JPWO2019142935A1 - Kynurenine monooxygenase and a method for measuring kynurenine using it - Google Patents
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Abstract
水溶性を有し、熱に安定なキヌレニンモノオキシゲナーゼを提供する。以下の性質（ａ）〜（ｈ）を有するキヌレニンモノオキシゲナーゼ。（ａ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体、及び酸素存在下で、Ｌ−キヌレニンと反応させることで、ＮＡＤ（Ｐ）＋又はそれらの誘導体、及び３−ヒドロキシキヌレニンを産生する（ｂ）原核生物を由来とする（ｃ）水溶性である（ｄ）ｐＨ９．０において、２５℃で３０分間静置後の残存活性が７０％以上である（ｅ）ｐＨ７．５において、４０℃で６０分間静置後の残存活性が６０％以上である（ｆ）Ｌ−キヌレニンに特異的に作用し、Ｌ−トリプトファンへの作用性が５％以下である（ｇ）分子量が４０ｋＤａ〜６０ｋＤａである（ｈ）フラビンを補酵素とするIt provides a water-soluble and heat-stable kynurenine monooxygenase. Kynurenine monooxygenase having the following properties (a) to (h). (A) NAD (P) H or its derivatives, and reaction with L-kynurenine in the presence of oxygen to produce NAD (P) + or its derivatives, and 3-hydroxykynurenine (b) prok. Residual activity after standing at 25 ° C. for 30 minutes at (c) water-soluble (d) pH 9.0 is 70% or more (e) at pH 7.5 for 60 minutes at 40 ° C. The residual activity after standing is 60% or more (f) It acts specifically on L-kynurenine, and the action on L-tryptophan is 5% or less (g) The molecular weight is 40 kDa to 60 kDa (h). ) Flavin as a coenzyme
Description
本発明は、キヌレニンモノオキシゲナーゼ、それを用いたキヌレニンの測定方法、及び該キヌレニンモノオキシゲナーゼを含むキヌレニン測定キットに関する。 The present invention relates to kynurenine monooxygenase, a method for measuring kynurenine using the same, and a kynurenine measurement kit containing the kynurenine monooxygenase.
Ｌ−キヌレニンは、Ｌ−トリプトファンの代謝物として生体内に存在することが知られており、医療分野において測定意義が各種検討されている。試料中のＬ−キヌレニン濃度測定においては、キヌレニンモノオキシゲナーゼ（ＫＭＯ）を利用する例が知られている。例えば、ヒト由来又はPseudomonas fluorescence由来のキヌレニンモノオキシゲナーゼを使用した例が報告されている（非特許文献１、特許文献１）。ヒトなどの真核生物由来のキヌレニンモノオキシゲナーゼは膜タンパク酵素であるため、大腸菌などでの大量生産が困難であり、また可溶化のために界面活性剤を併用する必要がある。キヌレニンモノオキシゲナーゼの可溶化のためにタグを付与する方法も知られているが、この方法は酵素タンパクあたりの活性が低下するという問題が報告されている（非特許文献２）。一方、原核生物由来のP.fluorescence由来のキヌレニンモノオキシゲナーゼは水溶性であり、大腸菌を用いて取得することが比較的容易である（非特許文献３）。しかしながら、P.fluorescence由来のキヌレニンモノオキシゲナーゼは熱に対して不安定であるため、特許文献１においては、主に２５℃で測定されている。また、他の原核生物由来のキヌレニンモノオキシゲナーゼとして、Cytophaga由来のものも知られているが、これは不溶性であるため、可溶化のために界面活性剤を使用することが必要とされている（非特許文献４）。このように、耐熱性を有する水溶性のキヌレニンモノオキシゲナーゼは知られていなかった。 L-kynurenine is known to exist in the living body as a metabolite of L-tryptophan, and various measurement significances have been studied in the medical field. An example of using kynurenine monooxygenase (KMO) is known for measuring the concentration of L-kynurenine in a sample. For example, an example using kynurenine monooxygenase derived from human or Pseudomonas fluorescence has been reported (Non-Patent Document 1, Patent Document 1). Since quinurenin monooxygenase derived from eukaryotes such as humans is a membrane protein enzyme, it is difficult to mass-produce it in Escherichia coli and the like, and it is necessary to use a surfactant in combination for solubilization. A method of adding a tag for solubilization of kynurenine monooxygenase is also known, but it has been reported that this method reduces the activity per enzyme protein (Non-Patent Document 2). On the other hand, kynurenine monooxygenase derived from P. fluorescence derived from prokaryotes is water-soluble and can be obtained relatively easily using Escherichia coli (Non-Patent Document 3). However, since Kynurenine monooxygenase derived from P. fluorescence is unstable to heat, it is mainly measured at 25 ° C. in Patent Document 1. Also, as a kynurenine monooxygenase derived from other prokaryotes, one derived from Cytophaga is also known, but since it is insoluble, it is necessary to use a surfactant for solubilization ( Non-Patent Document 4). As described above, a water-soluble kynurenine monooxygenase having heat resistance has not been known.
前述のように、大量生産が可能であり、生体試料中のキヌレニン測定に有用なキヌレニンモノオキシゲナーゼの開発が望まれている。本発明は、水溶性であり、かつ熱安定性を有するキヌレニンモノオキシゲナーゼを提供することを課題とする。 As described above, it is desired to develop a kynurenine monooxygenase that can be mass-produced and is useful for measuring kynurenine in a biological sample. An object of the present invention is to provide a kynurenine monooxygenase that is water-soluble and has thermal stability.
前記課題を解決するために、本発明者らは、原核生物からのスクリーニングをし、遺伝子クローニング、培養及び精製した酵素の特性を検討した。その結果、驚くべきことに、今回取得した原核生物由来の酵素が、キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有しており、水溶性で、かつP.fluorescence由来のキヌレニンモノオキシゲナーゼと比べて熱安定性を有することを見出した。加えて、これらの酵素はアルカリ性での安定性及びＬ−キヌレニンへの基質特異性が高いことも見出し、本発明を完成した。 In order to solve the above problems, the present inventors screened from prokaryotes and examined the characteristics of gene cloning, culturing and purified enzymes. As a result, surprisingly, the prokaryotic enzyme obtained this time has kynurenine monooxygenase activity, is water-soluble, and has thermal stability as compared with kynurenine monooxygenase derived from P. fluorescence. I found. In addition, they have also found that these enzymes are alkaline stable and have high substrate specificity for L-kynurenine, completing the present invention.
本発明は、以下の［１］〜［９］に関する。
［１］ 以下の性質（ａ）〜（ｈ）を有するキヌレニンモノオキシゲナーゼ。
（ａ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体、及び酸素存在下で、Ｌ−キヌレニンと反応させることで、ＮＡＤ（Ｐ）＋又はそれらの誘導体、及び３−ヒドロキシキヌレニンを産生する
（ｂ）原核生物を由来とする
（ｃ）水溶性である
（ｄ）ｐＨ９．０において、２５℃で３０分間静置後の残存活性が７０％以上である
（ｅ）ｐＨ７．５において、４０℃で６０分間静置後の残存活性が６０％以上である
（ｆ）Ｌ−キヌレニンに特異的に作用し、Ｌ−トリプトファンへの作用性が５％以下である
（ｇ）分子量が４０ｋＤａ〜６０ｋＤａである
（ｈ）フラビンを補酵素とする
［２］ 原核生物がDeltaproteobacteria網、又はXanthomonadales目に属する群より選択される、［１］に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼ。
［３］ 原核生物がPseudoxanthomonas属、Myxococcus属、Dyella属、又はRhodanobacter属に属する群より選択される、［２］に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼ。
［４］ 原核生物がPseudoxanthomonas suwonensis、Myxococcus stipitatus、Dyella japonica及びRhodanobacter denitrificansより選択される、［３］に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼ。
［５］ キヌレニンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列が、配列番号６〜９で示される配列のいずれか１つと９０％以上の類似性を有する配列である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼ。
［６］ ［１］〜［５］のいずれか１項に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼを用いたＬ−キヌレニンの測定方法。
［７］ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体、及びキヌレニンモノオキシゲナーゼを作用させることで、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択される１種以上の変化を測定する、［６］記載のキヌレニンの測定方法。
（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体の減少量
（ｉｉ）ＮＡＤ（Ｐ）＋又はそれらの誘導体の増加量
（ｉｉｉ）３−ヒドロキシキヌレニンの増加量
（ｉｖ）Ｌ−キヌレニンの減少量
［８］ ［１］〜［５］のいずれかに記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼを含むキヌレニン測定キット。
［９］ ｐＨ９．０以上の液体組成物又は液体組成物の乾燥品を含む、［８］記載のキヌレニン測定キット。The present invention relates to the following [1] to [9].
[1] Kynurenine monooxygenase having the following properties (a) to (h).
(A) NAD (P) H or a derivative thereof, and reaction with L-kynurenine in the presence of oxygen produces NAD (P) + or a derivative thereof, and 3-hydroxykynurenine (b) prok. Residual activity after standing at 25 ° C. for 30 minutes at (c) water-soluble (d) pH 9.0 is 70% or more (e) at pH 7.5 for 60 minutes at 40 ° C. The residual activity after standing is 60% or more (f) It acts specifically on L-kynurenine, and the action on L-tryptophan is 5% or less (g) The molecular weight is 40 kDa to 60 kDa (h). ) The kynurenine monooxygenase according to [1], wherein the prokaryotic organism is selected from the group belonging to the Deltaproteobacteria network or the order Xanthomonadales, using flavin as a coenzyme [2].
[3] The kynurenine monooxygenase according to [2], wherein the prokaryote is selected from the group belonging to the genus Pseudoxanthomonas, Myxococcus, Dyella, or Rhodanobacter.
[4] The kynurenine monooxygenase according to [3], wherein the prokaryote is selected from Pseudoxanthomonas suwonensis, Myxococcus stipitatus, Dyella japonica and Rhodanobacter denitrificans.
[5] In any one of [1] to [4], the amino acid sequence of kynurenine monooxygenase is a sequence having 90% or more similarity to any one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 6 to 9. The kynurenine monooxygenase described.
[6] The method for measuring L-kynurenine using the kynurenine monooxygenase according to any one of [1] to [5].
[7] By reacting NAD (P) H or a derivative thereof, and kynurenine monooxygenase, one or more changes selected from the group consisting of the following (i) to (iv) are measured, [6] ] The method for measuring kynurenine described.
(I) Decrease in NAD (P) H or derivatives thereof (ii) Increase in NAD (P) + or derivatives thereof (iii) Increase in 3-hydroxyquinurenine (iv) Decrease in L-kynurenine [ 8] A kynurenine measurement kit containing the kynurenine monooxygenase according to any one of [1] to [5].
[9] The kynurenine measurement kit according to [8], which comprises a liquid composition having a pH of 9.0 or higher or a dried product of the liquid composition.
