JPWO2019181911A1 - How to stabilize ascorbic acid oxidase - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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Abstract
長期間安定な液状試薬として耐えうるようアスコルビン酸オキシダーゼを安定化する方法を提供することを目的とする。本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼを、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法等を提供する。 It is an object of the present invention to provide a method for stabilizing ascorbic acid oxidase so that it can withstand as a stable liquid reagent for a long period of time. The present invention uses ascorbic acid oxidase as polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, and polyoxyethylene nonylphenyl. Provided is a method for stabilizing ascorbic acid oxidase, which is characterized by coexistence with at least one surfactant selected from the group consisting of ether.
Description
本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法に関する。 The present invention relates to a method for stabilizing ascorbic acid oxidase.
生体成分を酵素的に測定する方法はこれまで種々開発されてきている。この中で、コレステロールオキシダーゼなどのオキシダーゼを用いる方法は、オキシダーゼの作用により生成した過酸化物をペルオキシダーゼの存在下、水素供与体の発色系に導き比色定量に供する。本測定系は生体成分中のアスコルビン酸の影響を受けやすいことから、過酸化水素測定前または測定時に生体成分中に存在するアスコルビン酸にアスコルビン酸オキシダーゼ（以下、ＡＳＯと省略する場合がある）を作用させ、デヒドロアスコルビン酸に変換せしめ影響を回避することが一般に行われている。しかし、溶液中のＡＳＯは非常に不安定であり、試薬保存中に失活し試薬の保存安定性を左右する要因となっている。 Various methods for enzymatically measuring biological components have been developed so far. Among these, the method using an oxidase such as cholesterol oxidase guides the peroxide produced by the action of the oxidase to the color-developing system of the hydrogen donor in the presence of peroxidase and uses it for colorimetric quantification. Since this measurement system is easily affected by ascorbic acid in the biological component, ascorbic acid oxidase (hereinafter, may be abbreviated as ASO) is added to the ascorbic acid present in the biological component before or during the measurement of hydrogen peroxide. It is common practice to allow it to act and convert it to dehydroascorbic acid to avoid the effects. However, ASO in solution is very unstable and is deactivated during reagent storage, which is a factor that affects the storage stability of the reagent.
これに対し、安定化剤としてカタラーゼ、ゼラチン、グロブリン、ペルオキシダーゼ、メトヘモグロビンまたはヘマチン等を用いることで効果があることが示されている。また、金属と陰性の酸基とからなる化合物およびカタラーゼ及び／またはペルオキシダーゼの添加でＡＳＯの保存安定性が向上することが開示されている（例えば、特許文献１参照。）。また、アスコルビン酸オキシダーゼを含む溶液に糖アルコールを添加する方法（例えば、特許文献２参照）、亜硝酸若しくはその塩又は亜硝酸エステルを水性媒体中で共存させる方法（例えば、特許文献３参照）、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を用いる方法（例えば、特許文献４参照）、ビリルビン酸（塩）を配合させる方法（例えば、特許文献５参照）が開示されている。しかしながら、これらの方法では液状試薬として耐えうる安定性には尚問題が残る。 On the other hand, it has been shown that the use of catalase, gelatin, globulin, peroxidase, methemoglobin, hematin or the like as a stabilizer is effective. Further, it is disclosed that the storage stability of ASO is improved by adding a compound composed of a metal and a negative acid group and catalase and / or peroxidase (see, for example, Patent Document 1). Further, a method of adding a sugar alcohol to a solution containing ascorbic acid oxidase (see, for example, Patent Document 2), a method of allowing nitrite or a salt thereof or an nitrite ester to coexist in an aqueous medium (see, for example, Patent Document 3). Method using a substance selected from 2-methyl-4-isothiazolin-3-one, 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one, 1,2-benzisothiazolin-3-one and salts thereof ( For example, Patent Document 4) and a method of blending birylbic acid (salt) (see, for example, Patent Document 5) are disclosed. However, these methods still have problems with the stability that can be tolerated as a liquid reagent.
本発明が解決しようとする課題は長期間安定な液状試薬として耐えうるようＡＳＯを安定化する方法を提供することにある。 An object to be solved by the present invention is to provide a method for stabilizing ASO so that it can withstand a long-term stable liquid reagent.
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、ＡＳＯをある種の界面活性剤と共存させることにより、ＡＳＯを液状状態で安定に保つことを見出し、更には、ＡＳＯを該界面活性剤及びある種の緩衝剤の組合せと共存させることによって、より一層効果的にＡＳＯを液状状態で安定に保つことを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の構成からなる。 As a result of diligent studies to achieve the above object, the present inventors have found that ASO can be kept stable in a liquid state by coexisting with a certain surfactant, and further, ASO. The present invention has been completed by finding that ASO can be kept stable in a liquid state even more effectively by coexisting with a combination of the surfactant and a certain buffer. That is, the present invention has the following configuration.
［項１］アスコルビン酸オキシダーゼを、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項２］前記界面活性剤が、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、およびノニオンＮＳ−２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、項１に記載の方法。
［項３］アスコルビン酸オキシダーゼを、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤及びアミンを含む緩衝液と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項４］前記界面活性剤が、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、およびノニオンＮＳ−２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、項３に記載の方法。
［項５］前記アミンを含む緩衝液が、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、２−モルホリノエタンスルホン酸，一水和物（ＭＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸），二水和物（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、項３または項４に記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項６］前記アミンを含む緩衝液が、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸 (ＡＤＡ)およびＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、項３から項５のいずれかに記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項７］アスコルビン酸オキシダーゼ、および、以下の（１）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物。
（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤。
［項８］アスコルビン酸オキシダーゼ、以下の（１）および以下の（２）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物。
（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤、
（２）アミンを含む緩衝液。
［項９］項７または項８に記載の組成物を含む、生体成分分析用キット。[Item 1] Ascorbic acid oxidase is used as polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, and polyoxyethylene nonylphenyl. A method for stabilizing ascorbic acid oxidase, which comprises coexistence with at least one surfactant selected from the group consisting of ether.
