JPWO2019160994A5

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Publication number: JPWO2019160994A5
Application number: JP2020543880A
Authority: JP
Publication date: 2022-06-30
Anticipated expiration: 2039-02-13

Description

第１の実施形態において、セルフリーＤＮＡ中の酸化５－メチルシトシン残基をジヒドロウラシル残基に変換する方法が提供され、前記方法は、５－カルボキシシトシン、５－ホルミルシトシン、およびこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの酸化５－メチルシトシン残基を含むセルフリーＤＮＡを接触させることを含み、有機ボランは、少なくとも１つの酸化５－メチルシトシン残基を還元、脱アミノ化、および脱炭酸または脱ホルミル化のいずれかに効果的であり、それによりその場所にジヒドロウラシル残基を提供する。

In a first embodiment, a method for converting an oxidized 5-methylcytosine residue in cell-free DNA to a dihydrouracil residue is provided, wherein the method is 5- carboxycytosine , 5-formylcytosine, and these. Containing contact with cell-free DNA containing at least one 5-methylcytosine oxide residue selected from the combination, organic borane reduces, deaminates, and deaminates at least one 5-methylcytosine oxide residue. It is effective for either carbonation or deformation, thereby providing dihydrouracil residues at its site.

（ａ）５－カルボキシシトシン、５－ホルミルシトシン、およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの酸化５－メチルシトシン残基を含むセルフリーＤＮＡの試料；ならびに

(A) A sample of cell-free DNA containing at least one oxidized 5-methylcytosine residue selected from 5- carboxycytosine , 5-formylcytosine, and combinations thereof; and

（ｃ）未修飾５－メチルシトシン残基を酸化して、５－カルボキシシトシン、５－ホルミルシトシン、およびそれらの組み合わせから選択される酸化５－メチルシトシン残基を含むＤＮＡを得るステップ；

(C) The step of oxidizing an unmodified 5-methylcytosine residue to obtain a DNA containing an oxidized 5-methylcytosine residue selected from 5- carboxycytosine , 5-formylcytosine, and combinations thereof;

