JPWO2019156111A1 - How to Determine Cancer Treatment Resistance to Melanoma - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、がん治療耐性を有するメラノーマを判別することにより、効果的なメラノーマの治療を実現することを目的とする。【解決手段】本発明は、IL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を指標とした、メラノーマのがん治療耐性を判定する方法、メラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置への適応性を判定する方法、メラノーマ患者の化学療法、放射線療法又は免疫療法への適応性を判定する方法、メラノーマのがん治療耐性を判定するためのキット、及びメラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置への適応性を判定するためのキットに関する。【選択図】図１PROBLEM TO BE SOLVED: To realize effective treatment of melanoma by discriminating melanoma having resistance to cancer treatment. The present invention relates to a method for determining cancer treatment resistance of melanoma using the expression level of IL-34 protein or mRNA encoding the same as an index, and treatment of melanoma patients with a cancer treatment resistance reducing agent. Methods for determining indications, methods for determining indications for chemotherapy, radiation therapy or immunotherapy in melanoma patients, kits for determining cancer treatment resistance of melanoma, and cancer treatment resistance reducing agents for melanoma patients The present invention relates to a kit for determining the adaptability to the treatment with. [Selection diagram] Fig. 1
Description
本発明は、インターロイキン-34（IL-34）タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を指標とした、メラノーマのがん治療耐性を判定する方法、メラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置への適応性を判定する方法、メラノーマ患者の化学療法、放射線療法又は免疫療法への適応性を判定する方法、メラノーマのがん治療耐性を判定するためのキット、及びメラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置への適応性を判定するためのキットに関する。 The present invention is a method for determining cancer treatment resistance of melanoma using the expression level of interleukin-34 (IL-34) protein or mRNA encoding the same as an index, and treatment with a cancer treatment resistance reducing agent for melanoma patients. Methods for determining indications for melanoma, chemotherapy for melanoma patients, methods for determining indications for radiation therapy or immunotherapy, kits for determining cancer treatment resistance for melanoma, and cancer treatment resistance for melanoma patients It relates to a kit for determining the adaptability to treatment with a reducing agent.
メラノーマ（melanoma、悪性黒色腫）は高悪性度の皮膚がんの一種で、メラニン色素を産生する皮膚細胞であるメラノサイト又は母斑細胞が悪性化した腫瘍と考えられている。悪性黒色腫の罹患率は、男女とも60歳代から高齢になるにつれて高くなる傾向にある。 Melanoma (melanoma) is a type of high-grade skin cancer, and is considered to be a malignant tumor of melanocytes or mother's patch cells, which are skin cells that produce melanin pigment. The prevalence of malignant melanoma tends to increase in both men and women from their 60s to older age.
早期に発見されたメラノーマの治療は、原発部位の広範切除術、センチネルリンパ節生検術、所属リンパ節郭清術等の外科的処置によって行われるが、発見・診断が遅れ、外科的処置では対応することができない、特に転移が観察されるステージIII又はIVにまで進行したメラノーマの治療は一般に困難である。ステージIVの転移性メラノーマの5年生存率は、約11％に留まっている。 Treatment of early-detected melanoma is performed by surgical procedures such as extensive resection of the primary site, sentinel lymph node biopsy, and regional lymph node dissection, but detection and diagnosis are delayed, and surgical procedures are available. Treatment of melanoma that cannot be done, especially that has progressed to stage III or IV where metastasis is observed, is generally difficult. The 5-year survival rate for stage IV metastatic melanoma remains at about 11%.
メラノーマは化学療法、放射線療又は免疫療法等のがん治療に対してしばしば耐性（以下、がん治療耐性と表す）を獲得することが知られている。化学療法及び放射線療法は、その性質上、がん組織と正常組織とを厳格に区別して治療を行うことが元々困難な方法であり、例えば化学療法では薬効と毒性との差が小さいため副作用が発生し易く、また放射線療法はがん周辺の正常組織にも放射線を照射せざるを得ないという問題を抱えているため、化学療法及び放射線療法に対するがん治療耐性は深刻な問題となる。 It is known that melanoma often acquires resistance to cancer treatments such as chemotherapy, radiotherapy or immunotherapy (hereinafter referred to as cancer treatment resistance). Due to its nature, chemotherapy and radiation therapy are originally difficult methods to treat cancer tissue and normal tissue by strictly distinguishing them. For example, chemotherapy has side effects because the difference between drug efficacy and toxicity is small. Cancer treatment resistance to chemotherapy and radiation therapy becomes a serious problem because it is likely to occur and radiation therapy has the problem that normal tissues around the cancer must also be irradiated.
メラノーマの治療法として、重粒子線や陽子線といった特殊な放射線を用いた治療が有効であるとされているが、これら特殊な放射線治療は、特殊且つ大規模な設備の設置が必要とされる他、高度先進医療としての高額な経済的負担、放射線障害による後遺症等の問題を有する。 It is said that treatment using special radiation such as heavy ion beam and proton beam is effective as a treatment method for melanoma, but these special radiotherapy requires the installation of special and large-scale equipment. In addition, it has problems such as a high financial burden as highly advanced medical treatment and sequelae due to radiation damage.
近年は、化学療法及び放射線療法に加えて、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4（CTLA4）及びprogrammed death 1（PD-1）等の免疫チェックポイント分子を標的とした免疫療法によるメラノーマ治療が行われている。しかしながら、かかる免疫療法においても治療耐性の出現が報告されている（非特許文献１）。 In recent years, in addition to chemotherapy and radiation therapy, melanoma treatment by immunotherapy targeting immune checkpoint molecules such as cytotoxic T lymphocyte-related antigen 4 (CTLA4) and programmed death 1 (PD-1) has been performed. It has been. However, the emergence of treatment resistance has also been reported in such immunotherapy (Non-Patent Document 1).
本発明は、がん治療耐性を有するメラノーマを判別することにより、効果的なメラノーマの治療を実現することを目的とする。 An object of the present invention is to realize effective treatment of melanoma by discriminating melanoma having resistance to cancer treatment.
本発明者らは、がん治療耐性を有するメラノーマにおいては、がん治療耐性を有さないメラノーマと比べてIL-34 発現量が亢進していることを見出し、以下の発明を完成させた。 The present inventors have found that the expression level of IL-34 is increased in melanoma having cancer treatment resistance as compared with melanoma not having cancer treatment resistance, and completed the following inventions.
（１）メラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を測定する工程、及び
前記発現量が、がん治療耐性を持たないメラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量よりも高い場合、前記検体に含まれるメラノーマはがん治療耐性であると判定する工程
を含む、メラノーマのがん治療耐性を判定する方法。
（２）がん治療耐性が化学療法、放射線療法又は免疫療法に対する耐性である、（１）に記載の方法。
（３）メラノーマ患者から採取されたメラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を測定する工程、及び
前記発現量が、がん治療耐性を持たないメラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量よりも高い場合、前記患者にはがん治療耐性低減剤が適応可能であると判定する工程
を含む、メラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置への適応性を判定する方法であって、
前記がん治療耐性低減剤は、IL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、前記方法。
（４）がん治療耐性が化学療法、放射線療法又は免疫療法に対する耐性である、（３）に記載の方法。
（５）メラノーマ患者から採取されたメラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を測定する工程、及び
前記発現量が、がん治療耐性を持たないメラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量と同等又はそれより低い場合、前記患者には、化学療法、放射線療法又は免疫療法が適応可能であると判定する工程
を含む、メラノーマ患者の化学療法、放射線療法又は免疫療法への適応性を判定する方法。
（６）IL-34をコードするmRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はIL-34タンパク質に対する特異抗体を含む、メラノーマのがん治療耐性を判定するためのキット。
（７）IL-34をコードするmRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はIL-34タンパク質に対する特異抗体を含む、メラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置の適応性を判定するためのキットであって、前記がん治療低減剤がIL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、前記キット。
（８）IL-34をコードするmRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はIL-34タンパク質に対する特異抗体を含む、メラノーマ患者の化学療法、放射線療法又は免疫療法への適応性を判定するためのキット。(1) The step of measuring the expression level of IL-34 protein or mRNA encoding the same in a sample containing melanoma, and the expression level encodes the IL-34 protein or the same in melanoma having no cancer treatment resistance. A method for determining cancer treatment resistance of melanoma, which comprises a step of determining that the melanoma contained in the sample is resistant to cancer treatment when the expression level is higher than the expression level of mRNA.
