JPWO2019133677A5 - - Google Patents

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JPWO2019133677A5
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本明細書に引用される出願公開、特許出願、及び特許を含む全ての参照文献は、各参照文献が参照によって組み込まれるよう個々に及び具体的に示され、その全体が本明細書に示されているような場合と同じ程度、参照によって本明細書に組み込まれる。
最後に、本発明の好ましい実施態様を項分け記載する。
［実施態様１］
［実施態様１］
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する方法であって、
（ａ）ＡＡＶ含有溶液を、ＡＡＶを標的としたアフィニティ樹脂上に、前記溶液中の前記ＡＡＶと前記アフィニティ樹脂との間の結合を可能にする伝導下でロードすることと、
（ｂ）少なくとも２つの洗浄ステップを行うことと、
（ｃ）前記ＡＡＶを前記アフィニティ樹脂から溶出させることと、
を含む、方法。
［実施態様２］
前記ＡＡＶ含有溶液を前記アフィニティ樹脂にロードする前に、前記ＡＡＶ含有溶液を陰イオン交換体と接触させることと、前記陰イオン交換体から前記ＡＡＶ含有溶液を溶出させることと、をさらに含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
前記洗浄ステップのうちの少なくとも１つが、有機溶媒または界面活性剤を含む緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様４］
前記緩衝液がＴｒｉｓＨＣｌ及び塩を含む、実施態様３に記載の方法。
［実施態様５］
前記緩衝液が、ヒスチジン、ヒスチジン－ＨＣｌ、アルギニン－ＨＣｌ、リジン－ＨＣｌ、グリシン、タウリン、ＭＥＳ－Ｎａ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、及びＮ－アセチル－Ｄ，Ｌ－トリプトファンのうちの１つ以上を含む、実施態様３に記載の方法。
［実施態様６］
前記塩がＮａＣｌである、実施態様４または実施態様５に記載の方法。
［実施態様７］
前記緩衝液が酢酸ナトリウムを含む、実施態様３に記載の方法。
［実施態様８］
前記緩衝液が塩化マグネシウムを含む、実施態様３に記載の方法。
［実施態様９］
前記緩衝液がＴｒｉｓＨＣｌ及びエチレングリコールを含む、実施態様３に記載の方法。
［実施態様１０］
前記緩衝液が、アルギニン－ＨＣｌならびにスクロース及びグリセロールのうちの１つを含む、実施態様３に記載の方法。
［実施態様１１］
前記緩衝液がタウリン及びエチレングリコールを含む、実施態様３に記載の方法。
［実施態様１２］
前記緩衝液が、アルギニン－ＨＣｌ、リジン－ＨＣｌ、及びヒスチジン－ＨＣｌを含む、実施態様３に記載の方法。
［実施態様１３］
前記緩衝液がＴｒｉｓＨＣｌ及びＤＭＳＯを含む、実施態様３に記載の方法。
［実施態様１４］
少なくとも３つの洗浄ステップが実行される、実施態様１に記載の方法。
［実施態様１５］
３つの洗浄ステップが実行される、実施態様８に記載の方法。
［実施態様１６］
前記３つの洗浄ステップが連続して実行される、実施態様９に記載の方法。
［実施態様１７］
前記有機溶媒または界面活性剤が、ポリソルベート８０、エチレングリコール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、ＤＭＳＯ、スクロース、またはトレハロースである、実施態様３に記載の方法。
［実施態様１８］
前記界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ポリソルベート８０、及びトリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）のうちの１つ以上を含む、実施態様１７に記載の方法。
［実施態様１９］
前記緩衝液がＢｉｓ－Ｔｒｉｓを含む、実施態様１８に記載の方法。
［実施態様２０］
第１の洗浄ステップが、約５０～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．０５～約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液が約５．２～約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップが、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５～約５００ｍＭの塩を含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液が約７．５～約９．２のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップが、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約３０～約７５体積％のエチレングリコールを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液が約７．３～約８．８のｐＨを有する、実施態様１５または実施態様１６に記載の方法。
［実施態様２１］
第１の洗浄ステップが、約５０～約５００ｍＭの２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ－Ｎａ）のナトリウム塩と、約３～約３０ｍＭのＥＤＴＡと、ポリソルベート８０、ＤＭＳＯ、及びトリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む溶媒／界面活性剤混合物と、を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液が約５．２～約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップが、約３０～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌまたはアルギニン－ＨＣｌ及び約７５～約５００ｍＭの塩を含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液が約７．５～約９．２のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップが、約２０～約８０ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ及び約５０～約２００ｍＭの塩を含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液が約７．３～約８．８のｐＨを有する、実施態様１５または実施態様１６に記載の方法。
［実施態様２２］
第１の洗浄ステップが、約５０～約２００ｍＭのタウリン及び０．２～１．５％のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ ６０００）を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液が約５．２～約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップが約３０～約３００ｍＭのグリシンを含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液が約７．５～約９．２のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップが、約２０～約１５０ｍＭのタウリン、約３０～約７５体積％のエチレングリコール、及び０．０５～０．２％のオクチルグリコピラノシドを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液が約７．３～約８．８のｐＨを有する、実施態様１５または実施態様１６に記載の方法。
［実施態様２３］
第１の洗浄ステップが、約８０～約４００ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓと、約１１：３：３の比率（重量による）でＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、ポリソルベート８０、及びＴＮＢＰを含む約１０～約２０グラムの溶媒／界面活性剤混合物と、を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液が約５．２～約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップが約５～約２０ｍｍｏｌのクエン酸ナトリウムを含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液が約７．５～約９．２のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップが、約５０～約２００ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ、約５０～約２００ｍＭのリジンＨＣｌ、約５０～約２００ｍＭのヒスチジン－ＨＣｌ、及び約１ｍＭ～約４ｍＭのＮ－アセチル－Ｄ，Ｌ－トリプトファン、及び約１０％～約４０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液が約７．３～約８．８のｐＨを有する、実施態様１５または実施態様１６に記載の方法。
［実施態様２４］
第１の洗浄ステップが、約５０ｎＭ～約２００ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ及び約０．０５～約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液が約５．２～約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップが、約２０ｎＭ～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０ｎＭ～約２００ｎＭの塩を含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液が約７．５～約８．８のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップが、約２０ｍＭ～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４０％～約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液が約７．５～約８．８のｐＨを有する、実施態様１５または実施態様１６に記載の方法。
［実施態様２５］
第１の洗浄ステップが、約５０ｎＭ～約２００ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ及び約０．０５～約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液が約５．２～約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップが、約２０ｎＭ～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０ｎＭ～約２００ｎＭの塩を含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液が約７．５～約８．８のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップが、約２０ｍＭ～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４０％～約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液が約７．５～約８．８のｐＨを有する、実施態様１５または実施態様１６に記載の方法。