さらなる実施形態において、本発明は、セルフリーＤＮＡ試料中の５－メチルシトシン残基を同定するためのキットを提供し、上記キットは、５－ヒドロキシメチルシトシン残基を修飾し、その上に親和性タグを提供する；修飾５－ヒドロキシメチルシトシン残基を試料から取り除く；未修飾５－メチルシトシン残基を酸化し、酸化５－メチルシトシン残基を提供する；ならびに酸化５－メチルシトシン残基を還元、脱アミノ化、および脱炭酸または脱ホルミル化のいずれかに有効な有機ボランのための個々の試薬組成物を含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
セルフリーＤＮＡ中の酸化５－メチルシトシン残基をジヒドロウラシル残基に変換する方法であって、５－カルボキシシトシン、５－ホルミルシトシン、およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの酸化５－メチルシトシン残基を含むセルフリーＤＮＡを、前記少なくとも１つの酸化５－メチルシトシン残基を還元、脱アミノ化、および脱炭酸または脱ホルミル化のいずれかを行うのに有効な有機ボランと接触させ、、それによりその代わりにジヒドロウラシル残基を提供することを含む方法。
（項目２）
前記少なくとも１つの酸化５－メチルシトシン残基が、５－カルボキシシトシンを含む、項目１記載の方法。
（項目３）
前記少なくとも１つの酸化５－メチルシトシン残基が、５－ホルミルシトシンを含む、項目１記載の方法。
（項目４）
前記少なくとも１つの酸化５－メチルシトシン残基が、５－カルボキシシトシンおよび５－ホルミルシトシンの組み合わせを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記有機ボランが、ボランと、窒素複素環および第３級アミンから選択される窒素含有化合物との錯体を含む、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記有機ボランが、ボランと窒素複素環との錯体を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記窒素複素環が、１～４個の低級アルキル基で必要に応じて置換されたピリジンを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記窒素複素環が、ピリジン、２－メチルピリジン、または５－エチル－２－メチルピリジンを含む、項目７記載の方法。
（項目９）
前記窒素複素環が、２－メチルピリジンを含み、前記有機ボランが２－ピコリンボランである、項目８記載の方法。
（項目１０）
前記有機ボランが、ボランと第３級アミンとの錯体を含む、項目５に記載の方法。
（項目１１）
前記第３級アミンが、トリエチルアミンおよびトリ（ｔ－ブチル）アミンから選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
還元、脱アミノ化、および脱炭酸が、いかなる中間体を単離することなく行われる、項目１記載の方法。
（項目１３）
前記方法が、バイサルファイトの非存在下で行われる、項目１記載の方法。
（項目１４）
（ａ）５－カルボキシシトシン、５－ホルミルシトシン、およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの酸化５－メチルシトシン残基を含むセルフリーＤＮＡの試料；ならびに
（ｂ）前記少なくとも１つの酸化５－メチルシトシン残基を還元、脱アミノ化、および脱炭酸または脱ホルミル化のいずれかを行うのに有効な有機ボラン
を含む反応混合物。
（項目１５）
前記少なくとも１つの酸化５－メチルシトシン残基が、５－カルボキシシトシンを含む、項目１４に記載の混合物。
（項目１６）
前記少なくとも１つの酸化５－メチルシトシン残基が、５－ホルミルシトシンを含む、項目１４に記載の混合物。
（項目１７）
前記少なくとも１つの酸化５－メチルシトシン残基が、５－カルボキシシトシンと５－ホルミルシトシンとの組み合わせを含む、項目１４に記載の混合物。
（項目１８）
前記有機ボランが、ボランと、窒素複素環および第３級アミンから選択される窒素含有化合物との錯体を含む、項目１５から１７のいずれか一項に記載の混合物。
（項目１９）
前記有機ボランが、ボランと窒素複素環との錯体を含む、項目１８に記載の混合物。
（項目２０）
前記窒素複素環が、１～４個の低級アルキル基で必要に応じて置換されたピリジンを含む、項目１９に記載の混合物。
（項目２１）
前記窒素複素環が、ピリジン、２－メチルピリジン、または５－エチル－２－メチルピリジンを含む、項目２０記載の混合物。
（項目２２）
前記窒素複素環が、２－メチルピリジンを含み、前記有機ボランが、２－ピコリンボランである、項目２１に記載の混合物。
（項目２３）
前記有機ボランが、ボランと第３級アミンとの錯体を含む、項目１８に記載の混合物。
（項目２４）
前記第３級アミンが、トリエチルアミンおよびトリ（ｔ－ブチル）アミンから選択される、項目２３に記載の混合物。
（項目２５）
前記混合物がバイサルファイトを実質的に含まない、項目１４に記載の混合物。
（項目２６）
セルフリーＤＮＡ中の５－メチルシトシン残基の存在および位置を検出するための方法であって、前記方法が：
（ａ）断片化されたアダプターライゲーションセルフリーＤＮＡ中の５－ヒドロキシメチルシトシン残基を修飾し、その上に親和性タグを提供するステップであって、ここで前記親和性タグにより前記セルフリーＤＮＡから修飾５－ヒドロキシメチルシトシン含有ＤＮＡを除去できるステップ；
（ｂ）前記セルフリーＤＮＡから前記修飾５－ヒドロキシメチルシトシン含有ＤＮＡを除去し、未修飾５－メチルシトシン残基を含むＤＮＡを残すステップ；
（ｃ）前記未修飾５－メチルシトシン残基を酸化し、酸化５－メチルシトシン残基を含むＤＮＡを得るステップ；
（ｄ）前記酸化５－メチルシトシン残基を含むＤＮＡを、前記酸化５－メチルシトシン残基を還元、脱アミノ化、および脱炭酸または脱ホルミル化のいずれかを行うのに有効な有機ボランと接触させ、それにより、前記酸化５－メチルシトシン残基の代わりにジヒドロウラシル残基を含むＤＮＡを提供するステップ；
（ｅ）前記ジヒドロウラシル残基を含むＤＮＡを増幅および配列決定するステップ；
（ｆ）（ｅ）中の前記配列決定の結果から５－メチル化パターンを決定するステップ
を含む、方法。
（項目２７）
（ｇ）ステップ（ｂ）で前記セルフリーＤＮＡ試料から除去された５－ヒドロキシメチルシトシン含有ＤＮＡにおけるヒドロキシメチル化パターンを特定するステップ、
をさらに含む、項目２６に記載の方法：
（項目２８）
ステップ（ａ）から（ｄ）が、バイサルファイトの非存在下で行われる、項目２６または項目２７に記載の方法。
（項目２９）
ステップ（ａ）から（ｄ）が、いかなる中間体を単離することなく行われる、項目２６または項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記親和性タグがビオチンを含み、ステップ（ａ）がビオチンでの５－ヒドロキシメチルシトシン残基の選択的標識を含む、項目２６または項目２７に記載の方法。
（項目３１）
ステップ（ｂ）が前記ビオチン化ＤＮＡを支持体結合ストレプトアビジンと接触させることを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
ステップ（ｃ）が酵素的に行われる、項目２６または項目２７に記載の方法。
（項目３３）