(2) The method according to (1), wherein the cancer treatment resistance is resistance to chemotherapy, radiotherapy or immunotherapy.
(3) A step of measuring the expression level of IL-34 protein or mRNA encoding the IL-34 protein in a sample containing melanoma collected from a melanoma patient, and IL-34 in melanoma whose expression level does not have cancer treatment resistance. Treatment of melanoma patients with a cancer treatment resistance reducing agent, which comprises a step of determining that the cancer treatment resistance reducing agent is applicable to the patient when the expression level is higher than the expression level of the protein or the mRNA encoding the protein. It ’s a method of judging adaptability.
The cancer treatment resistance reducing agent contains, as an active ingredient, a substance that suppresses the expression of IL-34, inhibits the activity of IL-34, and / or inhibits the binding between CSF-1R and IL-34. The method.
(4) The method according to (3), wherein the cancer treatment resistance is resistance to chemotherapy, radiotherapy or immunotherapy.
(5) A step of measuring the expression level of IL-34 protein or mRNA encoding the IL-34 protein in a sample containing melanoma collected from a melanoma patient, and IL-34 in melanoma whose expression level does not have cancer treatment resistance. Chemotherapy, radiation therapy for melanoma patients, including determining that chemotherapy, radiation therapy or immunotherapy is applicable to the patient if the expression level of the protein or mRNA encoding it is equal to or lower than that of the protein. A method of determining the indication for therapy or immunotherapy.
(6) A kit for determining cancer treatment resistance of melanoma, which comprises a primer set or probe for detecting the expression of mRNA encoding IL-34 or a specific antibody against the IL-34 protein.
(7) To determine the suitability of treatment with a cancer treatment resistance reducing agent for melanoma patients, which contains a primer set or probe for detecting the expression of mRNA encoding IL-34 or a specific antibody against the IL-34 protein. The active ingredient of the kit is a substance that the cancer treatment reducing agent suppresses the expression of IL-34, inhibits the activity of IL-34, and / or inhibits the binding between CSF-1R and IL-34. The kit contained as.
(8) To determine the suitability of melanoma patients for chemotherapy, radiation therapy or immunotherapy, which contains a primer set or probe for detecting the expression of mRNA encoding IL-34 or a specific antibody against the IL-34 protein. Kit for.
本発明によれば、IL-34の発現量を指標としてメラノーマのがん治療耐性を判定することが可能になる。これにより、がん治療耐性を有するメラノーマに対しては、通常のがん治療を行う前に又はこれと組み合わせてがん治療耐性低減剤による処置を行うことで、効果的ながん治療を行うことができる。 According to the present invention, it is possible to determine the cancer treatment resistance of melanoma using the expression level of IL-34 as an index. As a result, effective cancer treatment is performed for melanoma having cancer treatment resistance by treating with a cancer treatment resistance reducing agent before or in combination with normal cancer treatment. be able to.
本発明の第１の態様は、メラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を測定する工程、及び前記発現量ががん治療耐性を持たないメラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量よりも高い場合、前記検体に含まれるメラノーマはがん治療耐性であると判定する工程を含む、メラノーマのがん治療耐性を判定する方法に関する。 The first aspect of the present invention is a step of measuring the expression level of IL-34 protein or mRNA encoding the IL-34 protein in a sample containing melanoma, and the IL-34 protein in melanoma whose expression level does not have cancer treatment resistance. Alternatively, the present invention relates to a method for determining cancer treatment resistance of melanoma, which comprises a step of determining that the melanoma contained in the sample is resistant to cancer treatment when the expression level is higher than the expression level of mRNA encoding the same.
本発明において用いられるメラノーマを含む検体は、医学的にメラノーマであると診断された患者の原発性若しくは転移性のメラノーマから採取されたもの、又は株化されたメラノーマ細胞を含むものであり得る。検体は、タンパク質若しくはmRNAの検出を目的とした一般的な処置を施されたものであってもよく、又はホルマリン固定などの一般的な保存的処置を施されたものであってもよい。 The melanoma-containing specimen used in the present invention may be taken from a primary or metastatic melanoma of a patient who has been medically diagnosed with melanoma, or may include established melanoma cells. The sample may be subjected to general treatment for the purpose of detecting protein or mRNA, or may be subjected to general conservative treatment such as formalin fixation.
検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量は、塩基配列又はアミノ酸配列が公知である遺伝子又はタンパク質の発現を確認することが可能な、当業者に公知の各種方法を採用して行うことができる。ヒトのIL-34の遺伝子及びタンパク質に翻訳されるmRNAの塩基配列はNCBI GeneにGene ID:146433として、タンパク質のアミノ酸配列はUniProtKB/Swiss-Protにアクセッション番号Q6ZMJ4.1として登録されている。 For the expression level of IL-34 protein or mRNA encoding the IL-34 protein in a sample, various methods known to those skilled in the art, which can confirm the expression of a gene or protein whose base sequence or amino acid sequence is known, are adopted. It can be carried out. The nucleotide sequence of mRNA translated into the human IL-34 gene and protein is registered in NCBI Gene as Gene ID: 146433, and the amino acid sequence of the protein is registered in UniProt KB / Swiss-Prot as accession number Q6ZMJ 4.1.
IL-34タンパク質の発現量の測定は、これに特異的な抗体を用いて、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等のELISA法、RIA法、インサイツハイブリダイゼーション、イムノブロット解析、ウエスタンブロット解析、及び組織アレイ解析等の周知の方法によって行うことができる。 The expression level of IL-34 protein is measured by using an antibody specific to this method, using an ELISA method such as direct competition method, indirect competition method, sandwich method, RIA method, in situ hybridization, immunoblot analysis, and Western blot analysis. , And a well-known method such as tissue array analysis.
IL-34タンパク質に特異的な抗体は、IL-34タンパク質に結合するが、他のタンパク質にほとんど又は全く結合しない抗体であり、IL-34タンパク質に対する高い結合親和性を有する抗体と表すこともできる。IL-34タンパク質に対する高い結合親和性を有する抗体は、例えば10-7 M以下、好ましくは10-8 M以下、より好ましくは10-9 M以下の解離定数KDを持つ抗体である。An antibody specific for the IL-34 protein is an antibody that binds to the IL-34 protein but hardly or at all to other proteins, and can also be described as an antibody having a high binding affinity for the IL-34 protein. .. An antibody having a high binding affinity for the IL-34 protein is, for example, an antibody having a dissociation constant KD of 10 -7 M or less, preferably 10 -8 M or less, and more preferably 10 -9 M or less.