本発明により、水溶性及び熱安定性を有するキヌレニンモノオキシゲナーゼが得られた。本酵素は水溶性であるため、可溶化を目的として界面活性剤を使用する必要がなく、さらに本酵素は熱に安定であるため、生化学自動分析装置の測定温度である３７℃での測定が可能である。従来酵素を使用した場合は、反応中の熱失活による感度低下が認められるために、測定時に過剰量の酵素を使用する必要があったが、酵素量を低減することができる。さらに本酵素は、ｐＨ安定性（特にアルカリへの耐性）を有しているため、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体と酵素を混合した、ｐＨ９．０以上のキヌレニン測定キットの調製が容易にできる。本酵素はいずれもＬ−キヌレニンに対する基質特異性も高いので、その結果、生体試料中のＬ−キヌレニンの測定が可能である。 According to the present invention, kynurenine monooxygenase having water solubility and thermal stability was obtained. Since this enzyme is water-soluble, it is not necessary to use a surfactant for the purpose of solubilization, and since this enzyme is heat-stable, it is measured at 37 ° C, which is the measurement temperature of an automatic biochemical analyzer. Is possible. When a conventional enzyme is used, a decrease in sensitivity due to heat deactivation during the reaction is observed, so that it is necessary to use an excessive amount of enzyme at the time of measurement, but the amount of enzyme can be reduced. Furthermore, since this enzyme has pH stability (particularly resistance to alkali), it is possible to easily prepare a kynurenine measurement kit having a pH of 9.0 or higher, which is a mixture of NADH, NADPH or a derivative thereof and an enzyme. Since all of these enzymes have high substrate specificity for L-kynurenine, as a result, it is possible to measure L-kynurenine in a biological sample.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
１．キヌレニンモノオキシゲナーゼ
１−１．キヌレニンモノオキシゲナーゼの性質
（ａ）キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼ（以下、本酵素と称することがある）は、Ｌ−キヌレニンを基質とする酸化還元酵素である。本酵素をＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの誘導体、及び酸素の存在下（好気的条件）で、Ｌ−キヌレニンと反応させることで、Ｌ−キヌレニンの酸化反応が起こり、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋又はＮＡＤ（Ｐ）＋誘導体及び３−ヒドロキシキヌレニンが産生される。
なお、以下本明細書において、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨをＮＡＤ（Ｐ）Ｈと、ＮＡＤ＋及びＮＡＤＰ＋をＮＡＤ（Ｐ）＋と総称する。1. 1. Kynurenine monooxygenase 1-1. Properties of kynurenine monooxygenase (a) Kynurenine monooxygenase activity The kynurenine monooxygenase of the present invention (hereinafter, may be referred to as the present enzyme) is an oxidoreductase using L-quinurenin as a substrate. By reacting this enzyme with L-kynurenine in the presence of NADH, NADPH or derivatives thereof, and oxygen (aerobic conditions), an oxidation reaction of L-kynurenine occurs, and NAD + , NADP +, or NAD ( P) + Derivatives and 3-hydroxyquinurenine are produced.
In the present specification, NADH and NADPH are collectively referred to as NAD (P) H, and NAD + and NADP + are collectively referred to as NAD (P) + .
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを触媒とする反応は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びそれらの誘導体から選択される電子供与体の存在下に行われる。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの誘導体とは、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの誘導体であり、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨと同様の電子供与性を有し、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨの安定性向上、モル吸光係数の上昇等のために使用することができる。本発明においては、キヌレニンモノオキシゲナーゼによる反応が進むのであれば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの誘導体の種類は特に限定されず、例えば、チオＮＡＤＨや特開２０１２−２２４６３８号公報で示されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ誘導体等、公知のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ誘導体を使用することができる。 The kynurenine monooxygenase-catalyzed reaction of the present invention is carried out in the presence of an electron donor selected from NAD (P) H and its derivatives. The derivative of NAD (P) H is a derivative of NADH or NADPH, has the same electron donating property as NADH and NADPH, and is used for improving the stability of NADH and NADPH, increasing the molar extinction coefficient, and the like. be able to. In the present invention, the type of the derivative of NAD (P) H is not particularly limited as long as the reaction with quinurenine monooxygenase proceeds, and for example, NAD (P) shown in Thio NADH and JP2012-224638A. Known NAD (P) H derivatives such as H derivatives can be used.
キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性の測定は、例えば、以下の試薬及び条件で行うことができる（「活性測定法１」とする）。測定方法は以下に限定されず、測定に問題がない範囲で適宜試薬及び／又は条件を変更することができる。
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）０．６ｍＬ、７．５ｍＭ ＮＡＤＰＨ溶液０．１ｍＬ、１ｍＭ Ｌ−キヌレニン溶液０．３ｍＬ、超純水１．９５ｍＬを光路長１ｃｍの石英セル内で混合し、３７℃で１０分間加温後、酵素サンプル０．０５ｍＬを添加し、３７℃で反応を開始する。反応開始後から３４０ｎｍの吸光度変化を測定し、１分間あたりの３４０ｎｍの吸光度の減少量（ΔＡｂｓ３４０／分）を測定し、式１に従いキヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を算出する。ＮＡＤＰＨのモル吸光係数は、基質であるキヌレニンも３４０ｎｍで吸収を有していることを考慮して、前述の非特許文献３に従い、６．７［ｍＭ−１ｃｍ−１］で計算することとする。
なお、上記活性測定法１のＮＡＤＰＨ溶液をより安価なＮＡＤＨ溶液に置き換えて測定することも可能である。The kynurenine monooxygenase activity can be measured, for example, with the following reagents and conditions (referred to as "activity measurement method 1"). The measuring method is not limited to the following, and the reagents and / or conditions can be appropriately changed as long as there is no problem in the measurement.
Mix 0.6 mL of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), 0.1 mL of 7.5 mM NADPH solution, 0.3 mL of 1 mM L-kynurenine solution, and 1.95 mL of ultrapure water in a quartz cell with an optical path length of 1 cm. After heating at 37 ° C. for 10 minutes, 0.05 mL of the enzyme sample is added, and the reaction is started at 37 ° C. After the reaction is started, the change in absorbance at 340 nm is measured, the amount of decrease in absorbance at 340 nm per minute (ΔAbs 340 / min) is measured, and the kynurenine monooxygenase activity is calculated according to Formula 1. The molar extinction coefficient of NADPH is calculated at 6.7 [mM -1 cm -1 ] in accordance with Non-Patent Document 3 described above, considering that the substrate kynurenine also has absorption at 340 nm. To do.
It is also possible to replace the NADPH solution of the activity measurement method 1 with a cheaper NADH solution for measurement.
式１中、「３．０」は反応液の液量［ｍＬ］、「６．７」はモル吸光係数［ｍＭ−１ｃｍ−１］、「１．０」は光路長［ｃｍ］、「０．０５」は使用した酵素の液量［ｍＬ］である。In Formula 1, "3.0" is the volume of the reaction solution [mL], "6.7" is the molar extinction coefficient [m M -1 cm -1 ], and "1.0" is the optical path length [cm]. "0.05" is the liquid volume [mL] of the enzyme used.
（ｂ）由来
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、大腸菌、酵母、カビのような微生物を宿主とした組換え微生物での大量生産が可能であり、水溶性を示し、また原核生物に由来するものが好ましい。原核生物由来であれば特に限定されないが、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、原核生物がDeltaproteobacteria網、又はXanthomonadales目に属する群由来のものが好ましく、Pseudoxanthomonas属、Myxococcus属、Dyella属、又はRhodanobacter属に属する微生物に由来することがより好ましい。この中でも、Pseudoxanthomonas suwonensis、Myxococcus stipitatus、Dyella japonica又はRhodanobacter denitrificansがより好ましい。(B) Origin The quinurenin monooxygenase of the present invention can be mass-produced by recombinant microorganisms using microorganisms such as Escherichia coli, yeast, and mold as hosts, shows water solubility, and is derived from prokaryotes. preferable. The quinurenin monooxygenase of the present invention is not particularly limited as long as it is derived from a prokaryote, but the prokaryote is preferably derived from the Deltaproteobacteria network or the group belonging to the order Xanthomonadales, and belongs to the genus Pseudoxanthomonas, Myxococcus, Dyella, or Rhodanobacter. It is more preferably derived from the microorganism to which it belongs. Of these, Pseudoxanthomonas suwonensis, Myxococcus stipitatus, Dyella japonica or Rhodanobacter de nitrificans are more preferred.
（ｃ）水溶性
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、水溶性である。具体的には、培養後の酵素収集において、界面活性剤等による可溶化工程を必要とせず、可溶性画分に酵素タンパクが存在していればよく、好ましくは１ｍＬの水に対する溶解度が、０．１ｍｇ以上であり、より好ましくは１ｍｇ以上である。タンパク濃度の測定方法としては、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を標準物質とし、ブラッドフォード法による比色法により測定が可能である。(C) Water solubility The kynurenine monooxygenase of the present invention is water soluble. Specifically, the enzyme collection after culturing does not require a solubilization step with a surfactant or the like, and the enzyme protein may be present in the soluble fraction, and the solubility in 1 mL of water is preferably 0. It is 1 mg or more, more preferably 1 mg or more. As a method for measuring the protein concentration, BSA (bovine serum albumin) is used as a standard substance, and the protein concentration can be measured by the colorimetric method by the Bradford method.
（ｄ）アルカリ安定性
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼはアルカリ性での安定性を有する。アルカリ溶液中で、２５℃で３０分間静置後の残存キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性が７０％以上である場合に、アルカリ安定性を有する、と判断する。具体的には、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、１．０ｍｇ／ｍＬの酵素をｐＨ９．０又はｐＨ９．５のグリシン−ＮａＯＨ緩衝液及び２５℃の条件において３０分間静置した後の残存活性が、処理前の酵素活性を１００％とした場合にそれぞれ７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上である。(D) Alkaline stability The kynurenine monooxygenase of the present invention has alkaline stability. When the residual kynurenine monooxygenase activity after standing at 25 ° C. for 30 minutes in an alkaline solution is 70% or more, it is judged to have alkaline stability. Specifically, the quinurenin monooxygenase of the present invention has a residual activity after allowing a 1.0 mg / mL enzyme to stand in a glycine-NaOH buffer solution having a pH of 9.0 or 9.5 and a temperature of 25 ° C. for 30 minutes. When the enzyme activity before treatment is 100%, it is 70% or more, preferably 75% or more, and more preferably 80% or more, respectively.
（ｅ）熱安定性
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは熱安定性を有する。４０℃で６０分間静置後の残存キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性が７０％以上である場合に、温度安定性を有する、と判断する。具体的には、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、１．０ｍｇ／ｍＬの酵素をｐＨ７．５のリン酸カリウム緩衝液及び４０℃の条件において６０分間静置した後の残存活性が、処理前の酵素活性を１００％とした場合に６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、更に好ましくは８０％以上である。(E) Thermal stability The kynurenine monooxygenase of the present invention has thermal stability. When the residual kynurenine monooxygenase activity after standing at 40 ° C. for 60 minutes is 70% or more, it is judged to have temperature stability. Specifically, the quinurenin monooxygenase of the present invention has a residual activity after allowing a 1.0 mg / mL enzyme to stand in a potassium phosphate buffer solution having a pH of 7.5 and a temperature of 40 ° C. for 60 minutes before the treatment. When the enzyme activity is 100%, it is 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 75% or more, and further preferably 80% or more.