ステップ（ｃ）がＴｅｎ－ＥｌｅｖｅｎＴｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）酵素を使用して行われる、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
ステップ（ｃ）が化学的に行われる、項目２６または項目２７に記載の方法。
（項目３５）
前記セルフリーＤＮＡが、セルフリーＤＮＡの選択された領域を含む、項目１に記載の方法。
（項目３６）
前記セルフリーＤＮＡ試料が、セルフリーＤＮＡの選択された領域を含む、項目２６または項目２７に記載の方法。
（項目３７）
前記アダプターライゲーションＤＮＡ断片が、試料識別子配列、断片識別子配列、および鎖識別子配列から選択される少なくとも１つの分子バーコードを含むアダプターを含む、項目２６または２７に記載の方法。
（項目３８）
ステップ（ｅ）において、プロセス識別子配列を含む分子バーコードが、前記ＤＨＵ含有ＤＮＡに付加される、項目２６または項目２７に記載の方法。
（項目３９）
前記セルフリーＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡを含む、項目２６または項目２７に記載の方法。
（項目４０）
前記セルフリーＤＮＡが、一本鎖ＤＮＡを含む、項目２６または項目２７に記載の方法。
（項目４１）
前記親和性タグが、所定の配列を有する選択されたオリゴヌクレオチドタグで構成されており、ステップ（ａ）が、前記オリゴヌクレオチドタグによる５－ヒドロキシメチルシトシン残基の選択的標識を含む、項目２６または項目２７に記載の方法。
（項目４２）
ステップ（ｂ）が、オリゴヌクレオチドタグ付きＤＮＡを、前記所定の配列に実質的に相補的な配列を含む支持体結合オリゴヌクレオチドと接触させることを含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記アダプターライゲーションＤＮＡ断片が、断片識別子配列および鎖識別子配列の両方を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４４）
処理された鎖における前記断片識別子配列および前記鎖識別子配列を分析して、鋳型ＤＮＡ断片が完全に修飾またはヘミ修飾されているかを決定することをさらに含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
セルフリーＤＮＡの５－メチルシトシン残基をジヒドロウラシル残基に変換するためのキットであって、前記５－ヒドロキシメチルシトシン残基をブロックするためのブロッキング試薬組成物、ヒドロキシメチル化を超えて前記５－メチルシトシン残基を酸化して酸化５－メチルシトシン残基を提供する酸化試薬、および前記酸化５－メチルシトシン残基を還元、脱アミノ化、および脱炭酸または脱ホルミル化のいずれかを行うのに有効な有機ボランを含む、キット。
（項目４６）
セルフリーＤＮＡ試料中の５－メチルシトシン残基を同定するためのキットであって、５－ヒドロキシメチルシトシン残基を修飾してその上に親和性タグを提供し、前記試料から前記修飾５－ヒドロキシメチルシトシン残基を除去し、ヒドロキシメチル化を超えて未修飾５－メチルシトシン残基を酸化して酸化５－メチルシトシン残基を提供するための個々の試薬組成物、ならびに前記酸化５－メチルシトシン残基を還元、脱アミノ化、および脱炭酸または脱ホルミル化のいずれかを行うのに有効な有機ボランを含む、キット。
（項目４７）
セルフリーＤＮＡ中の５－メチルシトシン残基および５－ヒドロキシメチルシトシン残基の存在および位置を検出する方法であって、前記方法が、
（ａ）断片化された、アダプターライゲーションセルフリーＤＮＡの５－ヒドロキシメチルシトシン残基をビオチン化して、ビオチン化５－ヒドロキシメチルシトシン含有ＤＮＡ断片の最初の群を形成するステップ；
（ｂ）前記セルフリーＤＮＡからビオチン化５－ヒドロキシメチルシトシン含有ＤＮＡ断片の最初の群を除去し、未修飾ＤＮＡと未修飾５－メチルシトシン残基を含むＤＮＡ断片とを残すステップ；
（ｃ）未修飾５－メチルシトシン断片を含むＤＮＡ断片を酸化して、それの代わりに５－ヒドロキシメチルシトシン残基を提供し、その後ビオチン化して、ビオチン化５－ヒドロキシメチルシトシン含有ＤＮＡ断片の第２の群を提供するステップ；
（ｄ）ビオチン化５－ヒドロキシメチルシトシン含有ＤＮＡ断片の第２の群を除去するステップ；ならびに
（ｅ）前記最初の群のＤＮＡ断片および第２の群のＤＮＡ断片をプールし、増幅し、配列決定するステップ、
を含む方法。
（項目４８）
（ｆ）ステップ（ｅ）の前記結果から、５－メチル化パターン、５－ヒドロキシメチル化パターン、または５－メチル化パターンおよび５－ヒドロキシメチル化パターンの両方を決定することをさらに含む、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
セルフリーＤＮＡの単一のＤＮＡ鎖における５－メチルシトシンと５－ヒドロキシメチルシトシンとの共起を同定する方法であって、
（ａ）断片化された、アダプターライゲーションセルフリーＤＮＡ中の５－ヒドロキシメチル残基を、前記セルフリーＤＮＡからタグ付きＤＮＡ断片を選択的に除去できる親和性タグで官能基化するステップ；
（ｂ）前記除去されたタグ付きＤＮＡ断片を酸化して、その結果、未修飾５－メチルシトシン残基が、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシシトシン残基、またはそれらの組み合わせから選択される酸化５－メチルシトシン残基に変換されるステップ；
（ｃ）（ｂ）の前記酸化タグ付きＤＮＡ断片を、前記酸化５－メチルシトシン残基を還元、脱アミノ化、および脱炭酸または脱ホルミル化のいずれかを行うのに有効な有機ボランと接触させ、それにより、前記酸化５－メチルシトシン残基の代わりにジヒドロウラシル残基を含むＤＮＡを提供するステップ；ならびに
（ｄ）ジヒドロウラシル残基を含む前記ＤＮＡを増幅し、配列決定するステップ、
を含む、方法。
（項目５０）
ＤＮＡ試料中の５－メチルシトシン残基および５－ヒドロキシメチルシトシン残基の存在および位置を検出するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記ＤＮＡ試料からのタグ付き５－ヒドロキシメチルシトシン含有ＤＮＡの選択的除去を可能にする親和性タグを使用して、前記ＤＮＡ試料内の５－ヒドロキシメチルシトシン残基を官能化するステップ；
（ｂ）前記タグ付きＤＮＡ断片を前記ＤＮＡ試料から除去し、未修飾ＤＮＡおよび未修飾５－メチルシトシン残基を含むＤＮＡを残すステップ；
（ｃ）前記５－メチルシトシン残基を修飾して、前記５－メチルシトシン含有ＤＮＡの選択的除去を可能にするステップ；
（ｄ）前記修飾５－メチルシトシン含有ＤＮＡを除去するステップ；ならびに
（ｅ）前記タグ付き５－ヒドロキシメチル含有ＤＮＡおよび前記修飾５－メチルシトシン含有ＤＮＡにプロセス識別子配列を追加するステップであって、ここで各プロセス識別子配列が、前記タグ付きＤＮＡおよび前記修飾ＤＮＡを識別および／または分離するために使用されるプロセスを識別するステップ。
（項目５１）
前記ＤＮＡ試料が、セルフリーＤＮＡを含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記セルフリーＤＮＡが、試料識別子配列、断片識別子配列、および鎖識別子配列から選択される分子バーコードを含む少なくとも１つのアダプターとアダプターライゲーションされる、項目５１に記載の方法。

