本実施例では、2入力・1方出力型センサの例であるアラビノースには応答せず、AHLのみで活性(濃度依存的に応答を示す)「AHL-Only」ゲートとしてPBADを使用した遺伝子スイッチを開発した。
まず、AraCのリガンド(アラビノース)結合部位のアラビノース認識に必要なアミノ酸残基に変異を導入することによって、AraC-LuxRのアラビノースとの親和性を低下させた。そして、該低下させたライブラリを使用して、EP-PCR/スクリーニングを行った。詳しくは、以下の通りである。
第1世代:公知の方法により、AraC-LuxRのL-arabinose結合残基(H80、H81及びY82)をランダム化したライブラリを作製した(ライブラリサイズ3 x106であった)。PBAD7-GFPをレポーターとし、10 μM AHLを含む固体培地上で蛍光を示すコロニーを48個選択した。これらのリガンド応答性を評価した。詳しくは、「リガンドなし」、「13mM L-arabinose」、および「10 μM AHL」に分けて培養し、L-arabinoseには応答せずかつAHL添加時に蛍光を示す変異体が5個得られた。中でも、AHL/none比およびL-arabinose/none比が、それぞれ1.0倍および1.6倍の変異体(H80F、H81K及びY82L)を2世代目の親として採用した。
第2世代:1世代目で獲得した変異体の全長をEP-PCR(50 μM MnCl2、増幅率10,000倍)にかけ、ランダム変異の導入された変異体プールを作製した(ライブラリサイズ5 x 105であった)。PBAD7-GFPをレポーターとし、10 μM AHLを含む固体培地上に形成されたコロニー計1600個のうち、中程度から強い蛍光を示すコロニーを41個ピックした。これらのリガンド応答性を評価した。詳しくは、「リガンドなし」、「13mM L-arabinose」及び「10 μM AHL」に分けて培養し、L-arabinoseには応答せずかつAHL/none比が2倍以上の変異体が5個得られた。中でも、最もAHL/none比の高かった変異体の蛍光強度測定結果を図3(d) に示す。
2ラウンドのスクリーニング(進化工学)により、AraC-LuxRN86K and C245Wの変異体(表5参照:H80F,H81K、Y82L、N393I、Y439H、R523L及びF541L)が得られた。
すなわち、実施例2−4とは異なる、2入力・1方出力型センサを開発することができた。
〇TetR-AraC-LuxRN86K and C245Wの融合体の作製
実施例2で作製した2入力型センサを基にして3入力型センサを開発した。実施例2で作製したAraC-LuxRN86K and C245Wの融合体のN末端に、さらにもうひとつの転写因子、TetR(テトラサイクリン応答性の転写因子)を融合し、TetR-AraC-LuxRN86Kand C245Wを作成した(参照:図4)この3転写因子融合タンパク質(配列番号16)は、いずれの標的プロモータに対しても、機能を保持していることを確認した。さらに、各転写因子は、各々の標的リガンドにしか応答しないことを確認した(参照:図5(a))。詳しくは、TetP(Tetプロモータ)に対しては、TetRの標的物質aTc(無水テトラサイクリン)にのみ応答して作用した。つまり、アラビノースにも、AHLにも応答しなかった。
第1世代:TetR-AraC-LuxRN86K and C245W(参照:図10)の全長をEP-PCR(50 μM MnCl2、増幅率1,000)にかけ、ランダム変異の導入された変異体プールを作製した(ライブラリサイズ1 x 105であった)。Ptet-GFP(参照:図15:Ptet-GFP-TK::APH)をレポーターとし、216 nM aTc、13 mM L-arabinose及び10 μM AHLを含む固体培地上に形成されたコロニー計3700個の中から、蛍光の弱いコロニーを35個ピックした。これらのリガンド応答性をスポット法で定性的に評価した。各リガンドの有無を掛け合わせた8通りの固体培地において、1個の変異体がすべてのリガンドと結合したときに転写抑制を示したことを確認した。この変異体に導入されていた塩基欠損を除去するために、TetRドメインをAraC-LuxRN86Kand C245Wと再度融合したものを2世代目の親として採用した。
第2世代:1世代目で獲得した変異体の全長をEP-PCR(10 μM MnCl2、増幅率1,000倍)にかけ、ランダム変異の導入された変異体プールを作製した(ライブラリサイズ7 x 105であった)。Plux-APH(Aminoglycosidephosphotransferase:カナマイシン耐性遺伝子)をセレクタとし、塩基欠損や終止コドンの生じた変異体を除去するために、セレクションを行なった(216 nM aTc、13 mM L-arabinose、10 μM AHL及び30 μg/mL Kanamycinで3時間)。
次に、Ptet-GFPをレポーターとし、216 nM aTc、13 mM L-arabinose及び10 μM AHLを含む固体培地上に形成されたコロニー計2000個の中から、蛍光の弱いコロニーを8個ピックした。これらのリガンド応答性をスポット法で定性的に評価した。各リガンドの有無を掛け合わせた8通りの固体培地において、3個の変異体が段階的な転写抑制が見られかつ塩基欠損や終止コドンが発生しなかった。中でも、すべてのリガンドを含む条件における漏出発現の抑えられた変異体を3世代目の親とした。
第3世代:2世代目で獲得した変異体の全長をEP-PCR(10 μM MnCl2、増幅率1,000倍)にかけ、ランダム変異の導入された変異体プールを作製した(ライブラリサイズ3 x 104であった)。Plux-APHをセレクタとし、塩基欠損や終止コドンの生じた変異体を除去するために、セレクションを行なった(216 nM aTc、13 mM L-arabinose、10 μM AHL及び60 μg/mLカナマイシンで3時間)。次に、Ptet-APHをセレクタとし、aTc添加のみでの転写抑制活性の弱まった変異体を濃縮するためにセレクションを行なった(216 nM aTc及び30 μg/mLカナマイシンで3時間)。さらに、Ptet-GFPをレポーターとし、216 nM aTc、13 mM L-arabinose及び10 μM AHLを含む固体培地上に形成されたコロニー計384個の中から、蛍光の弱いコロニーを184個ピックした。これらのリガンド応答性を評価した。詳しくは、「リガンドなし」、「216nM aTcのみ」、「216 nM aTc、13 mM L-arabinose及び10 μM AHL」に分けて培養し、5個の変異体がaTcのみでは転写抑制が弱いが、すべてのリガンドが添加されると高い転写抑制を示した。この5個の変異体の機能はいずれも類似していたが、変異箇所は異なっていたため、これらすべてを4世代目の親とした。
第4世代:3世代目で獲得した5個の変異体を混ぜて全長をEP-PCR(10 μM MnCl2、増幅率1,000倍)にかけ、ランダム変異の導入された変異体プールを作製した(ライブラリサイズ2 x 104であった)。Plux-APHをセレクタとし、塩基欠損や終止コドンの生じた変異体を除去するために、セレクションを行なった(216 nM aTc、13 mM L-arabinose、10 μM AHL、および30 μg/mL Kanで3時間)。さらに、Ptet-APHをセレクタとし、aTc添加のみでの転写抑制活性の弱まった変異体を濃縮するためにセレクションを行なった(216 nM aTcおよび30 μg/mL Kanで3時間)。次に、Ptet-GFPをレポーターとし、216 nM aTc、13 mM L-arabinose、および10 μM AHLを含む固体培地上に形成されたコロニー計900個の中から、蛍光の弱いコロニーを45個ピックした。これらのリガンド応答性をスポット法で定性的に評価した。各リガンドの有無を掛け合わせた8通りの固体培地では、3個の変異体がリガンドの数が増えるにしたがって転写抑制活性が向上した。これら3個の変異体に導入された変異は同一であり、そのうちの1つの変異体の蛍光強度測定結果を図5 (b) に示す。