[Item 2] At least one interface selected from the group consisting of Emargen A60, Emargen A90, Emargen B66, Emargen 108, Emargen 120, Emargen 707, Emargen LS110, Emargen LS114, and Nonion NS-210. Item 2. The method according to Item 1, which is an activator.
[Item 3] Ascorbic acid oxidase is used as polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, and polyoxyethylene nonylphenyl. A method for stabilizing ascorbic acid oxidase, which comprises coexistence with a buffer solution containing at least one surfactant and amine selected from the group consisting of ether.
[Item 4] At least one interface selected from the group consisting of Emargen A60, Emargen A90, Emargen B66, Emargen 108, Emargen 120, Emargen 707, Emargen LS110, Emargen LS114, and Nonion NS-210. Item 3. The method according to Item 3, which is an activator.
[Item 5] The buffer containing the amine is N- (2-acetamide) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), N- (2-acetamide) iminodiacetic acid (ADA), N, N-bis (2). -Hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES), N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine (Bine), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid (CAPS), 3- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] propanesulfonic acid (EPPS), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1 -Piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES), 2-hydroxy-3- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] propanesulfonic acid (HEPPSO), 2-morpholinoetansulfonic acid, monohydrate (MES) ), 3-Molholinopropanesulfonic acid (MOPS), 2-Hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPSO), Piperazin-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), Piperazin-1,4- Bis (2-hydroxy-3-propanesulfonic acid), dihydrate (POPSO), N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic acid (TAPS), N-tris (hydroxymethyl) methyl-2 Item 3 or item, which is at least one selected from the group consisting of −aminoethanesulfonic acid (TES), N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine (Tricine) and tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris). 4. The method for stabilizing ascorbic acid oxidase according to 4.
[Item 6] From the group in which the amine-containing buffer solution consists of N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA) and N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES). The method for stabilizing ascorbic acid oxidase according to any one of Items 3 to 5, which is at least one selected.
[Item 7] A composition in which ascorbic acid oxidase is stabilized, which comprises ascorbic acid oxidase and the following (1).
(1) Selected from the group consisting of polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, and polyoxyethylene nonylphenyl ether. At least one surfactant.
[Item 8] A composition in which ascorbic acid oxidase is stabilized, which comprises ascorbic acid oxidase, the following (1) and the following (2).
(1) Selected from the group consisting of polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, and polyoxyethylene nonylphenyl ether. At least one surfactant,
(2) A buffer solution containing an amine.
[Item 9] A kit for analyzing biological components, which comprises the composition according to Item 7 or 8.
本発明により、安定なＡＳＯ含有液状製剤を提供でき、長期間または過酷な条件下での保管後の液状製剤においてもアスコルビン酸の影響を受けることなく、正確な測定値を得ることができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a stable ASO-containing liquid preparation can be provided, and accurate measured values can be obtained even in a liquid preparation after long-term storage or storage under harsh conditions without being affected by ascorbic acid.
本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「〜」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ〜Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。また本明細書中の「及び／又は」は、いずれか一方または両方を意味する。また、本明細書において、単数形の表現は、他に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。 The embodiments of the present invention will be described in detail as follows, but the present invention is not limited thereto. All non-patent documents and patent documents described in the present specification are incorporated herein by reference. Further, "-" in the present specification means "greater than or equal to or less than or equal to", and for example, if "X to Y" is described in the present specification, it means "more than or equal to X and less than or equal to Y". Moreover, "and / or" in this specification means either one or both. It should also be understood herein that the singular representation also includes the concept of the plural, unless otherwise stated.
（界面活性剤によるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化）
本発明の実施態様の一つは、アスコルビン酸オキシダーゼを、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法である。ここで、本発明に用いる前記界面活性剤は全てポリオキシアルキレン系の非イオン性界面活性剤である点で共通する性質を有する。(Stabilization of ascorbic acid oxidase by surfactant)
One of the embodiments of the present invention is to use ascorbic acid oxidase as polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, and the like. A method for stabilizing ascorbic acid oxidase, which comprises coexistence with at least one surfactant selected from the group consisting of polyoxyethylene nonylphenyl ether and polyoxyethylene nonylphenyl ether. Here, the surfactants used in the present invention all have the common property in that they are polyoxyalkylene-based nonionic surfactants.
前記界面活性剤の種類は特に限定されない。
例えば、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルとして、花王製エマルゲンＡ６０（「エマルゲン」は登録商標。以下同様。）、エマルゲンＡ９０またはエマルゲンＡ５００が挙げられる。
例えば、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテルとして、エマルゲンＢ６６が挙げられる。
例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテルとして、エマルゲン１０３、エマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１３０Ｋ、エマルゲン１４７またはエマルゲン１５０が挙げられる。
例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとして、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、またはエマルゲン７０９が挙げられる。
例えば、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルとして、エマルゲンＬＳ１０６、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、またはエマルゲンＭＳ１１０が挙げられる。
例えば、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルとして、ノニオンＮＳ−２１０（「ノニオン」は登録商標。以下同様。）が挙げられる。The type of the surfactant is not particularly limited.
For example, examples of the polyoxyethylene distyrene phenyl ether include Kao's Emargen A60 (“Emargen” is a registered trademark; the same applies hereinafter), Emargen A90 or Emargen A500.
For example, as the polyoxyethylene tribenzyl phenyl ether, Emulgen B66 can be mentioned.
For example, polyoxyethylene lauryl ethers include Emargen 103, Emargen 104P, Emargen 105, Emargen 106, Emargen 108, Emargen 109P, Emargen 120, Emargen 123P, Emargen 130K, Emargen 147 or Emargen 150.
For example, polyoxyethylene alkyl ethers include emalgen 705, emalgen 707, or emalgen 709.
For example, examples of the polyoxyalkylene alkyl ether include Emargen LS106, Emargen LS110, Emargen LS114, or Emargen MS110.
For example, as polyoxyethylene nonylphenyl ether, Nonion NS-210 (“Nonion” is a registered trademark; the same shall apply hereinafter) can be mentioned.