［実施態様２６］
前記塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ ２ 、ＣａＣｌ ２ 、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ ２ 、ＣａＣｌ ２ 、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、及び酢酸ナトリウムうちの１つ以上の組み合わせから選択される、実施態様２０～２５のいずれかに記載の方法。
［実施態様２７］
前記塩がＮａＣｌである、実施態様２６に記載の方法。
［実施態様２８］
前記塩の濃度が５００ｍＭを超えない、実施態様２０～２７のいずれかに記載の方法。
［実施態様２９］
前記塩の濃度が２００ｍＭを超えない、実施態様２０～２７のいずれかに記載の方法。
［実施態様３０］
前記第３の緩衝液中の塩の濃度が５００ｍＭを超えない、実施態様２０～２９のいずれかに記載の方法。
［実施態様３１］
前記第３の緩衝液中の塩の濃度が２００ｍＭを超えない、実施態様２０～２９のいずれかに記載の方法。
［実施態様３２］
前記第１の洗浄ステップの前に起こり、約１０～約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含む第４の洗浄ステップをさらに含み、前記第４の緩衝液が約６．５～約８．０のｐＨを有する、実施態様２０～３１のいずれかに記載の方法。
［実施態様３３］
前記第１の緩衝液が約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．１％のポリソルベート８０を含み、前記第１の緩衝液が約６．０のｐＨを有する、実施態様２０～３２のいずれかに記載の方法。
［実施態様３４］
前記第２の緩衝液が約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、前記第２の緩衝液が約８．５のｐＨを有する、実施態様２０～３３のいずれかに記載の方法。
［実施態様３５］
前記第３の緩衝液が約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０体積％のエチレングリコールを含み、前記第３の緩衝液が約８．５のｐＨを有する、実施態様２０～３４のいずれかに記載の方法。
［実施態様３６］
第１の洗浄ステップが、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．０５～約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液が約５．５～約６．５のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップが、約１０～約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液が約８．０～約９．０のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップが、約１０～約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約３０～約７５体積％のエチレングリコールを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液が約８．０～約９．０のｐＨを有する、実施態様１５または実施態様１６に記載の方法。
［実施態様３７］
前記第１の洗浄ステップの前に起こり、約１０～約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含む第４の洗浄ステップをさらに含み、前記第４の緩衝液が約６．５～約８．０のｐＨを有する、実施態様３６に記載の方法。
［実施態様３８］
前記第１の緩衝液が約１００ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．１％のポリソルベート８０を含み、前記第１の緩衝液が約６．０のｐＨを有する、実施態様３６または実施態様３７に記載の方法。
［実施態様３９］
前記第２の緩衝液が約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、前記第２の緩衝液が約８．５のｐＨを有する、実施態様３６～３８のいずれかに記載の方法。
［実施態様４０］
前記第３の緩衝液が約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０体積％のエチレングリコールを含み、前記第３の緩衝液が約８．０のｐＨを有する、実施態様３６～３９のいずれかに記載の方法。
［実施態様４１］
酸性成分が除去される、実施態様４０に記載の方法。
［実施態様４２］
前記酸性成分がＨＥＫ２９３ ＤＮＡのような宿主細胞ＤＮＡであり、前記酸性成分がｑＰＣＲによって測定されるように、ＡＡＶ抗原のマイクログラムあたり２５０ｐｇ未満の値に低下する、実施態様４１に記載の方法。
［実施態様４３］
前記酸性成分がＨＥＫ２９３ ＤＮＡのような宿主細胞ＤＮＡであり、前記酸性成分がＥＬＩＳＡによって測定されるように、ＡＡＶ抗原のマイクログラムあたり２５０ｐｇ未満の値に低下する、実施態様４１に記載の方法。
［実施態様４４］
溶出させることが勾配溶出による溶出緩衝液の伝導性の連続的な線形増加を適用することを含む、実施態様１～４３のいずれかに記載の方法。
［実施態様４５］
溶出させることが勾配溶出による有機溶媒の濃度の連続的な線形増加を適用することを含む、実施態様１～４４のいずれかに記載の方法。
［実施態様４６］
溶出させることが、エチレングリコール、ＮａＣｌのような塩、及びＴｒｉｓＨＣｌのような緩衝液を含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることを含み、前記ｐＨが少なくとも７．０である、実施態様１～４５のいずれかに記載の方法。
［実施態様４７］
前記塩濃度が約７５０ｍＭであり、前記緩衝液濃度が約５０ｍＭであり、前記エチレングリコールが５０～６０％（ｗ／ｗ）である、実施態様４６に記載の方法。
［実施態様４８］
前記ｐＨが約８．０である、実施態様４６または実施態様４７に記載の方法。
［実施態様４９］
前記塩がＮａＣｌであり、前記緩衝液がＴｒｉｓＨＣｌである、実施態様４６～４８のいずれかに記載の方法。
［実施態様５０］
溶出させることが、約７５０ｍＭのＮａＣｌ及び５０～６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を少なくとも７．０のｐＨで接触させることを含む、実施態様１～４９のいずれかに記載の方法。
［実施態様５１］
前記溶出緩衝液が少なくとも約５５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む、実施態様５０に記載の方法。
［実施態様５２］
溶出させることが、約５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、約７５０ｍＭ～約１２５０ｍＭのＮａＣｌ及び約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を少なくとも７．８のｐＨで接触させることを含む、実施態様１～４９のいずれかに記載の方法。
［実施態様５３］
溶出させることが、約２ｍＭの塩化マグネシウム、約５０ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ、約７５０ｍＭ～約１０００ｍＭのＮａＣｌ及び少なくとも約５５％（ｗ／ｗ）のスクロースを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を少なくとも約８．０のｐＨで接触させることを含む、実施態様１～４９のいずれかに記載の方法。
［実施態様５４］
溶出させることが、
（ａ）約２０～約１００ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ及び約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第５の緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることであって、前記第５の緩衝液が約７．５～約８．５のｐＨを有する、前記接触させることと、
（ｂ）約２０～約１００ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ、約４０～約６０％（ｗ／ｗ）のグリセロール、及び約５００～１０００ｍＭの塩を含む第２の溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることであって、前記第２の緩衝液が約７．５～約８．５のｐＨを有する、前記接触させることと、をさらに含む、実施態様５３に記載の方法。
［実施態様５５］
前記ステップが連続して実行される、実施態様５４に記載の方法。
［実施態様５６］
溶出させることが、約２ｍＭの塩化マグネシウム、約５０ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ、約７５０ｍＭ～約１０００ｍＭのＮａＣｌ及び少なくとも約５０％（ｗ／ｗ）のグリセロールを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を少なくとも約８．０のｐＨで接触させることを含む、実施態様１～４９のいずれかに記載の方法。
［実施態様５７］
溶出させることが、約２ｍＭの塩化マグネシウム、約５０ｍＭのタウリン、約６００ｍＭ～約１０００ｍＭのＮａＣｌ、約０．０５～約０．２％のオクチルグリコピラノシド、及び少なくとも約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を少なくとも約７．８のｐＨで接触させることを含む、実施態様１～４９のいずれかに記載の方法。
［実施態様５８］
溶出させることが、
（ａ）約２０～約１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第５の緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることであって、前記第５の緩衝液が約８．０～約８．８のｐＨを有する、前記接触させることと、
（ｂ）少なくとも約６．８のｐＨで約１Ｍの硫酸アンモニウム、約５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、及び約５０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールを含む第２の溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることと、をさらに含む、実施態様５７に記載の方法。
［実施態様５９］
前記ステップが連続して実行される、実施態様５８に記載の方法。
［実施態様６０］
溶出させることが、少なくとも約６．８のｐＨで約１Ｍの硫酸アンモニウム、約５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、及び約５０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることを含む、実施態様１～４９のいずれかに記載の方法。