4ラウンドのスクリーニング(進化工学)により、TetR-AraC-LuxRN86Kand C245Wの変異体(表5参照:K46R、D95G、K108N、I134V、V145A、L204P、I214N、P216T、F217S、L409Q、T545A及びS569T)が得られた。
すなわち、3入力型センサ(特に、3入力型3段階出力低下センサ)を開発することができた。
なお、ヒ素標準液(以下As(III))は、和光純薬工業株式会社からひ素標準液(As 1000)を購入して本実施例で使用した。
(1−1−1)ArsR::LuxRN86K and C245W用ベクターの調製
Plasmid1(表7参照)をPrimer1及び2(表6参照:配列番号1、2)でPCR(KOD plus)処理して、PCR産物を得た。次に、該PCR産物にDpnI処理した後にゲル抽出した。抽出物をXhoI(市販の制限酵素)およびSpeI-HF(市販の制限酵素)でdigestionして、さらにゲル抽出した。
(1−1−2)ArsRドメインの調製(参照:図12)
大腸菌株MG1655のgenomeを鋳型に、Primer3及び4(表6参照:配列番号3、4)でPCR(KOD plus)処理して、PCR産物を得た。次に、該PCR産物にDpnI処理した後にゲル抽出した。抽出物をXhoIおよびSpeI-HFでdigestionして、さらにゲル抽出した。
(1−1−3)ArsR::LuxRN86K and C245Wの回収
上記「1−1−1」のベクター断片及び上記「1−1−2」のインサート断片でligationをした。次に、Ligation産物でXL10-Gold(市販のコンピテント・セル)を形質転換して、クローンを回収した。
(1−2−1)ベクター側の調製
Plasmid1(表7参照)をPrimer1及び2(表6参照)でPCR(KOD plus) 処理して、PCR産物を得た。次に、該PCR産物にDpnI処理した後にゲル抽出した。抽出物をXhoIおよびSpeI-HFでdigestionして、さらにゲル抽出した。
(1−2−2)インサート側の調製
大腸菌株MG1655のgenomeを鋳型に、Primer3及び5(表6参照:配列番号3、5)でPCR(KOD plus)処理して、PCR産物を得た。次に、該PCR産物にDpnI処理した後にゲル抽出した。抽出物をXhoIおよびSpeI-HFでdigestionして、さらにゲル抽出した。
(1−2−3)ArsRの回収
上記「1−2−1」のベクター断片及び上記「1−2−2」のインサート断片でligationをした。次に、Ligation産物でXL10-Goldを形質転換して、クローンを回収した。
(1−4−1)Pars-[rbs]GFPライブラリの作製
Plasmid 2(表7参照)を鋳型に、Primer6及び7(表6参照:配列番号6、7)でPCR(KOD plus)処理して、PCR産物を得た。次に、該PCR産物にゲル抽出した。ゲル抽出物に市販品を使用してGolden Gate法により、DNA断片をアッセンブルして、さらにカラム精製した。精製したGolden Gate産物でXL10-Goldを形質転換し、次に液体培養して、RBSライブラリを回収した。
(1−4−2)適度なRBSをもつPars-GFP(ArsR発現プラスミドがない条件下で高い蛍光を示すようなRBSを有するPars-GFP)の回収
上記「1−4−1」のRBSライブラリで大腸菌MG1655を共形質転換した。次に、固体培地上で単離されたコロニーの中から、蛍光が強いものを1個選択し、一晩培養した。次に、培養液から、Pars-GFPプラスミドを回収した。さらに、回収したPars-GFPおよびArsR(Plasmid4:表7参照)で大腸菌MG1655を共形質転換した。次に、固体培地上コロニーを単離し、前記コロニーから取得した蛍光が強いものと比べて蛍光が弱いことを確認した。
(2−1−1)ベクター断片の調製
Plasmid3(表7参照)を鋳型に、Primer 8及び9(表6参照:配列番号8、9)でPCR(KOD plus)処理して、PCR産物を得た。次に、該PCR産物にDpnI処理した後にゲル抽出した。抽出物をXhoI、BamHI-HF及びrSAPでdigestionして、さらにゲル抽出した。
(2−1―2)遺伝子全域にランダム変異の導入されたArsR::LuxR断片の調製
Plasmid3(表7参照)を鋳型に、Primer 10及び11(表6参照:配列番号10、11)でPCR(KOD plus)処理して、PCR産物を得た。次に、該PCR産物にDpnI処理した後にゲル抽出した。ゲル抽出物を鋳型に、Primer 10及び11(表6参照)でPCR(Taq、10または50 μM MnCl2)処理して、PCR産物を得た。次に、該PCR産物をゲル抽出した。抽出物をXhoI及びBamHI-HFでdigestionして、さらにゲル抽出した。
(2−1−3)ArsR::LuxRライブラリの回収
上記「2−1−1」のベクター断片及び上記「2−1−2」のインサート断片でligationをした。次に、Ligation産物をカラム精製した。次に、精製したligation産物で大腸菌株BW25113を形質転換して、液体培養した培養液からライブラリを回収した。
任意のレポータープラスミドでMG1655を形質転換した。次に、形質転換体を1つ選択し、コンピテントセル(大腸菌)を作製した。前記ライブラリ(プラスミド)で、前記大腸菌を形質転換した。単離されたコロニーを任意数選択し、一晩液体培養した。任意濃度のAs(III)またはAHLを含む液体培地中へ、前培養液を1/100量植菌し、12時間培養した。次に、生理食塩水を使用して、該培養液を10倍希釈した測定サンプル200 μLを調製した。FilterMax F5(市販の吸光度検出装置)を用いて、細胞密度(OD595)及び485 nmで励起したときの535 nmの蛍光を測定した。ブランク試料(コントロール)として液体培地を生理食塩水で10倍希釈したブランクサンプル200 μLも同時に測定し、サンプルの測定値からブランクサンプルの測定値を減算した値でデータ解析を行った。
レポーターPlux-GFP(Plasmid5:表7参照)でMG1655を形質転換した。そして、形質転換体を1つ選択し、コンピテントセル(大腸菌)を作製した。上記「2−1」のArsR::LuxRライブラリで、該大腸菌を形質転換し、液体培地10 mL中へ植菌して一晩培養した。次に、1 μM AHLおよび5000 ppb (67 μM) As(III)を含む液体培地10 mL中へ、プレ培養液107細胞分を植菌し、1時間培養した。次に、100 μg/mLのカナマイシンを添加し、3時間培養した。次に、培養液を遠心分離して上澄み液を除去した。さらに、1 μM AHLおよび5000 ppb (67 μM) As(III)を含む液体培地10 mLで再懸濁し、再度培養液を遠心分離して上澄み液を除去した(カナマイシンの除去操作をした)。再度、カナマイシンの除去操作をした。次に、1 μM AHLおよび5000 ppb (67 μM) As(III)を含む液体培地10 mLで再懸濁し、 一晩培養した。最後に、培養液から集菌し、濃縮されたライブラリプラスミドを回収した。