中でも、前記界面活性剤が、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、およびノニオンＮＳ−２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤であることが好ましい。 Among them, at least one surfactant selected from the group consisting of Emargen A60, Emargen A90, Emargen B66, Emargen 108, Emargen 120, Emargen 707, Emargen LS110, Emargen LS114, and Nonion NS-210. Is preferable.
本発明に用いる界面活性剤のＨＬＢは、本発明の効果を奏する限り限定されないが、例えば、ＨＬＢ１０〜２０程度の界面活性剤を用いることができ、より高い安定化効果が期待できるという観点から、ＨＬＢ１１〜１８程度の界面活性剤が好ましく、ＨＬＢ１２〜１６程度の界面活性剤がより好ましい。 The HLB of the surfactant used in the present invention is not limited as long as the effect of the present invention is exhibited, but for example, from the viewpoint that a surfactant of about 10 to 20 HLB can be used and a higher stabilizing effect can be expected. A surfactant having an HLB of about 11 to 18 is preferable, and a surfactant having an HLB of about 12 to 16 is more preferable.
ＡＳＯを含む溶液中の界面活性剤の濃度としては特に限定されるものではないが、範囲の上限は、好ましくは２０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１０ｇ／Ｌ、範囲の下限は好ましくは０．１ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．５ｇ／Ｌで、使用されるのが望ましい。 The concentration of the surfactant in the solution containing ASO is not particularly limited, but the upper limit of the range is preferably 20 g / L, more preferably 10 g / L, and the lower limit of the range is preferably 0.1 g / L. It is desirable to use L, more preferably 0.5 g / L.
（界面活性剤と緩衝液との組合せによるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化）
本発明の別の実施態様は、アスコルビン酸オキシダーゼを、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤及びアミンを含む緩衝液と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法である。このように特定のポリオキシアルキレン系非イオン性界面活性剤と、アミンを含む緩衝液とを共存させることで、両成分の作用が相俟って相乗的に高い安定化効果を発揮できることが、後述の実施例の結果から明らかである。(Stabilization of ascorbic acid oxidase by combination of surfactant and buffer solution)
Another embodiment of the present invention comprises ascorbic acid oxidase, polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, and A method for stabilizing ascorbic acid oxidase, which comprises coexistence with a buffer solution containing at least one surfactant and amine selected from the group consisting of polyoxyethylene nonylphenyl ether. By coexisting a specific polyoxyalkylene nonionic surfactant and a buffer solution containing an amine in this way, the actions of both components can be combined to exert a synergistically high stabilizing effect. It is clear from the results of the examples described later.
前記方法において、界面活性剤と緩衝液とを組合せる場合、界面活性剤の種類は特に限定されない。
例えば、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルとして、花王製エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０またはエマルゲンＡ５００が挙げられる。
例えば、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテルとして、エマルゲンＢ６６が挙げられる。
例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテルとして、エマルゲン１０３、エマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１３０Ｋ、エマルゲン１４７、またはエマルゲン１５０が挙げられる。
例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとして、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、またはエマルゲン７０９が挙げられる、
例えば、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルとして、エマルゲンＬＳ１０６、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、またはエマルゲンＭＳ１１０が挙げられる。
例えば、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルとして、ノニオンＮＳ−２１０が挙げられる。In the above method, when the surfactant and the buffer solution are combined, the type of the surfactant is not particularly limited.
For example, examples of the polyoxyethylene distyrene phenyl ether include Kao's Emargen A60, Emargen A90 or Emargen A500.
For example, as the polyoxyethylene tribenzyl phenyl ether, Emulgen B66 can be mentioned.
For example, polyoxyethylene lauryl ethers include Emargen 103, Emargen 104P, Emargen 105, Emargen 106, Emargen 108, Emargen 109P, Emargen 120, Emargen 123P, Emargen 130K, Emargen 147, or Emargen 150.
For example, polyoxyethylene alkyl ethers include emalgen 705, emalgen 707, or emalgen 709.
For example, examples of the polyoxyalkylene alkyl ether include Emargen LS106, Emargen LS110, Emargen LS114, or Emargen MS110.
For example, as polyoxyethylene nonylphenyl ether, nonionic NS-210 can be mentioned.
中でも、前記界面活性剤が、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、およびノニオンＮＳ−２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤であることが好ましい。 Among them, at least one surfactant selected from the group consisting of Emargen A60, Emargen A90, Emargen B66, Emargen 108, Emargen 120, Emargen 707, Emargen LS110, Emargen LS114, and Nonion NS-210. Is preferable.
さらに、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとして上記で例示されたもの以外では、エマルゲン１１０８、エマルゲン１１１８Ｓ−７０、エマルゲン１１３５Ｓ−７０またはエマルゲン１１５０Ｓ−６０（以上花王製）などを用いることができる。 Further, other than those exemplified above as the polyoxyethylene alkyl ether, Emulgen 1108, Emargen 1118S-70, Emargen 1135S-70, Emargen 1150S-60 (all manufactured by Kao Corporation) and the like can be used.