［実施態様６１］
溶出させることが、約２０％（ｗ／ｗ）のスクロース、約１０％（ｗ／ｗ）のソルビトール、約５％（ｗ／ｗ）のマンニトールまたは約５％（ｗ／ｗ）のスクロース、約１５％（ｗ／ｗ）のグリセロール、約５０ｍＭのヒスチジン、及び約７５０～約１０００ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を少なくとも約７．８のｐＨで接触させることを含む、実施態様１～４９のいずれかに記載の方法。
［実施態様６２］
溶出させることが、
（ａ）約２０～約１００ｍＭのヒスチジン、約８０～約１２０ｍＭのＮａＣｌを含む第５の緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることであって、前記第５の緩衝液が約８．０～約８．８のｐＨを有する、前記接触させることと、
（ｂ）約２０～約１００ｍＭのヒスチジン及び約６００～約９００ｍＭのＮａＣｌ、及び約５～６０％（ｗ／ｗ）のＤＭＳＯを含む第２の緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることであって、前記第５の緩衝液が約６．５～約８．５のｐＨを有する、前記接触させることと、をさらに含む、実施態様６１に記載の方法。
［実施態様６３］
前記ステップが連続して実行される、実施態様６２に記載の方法。
［実施態様６４］
溶出させることが、約１００ｍＭのグリシン－ＨＣｌ、約２００ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を約２．５のｐＨで接触させることを含む、実施態様１～４９のいずれかに記載の方法。
［実施態様６５］
前記溶出緩衝液が約８．０のｐＨにある、実施態様５０～６３のいずれかに記載の方法。
［実施態様６６］
前記溶出緩衝液が８．０のｐＨにある、実施態様５０～６３のいずれかに記載の方法。
［実施態様６７］
溶出させることが対イオン濃度の段階的な増加を含む、実施態様１～６６のいずれかに記載の方法。
［実施態様６８］
溶出させることが有機溶媒濃度の段階的な増加を含む、実施態様１～６７のいずれかに記載の方法。
［実施態様６９］
前記溶出緩衝液中の前記塩が、塩化物、酢酸塩、硫酸塩、クエン酸塩のような、一価、二価または多価の陰イオンから選択される、実施態様１～６８のいずれかに記載の方法。
［実施態様７０］
第１の洗浄ステップが、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．０５～約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液が約５．２～約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップが約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０～約２００ｍＭのＮａＣｌを含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液が約７．５～約９．２のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップが、約２０～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液が約７．５～約８．８のｐＨを有する、実施態様１５または実施態様１６に記載の方法。
［実施態様７１］
約２０～約５０ｍＭのＨＣｌを前記アフィニティ樹脂に約１．７～約２．５のｐＨで適用することが後に続く、前記アフィニティ樹脂に精製水を適用することによる溶出をさらに含む、実施態様７０に記載の方法。
［実施態様７２］
０～１００％の勾配の２０～５０ｍＭの塩酸／０．５～２．０ｍＭの塩酸中の８００～１２００ｍＭのＮａＣｌを適用することによる溶出をさらに含む、実施態様７０に記載の方法。
［実施態様７３］
前記溶出させるステップから得られた前記ＡＡＶが９９．９％以下のＨＣ不純物レベルを有する、実施態様１～７２のいずれかに記載の方法。
［実施態様７４］
前記溶出させるステップから得られた前記ＡＡＶが９９．０％以下のＨＣ不純物レベルを有する、実施態様１～７３のいずれかに記載の方法。
［実施態様７５］
前記ＡＡＶがＡＡＶ８であり、前記アフィニティ樹脂がＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８であり、前記溶出緩衝液が酸性でありエチレングリコールを含まない、実施態様１～７４のいずれかに記載の方法。
［実施態様７６］
前記ＡＡＶがＡＡＶ９であり、前記アフィニティ樹脂がＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９であり、前記溶出緩衝液が酸性でありエチレングリコールを含まない、実施態様１～７４のいずれかに記載の方法。
［実施態様７７］
前記ＡＡＶがＡＡＶ８であり、前記アフィニティ樹脂が、クロマトグラフィーマトリックス上に固定化されたタイプＡＤＫ８またはＡＤＫ８／９からのＡＡＶ８に対して固定化されたモノクローナル抗体からなる免疫アフィニティ樹脂である、実施態様１～７６のいずれかに記載の方法。
［実施態様７８］
前記ＡＡＶがＡＡＶ９であり、前記アフィニティ樹脂が、クロマトグラフィーマトリックス上に固定化されたタイプＡＤＫ９またはＡＤＫ８／９からのＡＡＶ９に対して固定化されたモノクローナル抗体からなる免疫アフィニティ樹脂である、実施態様１～７６のいずれかに記載の方法。
［実施態様７９］
酸性の荷電した汚染物質を前記ＡＡＶ含有溶液から枯渇させるために有効な正に荷電した基を含むフィルタに前記ＡＡＶ含有溶液を接触させることをさらに含む、実施態様１～７８のいずれかに記載の方法。
［実施態様８０］
３５ｎｍを超えるウイルスを除去するためのＡＡＶ画分のナノ濾過をさらに含む、実施態様１～７９のいずれかに記載の方法。
［実施態様８１］
テンタクルゲルを含むカラムを用いてＡＥＸクロマトグラフィーを実行することを含む磨きステップをさらに含む、実施態様１～８０のいずれかに記載の方法。
［実施態様８２］
ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介してＡＡＶ画分を試験することをさらに含む、実施態様１～８１のいずれかに記載の方法。
［実施態様８３］
前記ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡがＡＡＶに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡである、実施態様８２に記載の方法。
［実施態様８４］
実施態様１～８３のいずれかに記載の方法により産生されるＡＡＶ産物。 All references, including publications, patent applications, and patents cited herein, are individually and specifically indicated so that each reference is incorporated by reference, and the entire reference is presented herein in its entirety. Incorporated herein by reference to the same extent as in the case of.
Finally, preferred embodiments of the present invention are described in terms of terms.
[Embodiment 1]
[Embodiment 1]
A method of purifying adeno-associated virus (AAV)
(A) Loading an AAV-containing solution onto an AAV-targeted affinity resin under conduction that allows binding between the AAV and the affinity resin in the solution.
(B) Performing at least two cleaning steps and
(C) Elution of the AAV from the affinity resin and
Including the method.
[Embodiment 2]
Further comprising contacting the AAV-containing solution with the anion exchanger and eluting the AAV-containing solution from the anion exchanger before loading the AAV-containing solution into the affinity resin. The method according to aspect 1.
[Embodiment 3]
The method of embodiment 1, wherein at least one of the washing steps comprises applying a buffer containing an organic solvent or surfactant to the affinity resin.
[Embodiment 4]
The method of embodiment 3, wherein the buffer comprises TrisHCl and a salt.
[Embodiment 5]
The buffer comprises one or more of histidine, histidine-HCl, arginine-HCl, lysine-HCl, glycine, taurine, MES-Na, Bis-Tris, and N-acetyl-D, L-tryptophan. The method according to the third embodiment.
[Embodiment 6]
The method according to embodiment 4 or 5, wherein the salt is NaCl.
[Embodiment 7]
The method according to embodiment 3, wherein the buffer solution contains sodium acetate.
[Embodiment 8]
The method according to embodiment 3, wherein the buffer solution contains magnesium chloride.
[Embodiment 9]
The method of embodiment 3, wherein the buffer comprises TrisHCl and ethylene glycol.
[Embodiment 10]
The method of embodiment 3, wherein the buffer comprises arginine-HCl and one of sucrose and glycerol.
[Embodiment 11]
The method of embodiment 3, wherein the buffer comprises taurine and ethylene glycol.