（ｆ）基質特異性
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、基質特異性に優れている。例えば、Ｌ−キヌレニンに対する反応性に対して、少なくともＬ−トリプトファンに対する反応性が低い。生体試料においては、Ｌ−トリプトファンはＬ−キヌレニンの前駆体であり、さらにＬ−トリプトファンの含有量はＬ−キヌレニンよりも多量であることが一般的であり、トリプトファンへの反応性も高い酵素だとキヌレニンの測定に正確を期すことが困難なことがある。本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、Ｌ−トリプトファンに比べてＬ−キヌレニンへの特異性が高いことから、Ｌ−トリプトファンが共存する場合であっても、Ｌ−キヌレニン量又は濃度を正確に測定することが可能である。具体的には、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、活性測定法１に従い、Ｌ−キヌレニン、及びＬ−キヌレニンをＬ−トリプトファン又はＤ−キヌレニン（Ｌ−キヌレニンの光学異性体）に変えてそれぞれ測定すると、Ｌ−トリプトファンに対する反応性がＬ−キヌレニンに対する反応性に対して５％以下であり、好ましくは２．５％以下であり、より好ましくは１％以下である。また、Ｄ−キヌレニンに対する反応性がＬ−キヌレニンに対する反応性に対して２０％以下であり、より好ましくは１５％以下であり、さらに好ましくは６％以下である。(F) Substrate specificity The kynurenine monooxygenase of the present invention has excellent substrate specificity. For example, the reactivity with L-kynurenine is low at least with respect to L-tryptophan. In biological samples, L-tryptophan is a precursor of L-kynurenine, and the content of L-tryptophan is generally higher than that of L-kynurenine, and it is an enzyme with high reactivity to tryptophan. And it can be difficult to ensure accurate measurement of kynurenine. Since the kynurenine monooxygenase of the present invention has higher specificity for L-kynurenine than L-tryptophan, the amount or concentration of L-kynurenine should be accurately measured even when L-tryptophan coexists. Is possible. Specifically, the kynurenine monooxygenase of the present invention is measured by changing L-kynurenine and L-kynurenine to L-tryptophan or D-kynurenine (optical isomer of L-kynurenine) according to the activity measurement method 1. , The reactivity to L-tryptophan is 5% or less, preferably 2.5% or less, and more preferably 1% or less with respect to the reactivity to L-kynurenine. The reactivity with D-kynurenine is 20% or less, more preferably 15% or less, still more preferably 6% or less with respect to the reactivity with L-kynurenine.
（ｇ）分子量
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを構成するポリペプチド部分の分子量は、好ましくは４０〜６０ｋＤａであり、より好ましくは４５〜５５ｋＤａであり、さらに好ましくは５０〜５２ｋＤａである。(G) Molecular Weight The molecular weight of the polypeptide moiety constituting the kynurenine monooxygenase of the present invention is preferably 40 to 60 kDa, more preferably 45 to 55 kDa, and further preferably 50 to 52 kDa.
「ポリペプチド部分」とは、実質的に糖鎖が結合していない状態のキヌレニンモノオキシゲナーゼを意味する。ポリペプチド部分の分子量は、クローニングされたキヌレニンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列から計算により求めることができる。クローニングされていないキヌレニンモノオキシゲナーゼであって、微生物によって生産された本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼが糖鎖結合型である場合は、それを熱処理や糖加水分解酵素によって処理することにより、糖鎖を除去した状態（すなわち、「ポリペプチド部分」）にし、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量を測定することができる。実質的に糖鎖が結合していない状態とは、熱処理や糖加水分解酵素によって処理された糖鎖結合型キヌレニンモノオキシゲナーゼに不可避的に残存する糖鎖の存在を許容する。よって、キヌレニンモノオキシゲナーゼが本来的に糖鎖結合型でない場合は、それ自体が「ポリペプチド部分」に相当する。 The "polypeptide moiety" means a kynurenine monooxygenase in a state in which sugar chains are not substantially bound. The molecular weight of the polypeptide moiety can be calculated from the amino acid sequence of the cloned kynurenine monooxygenase. If the quinurenine monooxygenase that has not been cloned and the quinurenine monooxygenase of the present invention produced by a microorganism is a sugar chain-bound type, the sugar chain is removed by treating it with heat treatment or a sugar hydrolase. The molecular weight can be measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis in the state (that is, the "polypeptide moiety"). The state in which the sugar chains are not substantially bound allows the presence of sugar chains that inevitably remain in the sugar chain-bound quinurenin monooxygenase treated by heat treatment or a sugar hydrolase. Therefore, when kynurenine monooxygenase is not inherently sugar chain-bound, it itself corresponds to a "polypeptide moiety".
糖鎖結合型キヌレニンモノオキシゲナーゼから糖鎖を除去する手段は、特に制限されないが、例えば、糖鎖結合型のキヌレニンモノオキシゲナーゼを１００℃で１０分間加熱処理をして変性させた後、Ｎ−グリコシダーゼＦ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて３７℃で６時間処理することにより実施することができる。 The means for removing the sugar chain from the sugar chain-bound kynurenine monooxygenase is not particularly limited. For example, the sugar chain-linked kynurenine monooxygenase is denatured by heat treatment at 100 ° C. for 10 minutes and then N-glycosidase It can be carried out by treating at 37 ° C. for 6 hours using F (manufactured by Roche Diagnostics).
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼに糖鎖が結合している場合、その分子量は、キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性、基質特異性、及びＬ−キヌレニンに対する親和性などにネガティブに影響しない限り特に制限されない。例えば、糖鎖が結合した状態の本発明キヌレニンの分子量は、５０〜９０ｋＤａであることが好ましい。糖鎖結合型のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、酵素をより安定にするという観点及び水溶性を高めるという観点から好ましい。 When a sugar chain is bound to the kynurenine monooxygenase of the present invention, its molecular weight is not particularly limited as long as it does not negatively affect the kynurenine monooxygenase activity, substrate specificity, affinity for L-kynurenine, and the like. For example, the molecular weight of the kynurenine of the present invention in a state where sugar chains are bound is preferably 50 to 90 kDa. The sugar chain-bound kynurenine monooxygenase is preferable from the viewpoint of making the enzyme more stable and increasing water solubility.
（ｈ）補酵素
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは好ましくは、フラビンを補酵素とする、フラビン結合型の酵素である。(H) Coenzyme The quinurenin monooxygenase of the present invention is preferably a flavin-binding enzyme having flavin as a coenzyme.
その他、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼの酵素特性としては、至適ｐＨ、至適温度も挙げられる。概ね以下の範囲内であるが、本発明においては、本範囲に制限されないものとする。 In addition, the enzyme properties of the kynurenine monooxygenase of the present invention include the optimum pH and the optimum temperature. Although it is generally within the following range, it is not limited to this range in the present invention.
・至適ｐＨ
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼの至適ｐＨは、ｐＨ６．２〜８．８の範囲内である。本明細書において、至適ｐＨは、酵素終濃度を０．０５Ｕ／ｍＬとし、複数のｐＨを示す緩衝液（酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０〜５．０）、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０〜６．０）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．０〜９．０）又はグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５〜９．５））を用いて、後述の活性測定法２で酵素活性を測定することで求める。各緩衝液中で測定した内の一番高い活性値を１００％とした場合に、９０％以上の活性値を示すｐＨ範囲を至適ｐＨとする。・ Optimal pH
The optimum pH of the kynurenine monooxygenase of the present invention is in the range of pH 6.2 to 8.8. In the present specification, the optimum pH is a buffer solution (sodium acetate-sodium acetate buffer solution (pH 4.0 to 5.0), sodium citrate buffer solution) having a final enzyme concentration of 0.05 U / mL and showing a plurality of pH solutions. (PH 5.0-6.0), potassium phosphate buffer (pH 6.0-8.0), TAPS buffer (pH 8.0-9.0) or glycine-NaOH buffer (pH 8.5-9. It is obtained by measuring the enzyme activity by the activity measuring method 2 described later using 5)). When the highest activity value measured in each buffer solution is 100%, the pH range showing an activity value of 90% or more is set as the optimum pH.
・至適温度
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼの至適温度は、３５〜４５℃の範囲内である。本明細書において、至適温度は、酵素終濃度０．２５Ｕ／ｍＬとし、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中における各温度での酵素活性を前述の活性測定法１で測定、比較することにより求める。Optimal temperature The optimum temperature of the kynurenine monooxygenase of the present invention is in the range of 35 to 45 ° C. In the present specification, the optimum temperature is an enzyme final concentration of 0.25 U / mL, and the enzyme activity at each temperature in a potassium phosphate buffer solution (pH 7.5) is measured and compared by the above-mentioned activity measurement method 1. Obtained by.
１−２．キヌレニンモノオキシゲナーゼのポリペプチド
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、上記（ａ）〜（ｈ）の特性を示すポリペプチドであるか、及び／又は、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかのポリペプチドであれば、特に制限されない。
（Ｉ）配列番号６〜９によって示されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ＩＩ）配列番号６〜９によって示されるいずれか１つのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位したアミノ酸配列からなり、キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチド；
（ＩＩＩ）配列番号６〜９に示されるいずれか１つのアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列からなり、キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチド。1-2. Polypeptide of Kynurenine Monooxygenase The kynurenine monooxygenase of the present invention is a polypeptide exhibiting the above-mentioned characteristics (a) to (h) and / or any of the following (I) to (III) polypeptides. If so, there is no particular limitation.
(I) A polypeptide consisting of any one of the amino acid sequences set forth by SEQ ID NOs: 6-9;
(II) In any one of the amino acid sequences shown by SEQ ID NOs: 6 to 9, one or several amino acids consist of a residue substitution, deletion, insertion, addition and / or inverted amino acid sequence. Polypeptide with oxygenase activity;
(III) A polypeptide consisting of an amino acid sequence homologous to any one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 6 to 9 and having kynurenine monooxygenase activity.
「数個」とは、キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸数の１０％未満の個数であり、より好ましくは５％未満の個数、更に好ましくは２％未満の個数である。例えば、好ましくは多くとも４５個、４０個、３０個、２０個、１０個又は５個と例示できる。 The “several” is not limited as long as the kynurenine monooxygenase activity is maintained, but is, for example, less than 10% of the total number of amino acids, more preferably less than 5%, still more preferably less than 2%. It is the number. For example, preferably, at most 45, 40, 30, 20, 10, or 5 can be exemplified.
アミノ酸の置換の種類は、特に制限されないが、キヌレニンモノオキシゲナーゼの表現型に顕著な影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。また、一又は数個の変異は、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法など公知の手法を利用して、後述する本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼをコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。 The type of amino acid substitution is not particularly limited, but conservative amino acid substitution is preferable from the viewpoint of not significantly affecting the phenotype of kynurenine monooxygenase. In addition, one or several mutations can be obtained by introducing mutations into the DNA encoding the kynurenine monooxygenase of the present invention, which will be described later, by using a known method such as a position-designated mutation introduction method or a random mutation introduction method. It is possible to carry out.
キヌレニンモノオキシゲナーゼの活性を維持するという観点からは、キヌレニンモノオキシゲナーゼの活性部位又は基質結合部位に影響を与えない程度に、機能性を付与するような配列の付加や、Ｎ末端、Ｃ末端又は、任意の配列の内、少なくとも１つを削除してもよい。なお、これらの処理によって、（ｇ）で示す分子量の範囲を逸脱する場合、付加又は削除前の分子量が（ｇ）の範囲であるのなら、本発明の「ポリペプチド部分」と同等とみなすことができる。 From the viewpoint of maintaining the activity of quinurenine monooxygenase, addition of a sequence that imparts functionality to the extent that it does not affect the active site or substrate binding site of quinurenine monooxygenase, or N-terminal, C-terminal, or At least one of the arbitrary sequences may be deleted. In addition, when these treatments deviate from the range of the molecular weight shown in (g), if the molecular weight before addition or deletion is in the range of (g), it shall be regarded as equivalent to the "polypeptide moiety" of the present invention. Can be done.
「相同性を有するアミノ酸配列」とは、類似性が好ましくは少なくとも９０％又は９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列であること、又は同一性が好ましくは少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％又は９９％のアミノ酸配列であることを意味する。 The "amino acid sequence having homology" is preferably an amino acid sequence having a similarity of at least 90% or 95%, more preferably at least 96%, 97%, 98% or 99%, or preferably an identity. Means that the amino acid sequence is at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% or 99%.