レポータプラスミドPlux-GFP(Plasmid5:表7参照)でMG1655を形質転換した。次に、形質転換体を1つ選択し、コンピテントセル(大腸菌)を作製した。上記「2−1」のArsR-LuxRライブラリで、前記コンピテントセル(大腸菌)を形質転換した。固体培地上に形成されたコロニーを無作為に89個選択した。
上記「2−2」の方法により、「1 μM AHLを含む培地」と「1 μM AHLおよび5000 ppb As(III)を含む培地」に分けて培養した場合の細胞密度あたりの蛍光強度を評価した。AHLのみ添加された条件では蛍光が弱く、かつAHLおよびAs(III)が添加された条件で蛍光の強い変異体を回収した。
該回収した変異体を鋳型として、上記「2−1」の方法でライブラリを作製した。作製したライブラリで前記コンピテントセル(大腸菌)を形質転換した。固体培地上に形成されたコロニーを無作為に59個選択した。上記「2−2」の方法により、「1μM AHLを含む培地」と「1 μM AHLおよび5 ppb As(III)を含む培地」に分けて培養した場合の細胞密度あたりの蛍光強度を評価した。AHLのみ添加された条件では蛍光が弱く、かつAHLおよびAs(III)が添加された条件で蛍光の強い変異体を回収した。
上記「2−2」の方法により、高感度AND型ヒ素スイッチが作製されていることを確認した(参照:図6(c))。
レポータープラスミドPlux-GFP(Plasmid5:表7参照)でMG1655を形質転換した。次に、形質転換体を1つ選択し、コンピテントセル(大腸菌)を作製した。上記「2−1」のArsR-LuxRライブラリで、前記コンピテントセル(大腸菌)を形質転換した。
上記「2−3」の方法により、1 μM AHLおよび5000 ppb As(III)添加時に蛍光を示す変異体を濃縮した。次に、濃縮されたライブラリで、前記コンピテントセル(大腸菌)を形質転換した。次に、1 μM AHLを含む個体培地上で蛍光の弱いコロニーを80個選択した。
上記「2−2」の方法により、「1μM AHLを含む培地」、「1 μM AHLおよび5 ppb As(III)を含む培地」及び「1 μM AHLおよび500 ppb As(III)を含む培地」に分けて培養した場合の細胞密度あたりの蛍光強度を評価した。AHLのみ添加された条件では蛍光が弱く、かつAHLおよび5 ppb As(III)が添加された条件、かつAHLおよび500 ppb As(III)が添加された条件で蛍光が強い変異体を回収した。
上記「2−2」の方法により、緊縮性の高いAND型ヒ素スイッチが作製されていることを確認した(参照:図6(b))。
本実施例では、レポータープラスミドではPluxを使用しない場合の2入力AND型ヒ素スイッチの性能を評価した。
(4−1−1)ベクターの調製
pUC-TAL(Plasmid 8:表7参照、TetR-AraC-LuxRN86Kand C245W)を鋳型に、Primer12及び13(表6参照:配列番号12、13)でPCR(KOD plus)処理して、PCR産物を得た。次に、該PCR産物にゲル抽出した。抽出物をKpnI-HF(公知の制限酵素)、HindIII-HF及びrSAPでdigestionして、さらにゲル抽出した。
(4−1−2)インサートの調製
ArsRおよびArsR::LuxR(Plasmid 4及び7:表7参照)を鋳型に、Primer 11 &14(表6参照:配列番号11、14)でPCR(KOD plus)処理して、PCR産物を得た。次に、該PCR産物にゲル抽出した。抽出物をKpnI-HF及びHindIII-HFでdigestionして、さらにゲル抽出した。
(4−1−3)pUC産物の回収
上記「1−2−1」のベクター断片及び上記「1−2−2」のインサート断片でligationした。次に、ligation産物でXL10-Goldを形質転換して、クローンを回収した。
レポータープラスミドであるPars-GFP(Plasmid 6:表7参照)でMG1655を形質転換した。形質転換体を1つ選択し、コンピテントセル(大腸菌)を作製した。
pUC-ArsR、pUC-ArsR::LuxR又はpUC-phi(Plasmid 9-11:表7参照)で、コンピテントセル(大腸菌)を形質転換した。固体培地上に形成されたコロニーを無作為に3個選択した。
上記「2−2」の方法により、100μM AHLを含み、As(III)濃度を任意濃度に分けて培養した場合の細胞密度あたりの蛍光強度を評価した(参照:図8)。
本発明者らは、上記図2及び図6の結果より、本発明の遺伝子スイッチの製造方法から得られた遺伝子スイッチを含むセンサは、それぞれのリガンドに対する応答感度は、もう一方のリガンドの濃度に依存することを確認した。
詳しくは、実施例4で作製した2入力AND型ヒ素スイッチを含むセンサのEC50値を系中に存在するAHL濃度に対してPlotすると、AHL濃度が高くなるにつれて低下することを確認した(参照:図7)。
この現象は、本発明の方法で得られた遺伝子スイッチを含むセンサの異質な効果である。AND型の遺伝子スイッチは、AHLとの結合による安定化にも、そして砒素との結合による安定化にも依存するかたちで、機能構造を保持している。このような性質をもった遺伝子スイッチの場合、系中のAHLの濃度が高いほど、砒素センサとして働くArsRの実効濃度が高まるため、「砒素 + ArsR ⇔ 砒素・ArsR」のみかけの感度が高まる。
すなわち、本発明の遺伝子スイッチを含むセンサでは、以下の方法により、遺伝子スイッチのリガンドに対する感度を容易に調整することができる。
リガンドL1の感度を上げたい場合には、リガンドL2添加濃度を上げる。
リガンドL1の感度を下げたい場合には、リガンドL2添加濃度を下げる。
リガンドL2の感度を上げたい場合には、リガンドL1添加濃度を上げる。
リガンドL2の感度を下げたい場合には、リガンドL1添加濃度を下げる。
本発明者らは、上記実施例の結果より、本発明の製造方法は、センサの感度、出力強度、緊縮性等を向上させることができることを確認している。
例えば、転写因子LuxRを使用した場合、砒素検出スイッチを意図的にPluxプロモータの下流のレポーター遺伝子の発現によって検出することには下記の利点を有する。
(1)出力強度及び緊縮性:LuxRは転写因子の中でも、最も緊縮性が高く(非誘導状態における発現漏出が少ない)、そして誘導時の最大出力(転写亢進効率)が高い。一方、ArsR/ArsP(Pars)系は、出力強度が低く、かつ緊縮性も低い。よって、その砒素応答時のSignal-to-noise比は非常に低い結果となった(参照:図8の「ArsR→Pars」)。また、ArsR-LuxRのANDでは、融合による影響もあり、さらに緊縮性の低い結果となった(参照:図8の「AND→Pars」)。一方、LuxP下にレポーター遺伝子を配置した場合は、優れたLuxR/LuxPのSN比により、砒素濃度に対して、より大きな蛍光値変化を示す(参照:図8の「ArsR→Plux、AHL」)。すなわち、高感度検出可能な転写因子(例、LuxR)を融合パートナーに選び、さらに、該転写因子のプロモーター(例、LuxP)を選択すれば、リガンドの高感度検出可能な遺伝子スイッチを選択することができる。