[Embodiment 12]
The method of embodiment 3, wherein the buffer comprises arginine-HCl, lysine-HCl, and histidine-HCl.
[Embodiment 13]
The method of embodiment 3, wherein the buffer comprises TrisHCl and DMSO.
[Embodiment 14]
The method of embodiment 1, wherein at least three cleaning steps are performed.
[Embodiment 15]
8. The method of embodiment 8, wherein three cleaning steps are performed.
[Embodiment 16]
9. The method of embodiment 9, wherein the three cleaning steps are performed in succession.
[Embodiment 17]
The method according to embodiment 3, wherein the organic solvent or surfactant is polysorbate 80, ethylene glycol, sorbitol, mannitol, xylitol, DMSO, sucrose, or trehalose.
[Embodiment 18]
17. The method of embodiment 17, wherein the surfactant comprises one or more of Triton X100, polysorbate 80, and tri (n-butyl) phosphate (TNBP).
[Embodiment 19]
18. The method of embodiment 18, wherein the buffer comprises Bis-Tris.
[Embodiment 20]
The first washing step comprises applying to the affinity resin a first buffer containing from about 50 to about 2000 mM sodium acetate and from about 0.05 to about 0.2% polysorbate 80, said first. The buffer solution has a pH of about 5.2 to about 6.8 and has a pH of about 5.2 to about 6.8.
The second washing step comprises applying a second buffer to the affinity resin comprising about 30 to about 200 mM TrisHCl and about 75 to about 500 mM salt, wherein the second buffer is about 7. It has a pH of 5 to about 9.2 and has a pH of 5 to about 9.2.
A third washing step comprises applying a third buffer to the affinity resin comprising about 30 to about 200 mM TrisHCl and about 30 to about 75% by volume of ethylene glycol, wherein the third buffer is. The method of embodiment 15 or 16, wherein the method has a pH of about 7.3 to about 8.8.
[Embodiment 21]
The first wash step is about 50-about 500 mM sodium salt of 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES-Na), about 3-about 30 mM EDTA, polysolvate 80, DMSO, and birds ( It comprises applying a first buffer containing a solvent / surfactant mixture containing n-butyl) phosphate (TNBP) to the affinity resin, wherein the first buffer is from about 5.2 to about 6. Has a pH of .8 and has a pH of 8.
The second washing step comprises applying a second buffer to the affinity resin comprising about 30 to about 200 mM Tris HCl or arginine-HCl and about 75 to about 500 mM salt, said second buffer. Has a pH of about 7.5 to about 9.2,
A third wash step comprises applying a third buffer to the affinity resin comprising about 20 to about 80 mM arginine-HCl and about 50 to about 200 mM salt, wherein the third buffer is about. 13. The method of embodiment 15 or 16, which has a pH of 7.3 to about 8.8.
[Embodiment 22]
The first washing step comprises applying to the affinity resin a first buffer containing about 50-about 200 mM taurine and 0.2-1.5% PEG (eg, PEG 6000). The first buffer has a pH of about 5.2 to about 6.8 and has a pH of about 5.2 to about 6.8.
The second wash step comprises applying a second buffer containing about 30 to about 300 mM glycine to the affinity resin, the second buffer having a pH of about 7.5 to about 9.2. Have and
The third wash step said the third buffer containing about 20-about 150 mM taurine, about 30-about 75% by volume ethylene glycol, and 0.05-0.2% octylglycopyranoside. 15. The method of embodiment 15 or 16, comprising application to an affinity resin, wherein the third buffer has a pH of about 7.3 to about 8.8.
[Embodiment 23]
The first wash step is about 10 to about 20 grams of solvent containing about 80 to about 400 mM Bis-Tris and Triton-X100, polysorbate 80, and TNBP in a ratio of about 11: 3: 3 (by weight). / A first buffer containing a surfactant mixture is applied to the affinity resin, the first buffer having a pH of about 5.2 to about 6.8.
The second washing step comprises applying a second buffer containing about 5 to about 20 mmol of sodium citrate to the affinity resin, wherein the second buffer is from about 7.5 to about 9.2. Has pH
The third wash step is about 50-about 200 mM arginine-HCl, about 50-about 200 mM lysine HCl, about 50-about 200 mM histidine-HCl, and about 1 mM-about 4 mM N-acetyl-D, L. -Containing the application of a third buffer containing tryptophan and about 10% to about 40% (w / w) of polysorbate 80 to the affinity resin, the third buffer is from about 7.3 to about. The method according to embodiment 15 or 16, which has a pH of 8.8.
[Embodiment 24]
The first washing step comprises applying to the affinity resin a first buffer containing about 50 nM to about 200 mM NaActate and about 0.05 to about 0.2% polysorbate 80, said first. The buffer has a pH of about 5.2 to about 6.8 and has a pH of about 5.2 to about 6.8.
The second washing step comprises applying a second buffer to the affinity resin comprising a TrisHCl of about 20 nM to about 100 mM and a salt of about 50 nM to about 200 nM, wherein the second buffer is about 7. It has a pH of 5 to about 8.8 and has a pH of 5 to about 8.8.
The third washing step comprises applying to the affinity resin a third buffer containing about 20 mM to about 100 mM TrisHCl, about 40% to about 60% (w / w) ethylene glycol, said first. 15. The method of embodiment 15 or 16, wherein the buffer of 3 has a pH of about 7.5 to about 8.8.
[Embodiment 25]
The first washing step comprises applying to the affinity resin a first buffer containing about 50 nM to about 200 mM NaActate and about 0.05 to about 0.2% polysorbate 80, said first. The buffer has a pH of about 5.2 to about 6.8 and has a pH of about 5.2 to about 6.8.
The second washing step comprises applying a second buffer to the affinity resin comprising a TrisHCl of about 20 nM to about 100 mM and a salt of about 50 nM to about 200 nM, wherein the second buffer is about 7. It has a pH of 5 to about 8.8 and has a pH of 5 to about 8.8.
The third washing step comprises applying to the affinity resin a third buffer containing about 20 mM to about 100 mM TrisHCl, about 40% to about 60% (w / w) ethylene glycol, said first. 15. The method of embodiment 15 or 16, wherein the buffer of 3 has a pH of about 7.5 to about 8.8.
[Embodiment 26]
The salt is NaCl, KCl, MgCl 2 , CaCl 2 , sodium citrate, LiCl, CsCl, sodium acetate, and one of NaCl, KCl, MgCl 2 , CaCl 2 , sodium citrate, LiCl, CsCl, and sodium acetate. The method according to any of embodiments 20-25, selected from one or more combinations.
[Embodiment 27]
26. The method of embodiment 26, wherein the salt is NaCl.
[Embodiment 28]
The method according to any of embodiments 20-27, wherein the salt concentration does not exceed 500 mM.
[Embodiment 29]
The method according to any of embodiments 20-27, wherein the salt concentration does not exceed 200 mM.
[Embodiment 30]
The method according to any one of embodiments 20 to 29, wherein the concentration of the salt in the third buffer solution does not exceed 500 mM.
[Embodiment 31]
The method according to any one of embodiments 20 to 29, wherein the concentration of the salt in the third buffer solution does not exceed 200 mM.
[Embodiment 32]
A fourth wash step, which occurs prior to the first wash step and comprises applying a fourth buffer to the affinity resin, which comprises about 10 to about 30 mM TrisHCl and about 75 to about 250 mM NaCl. 20-31. The method of any of embodiments 20-31, comprising, wherein the fourth buffer has a pH of about 6.5 to about 8.0.