In a further embodiment, the invention provides a kit for identifying 5-methylcytosine residues in cell-free DNA samples, wherein the kit modifies 5-hydroxymethylcytosine residues and has an affinity on them. Provides sex tags; removes modified 5-hydroxymethylcytosine residues from the sample; oxidizes unmodified 5-methylcytosine residues to provide oxidized 5-methylcytosine residues; as well as oxidized 5-methylcytosine residues. Contains individual reagent compositions for organic borane that are effective for either reduction, deamination, and decarbonation or deformylization.
The present invention provides, for example, the following items.
(Item 1)
A method of converting 5-methylcytosine oxide residues in cell-free DNA to dihydrouracil residues, at least one 5-methylcytosine oxide selected from 5-carboxycytosine, 5-formylcytosine, and combinations thereof. Cell-free DNA containing cytosine residues is contacted with organic borane effective to reduce, deaminate, and decarbonate or deformylize at least one of the oxidized 5-methylcytosine residues. , Thereby providing a dihydrouracil residue instead.
(Item 2)
The method of item 1, wherein the at least one oxidized 5-methylcytosine residue comprises 5-carboxycytosine.
(Item 3)
The method of item 1, wherein the at least one oxidized 5-methylcytosine residue comprises 5-formylcytosine.
(Item 4)
The method of item 1, wherein the at least one oxidized 5-methylcytosine residue comprises a combination of 5-carboxycytosine and 5-formylcytosine.
(Item 5)
The method according to any one of items 1 to 4, wherein the organic borane contains a complex of borane and a nitrogen-containing compound selected from a nitrogen heterocycle and a tertiary amine.
(Item 6)
5. The method of item 5, wherein the organic borane comprises a complex of borane and a nitrogen heterocycle.
(Item 7)
6. The method of item 6, wherein the nitrogen heterocycle comprises a pyridine optionally substituted with 1 to 4 lower alkyl groups.
(Item 8)
7. The method of item 7, wherein the nitrogen heterocycle comprises pyridine, 2-methylpyridine, or 5-ethyl-2-methylpyridine.
(Item 9)
8. The method of item 8, wherein the nitrogen heterocycle comprises 2-methylpyridine and the organic borane is 2-picoline borane.
(Item 10)
5. The method of item 5, wherein the organic borane comprises a complex of borane and a tertiary amine.
(Item 11)
10. The method of item 10, wherein the tertiary amine is selected from triethylamine and tri (t-butyl) amines.
(Item 12)
The method of item 1, wherein reduction, deamination, and decarboxylation are performed without isolating any intermediate.
(Item 13)
The method according to item 1, wherein the method is performed in the absence of bisulfite.
(Item 14)
(A) A sample of cell-free DNA containing at least one oxidized 5-methylcytosine residue selected from 5-carboxycytosine, 5-formylcytosine, and combinations thereof; and
(B) Organic borane effective for reducing, deaminating, and decarboxylating or deformylating at least one of the oxidized 5-methylcytosine residues.
Reaction mixture containing.
(Item 15)
The mixture according to item 14, wherein the at least one oxidized 5-methylcytosine residue comprises 5-carboxycytosine.
(Item 16)
The mixture according to item 14, wherein the at least one oxidized 5-methylcytosine residue comprises 5-formylcytosine.
(Item 17)
The mixture according to item 14, wherein the at least one oxidized 5-methylcytosine residue comprises a combination of 5-carboxycytosine and 5-formylcytosine.
(Item 18)
The mixture according to any one of items 15 to 17, wherein the organic borane contains a complex of borane and a nitrogen-containing compound selected from a nitrogen heterocycle and a tertiary amine.
(Item 19)
Item 18. The mixture according to Item 18, wherein the organic borane contains a complex of borane and a nitrogen heterocycle.
(Item 20)
19. The mixture according to item 19, wherein the nitrogen heterocycle comprises a pyridine optionally substituted with 1 to 4 lower alkyl groups.
(Item 21)
20. The mixture of item 20, wherein the nitrogen heterocycle comprises pyridine, 2-methylpyridine, or 5-ethyl-2-methylpyridine.
(Item 22)
The mixture according to item 21, wherein the nitrogen heterocycle comprises 2-methylpyridine and the organic borane is 2-picoline borane.
(Item 23)
Item 18. The mixture according to item 18, wherein the organic borane contains a complex of borane and a tertiary amine.
(Item 24)
23. The mixture of item 23, wherein the tertiary amine is selected from triethylamine and tri (t-butyl) amines.
(Item 25)
The mixture according to item 14, wherein the mixture is substantially free of bisulfite.
(Item 26)
A method for detecting the presence and location of 5-methylcytosine residues in cell-free DNA, wherein:
(A) A step of modifying a 5-hydroxymethylcytosine residue in a fragmented adapter ligation cell-free DNA to provide an affinity tag on the 5-hydroxymethylcytosine residue, wherein the cell-free DNA is subjected to the affinity tag. Steps that can remove modified 5-hydroxymethylcytosine-containing DNA from
(B) A step of removing the modified 5-hydroxymethylcytosine-containing DNA from the cell-free DNA to leave a DNA containing an unmodified 5-methylcytosine residue;
(C) A step of oxidizing the unmodified 5-methylcytosine residue to obtain a DNA containing the oxidized 5-methylcytosine residue;
(D) The DNA containing the oxidized 5-methylcytosine residue is combined with an organic borane effective for reducing, deaminating, and decarbonating or deformulating the oxidized 5-methylcytosine residue. The step of contacting, thereby providing DNA containing a dihydrouracil residue in place of the 5-methylcytosine oxide residue;
(E) Amplification and sequencing of DNA containing the dihydrouracil residue;
(F) A step of determining a 5-methylation pattern from the result of the sequencing in (e).
Including, how.
(Item 27)
(G) A step of identifying the hydroxymethylation pattern in the 5-hydroxymethylcytosine-containing DNA removed from the cell-free DNA sample in step (b).
26. The method of item 26, further comprising:
(Item 28)
26 or 27, wherein steps (a) to (d) are performed in the absence of bisulfite.
(Item 29)
26 or 27, wherein steps (a) to (d) are performed without isolating any intermediate.
(Item 30)
26 or 27, wherein the affinity tag comprises biotin and step (a) comprises the selective labeling of 5-hydroxymethylcytosine residues in biotin.
(Item 31)
30. The method of item 30, wherein step (b) comprises contacting the biotinylated DNA with support-binding streptavidin.
(Item 32)
26 or 27, wherein step (c) is enzymatically performed.
(Item 33)