本発明の方法において、使用されるアミンを含む緩衝液は特に限定されないが、例えば、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸〔Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＡＣＥＳ）〕、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸〔Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＡＤＡ）〕、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸〔Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＢＥＳ）〕、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン〔Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｂｉｃｉｎｅ）〕、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン〔Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）〕、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸〔Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＣＡＰＳ）〕、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸〔３−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＥＰＰＳ）〕、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸〔２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）〕、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸〔２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＰＳＯ）〕、２−モルホリノエタンスルホン酸，一水和物〔２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（ＭＥＳ）〕、３−モルホリノプロパンスルホン酸〔３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）〕、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸〔２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＭＯＰＳＯ）〕、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）〔Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＰＩＰＥＳ）〕、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸），二水和物〔Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ），ｄｉｈｙｄｒａｔｅ（ＰＯＰＳＯ）〕、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸〔Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＴＡＰＳ）〕、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〔Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＴＥＳ）〕、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン〔Ｎ−［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｔｒｉｃｉｎｅ）〕およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｔｒｉｓ）〕からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミンが挙げられる。 The amine-containing buffer used in the method of the present invention is not particularly limited, but for example, N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid [N- (2-Acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid ( ACES)], N- (2-acetamido) iminodiacetic acid [N- (2-Acetamide) iminodiacetic acid (ADA)], N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid [N, N -Bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES)], N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine [N, N-Biz (2-hydroxyethyl) glycine (Bicine)], bis (2- Hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane [Bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) meshane (Bis-Tris)], N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid [N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulphonic acid] ], 3- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] propanesulfonic acid [3- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] tropanesulphonic acid (EPPS)], 2- [4-( 2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid [2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulphonic acid (HEEPS)], 2-hydroxy-3- [4- (2-hydroxyethyl) ) -1-Piperazinyl] Propane sulfonic acid [2-Hydroxy-3- [4- (2-hydroxathyl) -1-piperazinyl] propane sulfonic acid (HEPPSO)], 2-morpholinoetan sulfonic acid, monohydrate [2- Morphorinoethanesulfonic acid, monohydrate (MES)], 3-morpholinopropanesulfonic acid [3-Morphorinopropanesulphonic acid (MOPS)], 2-hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid [2-Hydroxy-3-morpho] linopropanesulphonic acid (MOPSO)], piperazin-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid) [Piperazine-1,4-bis (2-ethanesulphonic acid) (PIPES)], piperazin-1,4-bis (2-) Hydroxy-3-propanesulfonic acid), dihydrate [Piperazine-1,4-bis (2-hydroxy-3-propanesulphonic acid), dihydrate (POPSO)], N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-amino Propane sulfonic acid [N-Tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulphonic acid (TAPS)], N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid [N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulphonic acid TES)], N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine [N- [Tris (hydroxymethyl) methyl] glycine (Tricine)] and tris (hydroxymethyl) aminomethane [Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)] Included are at least one amine selected from the group.
本発明の方法において、前記アミンを含む緩衝液は、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸〔Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＡＤＡ）〕及びＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸〔Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＢＥＳ）〕からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。 In the method of the present invention, the buffer solution containing the amine is N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA)] and N, N-bis (2-hydroxyethyl)-. It is preferably at least one selected from the group consisting of 2-aminoethanesulfonic acid [N, N-Bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES)].
本発明のＡＳＯの安定化方法において使用する前記アミンを含む緩衝液と前記界面活性剤の組合せは特に限定されない。 The combination of the amine-containing buffer solution and the surfactant used in the method for stabilizing ASO of the present invention is not particularly limited.
例えば、前記方法においてアミンを含む緩衝液としてＡＤＡを選択する場合は、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４およびノニオンＮＳ−２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤であることが好ましい。 For example, when ADA is selected as the buffer solution containing an amine in the above method, it is selected from the group consisting of Emargen A60, Emargen A90, Emargen B66, Emargen 108, Emargen 120, Emargen 707, Emargen LS110, Emargen LS114 and Nonion NS-210. It is preferably at least one surfactant of choice.
また、例えば、前記方法においてアミンを含む緩衝液としてＢＥＳを選択する場合は、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４およびノニオンＮＳ−２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤であることが好ましい。 Further, for example, when BES is selected as the buffer solution containing an amine in the above method, it is composed of Emargen A60, Emargen A90, Emargen B66, Emargen 108, Emargen 120, Emargen 707, Emargen LS110, Emargen LS114 and Nonion NS-210. It is preferably at least one surfactant selected from the group.
ＡＳＯを含む溶液中のアミンを含む緩衝液の濃度としては特に限定されるものではないが、範囲の上限は、好ましくは２００ｍＭ、さらに好ましくは１００ｍＭ、範囲の下限は好ましくは５ｍＭ、さらに好ましくは２０ｍＭで、使用されるのが望ましい。 The concentration of the amine-containing buffer in the solution containing ASO is not particularly limited, but the upper limit of the range is preferably 200 mM, more preferably 100 mM, and the lower limit of the range is preferably 5 mM, further preferably 20 mM. It is desirable to use it.
また、アミンを含む緩衝液のｐＨ調整範囲は特に限定されないが、一般に生体試料の測定に必要な酵素等がいずれも中性付近で安定な性質を示しており、本発明においても中性付近の緩衝液を用いることが好ましい。範囲の上限は、好ましくは９．５、さらに好ましくは７．５、範囲の下限は、好ましくは４．５、さらに好ましくは６．０で、調整されるのが望ましい。 The pH adjustment range of the buffer solution containing amine is not particularly limited, but in general, all the enzymes and the like necessary for measuring a biological sample show stable properties near neutrality, and in the present invention, the pH adjustment range is also near neutrality. It is preferable to use a buffer solution. The upper limit of the range is preferably 9.5, more preferably 7.5, and the lower limit of the range is preferably 4.5, more preferably 6.0.
本発明で用いられるＡＳＯとは、ＥＣ１．１０．３．３に分類される以下の反応を触媒する酵素である。
Ｌ−アスコルビン酸＋１／２Ｏ２→デヒドロアスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ
上記酵素の由来は特に限定されないが、例えばキュウリ、カボチャ等の植物などから採取されるものなどに由来し得る。
また、本発明に用いられるＡＳＯには特開平６−２０９７７０に記載の以下の反応を触媒する酵素も含む。
Ｌ−アスコルビン酸＋１／２Ｏ２→デヒドロアスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ２
上記酵素の由来は特に限定されないが、例えば微生物などから採取されるものなどを含有する。前記微生物としては特に限定されないが、例えばトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属またはユペニシリウム属（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）が挙げられる。また、上記酵素は、化学的に合成してもよいし、遺伝子工学的に発現させて取得されるものであってもよい。アスコルビン酸オキシダーゼ活性を有する限り、公知のアスコルビン酸オキシダーゼを変異させたり、一部のドメインを欠損させたりしたタンパク質等の変異体であってもよい。
ＡＳＯを含む溶液中のＡＳＯの濃度は、特に限定されないが、酵素の起源によっても異なり、通常０．１〜５０Ｕ／ｍＬの範囲で好適に用いられる。The ASO used in the present invention is an enzyme that catalyzes the following reactions classified in EC1.10.3.3.