IL-34タンパク質に特異的な抗体は由来する動物種により制限されず、またポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体のいずれでもよく、免疫グロブリン全長からなる抗体又はFab断片、F(ab’)2断片、diabody、Fv、ScFv、Sc(Fv)2などの抗体の部分断片などでもよい。The IL-34 protein-specific antibody is not limited by the animal species from which it is derived, and may be any of a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, a human antibody, a chimeric antibody, or a humanized antibody. It may be an F (ab') 2 fragment, a partial fragment of an antibody such as diabody, Fv, ScFv, Sc (Fv) 2 or the like.
IL-34タンパク質に特異的な抗体は、好ましくは遺伝子組換え手法で作製された組換えヒトIL-34タンパク質又はその断片等を抗原として、ウサギ、マウス、ラット等の適当な実験動物への免疫によるポリクローナル抗体作製方法、免疫動物由来のB細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマを利用する又は抗体ファージライブラリーを利用するモノクローナル抗体作製方法を含む一般的な抗体作製方法によって調製することができる。 An antibody specific for the IL-34 protein preferably uses a recombinant human IL-34 protein prepared by a gene recombination method or a fragment thereof as an antigen to immunize an appropriate experimental animal such as a rabbit, mouse, or rat. It can be prepared by a general antibody production method including a method for producing a polyclonal antibody according to the above, a method for producing a monoclonal antibody using a hybridoma of B cells and myeloma cells derived from an immune animal, or a method for producing a monoclonal antibody using an antibody phage library.
また、WO2016/204216及びその対応米国出願公開US2018/0193453A1に記載されている抗IL-34抗体、R&D systemsから市販されている抗IL-34抗体であるMAB5265、ミリポアから市販されているMABT493、その他の既存の抗IL-34抗体も利用することができる。 In addition, the anti-IL-34 antibody described in WO2016 / 204216 and its corresponding US application publication US2018 / 0193453A1, MAB5265, which is an anti-IL-34 antibody commercially available from R & D systems, MABT493, which is commercially available from Millipore, and others. Existing anti-IL-34 antibodies are also available.
IL-34タンパク質に対する特異抗体は、蛍光物質（例えば、FITC、ローダミン、ファロイジン等）、金等のコロイド粒子、Luminex（登録商標、ルミネックス社）等の蛍光マイクロビーズ、重金属（例えば、金、白金等）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン、フィコシアニン等）、放射性同位体（例えば、3H、14C、32P、35S、125I、131I等）、酵素等（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジンその他の標識化合物によって標識されていてもよい。Specific antibodies against the IL-34 protein include fluorescent substances (eg, FITC, rhodamine, phalloidin, etc.), colloidal particles such as gold, fluorescent microbeads such as Luminex (registered trademark, Luminex), heavy metals (eg, gold, platinum, etc.). ), Dye proteins (eg, phycoerythrin, phycocyanin, etc.), radioisotopes (eg, 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 125 I, 131 I, etc.), enzymes, etc. (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.) , Biotin, streptavidin and other labeling compounds.
IL-34をコードするmRNAの発現量の測定は、その塩基配列を基に設計される適当な塩基配列からなるプライマー核酸を用いたPCR法、IL-34 mRNAの塩基配列又はこれに相補的なDNA若しくはRNA（cDNA若しくはcRNA）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるプローブ核酸を用いたハイブリダイゼーション法、IL-34 mRNAの塩基配列にハイブリダイズし得る塩基配列からなるプローブ核酸が固定化されたチップを用いたマイクロアレイ法、RNAシーケンシング法その他の、IL-34 mRNAの発現を検出することができる公知の方法により行うことができる。 The expression level of the mRNA encoding IL-34 is measured by a PCR method using a primer nucleic acid consisting of an appropriate base sequence designed based on the base sequence, the base sequence of IL-34 mRNA or complementary thereto. Hybridization method using a probe nucleic acid consisting of a base sequence capable of hybridizing to DNA or RNA (cDNA or cRNA) under stringent conditions, probe nucleic acid consisting of a base sequence capable of hybridizing to the base sequence of IL-34 mRNA It can be carried out by a microarray method using an immobilized chip, an RNA sequencing method, or any other known method capable of detecting the expression of IL-34 mRNA.
PCR法は、定量RT-PCR法、典型的にはリアルタイムRT-PCR法が好ましい。定量RT-PCR法においては、IL-34 mRNAから逆転写反応によってcDNAを合成し、これを特異的に増幅するプライマーセットを用いて、IL-34 mRNAの発現量が測定される。プライマーセットは、IL-34 mRNAから逆転写されたcDNAとアニールし、当該cDNA又はその一部を特異的に増幅することができるものであれば、cDNAとのアニーリング部位や増幅領域の長さといった条件に制限はなく、当業者はこれらの条件を適宜選択することができる。ここで特異的に増幅するとは、IL-34 mRNAから逆転写されたcDNAを増幅することができるが、他のcDNAをほとんど又は全く増幅しないことを意味する。プライマーセットのうちの少なくとも１つのプライマーの配列は、IL-34 mRNAから逆転写されたcDNAに選択的にアニールするように設計することが好ましい。また、プライマーの長さに特に制限はないが、典型的には15〜30塩基である。 As the PCR method, a quantitative RT-PCR method, typically a real-time RT-PCR method is preferable. In the quantitative RT-PCR method, the expression level of IL-34 mRNA is measured by synthesizing cDNA from IL-34 mRNA by a reverse transcription reaction and using a primer set that specifically amplifies the cDNA. The primer set can be annealed with the cDNA reverse-transcribed from IL-34 mRNA, and if it can specifically amplify the cDNA or a part thereof, the length of the annealing site or amplification region with the cDNA can be mentioned. There are no restrictions on the conditions, and those skilled in the art can appropriately select these conditions. Specific amplification here means that the cDNA reverse transcribed from IL-34 mRNA can be amplified, but little or no other cDNA is amplified. The sequence of at least one primer in the primer set is preferably designed to selectively anneal to the reverse transcribed cDNA from IL-34 mRNA. The length of the primer is not particularly limited, but is typically 15 to 30 bases.
TaqMan（登録商標）アッセイを利用したリアルタイムRT-PCR法においては、プライマーセットに加えて、増幅領域に特異的にハイブリダイズし得る標識プローブが用いられる。TaqMan（登録商標）アッセイではプローブの特異的ハイブリダイゼーションに基づいて増幅産物を検出することから、この方法で用いられるプライマーセットは、SP3 mRNAから逆転写されたcDNAを他の鋳型DNAよりも優先的に増幅することができればよく、必ずしも特異的に増幅することは必要とされない。 In the real-time RT-PCR method using the TaqMan® assay, in addition to the primer set, a labeled probe capable of specifically hybridizing to the amplification region is used. Because the TaqMan® assay detects amplification products based on probe-specific hybridization, the primer set used in this method prefers cDNA reverse transcribed from SP3 mRNA over other template DNAs. It suffices if it can be amplified specifically, and it is not always necessary to amplify it specifically.