32. The method of item 32, wherein step (c) is performed using a Ten-Eleven Transition (TET) enzyme.
(Item 34)
28. The method of item 26 or item 27, wherein step (c) is chemically performed.
(Item 35)
The method of item 1, wherein the cell-free DNA comprises a selected region of the cell-free DNA.
(Item 36)
26. The method of item 27, wherein the cell-free DNA sample comprises a selected region of cell-free DNA.
(Item 37)
26 or 27. The method of item 26 or 27, wherein the adapter ligation DNA fragment comprises an adapter comprising at least one molecular barcode selected from a sample identifier sequence, a fragment identifier sequence, and a strand identifier sequence.
(Item 38)
28. The method of item 26 or item 27, wherein in step (e), a molecular barcode containing the process identifier sequence is added to the DHU-containing DNA.
(Item 39)
26. The method of item 27, wherein the cell-free DNA comprises double-stranded DNA.
(Item 40)
26. The method of item 27, wherein the cell-free DNA comprises a single-stranded DNA.
(Item 41)
Item 26, wherein the affinity tag comprises a selected oligonucleotide tag having a predetermined sequence, and step (a) comprises the selective labeling of 5-hydroxymethylcytosine residues by the oligonucleotide tag. Alternatively, the method according to item 27.
(Item 42)
41. The method of item 41, wherein step (b) comprises contacting the oligonucleotide-tagged DNA with a support-binding oligonucleotide that comprises a sequence that is substantially complementary to said predetermined sequence.
(Item 43)
37. The method of item 37, wherein the adapter ligation DNA fragment comprises both a fragment identifier sequence and a strand identifier sequence.
(Item 44)
43. The method of item 43, further comprising analyzing the fragment identifier sequence and the strand identifier sequence in the treated strand to determine if the template DNA fragment is fully modified or hemi-modified.
(Item 45)
A kit for converting 5-methylcytosine residues of cell-free DNA to dihydrouracil residues, a blocking reagent composition for blocking the 5-hydroxymethylcytosine residues, beyond hydroxymethylation. Oxidation of 5-Methylcytosine Residues to Provide Oxidation 5-Methylcytosine Residues, and either reduction, deamination, and decarbonization or deformylation of said 5-methylcytosine residues. A kit containing organic borane that is useful to do.
(Item 46)
A kit for identifying 5-methylcytosine residues in a cell-free DNA sample, wherein the 5-hydroxymethylcytosine residue is modified to provide an affinity tag on it, and the modified 5- from the sample. Individual reagent compositions for removing hydroxymethylcytosine residues and oxidizing unmodified 5-methylcytosine residues beyond hydroxymethylation to provide oxidized 5-methylcytosine residues, as well as said oxidized 5-. A kit containing an organic borane effective for reducing, deaminating, and either decarbonating or deformylizing methylcytosine residues.
(Item 47)
A method for detecting the presence and location of 5-methylcytosine residues and 5-hydroxymethylcytosine residues in cell-free DNA, wherein the method comprises the above method.
(A) The step of biotinylated 5-hydroxymethylcytosine residues of fragmented, adapter ligation cell-free DNA to form the first group of biotinylated 5-hydroxymethylcytosine-containing DNA fragments;
(B) The step of removing the first group of biotinylated 5-hydroxymethylcytosine-containing DNA fragments from the cell-free DNA, leaving unmodified DNA and DNA fragments containing unmodified 5-methylcytosine residues;
(C) Oxidize a DNA fragment containing an unmodified 5-methylcytosine fragment to provide a 5-hydroxymethylcytosine residue in its place, and then biotinylated to biotinylated 5-hydroxymethylcytosine-containing DNA fragment. Steps to provide a second group;
(D) Steps to remove the second group of biotinylated 5-hydroxymethylcytosine-containing DNA fragments;
(E) A step of pooling, amplifying, and sequencing the first group of DNA fragments and the second group of DNA fragments.
How to include.
(Item 48)
(F) Item 46, further comprising determining from the results of step (e) the 5-methylation pattern, the 5-hydroxymethylation pattern, or both the 5-methylation pattern and the 5-hydroxymethylation pattern. The method described in.
(Item 49)
A method for identifying the co-occurrence of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in a single DNA strand of cell-free DNA.
(A) The step of functionalizing the fragmented 5-hydroxymethyl residue in the adapter ligation cell-free DNA with an affinity tag capable of selectively removing the tagged DNA fragment from the cell-free DNA;
(B) Oxidation of the removed tagged DNA fragment, resulting in unmodified 5-methylcytosine residues being selected from 5-formylcytosine, 5-carboxycytosine residues, or a combination thereof. Steps to be converted to 5-methylcytosine residues;
(C) The oxidation-tagged DNA fragment of (b) is contacted with an organic borane effective to reduce, deaminate, and decarbonate or deformylize the 5-methylcytosine oxide residue. And thereby providing DNA containing the dihydrouracil residue in place of the oxidized 5-methylcytosine residue;
(D) A step of amplifying and sequencing the DNA containing a dihydrouracil residue,
Including, how.
(Item 50)
A method for detecting the presence and location of 5-methylcytosine residues and 5-hydroxymethylcytosine residues in a DNA sample, wherein the method is:
(A) A step of functionalizing 5-hydroxymethylcytosine residues in the DNA sample using an affinity tag that allows selective removal of the tagged 5-hydroxymethylcytosine-containing DNA from the DNA sample. ;
(B) The step of removing the tagged DNA fragment from the DNA sample, leaving unmodified DNA and DNA containing unmodified 5-methylcytosine residues;
(C) A step of modifying the 5-methylcytosine residue to allow selective removal of the 5-methylcytosine-containing DNA;
(D) The step of removing the modified 5-methylcytosine-containing DNA;
(E) A step of adding a process identifier sequence to the tagged 5-hydroxymethyl-containing DNA and the modified 5-methylcytosine-containing DNA, wherein each process identifier sequence contains the tagged DNA and the modified DNA. A step that identifies the process used to identify and / or isolate.
(Item 51)
50. The method of item 50, wherein the DNA sample comprises cell-free DNA.
(Item 52)
51. The method of item 51, wherein the cell-free DNA is adapter-ligated with at least one adapter comprising a molecular barcode selected from a sample identifier sequence, a fragment identifier sequence, and a strand identifier sequence.