(2)リガンドの高感度検出:例えば、ArsR-LuxRの転写因子かつプロモータArsPの組み合わせの場合、ArsP下流のレポーター遺伝子の発現プロファイルは、50ppbあたりに変曲点を有するものであった。この検出感度は、ArsR単独でArsPに作用させる場合とほぼ同じ検出感度である。しかし、ArsR-LuxRの転写因子かつプロモータPluxの組み合わせの場合、Plux下流のレポーター遺伝子の発現プロファイルは、5ppb周辺で変曲点を有した。この感度は、バイオセンサとしては、世界最高の感度である。WHO基準となるヒ素濃度は10ppbである。ArsR/ArsP系を使う場合は、それより一桁高い濃度に変曲点があり、使用することができない。しかし、ArsR-LuxRの転写因子かつプロモータPluxの組み合わせの場合、環境モニタリングにそのまま使用することができる。
なお、この高感度化は、As-ArsR/ArsPの「depressor」という動作メカニズムからの解放に由来している。ArsRは、本来Asと高い親和性をもって結合できるのであるが、Asの無い状態では、ArsPにタイトに結合している。すなわち、ArsPとの結合によって、抑制状態のArsR構造は大きく安定化されている。ヒ素は安定化構造をキャンセルし、ArsR はArsPから脱着させるのである。
つまり、「As + ArsR ⇔ As-ArsR」の平衡は、ArsPの存在によって、大きく左側にシフトすることになる(つまり、感度が下がることになる)。ArsPの不在下、LuxPによって読み出されるAs-ArsR結合は、この感度低減の効果から解放されているため、1桁近い高感度化が実現していると考えられる。
(1−1−1)PrpC::LuxRN86K-C245W、PrpD::LuxRN86K-C245W用ベクターの調製
Plasmid-12(表7参照)をNcoI-HF(市販の制限酵素)およびSpeI-HF(市販の制限酵素)でdigestionして、ゲル抽出した。
(1−1−2)PrpC、PrpDドメインの調製
大腸菌株MG1655のgenomeを鋳型に、Primer-15及び16又はPrimer-17及び18(表6参照)でPCR(Q5 ploymerase)処理して、PCR産物を得た。次に、該PCR産物にDpnI処理した後にゲル抽出した。
(1−1−3)PrpC::LuxRN86K-C245W、PrpC::LuxRN86K-C245Wの回収
上記「1−1−1」のベクター断片及び上記「1−1−2」のインサート断片を市販品の酵素を使用してGibson assembly 法によりDNA断片をアッセンブルした。次に、Gibsonassembly産物でXL10-Gold(市販のコンピテント・セル)を形質転換して、クローンを回収した(Plasmid-14及び15)。
(1−2−1)pMC-Plux-GFP用ベクターの調製
Plasmid-16(表7参照)をPrimer-19及び20(表6参照)でPCR(KOD plus)処理して、PCR産物を得た。次に、該PCR産物にDpnI処理した後にゲル抽出した。抽出物をPrimer-19及び21(表6参照)でPCR(KOD plus)処理して、PCR産物を得た。次に、該PCR産物をゲル抽出した。抽出物をApaI(市販の制限酵素)、HindIII-HF(市販の制限酵素)、およびrSAP(市販の脱リン酸酵素)でdigestionして、さらにゲル抽出した。
(1−2−2)RBSがランダム化されたGFP-hsvTK::APHドメインの調製
Plasmid-5(表7参照)を鋳型に、Primer-22及び23(表6参照)でPCR(KOD plus)処理して、PCR産物を得た。次に、該PCR産物にDpnI処理した後にゲル抽出した。抽出物をApaI及びHindIII-HFでdigestionして、さらにゲル抽出した。
(1−2−3)pMC-Plux-GFPのRBSライブラリの回収
上記「1−2−1」のベクター断片及び上記「1−2−2」のインサート断片でligationをした。次に、Ligation産物でXL10-Gold(市販のコンピテント・セル)を形質転換して、クローンを回収した。
(1−2−4)pMC-Plux-GFPの回収
上記「1−2−3」のライブラリプラスミド及びPlasmid-17で大腸菌株BW25113を形質転換した。単離されたコロニーを無作為に30個選択し、一晩液体培養した。1 μM AHLを含む、又は含まない培地中へ1/100量植菌し、12時間培養した。次に、生理食塩水を使用して、該培養液を10倍希釈した測定サンプル200 μLを調製した。FilterMax F5(市販の吸光度検出系)を用いて、細胞密度(OD595)及び482 nmで励起したときの535 nmの蛍光を測定した。ブランク試料(コントロール)として液体培地を生理食塩水で10倍希釈したブランクサンプル200 μLも同時に測定し、サンプルの測定値からブランクサンプルの測定値を減算した値でデータ解析を行った。得たデータから、AHLを含むときと含むないときとで最も蛍光強度変化が大きいRBS変異体を単離回収した。
(1−3−1)PrpC::LuxRN86K-C245W、PrpD::LuxRN86K-C245Wライブラリー用ベクターの調製
Plasmid-14または15(表7参照)をPrimer-24及び25(表6参照)でinverse PCR(Q5 ploymerase)処理して、PCR産物を得た。次に、該PCR産物にDpnI処理した後にゲル抽出した。
(1−3−2)PrpC-LuxRN86K-C245W、PrpD-LuxRN86K-C245Wドメインライブラリーの調製
Plasmid-14または15(表7参照)を鋳型に、Primer-26及び27(表6参照)でerror prone PCR(Taq ploymerase)処理して、PCR産物を得た。次に、該PCR産物にDpnI処理した後にゲル抽出した。
(1−3−3)PrpC::LuxRN86K-C245W、PrpD::LuxRN86K-C245Wライブラリープラスミドの回収
上記「1−3−1」のベクター断片及び上記「1−3−2」のインサート断片を市販品の酵素を使用してGibson assembly 法によりDNA断片をアッセンブルした。次に、Gibsonassembly産物でBW25113(市販のコンピテント・セル)を形質転換して、ライブラリプラスミドを回収した。
(1−3−4)pET23d-PrpCK318R::LuxRN86K-C245W、pET23d-PrpDS163T-A225G-I285V::LuxRN86K-C245Wの回収
上記「1−3−3」のライブラリプラスミド及びPlasmid-23で大腸菌株BW25113を形質転換し、10μM AHLおよび50 mM プロピオン酸を含んだスクリーニングプレートに塗布した。単離されたコロニーの中からGFP蛍光を発するものを48個選択し、一晩液体培養した。50 mMプロピオン酸を含む、又は含まない液体培地中へ1/100量植菌し、12時間培養した。次に、生理食塩水を使用して、該培養液を10倍希釈した測定サンプル200 μLを調製した。FilterMax F5(市販の吸光度検出系)を用いて、細胞密度(OD595)及び482 nmで励起したときの535 nmの蛍光を測定した。ブランク試料(コントロール)として液体培地を生理食塩水で10倍希釈したブランクサンプル200 μLも同時に測定し、サンプルの測定値からブランクサンプルの測定値を減算した値でデータ解析を行った。得たデータから、プロピオン酸を含むときと含まないときとで最も蛍光強度変化が大きい変異体を単離回収し、シークエンスを解析し、変異箇所を特定した(PrpCK318R-LuxRN86K and C245Wの全長アミノ酸配列:配列番号31、PrpDS163T-A225G-I285V-LuxRN86Kand C245Wの全長アミノ酸配列:配列番号32)。