ハイブリダイゼーション法及びマイクロアレイ法においては、IL-34 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAに特異的にハイブリダイズし得るプローブを用いて、IL-34 mRNAの発現量が測定される。プローブは、IL-34 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAに特異的にハイブリダイズすることができるものであれば、ハイブリダイズする位置やハイブリダイズする領域の長さといった条件に制限はなく、当業者はこれらの条件を適宜選択することができる。またプローブは、IL-34 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAに特異的にハイブリダイズすることができる限り、その塩基配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。 In the hybridization method and the microarray method, the expression level of IL-34 mRNA is measured by using IL-34 mRNA or a cDNA or a probe capable of specifically hybridizing with the cDNA complementing the IL-34 mRNA. As long as the probe can specifically hybridize to IL-34 mRNA or a cDNA or cDNA complementary thereto, there are no restrictions on conditions such as the hybridizing position and the length of the hybridizing region. Those skilled in the art can appropriately select these conditions. The probe may also contain one or more substitutions, deletions or additions in its base sequence as long as it can specifically hybridize to IL-34 mRNA or a cDNA or cDNA complementary thereto. ..
特異的にハイブリダイズするとは、IL-34 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAにハイブリダイズすることができるが、他のcDNA若しくはcRNAにほとんど又は全くハイブリダイズしないことを意味する。プローブの配列は、IL-34 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAにもっぱら存在し、他のRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAにはあまり存在しない塩基配列に基づいて設計することが好ましい。また、プローブの長さに特に制限はなく、例えば10〜500塩基であることができる。 Specific hybridization means that it can hybridize to IL-34 mRNA or its complementary cDNA or cDNA, but hardly or at all to other cDNA or cDNA. The probe sequence is preferably designed based on a base sequence that is exclusively present in IL-34 mRNA or its complementary cDNA or cRNA and is rarely present in other RNA or its complementary cDNA or cRNA. .. Further, the length of the probe is not particularly limited and may be, for example, 10 to 500 bases.
プローブは、IL-34 mRNA又はこれに相補的なcDNA若しくはcRNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸であってもよい。当業者は、ストリンジェンシーに影響を及ぼす温度、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間、イオン強度、塩濃度といった種々の要素を考慮して、ストリンジェントな条件を適宜設定し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るプローブを設計することができる。ストリンジェントな条件は、例えば5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。 The probe may be a nucleic acid capable of hybridizing to IL-34 mRNA or a cDNA or cDNA complementary thereto under stringent conditions. Those skilled in the art will appropriately set stringent conditions in consideration of various factors such as temperature, probe concentration, probe length, reaction time, ionic strength, and salt concentration that affect stringency. Probes that can hybridize underneath can be designed. Stringent conditions are, for example, 5 × SSC, 5 × Denhardt solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C.
プライマーセット及びプローブは、採用される測定方法の原理及びIL-34遺伝子の塩基配列に基づいて、当業者が適宜設計し、一般的な核酸合成方法又は遺伝子工学的方法によって調製することができる。またプライマー核酸又はプローブ核酸は、用いられる方法に応じて、蛍光物質（例えば、Cy3、Cy5、FITC、Alexa Flour等）、放射性同位体（例えば、3H、14C、32P、35S、125I、131I等）、酵素、ビオチン、ストレプトアビジンその他の標識化合物によって標識されていてもよい。Primer sets and probes can be appropriately designed by those skilled in the art based on the principle of the measurement method adopted and the base sequence of the IL-34 gene, and can be prepared by a general nucleic acid synthesis method or a genetic engineering method. Primer nucleic acids or probe nucleic acids may be fluorescent substances (eg, Cy3, Cy5, FITC, Alexa Flour, etc.), radioisotopes (eg, 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 125, etc.), depending on the method used. I, 131 I, etc.), may be labeled with an enzyme, biotin, streptavidin or other labeling compound.
検体中のメラノーマのがん治療耐性の判定は、当該検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を、がん治療耐性を持たないメラノーマ（以下、対照メラノーマという）におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量と比較することにより行われる。具体的には、メラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量が対照メラノーマにおける発現量よりも高い場合、前記検体に含まれるメラノーマはがん治療耐性であると判定される。本発明において、がん治療耐性とは、がんの治療的処置に対する耐性、特に化学療法、放射線療法及び免疫療法よりなる群から選択される少なくとも１種のがん治療に対する耐性を意味する。 To determine the cancer treatment resistance of melanoma in a sample, the expression level of the IL-34 protein or the mRNA encoding the IL-34 protein in the sample is determined by the IL-34 in the melanoma having no cancer treatment resistance (hereinafter referred to as control melanoma). This is done by comparing with the expression level of the protein or the mRNA encoding it. Specifically, when the expression level of the IL-34 protein or the mRNA encoding the IL-34 protein in the sample containing melanoma is higher than the expression level in the control melanoma, the melanoma contained in the sample is determined to be resistant to cancer treatment. To. In the present invention, cancer treatment resistance means resistance to therapeutic treatment of cancer, particularly resistance to at least one cancer treatment selected from the group consisting of chemotherapy, radiation therapy and immunotherapy.
がん治療耐性を持たない対照メラノーマとしては、がん治療耐性を持たないことが実験的に確認されたメラノーマ細胞株、又はがん治療耐性を持たないことが医学的に確認されたメラノーマ患者から採取されたメラノーマを挙げることができる。対照メラノーマは、化学療法、放射線療法又は免疫療法のいずれかに対する耐性を持たないものであればよいが、これらのがん治療のいずれに対しても耐性を持たないメラノーマであることが望ましい。対照メラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量は、検体における発現量の測定と同様にして測定することができる。判定に用いられる対照メラノーマにおける発現量のデータは、前記メラノーマを含む検体における発現量と同時に測定されたものであっても、又は前記メラノーマを含む検体とは別に予め測定されたものであってもよい。 Control melanomas that do not have cancer treatment resistance include melanoma cell lines that have been experimentally confirmed to have no cancer treatment resistance, or melanoma patients that have been medically confirmed to have no cancer treatment resistance. The collected melanoma can be mentioned. The control melanoma may be one that is not resistant to either chemotherapy, radiation therapy or immunotherapy, but is preferably a melanoma that is not resistant to any of these cancer treatments. The expression level of the IL-34 protein or the mRNA encoding the IL-34 protein in the control melanoma can be measured in the same manner as the measurement of the expression level in the sample. The expression level data in the control melanoma used for the determination may be measured at the same time as the expression level in the sample containing the melanoma, or may be measured in advance separately from the sample containing the melanoma. Good.
メラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量が対照メラノーマにおける発現量よりも高いこと、すなわちメラノーマ患者から採取された検体中のメラノーマががん治療耐性であることは、当該患者のメラノーマは治療困難であり再発リスクが高いことを示唆する。 The expression level of IL-34 protein or mRNA encoding it in a sample containing melanoma is higher than that in a control melanoma, that is, the melanoma in a sample collected from a melanoma patient is resistant to cancer treatment. It suggests that the patient's melanoma is difficult to treat and has a high risk of recurrence.
また、メラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量が対照メラノーマにおける発現量よりも高いことは、本発明者らの発明にかかる国際特許出願WO2016/204216及びその対応米国出願公開US2018/0193453A1に記載されるようなIL-34の発現や活性を抑制するがん治療耐性低減剤による処置が適応可能であることをも意味する。 In addition, the expression level of IL-34 protein or mRNA encoding the same in a sample containing melanoma is higher than the expression level in control melanoma. It also means that treatment with a cancer treatment resistance reducing agent that suppresses the expression and activity of IL-34 as described in US 2018/0193453A1 is applicable.