L-ascorbic acid + 1 / 2O 2 → Dehydroascorbic acid + H 2 O
The origin of the above enzyme is not particularly limited, but may be derived from, for example, those collected from plants such as cucumber and pumpkin.
The ASO used in the present invention also includes an enzyme that catalyzes the following reactions described in JP-A-6-209770.
L-ascorbic acid + 1 / 2O 2 → Dehydroascorbic acid + H 2 O 2
The origin of the above-mentioned enzyme is not particularly limited, but includes, for example, those collected from microorganisms and the like. The microorganism is not particularly limited, and examples thereof include the genus Trichoderma, the genus Mortierella, and the genus Penicillium. Further, the above-mentioned enzyme may be chemically synthesized or may be obtained by genetically engineering expression. As long as it has ascorbic acid oxidase activity, it may be a mutant such as a protein in which a known ascorbic acid oxidase is mutated or a part of the domain is deleted.
The concentration of ASO in the solution containing ASO is not particularly limited, but varies depending on the origin of the enzyme, and is usually preferably used in the range of 0.1 to 50 U / mL.
本発明のＡＳＯの安定化方法においては、さらに防腐剤などを共存させてもよい。防腐剤は特に限定されないが、例えば、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。 In the method for stabilizing ASO of the present invention, a preservative or the like may be further coexisted. The preservative is not particularly limited, and examples thereof include azides, chelating agents, antibiotics, and antibacterial agents.
また、本発明のＡＳＯの安定化方法は、種々の生化学診断方法に適用できる。該生化学診断方法としては、例えば尿酸、遊離脂肪酸、グルコース、中性脂肪、コレステロール、リン脂質等を測定する方法が挙げられる。
具体的には、本発明のＡＳＯの安定化方法には、前記診断方法に必要な他の構成成分を共存させてもよい。例えば中性脂肪測定試薬を構成する成分には、一般にＡＳＯのほか、リパーゼ、グリセロールキナーゼ、ＡＴＰ、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色原体などが挙げられ、これらのすべてを共存させてもよいし、これらの中から適宜必要なものを選んで共存させてもよい。Further, the method for stabilizing ASO of the present invention can be applied to various biochemical diagnostic methods. Examples of the biochemical diagnostic method include methods for measuring uric acid, free fatty acids, glucose, triglycerides, cholesterol, phospholipids and the like.
Specifically, in the method for stabilizing ASO of the present invention, other components necessary for the diagnostic method may coexist. For example, the components constituting the triglyceride measurement reagent generally include lipase, glycerol kinase, ATP, magnesium, peroxidase, chromogen, etc. in addition to ASO, and all of these may coexist or all of these may coexist. You may select necessary ones from among them and make them coexist.
（アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物）
本発明の別の実施態様は、アスコルビン酸オキシダーゼ、および、以下の（１）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物である。
（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤。(Composition with stabilized ascorbic acid oxidase)
Another embodiment of the present invention is a composition in which ascorbic acid oxidase is stabilized, which comprises ascorbic acid oxidase and the following (1).
(1) Selected from the group consisting of polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, and polyoxyethylene nonylphenyl ether. At least one surfactant.
本発明のアスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物は、アスコルビン酸オキシダーゼ、以下の（１）および以下の（２）を含む組成物であってもよい。
（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤、
（２）アミンを含む緩衝液。The composition in which the ascorbic acid oxidase of the present invention is stabilized may be a composition containing ascorbic acid oxidase, the following (1) and the following (2).
(1) Selected from the group consisting of polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, and polyoxyethylene nonylphenyl ether. At least one surfactant,
(2) A buffer solution containing an amine.
前記界面活性剤およびアミンを含む緩衝液の詳細については、前記の本発明のＡＳＯの安定化方法の項で説明したとおりである。 The details of the buffer solution containing the surfactant and the amine are as described in the section of the method for stabilizing ASO of the present invention.
本発明は、前記のいずれかに記載の組成物を含む、生体成分分析用キットであってもよい。
種々の生体成分測定方法が既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＡＳＯ安定化方法やＡＳＯ含有組成物を生体成分分析用キットに適用して、各種試料中の生体成分の量又は濃度を測定することができる。その組成は特に限定されない。
本発明の組成物またはキットは、汎用自動分析機への適用などを考慮して２つ以上に分包される態様をとる場合もあるが、その場合ＡＳＯは少なくともいずれかに含まれていればよく、その場合、ＡＳＯを含む方の組成物に、前記界面活性剤と必要に応じて添加され得る前記アミンを含む緩衝液とを共存させることが好ましい。また、本発明の組成物（キットに含まれる形態を含む）は、水溶液であっても凍結乾燥したものであってもよい。本発明によれば、ＡＳＯが経時的に失活し易い液状製剤においても長期的な保存安定性を示すことができる。かかる観点を考慮すれば、本発明は液状製剤（例えば、水溶液等の液状の組成物）において、より有効に用いられ得る。また、凍結乾燥等で粉末状（固形状）の製剤として調製する場合であっても、例えば、液体溶媒に用事調製した後におけるＡＳＯの失活を抑制でき安定性を高めることができるというメリットがある。The present invention may be a biological component analysis kit containing the composition according to any one of the above.
Various biological component measurement methods have already been established in the art. Therefore, according to a known method, the ASO stabilization method of the present invention or the ASO-containing composition can be applied to a biological component analysis kit to measure the amount or concentration of biological components in various samples. Its composition is not particularly limited.