類似性は、表１のスコア表（ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）の説明書 ｐ．２２０ Ａ．１８ ホモロジースコア表 Ａ．１８．２ アミノ酸、参考文献：Atlas of Protein Sequence and Structure Vol.5 (1978)）を用いて、アライメント時にスコアが０以上になる文字数÷アライメント長で算出された値である。配列解析ソフトである、ＧＥＮＥＴＹＸ（（登録商標）、株式会社ゼネティックス製）を用いて算出できる。詳細には、該ソフトを初期設定で使用し、アミノ酸配列同士のホモロジー解析を行い、Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙとして算出される。
同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸを初期設定で使用し、アミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたｉｄｅｎｔｉｔｙの値に基づく。The similarity is described in the score table of Table 1 (GENETYX (registered trademark) description p.220 A.18 homology score table A.18.2 amino acids, reference: Atlas of Protein Sequence and Structure Vol.5 (1978)). Is a value calculated by dividing the number of characters whose score becomes 0 or more at the time of alignment by the alignment length. It can be calculated using GENETYX ((registered trademark), manufactured by Genetics Co., Ltd.), which is sequence analysis software. Specifically, the software is used in the initial setting, homology analysis between amino acid sequences is performed, and calculation is performed as Simularity.
Identity is based on identity values calculated by homology analysis of amino acid sequences using GENETYX by default.
２．キヌレニンモノオキシゲナーゼの取得方法
２−１．キヌレニンモノオキシゲナーゼをコードするＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記（ａ）〜（ｈ）の特性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡであるか、及び／又は、下記の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのＤＮＡである。
（Ａ）前記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２〜５に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２〜５に示される塩基配列との同一性が７０％以上である塩基配列からなり、かつキヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２〜５に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含み、かつキヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２〜５に示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列であり、かつキヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。2. 2. Acquisition method of kynurenine monooxygenase 2-1. DNA encoding kynurenine monooxygenase
The DNA of the present invention is a DNA encoding a polypeptide exhibiting the above-mentioned characteristics (a) to (h), and / or a DNA according to any one of the following (A) to (E).
(A) DNA encoding the amino acid sequence according to (I) to (III) above;
(B) DNA consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 5;
(C) A DNA encoding a polypeptide having a base sequence having 70% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NOs: 2 to 5 and having kynurenine monooxygenase activity;
(D) DNA comprising a DNA that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NOs: 2 to 5 and encoding a polypeptide having kynurenine monooxygenase activity;
(E) In the base sequence shown in SEQ ID NOs: 2 to 5, one or several bases are substituted, deleted, inserted, added and / or inverted, and have kynurenine monooxygenase activity. DNA encoding a polypeptide.
本明細書のキヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡは、そのアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。したがって、コドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれる。本発明のＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質は、キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有する。本発明のＤＮＡは、配列番号２〜５に示される塩基配列との同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９８％以上である塩基配列を有する。 The DNA encoding an enzyme having kynurenine monooxygenase activity as used herein refers to a DNA having a base sequence corresponding to the amino acid sequence. Therefore, DNA that differs depending on the codon decompression is also included. The protein having the amino acid sequence encoded by the DNA of the present invention has kynurenine monooxygenase activity. The DNA of the present invention has an identity of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, still more preferably 98, with the base sequence shown in SEQ ID NOs: 2 to 5. It has a base sequence of% or more.
塩基配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸの塩基配列同士のホモロジー解析により算出されたｉｄｅｎｔｉｔｙの値に基づく。 The identity of the base sequences is based on the identity value calculated by homology analysis between the base sequences of GENETYX.
本発明のＤＮＡは、それがコードするタンパク質が前記キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有する限り、配列番号２〜５に示される塩基配列のいずれかに相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。ここで「ストリンジェントな条件下でのハイブリダイズ」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。 The DNA of the present invention hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to any of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 5, as long as the protein it encodes has the kynurenine monooxygenase activity. It may be DNA to hybridize. Here, "hybridization under stringent conditions" refers to a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
具体的な条件としては、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．２）、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’s）溶液、０．１％ ＳＤＳ、１０％ デキストラン硫酸及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡの溶液を４２℃インキュベーションした後、バックグラウンド除去のために、０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄する条件を例示することができる。 Specific conditions include, for example, 50% formamide, 5 × SSC (150 mM sodium chloride, 15 mM trisodium citrate, 10 mM sodium phosphate, 1 mM ethylenediamine tetraacetic acid, pH 7.2), 5 × denhardt's solution, and the like. Illustrates the conditions under which a solution of 0.1% SDS, 10% dextran sulfate and 100 μg / mL denatured salmon sperm DNA is incubated at 42 ° C. and then washed at 42 ° C. in 0.2 × SSC for background removal. be able to.
前記（Ｅ）のＤＮＡに関し、「数個」とは前記「１−２．キヌレニンモノオキシゲナーゼのポリペプチド」の項に記載したものと同義である。 With respect to the DNA of (E), "several" are synonymous with those described in the section "1-2. Polypeptide of kynurenine monooxygenase".
本発明のＤＮＡは、配列番号２〜５の配列情報を基に、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などにより取得することができるが、化学的ＤＮＡ合成法によっても取得することができる。 The DNA of the present invention can be obtained by a standard genetic engineering method, molecular biological method, biochemical method, etc. based on the sequence information of SEQ ID NOs: 2 to 5, but it is a chemical DNA synthesis method. Can also be obtained by.
標準的な遺伝子工学的手法としては、具体的には、スクリーニングによりキヌレニンモノオキシゲナーゼを産生していると思われる適当な起源微生物を選定した後、それら起源微生物の染色体ＤＮＡを抽出し、本発明のＤＮＡ配列（例えば、配列番号２〜５の塩基配列）に特有の適当なプライマーを使用し、ＰＣＲなどにより目的のＤＮＡを取得する手法を指す。 As a standard genetic engineering method, specifically, after selecting appropriate origin microorganisms that are thought to produce quinurenin monooxygenase by screening, the chromosomal DNA of those origin microorganisms is extracted, and the chromosomal DNA of those origin microorganisms is extracted. It refers to a method of obtaining a target DNA by PCR or the like using an appropriate primer peculiar to a DNA sequence (for example, the base sequence of SEQ ID NOs: 2 to 5).
なお、増幅させたＤＮＡ断片の単離精製は、例えばゲル電気泳動法や市販の精製キットを用いることで可能である。 The amplified DNA fragment can be isolated and purified, for example, by using a gel electrophoresis method or a commercially available purification kit.
本発明のＤＮＡを使用することにより、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを容易に大量に、安定して製造することができる。 By using the DNA of the present invention, the kynurenine monooxygenase of the present invention can be easily and stably produced in a large amount.
２−２．キヌレニンモノオキシゲナーゼ生産株の取得
２−１で取得したＤＮＡを、公知の方法に従い、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、真菌（酵母、アスペルギルス属などの子嚢菌、担子菌等）、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞などに導入することで、生産株を取得することができる。本発明において、生産株については特に制限されないが、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは原核生物由来であるので、大腸菌の宿主／ベクター系で発現させるのが一般的である。2-2. Acquisition of kynurenine monooxygenase producing strain
Prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, fungi (ascomycetes such as yeast and Aspergillus spp. A production strain can be obtained by introducing it into cells or the like. In the present invention, the production strain is not particularly limited, but since the quinurenin monooxygenase of the present invention is derived from a prokaryote, it is generally expressed in an Escherichia coli host / vector system.
大腸菌の宿主／ベクター系としては、公知のpUC系、pBluescriptII、pET発現システム、pGEX発現システム、pCold発現システムなどが例示できる。また、必要に応じて、シャペロンやリゾチームなどの共発現を行うことも可能である。本発明においては、宿主としては、E.coli JM109、E.coli BL21(DE3)、ベクターとしては、pUC系又はpET系のプラスミドが好ましい。 Examples of the Escherichia coli host / vector system include known pUC systems, pBluescriptII, pET expression systems, pGEX expression systems, and pCold expression systems. It is also possible to co-express chaperone, lysozyme, etc., if necessary. In the present invention, the host is preferably E. coli JM109, E. coli BL21 (DE3), and the vector is preferably a pUC-based or pET-based plasmid.
なお、その他の宿主／ベクター系としては、宿主が酵母の場合は、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Candida utilis、Pichia pastoris等が例として挙げられ、ベクターとしてはpAUR101、pAUR224、pYES2等が挙げられる。宿主がカビである場合は、例えば、Aspergillus oryzae，Aspergillus niger等を例示することができる。 Examples of other host / vector systems include Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida utilis, Pichia pastoris and the like when the host is yeast, and pAUR101, pAUR224, pYES2 and the like as vectors. When the host is mold, for example, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger and the like can be exemplified.
本発明のＤＮＡの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、本発明のＤＮＡを含むベクターを、宿主細胞に導入し、本発明のＤＮＡが導入された形質転換体を得ることで、キヌレニンモノオキシゲナーゼの生産菌株を取得することができる。宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現してキヌレニンモノオキシゲナーゼを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。大腸菌の場合は、市販のコンピテントセルを使用することで容易に形質転換が可能である。 The means for introducing the DNA of the present invention into the host is not particularly limited. For example, quinurenin can be obtained by introducing a vector containing the DNA of the present invention into a host cell to obtain a transformant into which the DNA of the present invention has been introduced. A strain producing monooxygenase can be obtained. The host cell is not particularly limited as long as it can express the DNA of the present invention to produce kynurenine monooxygenase. Specifically, prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, eukaryotic cells such as yeast, mold, insect cells, and mammalian cells can be used. In the case of Escherichia coli, transformation can be easily performed by using a commercially available competent cell.
本発明の形質転換体は、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを産生する能力を有するため、それを用いて効率的に本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを製造することが可能となる。 Since the transformant of the present invention has the ability to produce the kynurenine monooxygenase of the present invention, it is possible to efficiently produce the kynurenine monooxygenase of the present invention using it.
２−３．キヌレニンモノオキシゲナーゼの製造方法
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼの生産能を有する微生物や細胞を培養することによって製造することができる。培養に供される微生物や細胞は、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを産生する能力を有する限り特に制限されないが、例えば、前記アミノ酸配列６〜９をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号２〜５の塩基配列）を用いて形質転換した組換え大腸菌を好適に利用することができる。2-3. Method for Producing Kynurenine Monooxygenase The quinurenine monooxygenase of the present invention can be produced by culturing a microorganism or cell capable of producing the quinurenine monooxygenase of the present invention. The microorganism or cell to be cultured is not particularly limited as long as it has the ability to produce the quinurenin monooxygenase of the present invention, but for example, the DNA encoding the amino acid sequences 6 to 9 (for example, the bases of SEQ ID NOs: 2 to 5). Recombinant Escherichia coli transformed with the sequence) can be preferably used.
培養法及び培養条件は、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼが生産される限り特に限定されない。すなわち、キヌレニンモノオキシゲナーゼが生産されることを条件として、使用する微生物や細胞の生育に適合した方法及び条件を適宜設定できる。以下に、微生物の培養条件として、培地、培養温度、及び培養時間を例示する。 The culturing method and culturing conditions are not particularly limited as long as the kynurenine monooxygenase of the present invention is produced. That is, on condition that kynurenine monooxygenase is produced, a method and conditions suitable for the growth of the microorganism or cell to be used can be appropriately set. Below, the culture medium, the culture temperature, and the culture time are exemplified as the culture conditions of the microorganism.