したがって、本発明は、メラノーマ患者から採取されたメラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を測定する工程、及び前記発現量が、がん治療耐性を持たないメラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量よりも高い場合、前記患者にはがん治療耐性低減剤が適応可能であると判定する工程を含む、メラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置への適応性を判定する方法であって、前記がん治療耐性低減剤は、IL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、前記方法を別の態様として提供する。本発明はさらに、上記のがん治療耐性低減剤による処置への適応性判定方法によってがん治療耐性低減剤が適応可能であると判定されたメラノーマ患者に有効量のがん治療耐性低減剤を投与する工程を含む、メラノーマの治療耐性を低減させる方法を別の態様として提供する。 Therefore, the present invention relates to a step of measuring the expression level of IL-34 protein or mRNA encoding the IL-34 protein in a sample containing melanoma collected from a melanoma patient, and in a melanoma whose expression level does not have cancer treatment resistance. Depending on the cancer treatment resistance reducing agent of the melanoma patient, which comprises the step of determining that the cancer treatment resistance reducing agent is applicable to the patient when the expression level is higher than the expression level of the IL-34 protein or the mRNA encoding the IL-34 protein. A method for determining treatment adaptability, the cancer treatment resistance reducing agent suppresses the expression of IL-34, inhibits the activity of IL-34 and / or includes CSF-1R and IL-34. The above-mentioned method, which comprises a substance that inhibits the binding of the protein as an active ingredient, is provided as another embodiment. The present invention further provides an effective amount of a cancer treatment resistance reducing agent to a melanoma patient who is determined to be applicable to the cancer treatment resistance reducing agent by the above-mentioned method for determining adaptability to treatment with a cancer treatment resistance reducing agent. Another embodiment provides a method of reducing the therapeutic resistance of melanoma, which comprises the step of administration.
本発明におけるがん治療耐性低減剤は、がんの治療耐性に関与する分子であるIL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害する物質を有効成分として含有する。IL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害する物質は、IL-34をコードする遺伝子からのRNA転写若しくはタンパク質翻訳を阻害することができる、IL-34がCSF-1Rとの結合を介して発揮する生理活性を阻害することができる、及び／又はCSF-1Rに作用してIL-34との結合を阻害することができる若しくはIL-34に作用してCSF-1Rとの結合を阻害することができる物質であればよい。かかる物質は、核酸、抗体、ペプチド及び化合物よりなる群から選択することができる。 The cancer treatment resistance reducing agent in the present invention suppresses the expression of IL-34, which is a molecule involved in cancer treatment resistance, inhibits the activity of IL-34, and / or contains CSF-1R and IL-34. Contains a substance that inhibits the binding of the active ingredient. Substances that suppress the expression of IL-34, inhibit the activity of IL-34 and / or inhibit the binding of CSF-1R to IL-34 are RNA transcription or protein translation from the gene encoding IL-34. Can inhibit the physiological activity that IL-34 exerts through binding to CSF-1R, and / or acts on CSF-1R to inhibit binding to IL-34. Any substance can be used or can act on IL-34 to inhibit its binding to CSF-1R. Such substances can be selected from the group consisting of nucleic acids, antibodies, peptides and compounds.
IL-34の発現を阻害する物質の例としては、IL-34をコードしている遺伝子の公知の塩基配列を基にして当業者が設計、作製することができる、アンチセンスRNA又はsiRNA等の阻害性核酸を典型例として挙げることができる。 Examples of substances that inhibit the expression of IL-34 include antisense RNA or siRNA, which can be designed and prepared by those skilled in the art based on the known base sequence of the gene encoding IL-34. Inhibitor nucleic acids can be mentioned as a typical example.
IL-34がCSF-1Rとの結合を介して発揮する生理活性を阻害することのできる物質の例としては、CSF-1Rとの結合部位以外の部位においてIL-34に特異的に結合し、IL-34がCSF-1Rと結合してもその生理活性を発揮させないように働く抗体等を挙げることができる。 An example of a substance capable of inhibiting the physiological activity of IL-34 through its binding to CSF-1R is that it specifically binds to IL-34 at a site other than the binding site with CSF-1R. Examples of antibodies that act so that IL-34 does not exert its physiological activity even if it binds to CSF-1R can be mentioned.
また、IL-34とヒトCSF-1Rとの結合を特異的に阻害する物質としては、CSF-1R又はIL-34に、特にIL-34に特異的に結合することで、IL-34とヒトCSF-1Rとの結合を阻害する物質が好ましい。そのような物質の例は、CSF-1R上のIL-34結合部位をブロックすることでIL-34とCSF-1Rとの結合を阻害する抗CSF-1R抗体、前記結合部位とは異なる部位でCSF-1Rに結合するが立体障害的にIL-34とCSF-1Rとの結合を阻害する抗CSF-1R抗体、IL-34上のCSF-1R結合部位をブロックすることでIL-34とCSF-1Rとの結合を阻害する抗IL-34抗体、又は前記結合部位とは異なる部位でIL-34に結合するが立体障害的にIL-34とCSF-1Rとの結合を阻害する抗IL-34抗体等を挙げることができる。CSF-1RはIL-34の他にM-CSFとも結合することから、本発明においてはM-CSFとCSF-1Rとの結合に影響を与えないという点で、IL-34に結合する抗体の利用が好ましい。 In addition, as a substance that specifically inhibits the binding between IL-34 and human CSF-1R, IL-34 and human by specifically binding to CSF-1R or IL-34, particularly IL-34. A substance that inhibits binding to CSF-1R is preferable. Examples of such substances are anti-CSF-1R antibodies that block the binding of IL-34 to CSF-1R by blocking the IL-34 binding site on CSF-1R, at a site different from the binding site. An anti-CSF-1R antibody that binds to CSF-1R but sterically impairs the binding of IL-34 to CSF-1R, IL-34 and CSF by blocking the CSF-1R binding site on IL-34. An anti-IL-34 antibody that inhibits binding to -1R, or an anti-IL- that binds to IL-34 at a site different from the binding site but sterically impairs the binding of IL-34 to CSF-1R. 34 Antibodies and the like can be mentioned. Since CSF-1R binds to M-CSF in addition to IL-34, the antibody that binds to IL-34 does not affect the binding between M-CSF and CSF-1R in the present invention. It is preferable to use it.
IL-34とヒトCSF-1Rとの結合を特異的に阻害する物質としてのIL-34タンパク質に特異的な抗体は、IL-34タンパク質に結合するが、他のタンパク質にほとんど又は全く結合しない抗体であり、IL-34タンパク質に対する高い結合親和性を有する抗体と表すこともできる。IL-34タンパク質に対する高い結合親和性を有する抗体は、例えば10-7 M以下、好ましくは10-8 M以下、より好ましくは10-9 M以下の解離定数KDを持つ抗体である。An antibody specific for the IL-34 protein as a substance that specifically inhibits the binding of IL-34 to human CSF-1R is an antibody that binds to the IL-34 protein but hardly or at all to other proteins. It can also be expressed as an antibody having a high binding affinity for the IL-34 protein. An antibody having a high binding affinity for the IL-34 protein is, for example, an antibody having a dissociation constant KD of 10 -7 M or less, preferably 10 -8 M or less, and more preferably 10 -9 M or less.