図１は、２－ピコリンボランと５－カルボキシシトシンとの仮定の反応産物を概略的に示す。FIG. 1 schematically shows a hypothetical reaction product of 2-picoline borane and 5- carboxycytosine .

図２は、５－カルボキシシトシン（上）および５－カルボキシシトシンと２－ピコリンボランの反応産物の質量スペクトルを提供する。FIG. 2 provides mass spectra of 5- carboxycytosine (top) and the reaction product of 5- carboxycytosine and 2-picoline borane.

図３は、５－カルボキシシトシンと２－メチルピリミジンとの反応産物のジヒドロウラシルとの同一性を確認する追加のスペクトルを提供する。FIG. 3 provides an additional spectrum confirming the identity of the reaction product of 5- carboxycytosine with 2-methylpyrimidine to dihydrouracil. 図３は、５－カルボキシシトシンと２－メチルピリミジンとの反応産物のFIG. 3 shows the reaction product of 5-carboxycytosine and 2-methylpyrimidine. ジヒドロウラシルとの同一性を確認する追加のスペクトルを提供する。Provides an additional spectrum confirming identity with dihydrouracil. 図３は、５－カルボキシシトシンと２－メチルピリミジンとの反応産物のFIG. 3 shows the reaction product of 5-carboxycytosine and 2-methylpyrimidine. ジヒドロウラシルとの同一性を確認する追加のスペクトルを提供する。Provides an additional spectrum confirming identity with dihydrouracil.

図４は、２－ピコリンボランボランとの反応による５－カルボキシシトシンのジヒドロウラシルへの変換に関与する可能性のある反応メカニズムを概略的に示す。FIG. 4 schematically shows the reaction mechanism that may be involved in the conversion of 5- carboxycytosine to dihydrouracil by reaction with 2-picoline borane borane.

図６および７は、２－ピコリンボランとの反応の前および後の両方で、５位でホルミル、カルボキシル、エチルアミド、およびエトキシイミノで置換されたシトシンの質量スペクトルを提供する。Figures 6 and 7 provide mass spectra of cytosine substituted with formyl, carboxyl, ethylamide, and ethoxyimino at the 5-position both before and after the reaction with 2-picoline borane. 図６および７は、２－ピコリンボランとの反応の前および後の両方で、５Figures 6 and 7 show 5 both before and after the reaction with 2-picoline borane. 位でホルミル、カルボキシル、エチルアミド、およびエトキシイミノで置換されたシトシンの質量スペクトルを提供する。Provides mass spectra of cytosines substituted with formyl, carboxyl, ethylamide, and ethoxyimino at the position. 図６および７は、２－ピコリンボランとの反応の前および後の両方で、５位でホルミル、カルボキシル、エチルアミド、およびエトキシイミノで置換されたシトシンの質量スペクトルを提供する。Figures 6 and 7 provide mass spectra of cytosine substituted with formyl, carboxyl, ethylamide, and ethoxyimino at the 5-position both before and after the reaction with 2-picoline borane. 図６および７は、２－ピコリンボランとの反応の前および後の両方で、５Figures 6 and 7 show 5 both before and after the reaction with 2-picoline borane. 位でホルミル、カルボキシル、エチルアミド、およびエトキシイミノで置換されたシトシンの質量スペクトルを提供する。Provides mass spectra of cytosines substituted with formyl, carboxyl, ethylamide, and ethoxyimino at the position.

図８は、酵素酸化剤、随意のブロッキング基、および有機ボラン２－メチルピリミジンボランを使用して、５－メチルシトシンおよび５－ヒドロキシメチルシトシンをジヒドロウラシルに段階的に変換する方法を概略的に示す。FIG. 8 schematically illustrates a method of stepwise conversion of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine to dihydrouracil using an enzymatic oxidant, an optional blocking group, and organic borane 2-methylpyrimidineboran. show. 図８は、酵素酸化剤、随意のブロッキング基、および有機ボラン２－メチFIG. 8 shows an enzyme oxidant, an optional blocking group, and an organic borane 2-methi. ルピリミジンボランを使用して、５－メチルシトシンおよび５－ヒドロキシメチルシトシンをジヒドロウラシルに段階的に変換する方法を概略的に示す。A method for stepwise conversion of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine to dihydrouracil using lupyrimidineborane is shown schematically.