培地としては、通常の微生物培養用培地が使用でき、炭素源、窒素源、ビタミン類、無機物、その他使用する微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地のいずれも使用可能である。炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜などが使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機塩類、ＤＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカーなどの窒素含有天然物が使用できる。ビタミン類としては、リボフラビン、ピリドキシン、ナイアシン（ニコチン酸）、チアミンなどが使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用できる。さらに、タンパク質の発現の調整に必要な化合物、例えばイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）や乳糖等を適宜添加してもよい。 As the medium, a normal medium for culturing microorganisms can be used, and if it contains a carbon source, a nitrogen source, vitamins, inorganic substances, and other micronutrients required by the microorganism to be used, a synthetic medium or a natural medium can be used. Both can be used. As the carbon source, glucose, sucrose, lactose, dextrin, starch, glycerin, molasses and the like can be used. Nitrogen sources include inorganic salts such as ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium sulfate and ammonium phosphate, amino acids such as DL-alanine and L-glutamic acid, and nitrogen such as peptone, meat extract, yeast extract, malt extract and corn steep liquor. Natural products can be used. As vitamins, riboflavin, pyridoxine, niacin (nicotinic acid), thiamine and the like can be used. As the inorganic substance, monosodium phosphate, disodium phosphate, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, ferric chloride and the like can be used. Furthermore, compounds necessary for regulating protein expression, such as isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG) and lactose, may be appropriately added.
培養条件としては、キヌレニンモノオキシゲナーゼの生産に適した培養条件であれば特に限定されないが、培養温度は１０℃から４５℃、かつｐＨ５からｐＨ１０の範囲で行うのが好ましい。培養期間は回分培養であれば、１日から８日以内の範囲が好ましいが、流加培養や連続培養による生産量増大を行うのであれば、生産性が最適と判断される範囲で期間を延ばすことができる。また、培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。 The culture conditions are not particularly limited as long as they are suitable for the production of kynurenine monooxygenase, but the culture temperature is preferably in the range of 10 ° C. to 45 ° C. and pH 5 to pH 10. In the case of batch culture, the culture period is preferably in the range of 1 to 8 days, but in the case of increasing the production amount by fed-batch culture or continuous culture, the period is extended within the range where productivity is judged to be optimal. be able to. Further, as the culture method, for example, a shaking culture method and an aerobic deep culture method using a jar fermenter can be used.
培養物中からキヌレニンモノオキシゲナーゼを得る方法は、通常のタンパク質の精製方法が使用できる。キヌレニンモノオキシゲナーゼが菌体内にある場合は、生産菌を培養後、培養液を遠心分離して培養微生物を得たのち、適当な方法で該培養微生物を破砕及び／又は溶菌処理し、処理液から遠心分離などによって上清液を得ることで、また、キヌレニンモノオキシゲナーゼが培地中に分泌されている場合は、生産菌を培養後、培養液を遠心分離して上清液を得ることで、それぞれ粗酵素液を取得することができる。 As a method for obtaining kynurenine monooxygenase from the culture, a usual protein purification method can be used. When quinurenin monooxygenase is present in the cells, after culturing the producing bacteria, the culture medium is centrifuged to obtain a culture microorganism, and then the culture microorganism is crushed and / or lysed by an appropriate method, and the culture medium is used from the treatment liquid. Obtain the supernatant by centrifugation, etc., and if quinurenin monooxygenase is secreted in the medium, culture the producing bacteria and then centrifuge the culture to obtain the supernatant. A crude enzyme solution can be obtained.
これらの粗酵素液に含まれるキヌレニンモノオキシゲナーゼは、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、熱処理、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィーなどの適当な精製操作を組み合わせることによって精製できる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。 The quinurenin monooxygenase contained in these crude enzyme solutions is subjected to appropriate purification operations such as ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, heat treatment, dialysis, ion exchange chromatography, hydrophobic adsorption chromatography, gel filtration, and affinity chromatography. It can be purified by combining. The purified enzyme preparation is preferably purified to the extent that it shows a single band by electrophoresis (SDS-PAGE).
本酵素を組換えタンパク質として得る場合、種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドやタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、Ｎ末端やＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化及び／又は生物学的機能の付加等が可能である。 When this enzyme is obtained as a recombinant protein, various modifications are possible. For example, if the DNA encoding this enzyme and another suitable DNA are inserted into the same vector and a recombinant protein is produced using the vector, it will consist of a recombinant protein to which any peptide or protein is linked. This enzyme can be obtained. Further, modifications may be made so as to add sugar chains and / or lipids and to process the N-terminal and C-terminal. With the above modifications, it is possible to extract the recombinant protein, simplify the purification and / or add a biological function.
３．キヌレニンモノオキシゲナーゼを使用したキヌレニンの測定方法
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを用いたキヌレニンの測定方法は、当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを用いて、各種試料中のキヌレニンの量又は濃度を測定することができる。本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体の存在下、Ｌ−キヌレニンと反応させることによって、ＮＡＤ（Ｐ）＋又はそれらの誘導体及び３−ヒドロキシキヌレニンが産生される。この反応における物質の増減をモニタすることにより、Ｌ−キヌレニンの量又は濃度を測定することができる。その態様は特に制限されないが、例えば、
（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体の減少量、
（ｉｉ）ＮＡＤ（Ｐ）＋又はそれらの誘導体の増加量、
（ｉｉｉ）３−ヒドロキシキヌレニンの増加量、又は
（ｉｖ）Ｌ−キヌレニンの減少量
を測定することにより、キヌレニンの量又は濃度を測定することができる。3. 3. Kynurenine Measurement Method Using Kynurenine Monooxygenase The method for measuring kynurenine using the kynurenine monooxygenase of the present invention has been established in the art. Therefore, according to a known method, the amount or concentration of kynurenine in various samples can be measured using the kynurenine monooxygenase of the present invention. By reacting the kynurenine monooxygenase of the present invention with L-kynurenine in the presence of NAD (P) H or a derivative thereof, NAD (P) + or a derivative thereof and 3-hydroxykynurenine are produced. By monitoring the increase or decrease of substances in this reaction, the amount or concentration of L-kynurenine can be measured. The mode is not particularly limited, but for example,
(I) Reduction of NAD (P) H or its derivatives,
(Ii) Increased amount of NAD (P) + or derivatives thereof,
The amount or concentration of kynurenine can be measured by measuring the amount of increase in (iii) 3-hydroxykynurenine or the amount of decrease in (iv) L-kynurenine.
本発明における、キヌレニンの量又は濃度の測定は、試料に本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを添加することにより実施することができる。キヌレニンを含有する試料は、特に制限されないが、例えば、体液（例えば、血液、尿、唾液等）、飲料、食品等を挙げることができる。 The measurement of the amount or concentration of kynurenine in the present invention can be carried out by adding the kynurenine monooxygenase of the present invention to a sample. The sample containing kynurenine is not particularly limited, and examples thereof include body fluids (for example, blood, urine, saliva, etc.), beverages, foods, and the like.
（ｉ）キヌレニンモノオキシゲナーゼ（ＫＭＯ）を触媒として、Ｌ−キヌレニンが酸化され、それに伴い、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体が減少する。このＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体の減少量を測定することにより、Ｌ−キヌレニンの測定を行うことができる。具体的には、Ｌ−キヌレニンを含む試料に対して、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体を含む緩衝液（ｐＨ５〜１０）を混合し、ＫＭＯを加えることによる、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸収極大波長（３４０ｎｍ）における吸光度の減少量を測定することによって行うことができる。又は、更にＮＡＤ（Ｐ）Ｈを高感度で測定する反応を組み合わせてもよく、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに対しテトラゾリウム塩と電荷キャリアを混合し生成した物質の吸光度の減少量を測定するという手法、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに対しレサズリンとジアホラーゼを混合し生成した物質の減少量を蛍光測定するという手法、又は化学発光や電気化学的検出が可能な試薬類と混合して測定するという手法があげられる。 (I) Kynurenine Monooxygenase (KMO) catalyzes the oxidation of L-kynurenine, which in turn reduces NAD (P) H or its derivatives. L-kynurenine can be measured by measuring the amount of decrease in NAD (P) H or a derivative thereof. Specifically, absorption of NAD (P) H by mixing a buffer solution (pH 5 to 10) containing NAD (P) H or a derivative thereof with a sample containing L-kynurenine and adding KMO. This can be done by measuring the amount of decrease in absorbance at the maximum wavelength (340 nm). Alternatively, a reaction for measuring NAD (P) H with high sensitivity may be combined, and for example, the amount of decrease in the absorbance of the substance produced by mixing the tetrazolium salt and the charge carrier with NAD (P) H is measured. The method, the method of measuring the decrease in the amount of the substance produced by mixing resazurin and diaholase with NAD (P) H by fluorescence, or the method of measuring by mixing with reagents capable of chemiluminescence or electrochemical detection. can give.
（ｉｉ）キヌレニンモノオキシゲナーゼを触媒として、キヌレニンが酸化され、それに伴い、電子供与体であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体よりＮＡＤ（Ｐ）＋又はＮＡＤ（Ｐ）＋誘導体が生成する。この増加量を測定することにより、キヌレニンの測定を行うことができる。具体的には、（ｉｉ−１）ＮＡＤ（Ｐ）＋又はＮＡＤ（Ｐ）＋誘導体に由来する蛍光測定、又は（ｉｉ−２）酵素サイクリング法で行うことができる。(Ii) Kynurenine is oxidized with quinurenine monooxygenase as a catalyst, and NAD (P) + or NAD (P) + derivative is produced from the electron donor NAD (P) H or a derivative thereof. By measuring this amount of increase, kynurenine can be measured. Specifically, it can be carried out by fluorescence measurement derived from (ii-1) NAD (P) + or NAD (P) + derivative, or (ii-2) enzyme cycling method.
（ｉｉ−１）ＮＡＤ（Ｐ）＋又はＮＡＤ（Ｐ）＋誘導体に由来する蛍光測定は、公知文献（Chem Commun (Camb). 2013, 49(98):11500-2）に記載の方法によって行うことができる。具体的には、ＮＡＤ（Ｐ）＋とアセトフェノン、２−アセチルベンゾフランなどを反応させ、生じた蛍光物質を蛍光で測定することができる（文献中の表２）。
（ｉｉ−２）酵素サイクリング法は、例えば、特許文献１の実施例４に記載の方法に準じて行うことができる。(Ii-1) Fluorescence measurement derived from NAD (P) + or NAD (P) + derivative is carried out by the method described in a publicly known document (Chem Commun (Camb). 2013, 49 (98): 11500-2). be able to. Specifically, NAD (P) + can be reacted with acetophenone, 2-acetylbenzofuran, or the like, and the resulting fluorescent substance can be measured by fluorescence (Table 2 in the literature).
(Ii-2) The enzyme cycling method can be performed according to, for example, the method described in Example 4 of Patent Document 1.
（ｉｉｉ）キヌレニンモノオキシゲナーゼは、キヌレニンを酸化して３−ヒドロキシキヌレニンを生成する。この３−ヒドロキシキヌレニンの増加量を測定することにより、キヌレニンの測定を行うことができる。具体的には、例えば、特許文献１の実施例３に記載の方法に準じて行うことができる。 (Iii) Kynurenine monooxygenase oxidizes kynurenine to produce 3-hydroxykynurenine. Kynurenine can be measured by measuring the amount of increase in 3-hydroxyquinurenine. Specifically, for example, it can be performed according to the method described in Example 3 of Patent Document 1.