本発明において利用される前記抗体、特にIL-34タンパク質に特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体であり得て、また当該抗体のFab、Fab’、F(ab’)2、scFv、ダイアボディ（diabody）、dsFv、Fv、ScFv、Sc(Fv)2、CDRを含むペプチド等の抗体誘導体も本発明において利用することができる。The antibody used in the present invention, particularly an antibody that specifically binds to the IL-34 protein, can be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody, and Fab, Fab of the antibody. Antibody derivatives such as peptides containing', F (ab') 2, scFv, diabody, dsFv, Fv, ScFv, Sc (Fv) 2 , and CDR can also be used in the present invention.
抗体は、好ましくは遺伝子組換え手法で作製された組換えヒトIL-34を抗原としてウサギ、マウス、ラット等の適当な実験動物を免疫することを含むポリクローナル抗体作製方法、免疫動物由来のB細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマを利用する又は抗体ファージライブラリーを利用するモノクローナル抗体作製方法を含む一般的な抗体作製方法によって調製することができる。あるいは、WO2016/204216及びその対応米国出願公開US2018/0193453A1に記載されている抗IL-34抗体、R&D systemsから市販されている抗IL-34抗体であるMAB5265、ミリポアから市販されているMABT493、その他の既存の抗IL-34抗体を使用してもよい。 The antibody is preferably a method for producing a polyclonal antibody, which comprises immunizing an appropriate experimental animal such as a rabbit, mouse, or rat using recombinant human IL-34 produced by a gene recombination method as an antigen, and B cells derived from an immune animal. It can be prepared by a general antibody production method including a monoclonal antibody production method using a hybridoma of and myeloma cells or an antibody phage library. Alternatively, the anti-IL-34 antibody described in WO2016 / 204216 and its corresponding US application publication US2018 / 0193453A1, the anti-IL-34 antibody MAB5265 commercially available from R & D systems, MABT493 commercially available from Millipore, and others. Existing anti-IL-34 antibodies may be used.
上記抗体を有効成分とするがん治療耐性低減剤は、抗体を含有する医薬製剤に用いられる一般的な担体を用いて凍結乾燥製剤又は水溶液の形態に調製されて使用されることが好ましい。担体の例としては、緩衝剤、抗酸化剤、保存剤、タンパク質、親水性ポリマー、アミノ酸、キレート化剤及び非イオン性界面活性剤等を挙げることができるが、これらには限定されない。 The cancer treatment resistance reducing agent containing the antibody as an active ingredient is preferably prepared and used in the form of a lyophilized preparation or an aqueous solution using a general carrier used for a pharmaceutical preparation containing the antibody. Examples of carriers include, but are not limited to, buffers, antioxidants, preservatives, proteins, hydrophilic polymers, amino acids, chelating agents, nonionic surfactants and the like.
がん治療耐性低減剤は、IL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害することのできる、前記阻害性核酸又は抗体以外の物質を含んでもよい。そのような物質は、IL-34を発現している適当な細胞を用いた発現抑制能のスクリーニング、又はCSF-1Rを発現している適当な細胞とIL-34とを用いたIL-34の活性阻害能若しくは結合阻害能のスクリーニングを通じて探索することができる。 The inhibitory nucleic acid or said, which can suppress the expression of IL-34, inhibit the activity of IL-34 and / or inhibit the binding of CSF-1R to IL-34. It may contain substances other than antibodies. Such substances can be screened for expression-suppressing ability using appropriate cells expressing IL-34, or IL-34 using appropriate cells expressing CSF-1R and IL-34. It can be searched through screening for activity inhibitory ability or binding inhibitory ability.
本発明におけるがん治療耐性低減剤は、WO2016/204216及びその対応米国出願公開US2018/0193453A1中にもその詳細が開示されている。当該文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。 The details of the cancer treatment resistance reducing agent in the present invention are also disclosed in WO2016 / 204216 and its corresponding US application publication US2018 / 0193453A1. The document is incorporated herein by reference in its entirety.
がん治療耐性低減剤は、先に例示されるもの以外の薬学的に許容される賦形剤、安定化剤、担体等の成分と医薬組成物を形成し又は製剤化して使用することができる。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十七改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。 The cancer treatment resistance reducing agent can be used by forming or formulating a pharmaceutical composition with components such as pharmaceutically acceptable excipients, stabilizers, carriers, etc. other than those exemplified above. .. Pharmaceutically acceptable ingredients are well known to those skilled in the art, and those skilled in the art can use the ingredients described in the 17th revised Japanese Pharmacopoeia and other standards within the range of normal practicability, depending on the form of the formulation. Can be appropriately selected and used.
本発明におけるがん治療耐性低減剤又はこれを含む医薬組成物は、筋内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与等、非経口的に投与されることが好ましく、そのような投与経路に適した製剤、例えば注射剤又は点滴剤等であることが好ましい。 The cancer treatment resistance reducing agent or the pharmaceutical composition containing the same in the present invention is preferably administered parenterally, such as intramuscular administration, intravenous administration, intraarterial administration, intraperitoneal administration, and subcutaneous administration. It is preferable that the preparation is suitable for such an administration route, for example, an injection or an infusion.
がん治療耐性低減剤又はこれを含む医薬組成物は、治療耐性がんを有する患者に投与することで当該がんの治療耐性を低減させ、化学療法、放射線療法及び／又は免疫療法によるがん治療の有効性を高めることができるものと期待されることから、これらのがん治療と組み合わせて用いられることが好ましい。したがって、本発明は、前述のがん治療耐性低減剤による処置への適応性判定方法によってがん治療耐性低減剤が適応可能であると判定された患者に有効量のがん治療耐性低減剤を投与する工程、並びに前記がん治療耐性低減剤の投与と一緒に又は別々に、同時に又は逐次的に、がんの化学療法、放射線療法及び／又は免疫療法を前記患者に施す工程を含む、治療耐性がんの治療方法をさらなる別の態様として提供する。 A cancer treatment resistance reducing agent or a pharmaceutical composition containing the same is administered to a patient having a treatment resistant cancer to reduce the treatment resistance of the cancer, and the cancer is treated with chemotherapy, radiation therapy and / or immunotherapy. Since it is expected that the effectiveness of the treatment can be enhanced, it is preferable to use it in combination with these cancer treatments. Therefore, the present invention provides an effective amount of a cancer treatment resistance reducing agent to a patient for whom a cancer treatment resistance reducing agent is determined to be applicable by the above-mentioned method for determining adaptability to treatment with a cancer treatment resistance reducing agent. Treatment comprising the step of administering and the step of administering the cancer chemotherapy, radiation therapy and / or immunotherapy to the patient together or separately, simultaneously or sequentially with the administration of the cancer treatment resistance reducing agent. A method of treating resistant cancer is provided as yet another aspect.
また、第一の態様の判定方法と対照的に、メラノーマ患者から採取されたメラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量が対照メラノーマにおける発現量と同等又はそれより低いことは、当該患者が有するメラノーマはがん治療に耐性ではなく、当該患者にはがんの一般的治療的処置である化学療法、放射線療法又は免疫療法が適応可能であることを意味する。したがって、本発明は、メラノーマ患者から採取されたメラノーマを含む検体におけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量を測定する工程、及び前記発現量が、対照メラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量と同等又はそれより低い場合、前記患者には、化学療法、放射線療法又は免疫療法が適応可能であると判定する工程を含む、メラノーマ患者の化学療法、放射線療法又は免疫療法への適応性を判定する方法をさらなる別の態様として提供する。 Further, in contrast to the determination method of the first aspect, the expression level of the IL-34 protein or the mRNA encoding the IL-34 protein or the mRNA encoding the same in the sample containing melanoma collected from the melanoma patient is equal to or lower than the expression level in the control melanoma. This means that the patient's melanoma is not resistant to cancer treatment and that the patient is eligible for chemotherapy, radiation therapy or immunotherapy, which are common therapeutic treatments for cancer. Therefore, the present invention is a step of measuring the expression level of IL-34 protein or mRNA encoding the same in a sample containing melanoma collected from a melanoma patient, and the expression level is the IL-34 protein or the same in a control melanoma. Chemotherapy, radiation therapy or immunotherapy for melanoma patients, including determining that chemotherapy, radiation therapy or immunotherapy is applicable to the patient if the expression level of the mRNA encoding the above is equal to or lower than that of the mRNA. A method for determining adaptability to therapy is provided as yet another aspect.