The composition or kit of the present invention may be packaged in two or more in consideration of application to a general-purpose automatic analyzer, but in that case, if ASO is contained in at least one of them. Often, in that case, it is preferable that the composition containing ASO coexists with the surfactant and a buffer solution containing the amine, which can be added as needed. In addition, the composition of the present invention (including the form contained in the kit) may be an aqueous solution or lyophilized. According to the present invention, long-term storage stability can be exhibited even in a liquid preparation in which ASO is easily inactivated over time. Considering this viewpoint, the present invention can be used more effectively in a liquid preparation (for example, a liquid composition such as an aqueous solution). Further, even when prepared as a powder (solid) preparation by freeze-drying or the like, for example, there is an advantage that the deactivation of ASO can be suppressed and the stability can be improved after the preparation in a liquid solvent. is there.
本発明は、前記のいずれかに記載の組成物、又は前記のいずれかに記載の組成物を含む生体成分分析用キットの製造方法をも提供する。
前記のようなアスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物を製造する方法では、アスコルビン酸オキシダーゼと、（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤とを共存させるように、当該分野で公知の製剤技術に従って組成物を調製すればよい。更に、前記のようなアスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物を製造する方法では、アスコルビン酸オキシダーゼと、（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤と、（２）アミンを含む緩衝液とを共存させるように、当該分野で公知の任意の製剤化技術に従って組成物を調製すればよい。これらの製造方法において、アスコルビン酸オキシダーゼと、前記（１）に記載のポリオキシアルキレン系の非イオン性である界面活性剤と、必要に応じて添加される前記（２）に記載のアミンを含む緩衝液との添加順序は、本発明の効果を奏する限り、特に限定されない。
ここで、前記（１）に記載のポリオキシアルキレン系の非イオン性である界面活性剤、前記（２）に記載のアミンを含む緩衝液の詳細については、前記の本発明のＡＳＯの安定化方法の項で説明したとおりである。The present invention also provides the composition according to any one of the above, or a method for producing a kit for analyzing a biological component containing the composition according to any one of the above.
In the method for producing a composition in which ascorbic acid oxidase is stabilized as described above, ascorbic acid oxidase and (1) polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, and polyoxyethylene lauryl ether are used. , Polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, and at least one surfactant selected from the group consisting of polyoxyethylene nonylphenyl ether, according to a formulation technique known in the art. Should be prepared. Further, in the method for producing a composition in which ascorbic acid oxidase is stabilized as described above, ascorbic acid oxidase and (1) polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, and polyoxyethylene At least one surfactant selected from the group consisting of lauryl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, and polyoxyethylene nonylphenyl ether, and (2) a buffer containing amine should coexist. In addition, the composition may be prepared according to any formulation technique known in the art. These production methods include ascorbic acid oxidase, the polyoxyalkylene-based nonionic surfactant according to (1) above, and the amine according to (2) above, which is added as needed. The order of addition with the buffer solution is not particularly limited as long as the effects of the present invention are obtained.
Here, for details of the buffer solution containing the polyoxyalkylene-based nonionic surfactant described in (1) above and the amine described in (2) above, the stabilization of the ASO of the present invention described above. As explained in the method section.
更なる実施形態として、本発明は、安定化されたアスコルビン酸オキシダーゼを含有する組成物を製造するための、（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤の使用、を提供する。更に、本発明は、安定化されたアスコルビン酸オキシダーゼを含有する組成物を製造するための、（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤、及び、（２）アミンを含む緩衝液の使用、を提供する。これらの製造における使用において、各成分の添加順序は、本発明の効果を奏する限り、特に限定されない。
ここで、前記（１）に記載のポリオキシアルキレン系の非イオン性である界面活性剤、前記（２）に記載のアミンを含む緩衝液の詳細については、前記の本発明のＡＳＯの安定化方法の項で説明したとおりである。As a further embodiment, the present invention comprises (1) polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, polyoxy for producing a composition containing stabilized ascorbic acid oxidase. Provided is the use of at least one surfactant selected from the group consisting of ethylene lauryl ethers, polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyalkylene alkyl ethers, and polyoxyethylene nonylphenyl ethers. Further, the present invention comprises (1) polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, for producing a composition containing stabilized ascorbic acid oxidase. Provided are at least one surfactant selected from the group consisting of polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyalkylene alkyl ethers, and polyoxyethylene nonylphenyl ethers, and (2) the use of buffers containing amines. In use in these productions, the order of addition of each component is not particularly limited as long as the effects of the present invention are obtained.
Here, for details of the buffer solution containing the polyoxyalkylene-based nonionic surfactant described in (1) above and the amine described in (2) above, the stabilization of the ASO of the present invention described above. As explained in the method section.
更なる一つの実施形態として、本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼを安定化するための、（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤を含む組成物、をも提供する。更に、本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼを安定化するための、（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤、及び、（２）アミンを含む緩衝液を含む組成物を提供する。これらの組成物は、前記（１）に記載のポリオキシアルキレン系の非イオン性である界面活性剤、及び必要に応じて前記（２）に記載のアミンを含む緩衝液の他に、本発明の効果を損なわない限り、添加物等の他の任意の成分を含んでいてもよく、またこれらの組成物を製造する際の各成分の添加順序は問わない。
ここで、前記（１）に記載のポリオキシアルキレン系の非イオン性界面活性剤、前記（２）に記載のアミンを含む緩衝液の詳細については、前記の本発明のＡＳＯの安定化方法の項で説明したとおりである。As a further embodiment, the present invention comprises (1) polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxy for stabilizing ascorbic acid oxidase. Also provided is a composition comprising at least one surfactant selected from the group consisting of ethylene alkyl ethers, polyoxyalkylene alkyl ethers, and polyoxyethylene nonylphenyl ethers. Furthermore, the present invention provides (1) polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene alkyl ether, and polyoxy for stabilizing ascorbic acid oxidase. Provided is a composition containing at least one surfactant selected from the group consisting of an alkylene alkyl ether and a polyoxyethylene nonylphenyl ether, and (2) a buffer solution containing an amine. In addition to the polyoxyalkylene-based nonionic surfactant described in (1) above and, if necessary, a buffer solution containing an amine described in (2) above, these compositions are of the present invention. Any other component such as an additive may be contained as long as the effect of the above is not impaired, and the order of addition of each component in producing these compositions does not matter.