（ｉｖ）Ｌ−キヌレニンが酸化されることにより、３−ヒドロキシキヌレニンが生成し、基質であるＬ−キヌレニンの量が減少する。このＬ−キヌレニンの減少量を測定することにより、Ｌ−キヌレニンの測定を行うことができる。Ｌ−キヌレニンの減少量は、Ｌ−キヌレニンの蛍光を測定することによって行うことができる（臨床化学、1975、第３巻、第４号、426-434）。Ｌ−キヌレニンは３７０ｎｍで励起され、４９０ｎｍの蛍光を出す。一方、Ｌ−キヌレニンの代謝物である３−ヒドロキシキヌレニンは蛍光を発しないため蛍光の減少量からＬ−キヌレニン濃度を推定することができる。 (Iv) Oxidation of L-kynurenine produces 3-hydroxykynurenine, which reduces the amount of substrate L-kynurenine. By measuring the amount of this decrease in L-kynurenine, L-kynurenine can be measured. The amount of decrease in L-kynurenine can be determined by measuring the fluorescence of L-kynurenine (Clinical Chemistry, 1975, Vol. 3, No. 4, 426-434). L-kynurenine is excited at 370 nm and fluoresces at 490 nm. On the other hand, 3-hydroxykynurenine, which is a biotransformer of L-kynurenine, does not emit fluorescence, so that the L-kynurenine concentration can be estimated from the amount of decrease in fluorescence.
Ｌ−キヌレニンの測定条件は、ｐＨ、温度、反応時間など用いられる試薬の安定性やキヌレニンモノオキシゲナーゼや併せて使用する酵素の至適反応条件、及び／又は想定される測定環境に応じて適宜設定することができる。例えば、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼの安定性を鑑み、２０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃、更に好ましくは３０〜４０℃の温度で、ｐＨ５．０〜１０．０、好ましくはｐＨ６．０〜９．０の範囲内で、０．５分〜１時間、好ましくは１分間〜３０分間反応に付すことによって行うことができる。 The measurement conditions for L-kynurenine are appropriately set according to the stability of the reagents used such as pH, temperature, reaction time, the optimum reaction conditions for the kynurenine monooxygenase and the enzyme used in combination, and / or the assumed measurement environment. can do. For example, in view of the stability of the kynurenine monooxygenase of the present invention, the temperature is 20 to 50 ° C., preferably 25 to 45 ° C., more preferably 30 to 40 ° C., pH 5.0 to 10.0, preferably pH 6.0. It can be carried out by subjecting to the reaction in the range of ~ 9.0 for 0.5 minutes to 1 hour, preferably 1 minute to 30 minutes.
生体試料の測定では、測定に支障となる可能性のある還元物質、夾雑蛋白質、金属イオン等の少なくとも１つを公知の方法で除去する前処理工程を含んでも良い。還元物質としては例えば、ビリルビン、尿酸や還元型アスコルビン酸等が挙げられる。例えば、ビリルビンの低減のための前処理工程としてビリルビンオキシダーゼによる処理が挙げられ、尿酸の低減のための前処理工程としてウリカーゼによる処理が挙げられ、又アスコルビン酸の低減のための前処理工程としてアスコルビン酸オキシダーゼによる処理等が挙げられる。さらに、過酸化水素やペルオキシダーゼによる処理も行うことができる。夾雑蛋白質は例えば、過塩素酸やトリクロロ酢酸等の除蛋白剤で低減することができる。金属イオンは、例えば、金属キレート剤で低減することができる。金属キレート剤は特に限定されないが、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）、ＣｙＤＴＡ（トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−四酢酸）等が好適に用いられる。 The measurement of the biological sample may include a pretreatment step of removing at least one of a reducing substance, a contaminating protein, a metal ion and the like which may interfere with the measurement by a known method. Examples of the reducing substance include bilirubin, uric acid, reduced ascorbic acid and the like. For example, a pretreatment step for reducing bilirubin includes treatment with bilirubin oxidase, a pretreatment step for reducing uric acid includes treatment with uricase, and a pretreatment step for reducing ascorbic acid is ascorbic acid. Treatment with acid oxidase and the like can be mentioned. Furthermore, treatment with hydrogen peroxide or peroxidase can also be performed. Contaminated proteins can be reduced with, for example, a deproteinizing agent such as perchloric acid or trichloroacetic acid. Metal ions can be reduced, for example, with a metal chelating agent. The metal chelating agent is not particularly limited, but is EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), bicine (N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine), DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid), CyDTA (trans-1,2-diaminocyclohexane-). N, N, N, N-tetraacetic acid) and the like are preferably used.
本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、トリプトファンに対するキヌレニンへの選択性が高いため、必ずしも必要ではないが、より正確な測定のために、任意で試料中の夾雑物の影響を実質的に除いてもよい。例えば、一般に生体試料中のＬ−トリプトファン濃度は、Ｌ−キヌレニン濃度の１０〜１００倍程度と考えられるため、Ｌ−トリプトファンのＬ−キヌレニン測定への影響を抑えることが好ましい。 The kynurenine monooxygenase of the present invention is not necessarily necessary due to its high selectivity for kynurenine for tryptophan, but for more accurate measurement, the effect of impurities in the sample may be substantially eliminated. .. For example, since the concentration of L-tryptophan in a biological sample is generally considered to be about 10 to 100 times the concentration of L-kynurenine, it is preferable to suppress the influence of L-tryptophan on the measurement of L-kynurenine.
Ｌ−トリプトファンの影響を低減する場合は、Ｌ−トリプトファンに作用する酵素を用いて、試料中のＬ−トリプトファンを低減する工程を含む、Ｌ−キヌレニンの測定方法が好ましい。該工程は、キヌレニンモノオキシゲナーゼによる反応に先立ち、前処理として行うのが好ましい。Ｌ−トリプトファン低減工程のため、Ｌ−トリプトファンに作用する酵素を使用することが好ましい。Ｌ−トリプトファンに作用する酵素は、Ｌ−キヌレニンに実質的に作用しない酵素が好ましく、トリプトファンオキシダーゼやトリプトファナーゼ等が例示できる。トリプトファンオキシダーゼはカタラーゼと組み合わせて使用するのが好ましい。 When reducing the influence of L-tryptophan, a method for measuring L-kynurenine, which comprises a step of reducing L-tryptophan in a sample by using an enzyme acting on L-tryptophan, is preferable. The step is preferably performed as a pretreatment prior to the reaction with kynurenine monooxygenase. For the L-tryptophan reduction step, it is preferable to use an enzyme that acts on L-tryptophan. The enzyme that acts on L-tryptophan is preferably an enzyme that does not substantially act on L-kynurenine, and examples thereof include tryptophan oxidase and tryptophanase. Tryptophan oxidase is preferably used in combination with catalase.
酵素使用量は、Ｌ−トリプトファン量を低減できれば特に限定されないが、トリプトファンオキシダーゼの場合、試料中の濃度が０．１〜１００Ｕ／ｍＬ程度であることが好ましく、１〜１０Ｕ／ｍＬ程度であることがより好ましい。トリプトファンオキシダーゼにカタラーゼを組み合わせる場合、試料中の濃度が０．１〜１０，０００Ｕ／ｍＬ程度であることが好ましく、１〜１，０００Ｕ／ｍＬ程度であることがより好ましい。トリプトファナーゼの場合、試料中の濃度が０．０１〜１０Ｕ／ｍＬ程度であることが好ましく、０．１〜２Ｕ／ｍＬ程度であることがより好ましい。 The amount of enzyme used is not particularly limited as long as the amount of L-tryptophan can be reduced, but in the case of tryptophan oxidase, the concentration in the sample is preferably about 0.1 to 100 U / mL, and is about 1 to 10 U / mL. Is more preferable. When catalase is combined with tryptophan oxidase, the concentration in the sample is preferably about 0.1 to 10,000 U / mL, more preferably about 1 to 1,000 U / mL. In the case of tryptophanase, the concentration in the sample is preferably about 0.01 to 10 U / mL, more preferably about 0.1 to 2 U / mL.
４．キヌレニン測定キット
本発明はまた、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼを含む測定キットに関する。典型的には、キットの組成物は、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼに加えて、緩衝液、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈ誘導体からなる群から選択される電子供与体を含む。好ましくは、少なくとも１回の測定に十分な量のキヌレニンモノオキシゲナーゼを含んでいればよいが、１試料当り０．００１から２００Ｕ程度が好ましく、０．０５から５０Ｕ程度がより好ましい。また、本発明のキヌレニン測定キットの組成物は、保存又はキヌレニンの測定に適した溶液（例えば、緩衝液）中に溶解した組成物の状態、又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）であるのが望ましい。4. Kynurenine Measurement Kit The present invention also relates to a measurement kit containing the kynurenine monooxygenase of the present invention. Typically, the composition of the kit comprises, in addition to the kynurenine monooxygenase of the invention, an electron donor selected from the group consisting of buffers, NAD (P) H and NAD (P) H derivatives. Preferably, a sufficient amount of kynurenine monooxygenase may be contained for at least one measurement, but it is preferably about 0.001 to 200 U, more preferably about 0.05 to 50 U per sample. In addition, the composition of the kynurenine measurement kit of the present invention is in the state of a composition dissolved in a solution (for example, a buffer solution) suitable for storage or measurement of kynurenine, or in a lyophilized state (for example, powder). It is desirable to have it.
本発明のキヌレニン測定キットは、キヌレニンの測定を行うための試薬として用いることができる。なお、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨはｐＨ８．０以下において分解されやすいことから、本キットの組成物を液体状態で保持する場合には、弱アルカリ性、例えばｐＨ８．５以上が好ましく、ｐＨ９．０以上であることがより好ましく、ｐＨ９．５以上であることが更に好ましい。また、緩衝液としては、ｐＨを弱アルカリ領域に調整できれば特に制限されないが、例えば、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（２−シクロへキシルアミノエタンスルホン酸）、グリシン−ＮａＯＨ、炭酸−炭酸水素ナトリウムなどを用いることができる。 The kynurenine measurement kit of the present invention can be used as a reagent for measuring kynurenine. Since NADH and NADPH are easily decomposed at pH 8.0 or lower, when the composition of this kit is kept in a liquid state, it is preferably weakly alkaline, for example, pH 8.5 or higher, and pH 9.0 or higher. Is more preferable, and the pH is more preferably 9.5 or more. The buffer solution is not particularly limited as long as the pH can be adjusted to a weak alkaline region. For example, TAPS (N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic acid) and CHES (2-cyclohexylaminoethane). Sulfonic acid), glycine-NaOH, carbonate-sodium hydrogen carbonate and the like can be used.
また、キヌレニンモノオキシゲナーゼ、緩衝液及び電子供与体以外の組成物として、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、糖類（例えば、トレハロースなど）若しくは糖アルコール類（例えば、マルチトール、ソルビトール、グリセロールなど）、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩、酵素と反応しないアミノ酸類、フラビン類又はタンパク質等から成る群より選ばれる安定化剤又は抗酸化剤等、当業者に公知の安定化成分を適宜含有させることで、該酵素や試薬成分の熱安定性や保存安定性を高めることができる。また、前記安定化剤やその他物質を、反応性、特異性、乾燥性及び／又は溶解性等を向上又は改善する目的で、前記試薬組成物に使用することもできる。 In addition, as compositions other than quinurenin monooxygenase, buffer solution and electron donor, for example, bovine serum albumin (BSA) or ovalbumin, sugar (for example, trehalose, etc.) or sugar alcohols (for example, martitol, sorbitol, glycerol) Etc.), carboxyl group-containing compounds, alkaline earth metal compounds, ammonium salts, sulfates, amino acids that do not react with enzymes, flavins, proteins, etc., stabilizers or antioxidants selected from the group, etc. By appropriately containing a known stabilizing component, the thermal stability and storage stability of the enzyme or reagent component can be enhanced. Further, the stabilizer and other substances can also be used in the reagent composition for the purpose of improving or improving reactivity, specificity, dryness and / or solubility and the like.