レポータープラスミドであるpMC-Plux-GFP(Plasmid 13:表7参照)でBW25113を形質転換した。形質転換体を1つ選択し、コンピテントセル(大腸菌)を作製した。
pET23d-PrpC::LuxRmut(参照:図19)、pET23d-PrpD::LuxRmut(参照:図20)(Plasmid 18-19:表7参照)で、コンピテントセル(大腸菌)を形質転換した。固体培地上に形成されたコロニーを無作為に3個選択し、一晩液体培養した。10 μMを含み、プロピオン酸ナトリウム濃度を任意に分けた液体培地中へ、前培養液を1/100量植菌し、12時間培養した。次に、生理食塩水を使用して、該培養液を10倍希釈した測定サンプル200 μLを調製した。FilterMax F5(市販の吸光度検出装置)を用いて、細胞密度(OD595)及び485 nmで励起したときの535 nmの蛍光を測定した。ブランク試料(コントロール)として液体培地を生理食塩水で10倍希釈したブランクサンプル200 μLも同時に測定し、サンプルの測定値からブランクサンプルの測定値を減算した値でデータ解析を行った。培養した場合の細胞密度あたりの蛍光強度を評価した。
結果を図21に示す。プロピオン酸は大腸菌内でPrpCの基質であるプロピオニルCoAとなり、つづいて酵素PrpDの基質である2-メチルクエン酸となる。PrpC::LuxRやPrpD::LuxR内のPrpCやPrpDがそれぞれの基質(プロピオニルCoAと2メチルクエン酸)と結合するとPrpC::LuxRやPrpD::LuxRが安定化して、LuxRの転写活性が上昇し、Plux-GFPのPluxにLuxRが結合し、GFPを転写する。よって、図21において、プロピオン酸濃度依存的に蛍光強度が上昇した。
以上の実施例により、本発明の遺伝子スイッチの製造方法では、機能集積化、高度化、可変型センサをつくるだけでなく、基本性能の低いセンサ機能の欠点を補い、より優れた転写因子の機能として出力できる方法である。
Claims (40)
- 以下の工程を有する、多入力・多出力型遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子の製造方法、
(A)
(1)リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列及びリガンドL2に応答するバインダーB2又は転写因子T2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたバインダーB1又は転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2の融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T1によって制御されるプロモータP1をコードする遺伝子配列及び/又は転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及び該プロモータ配列P1及び/若しくはP2と機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを、細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Xは1以上の整数を意味する、
(2)リガンドL1及び/又はリガンドL2を(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
(3)レポーターの発現量を指標として、バインダーB1又は転写因子T1とバインダーB1又は転写因子T2の融合変異体を遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する工程、
又は、
(B)
(1)リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列、リガンドL2に応答するバインダーB2又は転写因子T2をコードする遺伝子配列及びリガンドLNに応答するバインダーBN又は転写因子TNをコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたバインダーB1又は転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2とバインダーBN又は転写因子TNの融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T1によって制御されるプロモータP1をコードする遺伝子配列、転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及び/若しくは転写因子TNによって制御されるプロモータPNをコードする遺伝子配列及び該プロモータ配列P1、P2及び/若しくはPNと機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを、細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Nは、3以上の整数を意味する、
(2)リガンドL1、リガンドL2及び/又はリガンドLNを(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に導入する工程、
(3)レポーターの発現量を指標として、バインダーB1又は転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2とバインダーBN又は転写因子TNの融合変異体を遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する工程。
- 前記(A)において、
リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1又はリガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体を2入力・AND型出力センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(A)において、
転写因子T2によって制御されるプロモータP2を使用した場合、リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体を2入力・AND型出力センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
又は、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体を2入力・AND型出力センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドなしのレポーターの発現量比が高い融合変異体を2入力・OR型センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
又は、