[Embodiment 33]
20-32, wherein the first buffer contains about 100 mM sodium acetate, about 0.1% polysorbate 80, and the first buffer has a pH of about 6.0. the method of.
[Embodiment 34]
The method according to any of embodiments 20-33, wherein the second buffer contains about 50 mM TrisHCl and about 125 mM NaCl, and the second buffer has a pH of about 8.5.
[Embodiment 35]
The method according to any of embodiments 20-34, wherein the third buffer contains about 50 mM TrisHCl and about 50% by volume ethylene glycol and the third buffer has a pH of about 8.5. ..
[Embodiment 36]
The first washing step comprises applying to the affinity resin a first buffer containing from about 50 to about 200 mM sodium acetate and from about 0.05 to about 0.2% polysorbate 80, said first. The buffer solution has a pH of about 5.5 to about 6.5 and has a pH of about 5.5 to about 6.5.
The second washing step comprises applying a second buffer containing about 10 to about 70 mM TrisHCl and about 75 to about 250 mM NaCl to the affinity resin, wherein the second buffer is about 8. It has a pH of 0 to about 9.0 and has a pH of 0 to about 9.0.
A third washing step comprises applying a third buffer to the affinity resin comprising about 10 to about 70 mM TrisHCl and about 30 to about 75% by volume ethylene glycol, said third buffer. The method according to embodiment 15 or 16, which has a pH of about 8.0 to about 9.0.
[Embodiment 37]
A fourth wash step, which occurs prior to the first wash step and comprises applying a fourth buffer to the affinity resin, which comprises about 10 to about 30 mM TrisHCl and about 75 to about 250 mM NaCl. 36. The method of embodiment 36, wherein the fourth buffer has a pH of about 6.5 to about 8.0.
[Embodiment 38]
36 or 37, wherein the first buffer contains about 100 mM sodium acetate and about 0.1% polysorbate 80 and the first buffer has a pH of about 6.0. Method.
[Embodiment 39]
13. The method of any of embodiments 36-38, wherein the second buffer contains about 50 mM TrisHCl and about 125 mM NaCl, and the second buffer has a pH of about 8.5.
[Embodiment 40]
13. The method of any of embodiments 36-39, wherein the third buffer contains about 50 mM TrisHCl and about 50% by volume ethylene glycol and the third buffer has a pH of about 8.0. ..
[Embodiment 41]
40. The method of embodiment 40, wherein the acidic component is removed.
[Embodiment 42]
41. The method of embodiment 41, wherein the acidic component is host cell DNA such as HEK293 DNA, and the acidic component is reduced to a value of less than 250 pg per microgram of AAV antigen, as measured by qPCR.
[Embodiment 43]
41. The method of embodiment 41, wherein the acidic component is a host cell DNA such as HEK293 DNA, the acidic component being reduced to a value of less than 250 pg per microgram of AAV antigen, as measured by ELISA.
[Phase 44]
The method of any of embodiments 1-43, wherein elution comprises applying a continuous linear increase in the conductivity of the elution buffer by gradient elution.
[Embodiment 45]
The method of any of embodiments 1-44, wherein elution comprises applying a continuous linear increase in the concentration of the organic solvent by gradient elution.
[Phase 46]
Embodiment 1 comprising contacting the affinity resin with an elution buffer containing a buffer such as ethylene glycol, a salt such as NaCl, and a buffer such as TrisHCl, wherein the elution comprises contacting the affinity resin with a pH of at least 7.0. The method according to any one of 45 to 45.
[Embodiment 47]
46. The method of embodiment 46, wherein the salt concentration is about 750 mM, the buffer concentration is about 50 mM, and the ethylene glycol is 50-60% (w / w).
[Embodiment 48]
The method according to embodiment 46 or 47, wherein the pH is about 8.0.
[Embodiment 49]
The method according to any of embodiments 46-48, wherein the salt is NaCl and the buffer is TrisHCl.
[Embodiment 50]
Embodiments 1-49 include contacting the affinity resin with an elution buffer containing about 750 mM NaCl and 50-60% (w / w) ethylene glycol at a pH of at least 7.0. The method described in any of.
[Embodiment 51]
50. The method of embodiment 50, wherein the elution buffer comprises at least about 55% (w / w) ethylene glycol.
[Embodiment 52]
The elution is to contact the affinity resin with an elution buffer containing about 50 mM Tris HCl, about 750 mM to about 1250 mM NaCl and about 60% (w / w) ethylene glycol at a pH of at least 7.8. The method according to any one of embodiments 1 to 49, comprising.
[Embodiment 53]
Elution can include elution buffer containing at least about 2 mM magnesium chloride, about 50 mM arginine-HCl, about 750 mM to about 1000 mM NaCl and at least about 55% (w / w) sucrose and at least about 8 of the affinity resin. The method according to any of embodiments 1-49, comprising contacting at a pH of 0.0.
[Embodiment 54]
To elute
(A) The affinity resin is brought into contact with a fifth buffer solution containing about 20 to about 100 mM arginine-HCl and about 75 to about 250 mM NaCl, and the fifth buffer solution is about 7.5. With the contact having a pH of ~ about 8.5,
(B) Contacting the affinity resin with a second elution buffer containing about 20 to about 100 mM arginine-HCl, about 40 to about 60% (w / w) glycerol, and about 500 to 1000 mM salt. 53. The method of embodiment 53, wherein the second buffer has a pH of about 7.5 to about 8.5, further comprising contacting the second buffer.
[Embodiment 55]
54. The method of embodiment 54, wherein the steps are performed sequentially.
[Embodiment 56]
The elution buffer containing at least about 8 mM magnesium chloride, about 50 mM arginine-HCl, about 750 mM to about 1000 mM NaCl and at least about 50% (w / w) glycerol and the affinity resin. The method according to any of embodiments 1-49, comprising contacting at a pH of 0.0.
[Embodiment 57]
Elution can be about 2 mM magnesium chloride, about 50 mM taurine, about 600 mM to about 1000 mM NaCl, about 0.05 to about 0.2% octylglycopyranoside, and at least about 60% (w / w). The method according to any one of embodiments 1 to 49, which comprises contacting the elution buffer containing ethylene glycol of) with the affinity resin at a pH of at least about 7.8.
[Embodiment 58]
To elute
(A) The affinity resin is brought into contact with a fifth buffer solution containing about 20 to about 100 mM Tris-HCl and about 75 to about 250 mM NaCl, and the fifth buffer solution is about 8.0. With the contact having a pH of ~ about 8.8,
(B) Contacting the affinity resin with a second elution buffer containing about 1 M ammonium sulphate, about 50 mM Tris HCl, and about 50% (v / v) ethylene glycol at a pH of at least about 6.8. 57. The method of embodiment 57, further comprising.
[Embodiment 59]
58. The method of embodiment 58, wherein the steps are performed sequentially.
[Embodiment 60]
Elution involves contacting the affinity resin with an elution buffer containing about 1 M ammonium sulphate, about 50 mM Tris HCl, and about 50% (v / v) ethylene glycol at a pH of at least about 6.8. The method according to any of embodiments 1-49, comprising.
[Embodiment 61]
Elution can be about 20% (w / w) sucrose, about 10% (w / w) sorbitol, about 5% (w / w) mannitol or about 5% (w / w) sucrose, about. Embodiment 1 comprising contacting the affinity resin with an elution buffer containing 15% (w / w) glycerol, about 50 mM histidine, and about 750 to about 1000 mM NaCl at a pH of at least about 7.8. The method according to any one of 49 to 49.