本発明を以下の実施例により説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。 The present invention will be described with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.
実施例１
キヌレニンモノオキシゲナーゼの取得
原核生物に対するスクリーニングにより、キヌレニンモノオキシゲナーゼを産生する種々の菌株を選定した。各菌株の染色体ＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うなどして、キヌレニンモノオキシゲナーゼ（ＫＭＯ）活性を有すると思われる複数の遺伝子（配列番号２〜５のＤＮＡ配列）をそれぞれ取得した。なお、前記ＰＣＲには、本発明者らによって別途解明していたＫＭＯ配列を基に設計したプライマーを使用した。配列番号２はPseudoxanthomonas suwonensis（P.suwと略す）、配列番号３はMyxococcus stipitatus（M.stiと略す）、配列番号４はDyella japonica（D.japと略す）、配列番号５はRhodanobacter denitrificans（R.denと略す）由来のＤＮＡ配列である。なお、比較例として、特許文献１に従い、公知のPseudomonas fluorescence（P.fluと略す）由来のアミノ酸配列（配列番号１）をコードする遺伝子も取得した。各遺伝子をpET-21a(+)ベクターに挿入後、得られたベクターを各々大腸菌BL21(DE3）コンピテントセル（バイオダイナミクス研究所社製）に導入して、各組換え大腸菌を取得した。各組換え大腸菌をＬＢ培地で培養して得られた菌体を各々破砕後、遠心して得られた上清を硫安分画及びイオン交換クロマトグラフィーに供し、水溶性の各精製酵素を取得した。各精製酵素を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、ほぼ単一バンドまで精製されたことを確認した。さらに、前述の活性測定法１で記載した、キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性測定法により、いずれの精製酵素もキヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を有することを確認した。Example 1
Acquisition of kynurenine monooxygenase Various strains producing kynurenine monooxygenase were selected by screening for prokaryotes. Chromosome DNA of each strain was extracted, and PCR was performed using the DNA as a template to obtain a plurality of genes (DNA sequences of SEQ ID NOs: 2 to 5) which are considered to have kynurenine monooxygenase (KMO) activity. .. For the PCR, a primer designed based on the KMO sequence separately elucidated by the present inventors was used. SEQ ID NO: 2 is Pseudoxanthomonas suwonensis (abbreviated as P.suw), SEQ ID NO: 3 is Myxococcus stipitatus (abbreviated as M.sti), SEQ ID NO: 4 is Dyella japonica (abbreviated as D.jap), and SEQ ID NO: 5 is Rhodanobacter denitrificans (R). It is a DNA sequence derived from (abbreviated as .den). As a comparative example, a gene encoding a known amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) derived from Pseudomonas fluorescence (abbreviated as P.flu) was also obtained in accordance with Patent Document 1. After inserting each gene into the pET-21a (+) vector, each of the obtained vectors was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) competent cells (manufactured by Biodynamics Research Institute) to obtain each recombinant Escherichia coli. The cells obtained by culturing each recombinant Escherichia coli in an LB medium were crushed, and the supernatant obtained by centrifugation was subjected to ammonium sulfate fractionation and ion exchange chromatography to obtain water-soluble purified enzymes. Each purified enzyme was subjected to electrophoresis (SDS-PAGE), and it was confirmed that the product was purified to almost a single band. Furthermore, it was confirmed that all the purified enzymes had kynurenine monooxygenase activity by the kynurenine monooxygenase activity measuring method described in the above-mentioned activity measuring method 1.
その結果、P.suw、M.sti、D.jap及びR.den由来の４種の新規キヌレニンモノオキシゲナーゼの大腸菌組換え酵素、並びに特許文献１記載のP.flu由来のキヌレニンモノオキシゲナーゼの大腸菌組換え酵素を取得することができた（以下、それぞれP.suw由来ＫＭＯ、M.sti由来ＫＭＯ、D.jap由来ＫＭＯ及びR.den由来ＫＭＯ、並びにP.flu由来ＫＭＯとする）。なお、P.suw由来ＫＭＯは配列番号６、M.sti由来ＫＭＯは配列番号７、D.jap由来ＫＭＯは配列番号８及びR.den由来ＫＭＯは配列番号９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有している。最終的に得られた新規ＫＭＯ溶液のタンパク濃度は、それぞれ７．４、６．３、６．０、及び１．７ｍｇ／ｍＬであった。また活性測定の際に、電子供与体にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを使用した場合で比較すると、活性比（ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ）は、P.suw由来ＫＭＯは１．５、M.sti由来ＫＭＯは１．０、P.flu、D.jap及びR.den由来ＫＭＯは０．５であり、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを適宜選択できることが分かった。 As a result, four novel kynurenine monooxygenase Escherichia coli recombinant enzymes derived from P.suw, M.sti, D.jap and R.den, and an Escherichia coli set of P.flu-derived kynurenine monooxygenase described in Patent Document 1 A recombinant enzyme could be obtained (hereinafter referred to as P.suw-derived KMO, M.sti-derived KMO, D.jap-derived KMO, R.den-derived KMO, and P.flu-derived KMO, respectively). The P.suw-derived KMO has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, the M.sti-derived KMO has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, the D.jap-derived KMO has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, and the R.den-derived KMO has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9. ing. The protein concentrations of the finally obtained novel KMO solution were 7.4, 6.3, 6.0, and 1.7 mg / mL, respectively. In addition, when NADH or NADPH was used as the electron donor in the activity measurement, the activity ratio (NADH / NADPH) was 1.5 for P.suw-derived KMO and 1.0 for M.sti-derived KMO. , P.flu, D.jap and R.den-derived KMO was 0.5, and it was found that NADH or NADPH could be appropriately selected.
実施例２
キヌレニンモノオキシゲナーゼの特性評価１
（１）熱安定性
前記のP.suw由来ＫＭＯ、M.sti由来ＫＭＯ、D.jap由来ＫＭＯ及びR.den由来ＫＭＯ、並びにP.flu由来ＫＭＯを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）存在下、４０℃で６０分間加熱し、前述の活性測定法１で記載した、キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性測定法により加熱処理後の酵素溶液の残存活性を評価した。残存活性は４℃で６０分間静置した酵素の活性を１００％としたときの相対値として得た。結果は表２に示す通りであった。Example 2
Characterization of kynurenine monooxygenase 1
(1) Thermal stability 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing the above-mentioned P.suw-derived KMO, M.sti-derived KMO, D.jap-derived KMO and R.den-derived KMO, and P.flu-derived KMO. In the presence, the mixture was heated at 40 ° C. for 60 minutes, and the residual activity of the enzyme solution after the heat treatment was evaluated by the quinurenin monooxygenase activity measurement method described in the above-mentioned activity measurement method 1. The residual activity was obtained as a relative value when the activity of the enzyme left at 4 ° C. for 60 minutes was taken as 100%. The results are as shown in Table 2.
P.flu由来ＫＭＯは４０℃、１時間の加温により活性が大幅に減少したのに対し、本発明の新規ＫＭＯは全て、１時間後でも活性を保持していた。 The activity of P.flu-derived KMO was significantly reduced by heating at 40 ° C. for 1 hour, whereas all the novel KMOs of the present invention retained their activity even after 1 hour.
（２）基質特異性
各ＫＭＯの基質特異性を評価した。キヌレニンモノオキシゲナーゼ活性の測定を行うための試薬及び条件は、前述の活性測定法１で記載した通りである。(2) Substrate specificity The substrate specificity of each KMO was evaluated. The reagents and conditions for measuring the kynurenine monooxygenase activity are as described in the above-mentioned activity measurement method 1.
このうち、基質のＬ−キヌレニンをそれぞれ、Ｌ−トリプトファン、Ｄ−キヌレニンに変えて測定した。Ｌ−キヌレニンの作用性を１００％としたときの、Ｌ−トリプトファン及びＤ−キヌレニンへの作用性は表３に示す通りであった。 Of these, the substrate L-kynurenine was changed to L-tryptophan and D-kynurenine, respectively, and the measurement was performed. The activity on L-tryptophan and D-kynurenine when the activity of L-kynurenine was 100% was as shown in Table 3.
（３）分子量
各酵素の分子量を、配列番号６〜９に記載のアミノ酸配列のアミノ酸組成から算出した。本結果は表４に示す通りであった。(3) Molecular Weight The molecular weight of each enzyme was calculated from the amino acid composition of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 6 to 9. The results are as shown in Table 4.
（４）ｐＨ安定性（アルカリへの耐性）
タンパク濃度１ｍｇ／ｍＬの各ＫＭＯを、２００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０又はｐＨ９．５）の存在下、２５℃で３０分間処理した。３０分経過後に、１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈しｐＨを中性に戻した。その後、前述の活性測定法１で記載した方法でキヌレニンモノオキシゲナーゼ活性を測定した。残存活性は処理開始時の酵素の活性を１００％とした場合の相対値として得た。結果は表５に示す通りであった。(4) pH stability (resistance to alkali)
Each KMO with a protein concentration of 1 mg / mL was treated at 25 ° C. for 30 minutes in the presence of 200 mM glycine-NaOH buffer (pH 9.0 or pH 9.5). After 30 minutes, the pH was returned to neutral by diluting with 1M potassium phosphate buffer (pH 7.5). Then, the kynurenine monooxygenase activity was measured by the method described in the above-mentioned activity measurement method 1. The residual activity was obtained as a relative value when the activity of the enzyme at the start of the treatment was 100%. The results are as shown in Table 5.
以上より、本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼは、いずれも、ｐＨ９．０又はｐＨ９．５という、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を安定に保持することが可能なアルカリ条件下において、公知のP.flu由来のキヌレニンモノオキシゲナーゼよりも高い安定性を有することが明らかになった。 From the above, all of the kynurenine monooxygenases of the present invention are derived from known P.flu under alkaline conditions such as pH 9.0 or pH 9.5, which can stably retain NAD (P) Hs. It was found to have higher stability than kynurenine monooxygenase.
（５）補酵素
各ＫＭＯに対し分光光度計による２００−７００ｎｍにおける吸収スペクトルを測定した。その結果、ＦＡＤに由来する特徴的なスペクトルが得られたこと、及び配列番号６〜９に記載のアミノ酸配列がいずれもＦＡＤ酵素のコンセンサス配列であるＧＸＧＸＸＧを含んでいることから、本発明のＫＭＯはいずれもＦＡＤが補酵素であると判断した（Ｇはグリシン、Ｘは任意のアミノ酸を指す）。(5) Coenzyme The absorption spectrum of each KMO at 200-700 nm was measured by a spectrophotometer. As a result, a characteristic spectrum derived from FAD was obtained, and since the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 6 to 9 all contain GXGXXXXG, which is a consensus sequence of FAD enzyme, the KMO of the present invention was obtained. Judged that FAD is a coenzyme (G refers to glycine and X refers to any amino acid).