図１０は、２－ピコリンボランとの反応前後の５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、および５－グルコメチルシトシンの質量スペクトルを示す。FIG. 10 shows the mass spectra of 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine, and 5-glucomethylcytosine before and after the reaction with 2-picoline borane. 図１０は、２－ピコリンボランとの反応前後の５－メチルシトシン、５FIG. 10 shows 5-methylcytosine and 5 before and after the reaction with 2-picoline borane. －ヒドロキシメチルシトシン、および５－グルコメチルシトシンの質量スペクトルを示す。The mass spectra of -hydroxymethylcytosine and 5-glucomethylcytosine are shown. 図１０は、２－ピコリンボランとの反応前後の５－メチルシトシン、５FIG. 10 shows 5-methylcytosine and 5 before and after the reaction with 2-picoline borane. －ヒドロキシメチルシトシン、および５－グルコメチルシトシンの質量スペクトルを示す。The mass spectra of -hydroxymethylcytosine and 5-glucomethylcytosine are shown.

用語「酸化５－メチルシトシン」は、５位で酸化されている酸化５－メチルシトシン残基を指す。したがって、酸化５－メチルシトシン残基は、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ホルミルシトシン、および５－カルボキシシトシンを含む。本発明の一実施形態による有機ボランとの反応を受ける酸化５－メチルシトシン残基は、５－ホルミルシトシンおよび５－カルボキシシトシンである。

The term "5-methylcytosine oxide" refers to the 5-methylcytosine oxide residue that is oxidized at the 5-position. Thus, 5-methylcytosine oxide residues include 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine, and 5- carboxycytosine . The 5-methylcytosine oxide residues that undergo a reaction with organic borane according to one embodiment of the present invention are 5-formylcytosine and 5- carboxycytosine .

一実施形態において、本発明は、セルフリーＤＮＡ中の酸化５－メチルシトシン残基をジヒドロウラシル残基に変換する方法を提供する。この方法は、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）、５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）、およびそれらの組み合わせから選択される酸化５ｍＣ残基と有機ボランとの反応を含む。酸化５ｍＣ残基は、天然に生じるか、またはより典型的には、５ｍＣまたは５ｈｍＣ残基の事前酸化の結果、たとえば、５ｍＣまたは５ｈｍＣのＴＥＴファミリー酵素（例えば、下で議論するようにＴＥＴ１、ＴＥＴ２、またはＴＥＴ３）での酸化の結果である。あるいは、例えば、過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ_４）もしくはペルオキソタングステン酸塩（例えばＯｋａｍｏｔｏｅｔａｌ．（２０１１）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４７：１１２３１－３３参照）および過塩素酸銅（ＩＩ）／２，２，６，６－テトラメチルピぺリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）配合物（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａｅｔａｌ．（２０１７）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５３：５７５６－５９参照）などの無機ペルオキソ化合物または組成物による５ｍＣあるいは５ｈｍＣの化学酸化の結果である

In one embodiment, the invention provides a method of converting an oxidized 5-methylcytosine residue in cell-free DNA to a dihydrouracil residue. The method comprises the reaction of organic borane with an oxidized 5mC residue selected from 5-formylcytosine (5fC), 5- carboxycytosine (5caC), and combinations thereof. Oxidized 5mC residues are naturally occurring or more typically the result of pre-oxidation of 5mC or 5hmC residues, eg, 5mC or 5hmC TET family enzymes (eg, TET1, TET2 as discussed below). , Or is the result of oxidation in TET3). Alternatively, for example, potassium perlutenate (KRuO ₄ ) or peroxotungstate (see, eg, Okamoto et al. (2011) Chem. Commun. 47: 11231-33) and copper perchlorate (II) / 2,2. Chemical oxidation of 5 mC or 5 hmC with an inorganic peroxo compound or composition such as a 6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl (TEMPO) formulation (see Mathushita et al. (2017) Chem. Commun. 53: 5756-59). Is the result of

有機ボランを使用して酸化５－メチルシトシン残基をジヒドロウラシルに変換する実現可能性を決定するために、２－ピコリンボランを水性ＤＮＡ緩衝液中で、配列５’－ＴＣＧＡＣ５ｃａＣＧＧＡＴＣ－３’を有するオリゴヌクレオチドと組み合わせた、ここで５ｃａｃは５－カルボキシシトシンを表す。図１は、２－ピコリンボランと５ｃａＣの仮定の反応生成物を示す。示されているように、反応生成物としてジヒドロウラシルを使用すると、４１Ｄａの損失が予想される。得られた結果を図２に示す。約４１．６Ｄａの損失が見られ、主な反応生成物が、ジヒドロウラシルであることを示唆している。さらに^１ＨＮＭＲおよび質量スペクトル分析により、この発見が確認された；図３を参照。反応のために提案されたメカニズムは、図４に概略的に示され、上記のように、連続的な還元、脱アミノ化、および脱炭酸のステップを伴い、一方図５は、２－ピコリンボランと５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）との類似の反応を示す。前記図は、連続的な還元、脱アミノ化、および脱ホルミル化を伴う、提案されたメカニズムも示す。
To determine the feasibility of converting 5-methylcytosine oxide residues to dihydrouracil using organic borane, 2-picoline borane has the sequence 5'-TCGAC5caCGGATC-3'in an aqueous DNA buffer. Combined with an oligonucleotide, where 5cc represents 5- carboxycytosine . FIG. 1 shows the hypothetical reaction product of 2-picoline borane and 5caC. As shown, the use of dihydrouracil as a reaction product is expected to result in a loss of 41 Da. The obtained results are shown in FIG. A loss of about 41.6 Da is seen, suggesting that the main reaction product is dihydrouracil. Further ^{1 1} H NMR and mass spectral analysis confirmed this finding; see Figure 3. The mechanism proposed for the reaction is schematically shown in FIG. 4, which involves continuous reduction, deamination, and decarboxylation steps, while FIG. 5 shows 2-picoline borane. And 5-formylcytosine (5fC) show similar reactions. The figure also shows the proposed mechanism with continuous reduction, deamination, and deformylation.