Here, for details of the buffer solution containing the polyoxyalkylene-based nonionic surfactant described in (1) and the amine described in (2), the method for stabilizing ASO of the present invention described above. As explained in the section.
（アスコルビン酸オキシダーゼの活性測定法）
ＡＳＯの活性測定は、以下の測定条件で行う。
＜反応液＞
１００ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ５．６
０．５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸
＜測定条件＞
（１）上記反応液を１ｍＭキュベットにとり、３０℃で約５分間予備加温する。
（２）酵素溶液０．１ｍＬを添加し反応を開始する。正確に５分間反応させた後に、０．２Ｎ塩酸溶液３．０ｍＬを加えて反応を停止させる。この液を分光光度計で２４５ｎｍの吸光度を測定する。
（３）盲検は反応液を３０℃で５分放置後、０．２Ｎ塩酸溶液３．０ｍＬを加えて混和し、次いで酵素溶液０．１ｍＬを加えて調製する。この液について同様に急高度を測定する。(Method for measuring the activity of ascorbic acid oxidase)
The ASO activity is measured under the following measurement conditions.
<Reaction solution>
100 mM phosphate buffer pH 5.6
0.5 mM L-ascorbic acid <Measurement conditions>
(1) Take the above reaction solution in a 1 mM cuvette and preheat it at 30 ° C. for about 5 minutes.
(2) Add 0.1 mL of the enzyme solution and start the reaction. After reacting for exactly 5 minutes, 3.0 mL of 0.2N hydrochloric acid solution is added to stop the reaction. The absorbance of this solution at 245 nm is measured with a spectrophotometer.
(3) Blindly prepared by leaving the reaction solution at 30 ° C. for 5 minutes, adding 3.0 mL of 0.2N hydrochloric acid solution and mixing, and then adding 0.1 mL of enzyme solution. Similarly, measure the steep altitude of this liquid.
本発明において「アスコルビン酸オキシダーゼが安定である」とは、アスコルビン酸オキシダーゼの経時的な失活が抑制され、長期的な保存安定性が改善されていることをいう。具体的には、界面活性剤もアミンを含む緩衝液も含まない蒸留水（但し、塩化マグネシウムを１ｇ／Ｌを含んでいてもよい）で保存した場合に比べて、３５℃で７日間保存後のＡＳＯの残存酵素活性が高められていることをいう。 In the present invention, "ascorbic acid oxidase is stable" means that the inactivation of ascorbic acid oxidase over time is suppressed and the long-term storage stability is improved. Specifically, after storage at 35 ° C. for 7 days, compared with the case of storage in distilled water containing neither a surfactant nor a buffer solution containing amine (however, magnesium chloride may contain 1 g / L). It means that the residual enzyme activity of ASO is enhanced.
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples. The present invention is not particularly limited to the examples.
実施例１：界面活性剤によるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化
ＡＳＯ（東洋紡製ＡＳＯ−３１１）３Ｕ／ｍＬを塩化マグネシウム（１ｇ／Ｌ）を含む蒸留水に溶解し、この水溶液に各種添加剤を１ｇ／Ｌ加え、添加剤を加えない場合を対照として、３７℃で７日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値＝[スタート活性]に対する保存後の活性値の割合）を検討した。Example 1: Stabilization of ascorbic acid oxidase with a surfactant 3 U / mL of ASO (Toyobo ASO-311) is dissolved in distilled water containing magnesium chloride (1 g / L), and 1 g / of various additives are added to this aqueous solution. As a control when L was added and no additive was added, the mixture was stored at 37 ° C. for 7 days, and the residual activity (activity value immediately after dissolution = ratio of activity value after storage to [start activity]) was examined.
結果を表１に示す。
ＡＳＯ水溶液にエマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、またはノニオンＮＳ−２１０を加えることで、添加剤を加えない場合に対し良好な安定性が得られた。The results are shown in Table 1.
By adding Emargen A60, Emargen A90, Emargen B66, Emargen 108, Emargen 120, Emargen 707, Emargen LS110, Emargen LS114, or Nonion NS-210 to the ASO aqueous solution, good stability is obtained without the addition of additives. Obtained.
実施例２：界面活性剤と緩衝液との組合せによるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化
ＡＳＯ（東洋紡製ＡＳＯ−３１１）３Ｕ／ｍＬを塩化マグネシウム（１ｇ／Ｌ）を含む蒸留水、ＡＤＡ（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）、またはＢＥＳ（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）に溶解し、この水溶液に各種添加剤を１ｇ／Ｌ加え、蒸留水に添加剤を加えない場合を対照として、３７℃で７日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値＝[スタート活性]に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
なお、参考として、緩衝液単独でのアスコルビン酸オキシダーゼの安定化についてもデータを取得したところ、ＡＳＯをＡＤＡまたはＢＥＳに溶解することで、蒸留水に対し良好な安定性が得られた。Example 2: Stabilization of ascorbic acid oxidase by a combination of a surfactant and a buffer solution ASO (Toyo Boseki ASO-311) 3 U / mL is distilled water containing magnesium chloride (1 g / L), ADA (100 mM, pH 7. Dissolve in 0) or BES (100 mM, pH 7.0), add 1 g / L of various additives to this aqueous solution, and store at 37 ° C. for 7 days as a control when no additives are added to distilled water, and remain. The activity (activity value immediately after dissolution = ratio of activity value after storage to [start activity]) was examined.
As a reference, when data were obtained on the stabilization of ascorbic acid oxidase with the buffer solution alone, good stability with respect to distilled water was obtained by dissolving ASO in ADA or BES.