[Embodiment 62]
To elute
(A) The affinity resin is brought into contact with a fifth buffer solution containing about 20 to about 100 mM histidine and about 80 to about 120 mM NaCl, and the fifth buffer solution is about 8.0 to about 8.0 to about. With the contact having a pH of 8.8,
(B) Contacting the affinity resin with a second buffer containing about 20 to about 100 mM histidine, about 600 to about 900 mM NaCl, and about 5 to 60% (w / w) DMSO. 61. The method of embodiment 61, further comprising contacting, wherein the fifth buffer has a pH of about 6.5 to about 8.5.
[Embodiment 63]
62. The method of embodiment 62, wherein the steps are performed sequentially.
[Embodiment 64]
12. The embodiment according to any one of embodiments 1-49, wherein elution comprises contacting the affinity resin with an elution buffer containing about 100 mM glycine-HCl, about 200 mM NaCl at a pH of about 2.5. Method.
[Embodiment 65]
The method according to any of embodiments 50-63, wherein the elution buffer is at a pH of about 8.0.
[Embodiment 66]
The method according to any of embodiments 50-63, wherein the elution buffer is at a pH of 8.0.
[Embodiment 67]
The method according to any of embodiments 1-66, wherein elution comprises a stepwise increase in counterion concentration.
[Embodiment 68]
The method according to any of embodiments 1-67, wherein elution comprises a stepwise increase in organic solvent concentration.
[Embodiment 69]
Any of embodiments 1-68, wherein the salt in the elution buffer is selected from monovalent, divalent or polyvalent anions such as chloride, acetate, sulfate, citrate. The method described in.
[Embodiment 70]
The first washing step comprises applying to the affinity resin a first buffer containing from about 50 to about 200 mM sodium acetate, from about 0.05 to about 0.2% polysorbate 80, said first. The buffer solution has a pH of about 5.2 to about 6.8 and has a pH of about 5.2 to about 6.8.
The second washing step comprises applying a second buffer containing about 25 to about 100 mM TrisHCl and about 50 to about 200 mM NaCl to the affinity resin, the second buffer being about 7.5. It has a pH of ~ 9.2 and
A third wash step comprises applying a third buffer to the affinity resin containing about 20 to about 100 mM TrisHCl and about 75 to about 250 mM NaCl, wherein the third buffer is about 7. The method of embodiment 15 or 16, wherein the method has a pH of 5 to about 8.8.
[Embodiment 71]
Embodiment 70 further comprises applying about 20 to about 50 mM HCl to the affinity resin at a pH of about 1.7 to about 2.5, followed by elution by applying purified water to the affinity resin. The method described in.
[Embodiment 72]
80. The method of embodiment 70, further comprising elution by applying 800-1200 mM NaCl in 20-50 mM hydrochloric acid / 0.5-2.0 mM hydrochloric acid with a 0-100% gradient.
[Embodiment 73]
The method according to any of embodiments 1-72, wherein the AAV obtained from the elution step has an HC impurity level of 99.9% or less.
[Embodiment 74]
The method according to any of embodiments 1-73, wherein the AAV obtained from the elution step has an HC impurity level of 99.0% or less.
[Embodiment 75]
The method according to any one of embodiments 1 to 74, wherein the AAV is AAV8, the affinity resin is POROS ™ CaptureSelect ™ AAV8, and the elution buffer is acidic and does not contain ethylene glycol.
[Embodiment 76]
The method according to any one of embodiments 1 to 74, wherein the AAV is AAV9, the affinity resin is POROS ™ CaptureSelect ™ AAV9, and the elution buffer is acidic and does not contain ethylene glycol.
[Embodiment 77]
Embodiment 1 wherein the AAV is AAV8 and the affinity resin is an immunoaffinity resin consisting of a monoclonal antibody immobilized against AAV8 from type ADK8 or ADK8 / 9 immobilized on a chromatographic matrix. The method according to any one of ~ 76.
[Embodiment 78]
Embodiment 1 wherein the AAV is AAV9 and the affinity resin is an immunoaffinity resin consisting of a monoclonal antibody immobilized against AAV9 from type ADK9 or ADK8 / 9 immobilized on a chromatographic matrix. The method according to any one of ~ 76.
[Embodiment 79]
The embodiment 1-78, further comprising contacting the AAV-containing solution with a filter containing a positively charged group effective for depleting the AAV-containing solution of acidic charged contaminants. Method.
[Embodiment 80]
The method of any of embodiments 1-79, further comprising nanofiltration of AAV fractions to remove viruses above 35 nm.
[Embodiment 81]
The method according to any of embodiments 1-80, further comprising a polishing step comprising performing AEX chromatography with a column comprising a tentacle gel.
[Embodiment 82]
The method of any of embodiments 1-81, further comprising testing the AAV fraction via an AAV-specific ELISA.
[Embodiment 83]
82. The method of embodiment 82, wherein the AAV-specific ELISA is an AAV-specific sandwich ELISA.
[Embodiment 84]
An AAV product produced by the method according to any of embodiments 1-83.

Claims (32)

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する方法であって、
（ａ）ＡＡＶを含む溶液を、ＡＡＶを標的としたアフィニティ樹脂に、前記溶液中のＡＡＶと前記アフィニティ樹脂との間の結合を可能にする伝導下でロードすること、
（ｂ）少なくとも２つの洗浄ステップを行うこと、及び
（ｃ）前記アフィニティ樹脂からＡＡＶを溶出させること、
を含み、
前記洗浄ステップのうちの少なくとも１つは、有機溶媒または界面活性剤を含む緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含む、方法。 A method of purifying adeno-associated virus (AAV)
(A) Loading a solution containing AAV into an AAV-targeted affinity resin under conduction that allows binding between the AAV and the affinity resin in the solution.
(B) Performing at least two cleaning steps and
(C) Elution of AAV from the affinity resin,
Including
A method comprising applying a buffer containing an organic solvent or surfactant to the affinity resin, at least one of the washing steps . ＡＡＶを含む溶液を前記アフィニティ樹脂にロードする前に、ＡＡＶを含む溶液を陰イオン交換体と接触させること、及び前記陰イオン交換体からＡＡＶを含む溶液を溶出させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。 Further comprising contacting the solution containing AAV with the anion exchanger and eluting the solution containing AAV from the anion exchanger prior to loading the solution containing AAV into the affinity resin. The method according to claim 1. 前記緩衝液の少なくとも１つは、（ａ）ＴｒｉｓＨＣｌ、及び塩；（ｂ）酢酸ナトリウム；（ｃ）ＴｒｉｓＨＣｌ、及びエチレングリコール；（ｄ）アルギニン－ＨＣｌ、及びスクロースとグリセロールのうちの１つ；（ｅ）タウリン、及びエチレングリコール；（ｆ）アルギニン－ＨＣｌ、リジン－ＨＣｌ、及びヒスチジン－ＨＣｌ；（ｇ）ＴｒｉｓＨＣｌ、及びＤＭＳＯ；またはそれらの組み合わせを含む、請求項１または２に記載の方法。 At least one of the buffers is (a) TrisHCl and salt ; (b) sodium acetate; (c) TrisHCl and ethylene glycol; (d) arginine-HCl, and one of sucrose and glycerol; ( e) The method of claim 1 or 2 , comprising taurine and ethylene glycol; (f) arginine-HCl, lysine-HCl, and histidine-HCl; (g) TrisHCl, and DMSO; or a combination thereof . 前記有機溶媒または界面活性剤は、ポリソルベート８０、エチレングリコール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、ＤＭＳＯ、スクロース、トレハロース、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、トリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）、またはそれらの組み合わせである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。 The organic solvent or surfactant is claimed to be polysorbate 80, ethylene glycol, sorbitol, mannitol, xylitol, DMSO, sucrose, trehalose, Triton X100, tri (n-butyl) phosphate (TNBP), or a combination thereof. The method according to any one of 1 to 3 . 第１の洗浄ステップは、約５０ｍＭ～約２０００ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．０５％（ｗ／ｗ）～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液のｐＨは約５．２～約６．８であり、
第２の洗浄ステップは、約３０ｍＭ～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５ｍＭ～約５００ｍＭの塩を含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液のｐＨは約７．５～約９．２であり、かつ
第３の洗浄ステップは、約３０ｍＭ～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約３０％（ｗ／ｗ）～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液のｐＨは約７．３～約８．８である、請求項１に記載の方法。 The first wash step is the first buffer containing about 50 mM to about 2000 mM sodium acetate and about 0.05 % (w / w) to about 0.2% (w / w) polysorbate 80. The pH of the first buffer, including application to affinity resins, is from about 5.2 to about 6.8 .