転写因子T2によって制御されるプロモータP2を使用した場合、リガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドなしのレポーターの発現量比が高い融合変異体を2入力・OR型センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体をリガンドL1に特異的に応答する出力型センサの遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
又は、
転写因子T2によって制御されるプロモータP2を使用した場合、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体をリガンドL2に特異的に応答する出力型センサの遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドなしのレポーターの発現量/リガンドL1の導入によるレポーターの発現量比が高く,かつリガンドなしのレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体を、NOR型センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドなし又はリガンドL1若しくはリガンドL2の一方の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体を、NAND型センサ機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(A)において、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL2導入によるレポーターの発現量の両方が減少する融合変異体を2入力3段階出力低下型センサとしての機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(A)において、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL2導入によるレポーターの発現量の両方が上昇する融合変異体を2入力3段階出力向上型センサとしての機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(B)において、N=3であり、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL3導入によるレポーターの発現量が減少する融合変異体を3入力4段階出力低下型センサとしての機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(B)において、N=3であり、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL3導入によるレポーターの発現量が上昇する融合変異体を3入力4段階出力向上型センサとしての機能を有する遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(B)において、N=3であり、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1、プロモータ配列P1と機能的に連結されたレポーターR1、転写因子T2によって制御されるプロモータP2、プロモータ配列P2と機能的に連結されたレポーターR2、並びに転写因子T3によって制御されるプロモータP3、プロモータ配列P3と機能的に連結されたレポーターR3を使用し、
変異導入によってリガンド結合能を消失させたリガンドL1結合型の転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2とバインダーB3又は転写因子T3の融合変異体の核酸のライブラリを使用し、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量は向上せず、リガンドL3の導入によるレポーターの発現量が向上しかつレポーターR1、レポーターR2及びレポーターR3が発現する融合変異体をリガンドL3に特異的に応答する多出力型センサの遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(B)において、N=3であり、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1、プロモータ配列P1と機能的に連結されたレポーターR1、転写因子T2によって制御されるプロモータP2、プロモータ配列P2と機能的に連結されたレポーターR2、並びに転写因子T3によって制御されるプロモータP3、プロモータ配列P3と機能的に連結されたレポーターR3を使用し、
変異導入によってリガンド結合能を消失させたバインダーB1又は転写因子T1と変異導入によってリガンド結合能を消失させたバインダーB2又は転写因子T2とバインダーB3又は転写因子T3の融合変異体の核酸のライブラリを使用し、
リガンドL2の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL3の導入によるレポーターの発現量が向上し、リガンドL1の導入によるレポーターの発現量は向上せず、かつレポーレポーターR2が発現する融合変異体をリガンドL2とリガンドL3に特異的に応答する多出力型センサの遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する、
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- バインダーB1 、バインダーB2、バインダーB3及びバインダーBNは転写因子、酵素、抗体、ヒストン、シャペロン又はリボゾームから選択される請求項1〜13のいずれか1に記載の方法。
- バインダーB1 、バインダーB2、バインダーB3及びバインダーBNは転写因子又は酵素である請求項1〜13のいずれか1に記載の方法。
- 以下の工程を有する、リガンドL1検出用遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子の製造方法、
(1)リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列及び転写因子T2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたバインダーB1又は転写因子T1と転写因子T2の融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及びプロモータP2と機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持した発現ベクターを細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Xは1以上の整数を意味する、
(2)リガンドL1及び/又はリガンドL2を(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
(3)リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体又はリガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体をリガンドL1検出用遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子として選抜する工程。
- 前記リガンドL1はヒ素である、請求項16に記載の製造方法。