本発明が提供する各判定方法は、各判定を行うためのデータの収集方法、各判定を補助する方法と表すこともできる。 Each determination method provided by the present invention can also be expressed as a method for collecting data for performing each determination and a method for assisting each determination.
本発明の別の態様は、IL-34をコードするmRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はIL-34タンパク質に対する特異抗体を含む、メラノーマのがん治療耐性を判定するためのキットに関する。 Another aspect of the present invention relates to a kit for determining cancer treatment resistance of melanoma, which comprises a primer set or probe for detecting the expression of mRNA encoding IL-34 or a specific antibody against the IL-34 protein. ..
本発明のまた別の態様は、IL-34をコードするmRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はIL-34タンパク質に対する特異抗体を含む、メラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置の適応性を判定するためのキットであって、前記がん治療低減剤がIL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、前記キットに関する。 Another aspect of the present invention is the treatment of a melanoma patient with a cancer treatment resistance reducing agent, which comprises a primer set or probe for detecting the expression of mRNA encoding IL-34 or a specific antibody against the IL-34 protein. A kit for determining indication, the cancer treatment reducing agent suppresses the expression of IL-34, inhibits the activity of IL-34 and / or binds CSF-1R to IL-34. The present invention relates to the above-mentioned kit containing an inhibitory substance as an active ingredient.
本発明のさらなる別の態様は、IL-34をコードするmRNAの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はIL-34タンパク質に対する特異抗体を含む、メラノーマ患者の化学療法、放射線療法又は免疫療法への適応性を判定するためのキットに関する。 Yet another aspect of the invention is to chemotherapy, radiation therapy or immunotherapy for melanoma patients, including a primer set or probe for detecting the expression of mRNA encoding IL-34 or a specific antibody against the IL-34 protein. Regarding a kit for determining the adaptability of.
上記キットに含まれるプライマーセット、プローブ、特異抗体及びこれらの使用方法並びにがん治療低減剤の説明は、上で述べたとおりである。また上記キットは、プライマーセット、プローブ又は特異抗体に加えて、それぞれの測定又は検出方法に応じて、例えばdNTP、酵素、標識用又は検出用試薬、コントロール用試薬（例えば、ポジティブ又はネガティブコントロール用のオリゴヌクレオチド又は抗原）、緩衝液、pH調整剤、安定剤、固相支持体、反応容器、取扱説明書等をさらに含んでもよい。 The description of the primer set, probe, specific antibody, usage method thereof, and cancer treatment reducing agent included in the above kit is as described above. In addition to primer sets, probes or specific antibodies, the kit also includes, for example, dNTPs, enzymes, labeling or detection reagents, control reagents (eg, for positive or negative control), depending on the respective measurement or detection method. Oligonucleotides or antigens), buffers, pH regulators, stabilizers, solid support, reaction vessels, instruction manuals, etc. may be further included.
プライマーセット又はプローブを含む上記キットは、GAPDHやアクチンといったハウスキーピング遺伝子を検出する内部コントロール用のプライマーセット又はプローブをさらに含んでもよい。また、特異抗体を含む上記キットは、IL-34タンパク質に結合した特異抗体を検出するために蛍光物質、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Horse Radish Peroxidase）等の標識物質をコンジュゲートした2次抗体や、前記特異抗体と異なる部位でIL-34タンパク質と結合する抗体をさらに含んでもよい。 The kit containing a primer set or probe may further include a primer set or probe for internal control to detect housekeeping genes such as GAPDH and actin. In addition, the above kit containing the specific antibody includes a secondary antibody in which a fluorescent substance, a labeling substance such as Horseradish Peroxidase (Horse Radish Peroxidase) is conjugated to detect the specific antibody bound to the IL-34 protein, and the specific antibody. It may further contain an antibody that binds to the IL-34 protein at a site different from the antibody.
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto.
北海道大学の自主臨床研究に関する承認及びヒトを対象とする医学系研究に関する倫理指針の下、患者の同意を得て、以下の研究が行われた。
（１）試験方法
臨床検体
左足底に5mm厚の色素性病変を有する74歳の日本人女性が、2008年2月に皮膚科（北海道大学病院、札幌）に入院し、外科手術を受けた。術後に細胞診によりステージIII Bのメラノーマとの診断が確認され、メラノーマTNM分類に従ってpT4bN2aM0と分類された。患者は次いでインターフェロンβ（DAV-Feron）で治療を受けたが、初回投与後に患者の希望により治療を中止した。2014年に患者はin-transit転移を再度呈し、2014年から2015年の間にダカルバジン治療を受けた（8回投与）。8回目のダカルバジン投与の後、遠隔リンパ節で転移性メラノーマが確認された。患者は次いで2015年から2016年の間にニボルマブ（2mg/kg/3週間）での治療を受けた。2016年12月に遠隔リンパ節へのメラノーマ転移の増大を示し、転移部位でサンプリングが行われた。図１に疾患及び治療の経過を示す。The following studies were conducted with the consent of patients under the approval of Hokkaido University's independent clinical studies and the ethical guidelines for medical studies targeting humans.
(1) Test method
Clinical specimen A 74-year-old Japanese woman with a 5 mm-thick pigmented lesion on the left sole was admitted to the dermatology department (Hokkaido University Hospital, Sapporo) in February 2008 and underwent surgery. Postoperatively, cytology confirmed the diagnosis of stage III B melanoma and classified it as pT4bN2aM0 according to the melanoma TNM classification. The patient was then treated with interferon β (DAV-Feron), but was discontinued at the patient's request after the first dose. In 2014, the patient reappeared in-transit metastases and received dacarbazine treatment between 2014 and 2015 (8 doses). After the eighth dose of dacarbazine, metastatic melanoma was confirmed in the distant lymph nodes. Patients were then treated with nivolumab (2 mg / kg / 3 weeks) between 2015 and 2016. In December 2016, an increase in melanoma metastasis to distant lymph nodes was shown, and sampling was performed at the metastatic site. FIG. 1 shows the disease and the course of treatment.