結果を表２〜表３に示す。
アミンを含む緩衝液（ＡＤＡまたはＢＥＳ）および各種添加剤の相乗効果を調べた。相乗効果は以下の通り判定した。
［安定化効果 総合（Ａ）］
各実施例の実験結果から比較例の結果を差し引き、安定化効果を相対化した。
（各実施例の活性残存率％）−（比較例（蒸留水×添加剤なし）での活性残存率（１２％））
［安定化効果 Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ）］
各Ｂｕｆｆｅｒ（ＡＤＡまたはＢＥＳ）単独の安定化効果を求めた。
（添加剤なしの場合の活性残存率％）−（比較例（蒸留水×添加剤なし）での活性残存率（１２％））
［安定化効果 添加剤（Ｃ）］
各添加物単独の安定化効果を求めた。
（Ｂｕｆｆｅｒなしの場合の活性残存率％）−（比較例（蒸留水×添加剤なし）での活性残存率（１２％））
［相乗効果］
総合（Ａ）−Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ）−添加剤（Ｃ）
相乗効果がなければ０％となるはずである。従って、正の値であればプラスの相乗効果、負の値であればマイナスの相乗効果があると判断した。The results are shown in Tables 2 and 3.
The synergistic effect of the amine-containing buffer (ADA or BES) and various additives was investigated. The synergistic effect was determined as follows.
[Comprehensive stabilization effect (A)]
The stabilization effect was relativized by subtracting the results of the comparative examples from the experimental results of each example.
(Activity residual rate% of each example)-(Activity residual rate (12%) in Comparative Example (distilled water × no additive))
[Stabilization effect Buffer (B)]
The stabilizing effect of each Buffer (ADA or BES) alone was determined.
(Activity residual rate% when no additive is used)-(Activity residual rate (12%) in Comparative Example (distilled water x no additive))
[Stabilizing effect additive (C)]
The stabilizing effect of each additive alone was determined.
(Activity residual rate% without Buffer)-(Activity residual rate (12%) in Comparative Example (distilled water × no additive))
[Synergy]
Comprehensive (A) -Buffer (B) -Additive (C)
If there is no synergistic effect, it should be 0%. Therefore, it was judged that a positive value has a positive synergistic effect and a negative value has a negative synergistic effect.
表２の結果によれば、ＡＤＡ緩衝液と、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、およびノニオンＮＳ２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤との組合せにおいて、安定化効果における相乗効果が見られた。 According to the results in Table 2, at least one selected from the group consisting of ADA buffer and Emargen A60, Emargen A90, Emargen B66, Emargen 108, Emargen 120, Emargen 707, Emargen LS110, Emargen LS114, and Nonion NS210. A synergistic effect on the stabilizing effect was observed in combination with the additive.
表３の結果によれば、ＢＥＳ緩衝液と、エマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６、エマルゲン１０８、エマルゲン１２０、エマルゲン７０７、エマルゲンＬＳ１１０、エマルゲンＬＳ１１４、およびノニオンＮＳ２１０からなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤との組合せにおいて、安定化効果における相乗効果が見られた。 According to the results in Table 3, at least one selected from the group consisting of BES buffer and Emargen A60, Emargen A90, Emargen B66, Emargen 108, Emargen 120, Emargen 707, Emargen LS110, Emargen LS114, and Nonion NS210. A synergistic effect on the stabilizing effect was observed in combination with the additive.
溶液中のアスコルビン酸オキシダーゼは非常に不安定であるため、前記の試験条件下での実施例の結果に示されるように、本発明により保存安定性を向上させることができたことは、非常に有益である。特に、酵素の機能を利用した分子生物学用途の分析用試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工したドライ系の体外診断薬、酵素センサーや酵素電極、医薬品、食品および飲料などの組成物では、酵素反応が最も重要なファクターとなり、律速要因にもなり得る。従って、前記実施例の結果に示すように、不安定化しやすい溶液中でアスコルビン酸オキシダーゼの保存安定性を高めることができ、しかも非常に簡便な手法で安定性を高めることができたことは極めて有益であることが明らかとなった。 Since ascorbic acid oxidase in solution is very unstable, it is very significant that the present invention was able to improve storage stability, as shown in the results of the examples under the above test conditions. It is beneficial. In particular, analytical reagents for molecular biology applications that utilize the functions of enzymes, analytical reagents for biochemical applications, in vitro diagnostic agents, liquid in vitro diagnostic agents, dry in vitro diagnostic agents processed into chips or slits, enzyme sensors. And in compositions such as enzyme electrodes, pharmaceuticals, foods and beverages, the enzymatic reaction is the most important factor and can also be a rate-determining factor. Therefore, as shown in the results of the above-mentioned examples, it is extremely possible to improve the storage stability of ascorbic acid oxidase in a solution that is easily destabilized, and to improve the stability by a very simple method. It turned out to be beneficial.
なお、上記開示した実施形態および実施例はすべて例示であり制限的なものではない。また、実施形態および実施例に開示された内容を組み合わせた実施形態及び実施例も本発明の範囲に含まれる。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲によって有効であり、特許請求の範囲の記載と均等の意味および範囲内のすべての変更・修正・置き換え等を含むものである。 The embodiments and examples disclosed above are all examples and are not restrictive. In addition, the scope of the present invention also includes embodiments and examples in which the contents disclosed in the embodiments and examples are combined. The technical scope of the present invention is valid depending on the scope of claims, and includes the description of the claims and the meaning equivalent to the description and all changes, modifications, replacements, etc. within the scope.
本発明により、アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯ）を含有する、より長期間安定な液状試薬を供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a liquid reagent containing ascorbic acid oxidase (ASO), which is stable for a longer period of time.
Claims (9)
（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤。A composition in which ascorbic acid oxidase is stabilized, which comprises ascorbic acid oxidase and the following (1).
(1) Selected from the group consisting of polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, and polyoxyethylene nonylphenyl ether. At least one surfactant.
（１）ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤、
（２）アミンを含む緩衝液。A composition in which ascorbic acid oxidase is stabilized, which comprises ascorbic acid oxidase, the following (1) and the following (2).
(1) Selected from the group consisting of polyoxyethylene distyrene phenyl ether, polyoxyethylene tribenzylphenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, and polyoxyethylene nonylphenyl ether. At least one surfactant,
(2) A buffer solution containing an amine.
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