図６および７の質量スペクトルは、２－ピコリンボランが５－カルボキシシトシンおよび５－ホルミルシトシンと選択的に反応してこれらの残基をＤＨＵに変換したが、オキシム＝Ｎ－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_３またはアミド－（ＣＯ）－ＮＨ－ＣＨ_２ＣＨ_３で５位が置換されたシトシンとは反応しないことを示す。

The mass spectra of FIGS. 6 and 7 show that 2-picoline borane selectively reacted with 5- carboxycytosine and 5-formylcytosine to convert these residues to DHU, but oxime = NO-CH ₂ . It is shown that it does not react with cytosine substituted at the 5-position with CH ₃ or amide- (CO) -NH-CH ₂ CH ₃ .

図１０は、２－ピコリンボランとの反応前後の５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、および５－グルコメチルシトシンの質量スペクトルを示す。見ての通り、２－ピコリンボランはこれらのいずれとも反応せず、５－ホルミルシトシンおよび５－カルボキシシトシンに対する２－ピコリンボランの選択性が強調されていた。

FIG. 10 shows the mass spectra of 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine, and 5-glucomethylcytosine before and after the reaction with 2-picoline borane. As can be seen, 2-picoline borane did not react with any of these, emphasizing the selectivity of 2-picoline borane for 5-formylcytosine and 5- carboxycytosine .

前述の方法は、図８の右側のスキームに示されており、β－ＧＴブロッキングを用いたＴＥＴ支援２－ピコリンボラン配列（ＴＡＰＳ）を示す。このスキームは、５－ヒドロキシメチルシトシン残基が、β－グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）でブロックされているのに対し、５－メチルシトシン残基は、５－ホルミルシトシンおよび５－カルボキシシトシンの混合物を提供するのに効果的なＴＥＴ酵素で酸化されていることを示す。これらの酸化種の両方を含む混合物を２－ピコリンボランまたは別の有機ボランと反応させ、ジヒドロウラシルを得ることができる。この実施形態の変形において、５ｈｍＣ含有断片は、ステップ（ｂ）では除去されない。むしろ、図８の左側のスキームに示されるように、「ＴＥＴ支援ピコリンボラン配列（ＴＡＰＳ）」、５ｍＣ含有断片および５ｈｍＣ含有断片を一緒に酵素酸化して、５ｆＣおよび５ｃａＣ含有断片を提供する。２－ピコリンボランとの反応により、５ｍＣおよび５ｈｍＣ残基が元々存在していた場所にＤＨＵ残基が生じる。「化学支援ピコリンボラン配列決定（ＣＡＰＳ）」と題された図９は、５ｍＣ残基を変更せずに残したまま、過ルテニウム酸カリウムを用いた５ｈｍＣ含有断片の選択的酸化を模式的に示している。

The aforementioned method is shown in the scheme on the right side of FIG. 8 showing a TET-assisted 2-picoline borane sequence (TAPS) with β-GT blocking. In this scheme, 5-hydroxymethylcytosine residues are blocked with β-glucosyltransferase (βGT), whereas 5-methylcytosine residues are a mixture of 5-formylcytosine and 5- carboxycytosine . It is shown to be oxidized with an effective TET enzyme to provide. A mixture containing both of these oxidized species can be reacted with 2-picoline borane or another organic borane to give dihydrouracil. In the modification of this embodiment, the 5hmC-containing fragment is not removed in step (b). Rather, as shown in the scheme on the left side of FIG. 8, "TET-supported picoline borane sequence (TAPS)", 5mC-containing and 5hmC-containing fragments are enzymatically oxidized together to provide 5fC and 5caC-containing fragments. Reaction with 2-picoline borane results in DHU residues where the 5mC and 5hmC residues were originally present. FIG. 9, entitled "Chemically Assisted Picoline Borane Sequencing (CAPS)", schematically illustrates the selective oxidation of 5hmC-containing fragments with potassium perteniumate, leaving the 5mC residues unchanged. ing.

Claims

A method for identifying 5hmC positions in adapter-ligated target DNA in a cell-free DNA sample, wherein the method is:
(A) A step of oxidizing 5 hmC in the target DNA with an oxidizing reagent without affecting 5 mC to obtain a DNA containing 5 hmC oxidized, wherein the 5 hmC oxidized is 5caC, 5 fC, and a combination thereof. Select from, step;
(B) The DNA containing 5 hmC of oxidation is reacted with pyridineborane to reduce, deaminate, and decarboxylate or deformylize the 5 hmC of oxidation, thereby replacing the 5 hmC of oxidation. To provide modified DNA containing DHU;
(C) Amplification and sequencing of the modified DNA to provide a sequence reading showing 5 hmC; and
(D) In the step of comparing the sequence read indicating the 5 hmC with the standard sequence read obtained for the target molecule, the change from C in the standard sequence read to T in the sequence read indicating the 5 hmC is 5 hmC. A step that indicates the position
Including, how.

The method of claim 1, wherein steps (a) to (c) are performed without isolating any intermediate.

The method according to claim 1, wherein steps (a) to (c) are carried out in the absence of bisulfite.

The method of claim 1, wherein step (a) is performed using a chemical oxidation reagent.

The method according to claim 4, wherein the chemical oxidation reagent is perruthenium salt.

The method of claim 1, wherein the adapter-ligated target DNA comprises an adapter comprising a sample identifier sequence and at least one additional molecular barcode selected from a fragment identifier sequence and a strand identifier sequence.

The method of claim 6, wherein the adapter-ligated target DNA comprises both a fragment identifier sequence and a strand identifier sequence.

The method of claim 1, wherein the cell-free DNA comprises double-stranded DNA.

The method of claim 1, wherein the cell-free DNA comprises a single-stranded DNA.