免疫組織化学（IHC）
Opal 4色蛍光IHCキット（Perkin-Elmer NEL810001KT）を製造業者の指示に従って使用して、原発部位及び転移部位から採取したメラノーマ組織のホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）切片の多重免疫蛍光染色を行った。詳細には、原発性又は転移性メラノーマ組織由来パラフィン包埋臨床検体の4μm厚薄片をキシレン中で脱パラフィンし、エタノール中で再水和した。抗原回収は、Immunosavers（Nissin、Tokyo、Japan）を用いて98℃で45分間行った。内在性ペルオキシダーゼ活性を低下させるため、切片を0.3％H2O2を用いて室温で10分間処理した。4% Block Ace (DS Pharma Biomedical, Tokyo, Japan)によりブロッキングした後、切片を以下の一次抗体と共に、4℃で一晩インキュベートした。
抗ヒトIL-34抗体（1：200希釈、クローン1D12、ミリポア、MABT493）
抗ヒトメラノーマ抗体（1:50希釈、Abcam社ab732）
抗ヒトCD163抗体（1：200希釈、BIO-RAD MCA1853T）又は
抗ヒトCD8抗体（1：100希釈、BioLegend 372902） Immunohistochemistry (IHC)
Multiple immunofluorescent staining of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) sections of melanoma tissue taken from the primary and metastatic sites was performed using the Opal 4-color fluorescent IHC kit (Perkin-Elmer NEL810001KT) according to the manufacturer's instructions. .. Specifically, 4 μm thick flakes of paraffin-embedded clinical specimens derived from primary or metastatic melanoma tissue were deparaffinized in xylene and rehydrated in ethanol. Antigen recovery was performed using Immunosavers (Nissin, Tokyo, Japan) at 98 ° C. for 45 minutes. Sections were treated with 0.3% H 2 O 2 at room temperature for 10 minutes to reduce endogenous peroxidase activity. After blocking with 4% Block Ace (DS Pharma Biomedical, Tokyo, Japan), sections were incubated overnight at 4 ° C with the following primary antibody.
Anti-human IL-34 antibody (1: 200 dilution, clone 1D12, Millipore, MABT493)
Anti-human melanoma antibody (1:50 dilution, Abcam ab732)
Anti-human CD163 antibody (1: 200 dilution, BIO-RAD MCA1853T) or anti-human CD8 antibody (1: 100 dilution, BioLegend 372902)
次に、切片をPBS-T（0.1M PBS、0.3％Triton）で3回洗浄した。10％ヤギ正常血清でブロッキングした後、切片をHRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体（1:100希釈、BioLegend 4053061）と共に室温で30分間インキュベートした。PBS-T（0.1M PBS、0.3％Triton）で3回洗浄した後、切片をフルオロフォア増幅試薬で10分間浸漬した。最後に、切片をDAPIで5分間対比染色し、VECTASHIELDマウンティング培地にマウントした。各切片について600倍の倍率で2人の独立した研究者によって腫瘍領域を客観的に判定し、切片毎に20超の無作為に選択した腫瘍領域について、FV1000 OLYMPUSソフトウェアを用いてIL-34、メラノーマ抗原、CD163又はCD8免疫反応性の定量値を測定した。 The sections were then washed 3 times with PBS-T (0.1M PBS, 0.3% Triton). After blocking with 10% normal goat serum, sections were incubated with HRP-labeled goat anti-mouse IgG antibody (1: 100 dilution, BioLegend 4053061) for 30 minutes at room temperature. After washing 3 times with PBS-T (0.1M PBS, 0.3% Triton), the sections were immersed in fluorofore amplification reagent for 10 minutes. Finally, sections were counterstained with DAPI for 5 minutes and mounted on VECTASHIELD mounting medium. Tumor areas were objectively determined by two independent researchers at a magnification of 600 for each section, and more than 20 randomly selected tumor areas per section were used with FV1000 OLYMPUS software to determine the tumor area, IL-34, Quantitative values of melanoma antigen, CD163 or CD8 immunoreactivity were measured.
統計解析
独立した２群間の差の有意性は、スチューデントのt検定により決定した。p値<0.05を統計的に有意とした。 Statistical analysis The significance of the difference between the two independent groups was determined by Student's t-test. A p-value <0.05 was considered statistically significant.
（２）結果と考察
原発性又はニボルマブ抵抗性転移性メラノーマにおけるIL-34又はメラノーマ抗原の免疫組織化学染色の代表例を図２に、無作為に選択した腫瘍領域におけるIL-34、メラノーマ抗原及びCD163の定量値をそれぞれ図３Ａ、図３Ｂ及び図４に示す。原発性メラノーマと比較して、転移性メラノーマにおいてIL-34の発現は有意に増加していた。また、転移性メラノーマにおけるIL-34の高発現は、腫瘍微小環境において免疫抑制及び腫瘍形成促進機能の増強を示すCD163陽性マクロファージ（M2マクロファージ）の頻度増加と正の相関を示した。
(2) Results and discussion Representative examples of immunohistochemical staining of IL-34 or melanoma antigen in primary or nivolumab-resistant metastatic melanoma are shown in FIG. 2, IL-34, melanoma antigen and in randomly selected tumor regions. The quantitative values of CD163 are shown in FIGS. 3A, 3B and 4, respectively. IL-34 expression was significantly increased in metastatic melanoma compared to primary melanoma. In addition, high expression of IL-34 in metastatic melanoma was positively correlated with increased frequency of CD163-positive macrophages (M2 macrophages), which show enhanced immunosuppression and tumorigenesis-promoting functions in the tumor microenvironment.
Claims (8)
前記発現量が、がん治療耐性を持たないメラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量よりも高い場合、前記検体に含まれるメラノーマはがん治療耐性であると判定する工程
を含む、メラノーマのがん治療耐性を判定する方法。The step of measuring the expression level of the IL-34 protein or the mRNA encoding the IL-34 protein in a sample containing melanoma, and the expression of the IL-34 protein or the mRNA encoding the IL-34 protein in the melanoma whose expression level is not resistant to cancer treatment. A method for determining cancer treatment resistance of melanoma, which comprises a step of determining that the melanoma contained in the sample is resistant to cancer treatment when the amount is higher than the amount.
前記発現量が、がん治療耐性を持たないメラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量よりも高い場合、前記患者にはがん治療耐性低減剤が適応可能であると判定する工程
を含む、メラノーマ患者のがん治療耐性低減剤による処置への適応性を判定する方法であって、
前記がん治療耐性低減剤は、IL-34の発現を抑制する、IL-34の活性を阻害する及び／又はCSF-1RとIL-34との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、前記方法。The step of measuring the expression level of IL-34 protein or mRNA encoding the same in a sample containing melanoma collected from a melanoma patient, and the IL-34 protein or this in melanoma whose expression level is not resistant to cancer treatment. If the expression level is higher than the expression level of the mRNA encoding the above, the adaptability of the melanoma patient to the treatment with the cancer treatment resistance reducing agent, including the step of determining that the cancer treatment resistance reducing agent is applicable to the patient. It ’s a judgment method,
The cancer treatment resistance reducing agent contains, as an active ingredient, a substance that suppresses the expression of IL-34, inhibits the activity of IL-34, and / or inhibits the binding between CSF-1R and IL-34. The method.
前記発現量が、がん治療耐性を持たないメラノーマにおけるIL-34タンパク質又はこれをコードするmRNAの発現量と同等又はそれより低い場合、前記患者には、化学療法、放射線療法又は免疫療法が適応可能であると判定する工程
を含む、メラノーマ患者の化学療法、放射線療法又は免疫療法への適応性を判定する方法。The step of measuring the expression level of IL-34 protein or mRNA encoding the IL-34 protein in a sample containing melanoma collected from a melanoma patient, and the IL-34 protein or this in melanoma whose expression level is not resistant to cancer treatment. Chemotherapy, radiation therapy or immunotherapy for melanoma patients, including determining that chemotherapy, radiation therapy or immunotherapy is applicable to the patient if the expression level of the mRNA encoding the above is equal to or lower than that of the mRNA. A method of determining adaptability to therapy.
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