- 以下の工程を有する、リガンドL1による転写因子T2によって制御されるプロモータP2の発現を亢進させることが可能な転写因子の製造方法、
(1)リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列及びリガンドL2に応答するバインダーB2又は転写因子T2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたバインダーB1又は転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2の融合変異体の核酸のライブラリ、並びに、転写因子T2によって制御されるプロモータP2をコードする遺伝子配列及びプロモータP2と機能的に連結されたレポーターRxをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、ここで、Xは1以上の整数を意味する、
(2)リガンドL1及び/又はリガンドL2を(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
(3)リガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い融合変異体をリガンドL1による転写因子T2によって制御されるプロモータP2の発現を亢進させることが可能な転写因子として選抜する工程。
- 請求項1〜18のいずれか1以上の製造方法から得られた遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子。
- 請求項1〜15のいずれか1以上の製造方法から得られた遺伝子融合変異体であって、
ここで、リガンドL1、L2及び/又はLN によって、T1、T2及び/又はTNによって制御されるプロモータP1、P2及び/又はPNの発現を亢進又は抑制させることができる遺伝子融合変異体。
- 前記遺伝子融合変異体は、以下のいずれか1である請求項20に記載の遺伝子融合変異体。
(1)リガンドL1によって転写因子T2によって制御されるプロモータP2の発現を亢進させることが可能な遺伝子融合変異体、
(2)リガンドL1によって転写因子T2によって制御されるプロモータP2の発現を減少させることが可能な遺伝子融合変異体
(3)リガンドL1によって転写因子T1、転写因子T2及び転写因子TNによって制御されるプロモータP1、P2及びPNの発現を亢進又は抑制させることが可能な遺伝子融合変異体、
(4)リガンドL1によって転写因子T2及び転写因子TNによって制御されるプロモータP2及びPNの発現を亢進又は抑制させることが可能な遺伝子融合変異体、
(5)リガンドL1及びL2によって転写因子T1、転写因子T2及び転写因子TNによって制御されるプロモータP1、P2及びPNの発現を亢進又は抑制させることが可能な遺伝子融合変異体
(6)リガンドL1及びL2によって転写因子T2及び転写因子TNによって制御されるプロモータP2及びPNの発現を亢進又は抑制させることが可能な遺伝子融合変異体、
(7)リガンドL1、L2及びLN によって、T1、T2及びTNによって制御されるプロモータP1、P2及びPNの発現を亢進させることができる遺伝子融合変異体
(8)リガンドL1、L2及びLN によって、T1、T2及びTNによって制御されるプロモータP1、P2及びPNの発現を抑制させることができる遺伝子融合変異体
(9)リガンドL1よって転写因子T1に制御されるプロモータP1の発現が抑制され、かつ転写因子T2に制御されるプロモータP2の発現を亢進させかつ転写因子T3に制御されるプロモータP3の発現を亢進させる遺伝子融合変異体
- 請求項1〜18のいずれか1以上の製造方法から得られた遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子、又は、請求項19に記載の遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子をリガンドL1、リガンドL2及び/又はリガンドLNの検出用センサ,タンパク質合成、タンパク質分泌の誘導、生合成経路の誘導、生合成経路の流量調節、細胞増殖の誘導、生理機能の誘導又は生理機能の制御機構としての使用方法。
- 請求項1〜18のいずれか1以上の製造方法から得られた遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子、又は、請求項19に記載の遺伝子スイッチ又は該スイッチを形成する転写因子をリガンドL1、リガンドL2及び/又はリガンドLNの検出用センサとしての使用方法において、以下のリガンドL1、リガンドL2及び/又はリガンドLNの検出感度調整工程を含む使用方法。
(1)リガンドL1への応答感度を上げる場合には、リガンドL2及び/又はリガンドLNの添加濃度を上げる
(2)リガンドL1への応答感度を下げる場合には、リガンドL2及び/又はリガンドLNの添加濃度を下げる
(3)リガンドL2への応答感度を上げる場合には、リガンドL1及び/又はリガンドLN添加濃度を上げる
(4)リガンドL2への応答感度を下げる場合には、リガンドL1及び/又はリガンドLN添加濃度を下げる
(5)リガンドLNへの応答感度を上げる場合には、リガンドL1及び/又はリガンドL2の添加濃度を上げる
(6)リガンドLNへの応答感度を下げる場合には、リガンドL1及び/又はリガンドL2の添加濃度を下げる
- (A)リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列及びリガンドL2に応答するバインダーB2又は転写因子T2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたバインダーB1又は転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2の融合変異体を含む遺伝子スイッチ、
又は
(B)リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列、リガンドL2に応答するバインダーB2又は転写因子T2をコードする遺伝子配列及びリガンドLNに応答するバインダーBN又は転写因子TNをコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたバインダーB1又は転写因子T1とバインダーB2又は転写因子T2とバインダーBN又は転写因子TNの融合変異体含む遺伝子スイッチ。
- 前記(A)において、
リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1又はリガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高くかつ2入力・AND型出力センサ機能を有することを特徴とする、請求項24に記載の遺伝子スイッチ。
- 前記(A)において、
転写因子T2によって制御されるプロモータP2を使用した場合、リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高くかつ2入力・AND型出力センサ機能を有する、
又は、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1の導入によるレポーターの発現量比が高くかつ2入力・AND型出力センサ機能を有する、
ことを特徴とする、請求項24に記載の遺伝子スイッチ。