実施例３
ＫＭＯを使用したＬ−キヌレニン濃度の測定
Ｌ−キヌレニンを含む試料に対して、ＫＭＯを作用させ、ＮＡＤＰＨの減少量（３４０ｎｍの吸光度の減少量）から試料中のＬ−キヌレニン濃度を測定した。１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）０．６ｍＬ、３ｍＭ ＮＡＤＰＨ溶液０．１ｍＬ、Ｌ−キヌレニン溶液０．３ｍＬ、超純水１．９５ｍＬを光路長１ｃｍの石英セル中で混合した。このとき、添加するＬ−キヌレニン溶液の濃度を５０μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭにし、またＬ−キヌレニンの代わりに超純水を加えたサンプルも用意した。３７℃で１０分間加温後、３４０ｎｍの吸光度を測定しブランク値とした。３Ｕ／ｍＬのＫＭＯ酵素又は超純水０．０５ｍＬを添加し、１分後の３４０ｎｍの吸光度を測定し、得られた値から対応するブランク値を差し引いた（測定値Ａ）。Ｌ−キヌレニンを含まない試料の測定値Ａから、各Ｌ−キヌレニン濃度の測定値Ａを差し引いた（測定値Ｂ）。Ｘ軸にＬ−キヌレニン（L-Kyn）濃度、Ｙ軸に測定値Ｂ（ΔＡｂｓ３４０）をプロットして検量線を作成した。Example 3
Measurement of L-Kynurenine Concentration Using KMO KMO was allowed to act on a sample containing L-kynurenine, and the L-kynurenine concentration in the sample was measured from the amount of decrease in NADPH (the amount of decrease in absorbance at 340 nm). 0.6 mL of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), 0.1 mL of 3 mM NADPH solution, 0.3 mL of L-kynurenine solution, and 1.95 mL of ultrapure water were mixed in a quartz cell having an optical path length of 1 cm. At this time, the concentrations of the L-kynurenine solution to be added were set to 50 μM, 100 μM, 150 μM, and 200 μM, and a sample in which ultrapure water was added instead of L-kynurenine was also prepared. After heating at 37 ° C. for 10 minutes, the absorbance at 340 nm was measured and used as a blank value. 3 U / mL KMO enzyme or 0.05 mL of ultrapure water was added, the absorbance at 340 nm after 1 minute was measured, and the corresponding blank value was subtracted from the obtained value (measured value A). The measured value A of each L-kynurenine concentration was subtracted from the measured value A of the sample containing no L-kynurenine (measured value B). A calibration curve was prepared by plotting the L-kynurenine (L-Kyn) concentration on the X-axis and the measured value B (ΔAbs340) on the Y-axis.
その結果、図１に示すように、比較例のP.flu由来ＫＭＯを使用した場合に比べて、本発明のＫＭＯを使用した場合には、いずれも傾きが高くなっていた（参考にΔＡｂｓ３４０の数値データを表６に示す）。なお、P.flu由来ＫＭＯに関しては、図１又は表６には示していないが、活性として２倍量のＫＭＯを使用することで、本発明のＫＭＯと同じような結果が得られた。すなわち、従来のＫＭＯが反応中に失活していたのに対し、本発明のＫＭＯは熱安定性が高いために失活しないことによって、反応性が約２倍になっており、本発明のＫＭＯを使用することで、従来のＫＭＯに比べてより少ない酵素量での測定が可能になることが分かった。 As a result, as shown in FIG. 1, the inclination was higher when the KMO of the present invention was used as compared with the case where the P.flu-derived KMO of the comparative example was used (for reference, ΔAbs340). Numerical data are shown in Table 6). Although the P.flu-derived KMO is not shown in FIG. 1 or Table 6, the same result as the KMO of the present invention was obtained by using twice the amount of KMO as the activity. That is, while the conventional KMO was inactivated during the reaction, the KMO of the present invention is not inactivated due to its high thermal stability, so that the reactivity is about doubled. It was found that the use of KMO enables measurement with a smaller amount of enzyme than the conventional KMO.
実施例４
キヌレニン測定キットの調製
ＫＭＯ終濃度０．５Ｕ／ｍＬ、ＮＡＤＰＨ終濃度２５０μＭ、５０ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）からなる溶液を調製することで、キヌレニン測定キットを取得した。本キットに対し、測定用の緩衝液及び試料を混合し、３７℃で反応させた結果、反応液中の３４０ｎｍの吸光度変化が認められ、試料中のキヌレニン濃度の測定が可能であることが分かった。
また、本溶液を凍結乾燥することで、乾燥物としてキヌレニン測定キットを取得することができた。Example 4
Preparation of kynurenine measurement kit A kynurenine measurement kit was obtained by preparing a solution consisting of KMO final concentration 0.5 U / mL, NADPH final concentration 250 μM, and 50 mM glycine-NaOH buffer (pH 9.0). As a result of mixing the buffer solution for measurement and the sample with this kit and reacting at 37 ° C., a change in absorbance at 340 nm in the reaction solution was observed, and it was found that the kynurenine concentration in the sample can be measured. It was.
In addition, by freeze-drying this solution, a kynurenine measurement kit could be obtained as a dried product.
実施例５
キヌレニンモノオキシゲナーゼの特性評価２
実施例１で取得したキヌレニンモノオキシゲナーゼについて、酵素の至適温度及び至適ｐＨを測定した。Example 5
Characterization of kynurenine monooxygenase 2
For the kynurenine monooxygenase obtained in Example 1, the optimum temperature and the optimum pH of the enzyme were measured.
至適温度は、酵素終濃度０．２５Ｕ／ｍＬとし、前述の活性測定法１に記載のキヌレニンモノオキシゲナーゼ活性測定法により測定、比較し、求めることとした。測定温度を種々変化させて、活性値が最も高い温度を至適温度とした。P.flu 由来ＫＭＯは、２５、３０、３５及び４０℃で評価し、それ以外のＫＭＯは、２５、３７及び４５℃で評価した。その結果を表７に示す。至適温度は３５〜４５℃の範囲内であった。 The optimum temperature was set to an enzyme final concentration of 0.25 U / mL, and it was determined by measuring, comparing, and determining by the kynurenine monooxygenase activity measuring method described in the above-mentioned activity measuring method 1. The measurement temperature was variously changed, and the temperature having the highest activity value was set as the optimum temperature. P.flu-derived KMOs were evaluated at 25, 30, 35 and 40 ° C, and other KMOs were evaluated at 25, 37 and 45 ° C. The results are shown in Table 7. The optimum temperature was in the range of 35 to 45 ° C.
至適ｐＨは、マイクロプレートを用いて測定を行った。ｐＨの異なる１Ｍの緩衝液（酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０、４．５、５．０）、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０、５．５、６．０）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０）、ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．０、８．５、９．０）又はグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５、９．０、９．５））を用いて８０ｍＭの各緩衝液を調製し、酵素反応液に使用した。マイクロプレートに、８０ｍＭの各ｐＨの緩衝液５０μＬと、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、０．８ｍＭ Ｌ−キヌレニンからなる溶液５０μＬを混合した後に０．１Ｕ／ｍＬの酵素溶液１００μＬを混合し、２５℃で５分間反応させた。酵素反応により生じたヒドロキシキヌレニンを測定するため、反応液から５０μＬをサンプリングし、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、０．８ｍＭフェリシアン化カリウムからなる溶液５０μＬと混合した。速やかに発色するので、発色後直ちに４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ３８４、モレキュラーデバイス社製）にて測定した。２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、０．８ｍＭ フェリシアン化カリウムからなる溶液の４５０ｎｍの吸光度をブランクとし、その値を差し引いた値で活性の評価をした（「活性測定法２」とする）。なお、酵素反応液のｐＨをｐＨ計で測定し、その測定値を実際のｐＨとした。各酵素の測定において、一番高い活性値を１００％とした場合に、９０％以上の活性値を示すｐＨ範囲を至適ｐＨとした。本発明のキヌレニンモノオキシゲナーゼの至適ｐＨは６．２〜８．８の範囲内であり、それぞれの酵素の至適ｐＨは表７の通りであった。また、各酵素において一番高い活性値を示したｐＨも併せて示した。 The optimum pH was measured using a microplate. 1M buffer solution with different pH (sodium acetate-sodium acetate buffer (pH 4.0, 4.5, 5.0), sodium citrate buffer (pH 5.0, 5.5, 6.0), potassium phosphate) Buffer solution (pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0), TAPS buffer solution (pH 8.0, 8.5, 9.0) or glycine-NaOH buffer solution (pH 8.5). , 9.0, 9.5))) were used to prepare 80 mM buffers and used as the enzyme reaction solution. A microplate is mixed with 50 μL of 80 mM buffer of each pH, 50 μL of a solution consisting of 1 mM NADPH and 0.8 mM L-kynurenine, and then 100 μL of 0.1 U / mL enzyme solution is mixed and reacted at 25 ° C. for 5 minutes. I let you. To measure hydroxyquinurenin produced by the enzymatic reaction, 50 μL was sampled from the reaction solution and mixed with 50 μL of a solution consisting of 200 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) and 0.8 mM potassium ferricyanide. Since the color develops rapidly, the absorbance at 450 nm was measured immediately after the color development with a plate reader (SpectraMax Plus384, manufactured by Molecular Devices). The absorbance at 450 nm of a solution consisting of 200 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) and 0.8 mM potassium ferricyanide was used as a blank, and the value obtained by subtracting the absorbance was used to evaluate the activity (referred to as “activity measurement method 2”). .. The pH of the enzyme reaction solution was measured with a pH meter, and the measured value was taken as the actual pH. In the measurement of each enzyme, when the highest activity value was 100%, the pH range showing an activity value of 90% or more was defined as the optimum pH. The optimum pH of the kynurenine monooxygenase of the present invention was in the range of 6.2 to 8.8, and the optimum pH of each enzyme was shown in Table 7. In addition, the pH showing the highest activity value for each enzyme is also shown.
Claims (9)
（ａ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体、及び酸素存在下で、Ｌ−キヌレニンと反応させることで、ＮＡＤ（Ｐ）＋又はそれらの誘導体、及び３−ヒドロキシキヌレニンを産生する
（ｂ）原核生物を由来とする
（ｃ）水溶性である
（ｄ）ｐＨ９．０において、２５℃で３０分間静置後の残存活性が７０％以上である
（ｅ）ｐＨ７．５において、４０℃で６０分間静置後の残存活性が６０％以上である
（ｆ）Ｌ−キヌレニンに特異的に作用し、Ｌ−トリプトファンへの作用性が５％以下である
（ｇ）分子量が４０ｋＤａ〜６０ｋＤａである
（ｈ）フラビンを補酵素とするKynurenine monooxygenase having the following properties (a) to (h).
(A) NAD (P) H or its derivatives, and reaction with L-kynurenine in the presence of oxygen to produce NAD (P) + or its derivatives, and 3-hydroxykynurenine (b) prok. Residual activity after standing at 25 ° C. for 30 minutes at (c) water-soluble (d) pH 9.0 is 70% or more (e) at pH 7.5 for 60 minutes at 40 ° C. The residual activity after standing is 60% or more (f) It acts specifically on L-kynurenine, and the activity on L-tryptophan is 5% or less (g) The molecular weight is 40 kDa to 60 kDa (h). ) Flavin as a coenzyme
（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はそれらの誘導体の減少量
（ｉｉ）ＮＡＤ（Ｐ）＋又はそれらの誘導体の増加量
（ｉｉｉ）３−ヒドロキシキヌレニンの増加量
（ｉｖ）Ｌ−キヌレニンの減少量The sixth aspect of claim 6, wherein by allowing NAD (P) H or a derivative thereof and kynurenine monooxygenase to act, one or more changes selected from the group consisting of the following (i) to (iv) are measured. How to measure kynurenine.
(I) Decrease in NAD (P) H or its derivatives (ii) Increase in NAD (P) + or its derivatives (iii) Increase in 3-hydroxyquinurenine (iv) Decrease in L-kynurenine
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