The second wash step comprises applying a second buffer to the affinity resin comprising a TrisHCl of about 30 mM to about 200 mM and a salt of about 75 mM to about 500 mM, the pH of the second buffer. Is about 7.5 to about 9.2 , and the third wash step is about 30 mM to about 200 mM Tris HCl and about 30 % (w / w) to about 75% (w / w) ethylene glycol. The method according to claim 1 , wherein a third buffer solution containing the above is applied to the affinity resin, and the pH of the third buffer solution is about 7.3 to about 8.8. 第１の洗浄ステップは、約５０ｍＭ～約２００ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．０５％（ｗ／ｗ）～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液のｐＨは約５．２～約６．８であり、
第２の洗浄ステップは、約２０ｍＭ～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０ｍＭ～約２００ｍＭの塩を含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液のｐＨは約７．５～約８．８であり、かつ
第３の洗浄ステップは、約２０ｍＭ～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４０％（ｗ／ｗ）～約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液のｐＨは約７．５～約８．８である、請求項１に記載の方法。 The first wash step is the affinity of the first buffer containing about 50 mM to about 200 mM sodium acetate and about 0.05% (w / w) to about 0.2% (w / w) polysorbate 80. The pH of the first buffer, including application to resins, is from about 5.2 to about 6.8.
The second washing step comprises applying a second buffer containing about 20 mM to about 100 mM TrisHCl and a salt of about 50 mM to about 200 mM to the affinity resin, the pH of the second buffer being about. It is 7.5 to about 8.8, and
The third washing step is to apply a third buffer solution containing about 20 mM to about 100 mM TrisHCl, about 40% (w / w) to about 60% (w / w) ethylene glycol to the affinity resin. The method according to claim 1, wherein the pH of the third buffer solution is about 7.5 to about 8.8 . 第１の洗浄ステップは、約５０ｍＭ～約２００ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．０５％（ｗ／ｗ）～約０．２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液のｐＨは約５．５～約６．５であり、
第２の洗浄ステップは、約１０ｍＭ～約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５ｍＭ～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液のｐＨは約８．０～約９．０であり、
第３の洗浄ステップは、約１０ｍＭ～約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約３０％（ｗ／ｗ）～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液のｐＨは約８．０～約９．０である、請求項１に記載の方法。 The first wash step is the affinity of the first buffer containing about 50 mM to about 200 mM sodium acetate and about 0.05% (w / w) to about 0.2% (w / w) polysorbate 80. The pH of the first buffer, including application to resins, is from about 5.5 to about 6.5.
The second washing step comprises applying a second buffer containing about 10 mM to about 70 mM TrisHCl and about 75 mM to about 250 mM NaCl to the affinity resin, the pH of the second buffer being about. It is 8.0 to about 9.0,
The third washing step is to apply a third buffer solution containing about 10 mM to about 70 mM TrisHCl and about 30% (w / w) to about 75% (w / w) ethylene glycol to the affinity resin. The method according to claim 1, wherein the pH of the third buffer solution is about 8.0 to about 9.0 . 第１の洗浄ステップは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウム及び０．０５～０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液のｐＨは約５．２～約６．８であり、
第２の洗浄ステップは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０～約２００ｍＭの塩を含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液のｐＨは約７．５～約９．２であり、
最初の溶出ステップの前に、精製水を用いた洗浄が行われる、請求項１に記載の方法。 The first washing step comprises applying a first buffer to the affinity resin comprising about 50 to about 200 mM sodium acetate and 0.05 to 0.2% polysorbate 80, said first buffer. The pH of the liquid is about 5.2 to about 6.8,
The second washing step comprises applying a second buffer containing about 25 to about 100 mM TrisHCl and about 50 to about 200 mM salt to the affinity resin, the pH of the second buffer being about. It is 7.5 to about 9.2,
The method of claim 1, wherein washing with purified water is performed prior to the first elution step . 少なくとも３つの洗浄ステップが実行され、
第１の洗浄ステップは、約５０～約２００ｍＭの酢酸ナトリウム及び０．０５～０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液のｐＨは約５．２～約６．８であり、
第２の洗浄ステップは、約２５～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０～２００ｍＭの塩を含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液のｐＨは約７．５～約９．２であり、
前記第１の洗浄ステップの前に第３の洗浄ステップが行われ、該第３の洗浄ステップは、約２０～約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液のｐＨは約７．５～約８．８である、請求項１に記載の方法。 At least 3 cleaning steps have been performed
The first washing step comprises applying a first buffer to the affinity resin comprising about 50 to about 200 mM sodium acetate and 0.05 to 0.2% polysorbate 80, said first buffer. The pH of the liquid is about 5.2 to about 6.8,
The second washing step comprises applying a second buffer containing about 25 to about 100 mM TrisHCl and about 50 to 200 mM salt to the affinity resin, wherein the pH of the second buffer is about 7. It is 5 to about 9.2,
A third wash step is performed prior to the first wash step, wherein the third wash step comprises a third buffer containing from about 20 to about 100 mM TrisHCl and about 75 to about 250 mM NaCl. The method of claim 1, wherein the pH of the third buffer, comprising application to an affinity resin, is from about 7.5 to about 8.8 . 第１の洗浄ステップは、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ－Ｎａ）のナトリウム塩と、約３ｍＭ～約３０ｍＭのＥＤＴＡと、ポリソルベート８０、ＤＭＳＯ、及びトリ（ｎ－ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む溶媒／界面活性剤混合物とを含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液のｐＨは約５．２～約６．８であり、
第２の洗浄ステップは、約３０ｍＭ～約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌまたはアルギニン－ＨＣｌと、約７５ｍＭ～約５００ｍＭの塩とを含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液のｐＨは約７．５～約９．２であり、
第３の洗浄ステップは、約２０ｍＭ～約８０ｍＭのアルギニン－ＨＣｌと、約５０ｍＭ～約２００ｍＭの塩とを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液のｐＨは約７．３～約８．８である、請求項１に記載の方法。 The first wash step is about 50 mM to about 500 mM sodium salt of 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES-Na), about 3 mM to about 30 mM EDTA, polysolvate 80, DMSO, and It comprises applying a first buffer solution containing a solvent / surfactant mixture containing tri (n-butyl) phosphate (TNBP) to the affinity resin, the pH of the first buffer solution being about 5.2. ~ 6.8 ,
The second washing step comprises applying to the affinity resin a second buffer containing from about 30 mM to about 200 mM TrisHCl or arginine-HCl and about 75 mM to about 500 mM salt, said first. The pH of the buffer solution of 2 is about 7.5 to about 9.2 , and the pH is about 7.5 to about 9.2.