- 前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドなしのレポーターの発現量比が高くかつ2入力・OR型センサ機能を有する、
又は、
転写因子T2によって制御されるプロモータP2を使用した場合、リガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドなしのレポーターの発現量比が高くかつ2入力・OR型センサ機能を有する、
ことを特徴とする、請求項24に記載の遺伝子スイッチ。
- 前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高くかつリガンドL1に特異的に応答する出力型センサの機能を有する、
又は、
転写因子T2によって制御されるプロモータP2を使用した場合、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1の導入によるレポーターの発現量比が高くかつリガンドL2に特異的に応答する出力型センサの機能を有する、
ことを特徴とする、請求項24に記載の遺伝子スイッチ。
- 前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドなしのレポーターの発現量/リガンドL1の導入によるレポーターの発現量比が高く,かつリガンドなしのレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高くかつNOR型センサ機能を有することを特徴とする、請求項24に記載の遺伝子スイッチ。
- 前記(A)において、
転写因子T1によって制御されるプロモータP1を使用した場合、リガンドなし又はリガンドL1若しくはリガンドL2の一方の導入によるレポーターの発現量/リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高くかつNAND型センサ機能を有することを特徴とする、請求項24に記載の遺伝子スイッチ。
- 前記(A)において、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL2導入によるレポーターの発現量の両方が減少しかつ2入力3段階出力低下型センサとしての機能を有することを特徴とする、請求項24に記載の遺伝子スイッチ。
- 前記(A)において、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL2導入によるレポーターの発現量の両方が上昇しかつ2入力3段階出力向上型センサとしての機能を有することを特徴とする、請求項24に記載の遺伝子スイッチ。
- 前記(B)において、N=3であり、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL3導入によるレポーターの発現量が減少しかつ3入力4段階出力低下型センサとしての機能を有することを特徴とする、請求項24に記載の遺伝子スイッチ。
- 前記(B)において、N=3であり、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量、リガンドL2の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL3導入によるレポーターの発現量が上昇しかつ3入力4段階出力向上型センサとしての機能を有することを特徴とする、請求項24に記載の遺伝子スイッチ。
- 前記(B)において、N=3であり、
リガンドL1の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量は向上せず、リガンドL3の導入によるレポーターの発現量が向上しかつレポーターR1、レポーターR2及びレポーターR3が発現しかつリガンドL3に特異的に応答する多出力型センサとしての機能を有することを特徴とする、請求項24に記載の遺伝子スイッチ。
- 前記(B)において、N=3であり、
リガンドL2の導入によるレポーターの発現量及びリガンドL3の導入によるレポーターの発現量が向上し、リガンドL1の導入によるレポーターの発現量は向上せず、かつレポーレポーターR2が発現しかつリガンドL2とリガンドL3に特異的に応答する多出力型センサとしての機能を有することを特徴とする、請求項24に記載の遺伝子スイッチ。
- バインダーB1 、バインダーB2、バインダーB3及びバインダーBNは転写因子、酵素、抗体、ヒストン、シャペロン又はリボゾームから選択される請求項24〜36のいずれか1に記載の遺伝子スイッチ。
- バインダーB1 、バインダーB2、バインダーB3及びバインダーBNは転写因子又は酵素である請求項24〜36のいずれか1に記載の遺伝子スイッチ。
- リガンドL1に応答するバインダーB1又は転写因子T1をコードする遺伝子配列及び転写因子T2をコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異を導入して得られたリガンドL1検出用遺伝子スイッチであって、
ここで、リガンドL1及びリガンドL2の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高い又はリガンドL1の導入によるレポーターの発現量/リガンドL2の導入によるレポーターの発現量比が高く、かつリガンドL1検出機能を有することを特徴とするリガンドL1検出用遺伝子スイッチ。
- 前記リガンドL1はヒ素である、請求項39に記載の遺伝子スイッチ。
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US20160202256A1 (en) * | 2015-01-12 | 2016-07-14 | President And Fellows Of Harvard College | Biosensors Engineered from Conditionally Stable Ligand-Binding Domains |
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- 2019-03-23 WO PCT/JP2019/012285 patent/WO2019182156A1/ja active Application Filing
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2012060407A1 (ja) * | 2010-11-02 | 2012-05-10 | 国立大学法人 千葉大学 | 遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の高速開発方法 |
US20160202256A1 (en) * | 2015-01-12 | 2016-07-14 | President And Fellows Of Harvard College | Biosensors Engineered from Conditionally Stable Ligand-Binding Domains |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ACS SYNTH. BIOL., vol. 5, no. 11, JPN6019022877, 2016, pages 1201 - 1210, ISSN: 0005015543 * |
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