The third washing step comprises applying to the affinity resin a third buffer containing about 20 mM to about 80 mM arginine-HCl and about 50 mM to about 200 mM salt, said third. The method of claim 1 , wherein the pH of the buffer is from about 7.3 to about 8.8. 第１の洗浄ステップは、約５０ｍＭ～約２００ｍＭのタウリン及び０．２～１．５％のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ ６０００）を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液のｐＨは約５．２～約６．８であり、
第２の洗浄ステップは、約３０ｍＭ～約３００ｍＭのグリシンを含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液のｐＨは約７．５～約９．２であり、
第３の洗浄ステップは、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭのタウリン、約３０％（ｗ／ｗ）～約７５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、及び０．０５％～０．２％のオクチルグリコピラノシドを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液のｐＨは約７．３～約８．８である、請求項１に記載の方法。 The first washing step comprises applying to the affinity resin a first buffer containing about 50 mM to about 200 mM taurine and 0.2 to 1.5% PEG (eg, PEG 6000). The pH of the first buffer solution is about 5.2 to about 6.8 .
The second washing step comprises applying a second buffer containing about 30 mM to about 300 mM glycine to the affinity resin, the pH of the second buffer being from about 7.5 to about 9. 2 and
The third washing step is about 20 mM to about 150 mM taurine, about 30 % (w / w) to about 75% (w / w) ethylene glycol, and 0.05 % to 0.2% octylglyco. The method of claim 1 , wherein a third buffer containing pyranoside is applied to the affinity resin, wherein the pH of the third buffer is from about 7.3 to about 8.8 . .. 第１の洗浄ステップは、約８０ｍＭ～約４００ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓと、約１１：３：３の比率（重量による）でＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、ポリソルベート８０、及びＴＮＢＰを含む約１０グラム～約２０グラムの溶媒／界面活性剤混合物とを含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液のｐＨは約５．２～約６．８であり、
第２の洗浄ステップは、約５ｍＭ～約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液のｐＨは約７．５～約９．２であり、かつ
第３の洗浄ステップは、約５０ｍＭ～約２００ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ、約５０ｍＭ～約２００ｍＭのリジンＨＣｌ、約５０ｍＭ～約２００ｍＭのヒスチジン－ＨＣｌ、及び約１ｍＭ～約４ｍＭのＮ－アセチル－Ｄ，Ｌ－トリプトファン、及び約１０％（ｗ／ｗ）～約４０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液のｐＨは約７．３～約８．８である、請求項１に記載の方法。 The first wash step is about 10 to about 20 grams containing Triton-X100, polysorbate 80, and TNBP in a ratio of about 11: 3: 3 (by weight) to about 80 mM to about 400 mM Bis-Tris. A first buffer solution containing the solvent / surfactant mixture of the above is applied to the affinity resin, and the pH of the first buffer solution is about 5.2 to about 6.8 .
The second washing step comprises applying a second buffer containing from about 5 mM to about 20 mM sodium citrate to the affinity resin, the pH of the second buffer being from about 7.5 to. It is about 9.2 and the third wash step is about 50 mM to about 200 mM arginine-HCl, about 50 mM to about 200 mM lysine HCl, about 50 mM to about 200 mM histidine-HCl, and about 1 mM. Applying to the affinity resin a third buffer containing ~ about 4 mM N-acetyl-D, L-tryptophan and about 10% (w / w) ~ about 40% (w / w) polysorbate 80. The method according to claim 1, wherein the pH of the third buffer solution is about 7.3 to about 8.8. 前記塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、及び酢酸ナトリウムうちの１つ以上の組み合わせから選択される、請求項３～１０のいずれか一項に記載の方法。 The salt is one of NaCl, KCl, MgCl 2 , CaCl 2 , sodium citrate, LiCl, CsCl, sodium acetate, and NaCl, KCl, MgCl 2 , CaCl 2 , sodium citrate, LiCl, CsCl, and sodium acetate. The method according to any one of claims 3 to 10 , which is selected from one or more combinations. 前記第１の洗浄ステップの前に行われる洗浄ステップをさらに含み、該洗浄ステップは、約１０ｍＭ～約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５ｍＭ～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、該緩衝液のｐＨは約６．５～約８．０である、請求項５～１３のいずれか一項に記載の方法。 Further comprising a wash step performed prior to the first wash step, the wash step applies a buffer containing about 10 mM to about 30 mM TrisHCl and about 75 mM to about 250 mM NaCl to the affinity resin. The method according to any one of claims 5 to 13 , wherein the pH of the buffer solution is about 6.5 to about 8.0. 前記第１の緩衝液は、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．１％のポリソルベート８０を含み、該第１の緩衝液のｐＨは約６．０である、請求項５～９、１３及び１４のいずれか一項に記載の方法。 The first buffer contains about 100 mM sodium acetate, about 0.1% polysorbate 80, and the pH of the first buffer is about 6.0 , claims 5-9, 13 and. The method according to any one of 14 . 前記第２の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、該第２の緩衝液のｐＨは約８．５である、請求項５～１０、及び１３～１５のいずれか一項に記載の方法。 The second buffer contains about 50 mM TrisHCl and about 125 mM NaCl, and the pH of the second buffer is about 8.5 , any of claims 5-10 and 13-15 . The method described in paragraph 1. 前記第３の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含み、該第３の緩衝液のｐＨは約８．５のｐＨである、請求項５～７、及び１３～１６のいずれか一項に記載の方法。 The third buffer contains about 50 mM TrisHCl and about 50% (w / w) ethylene glycol, and the pH of the third buffer is about 8.5, claims 5 to 5. 7. The method according to any one of 13 to 16 . 溶出させることが、エチレングリコール、塩、及び緩衝液を含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることを含み、前記溶出緩衝液のｐＨは少なくとも７．０である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。 13 . _ The method described in item 1. 前記溶出緩衝液において、前記塩はＮａＣｌである、及び／または前記緩衝液はＴｒｉｓＨＣｌである、請求項１８に記載の方法。 18. The method of claim 18, wherein in the elution buffer, the salt is NaCl and / or the buffer is TrisHCl . 前記溶出緩衝液において、前記塩の濃度は約７５０ｍＭであり、前記緩衝液の濃度は約５０ｍＭであり、前記エチレングリコールは約５０～６０％（ｗ／ｗ）である、請求項１８または１９に記載の方法。 Claim 18 or 19 , wherein in the elution buffer, the concentration of the salt is about 750 mM, the concentration of the buffer is about 50 mM, and the ethylene glycol is about 50-60% (w / w). The method described. 溶出させることが、約２ｍＭの塩化マグネシウム、約５０ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ、約７５０ｍＭ～約１０００ｍＭのＮａＣｌ、及び少なくとも約５５％（ｗ／ｗ）のスクロースを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を少なくとも約８．０のｐＨで接触させることを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。 The elution buffer containing at least about 2 mM magnesium chloride, about 50 mM arginine-HCl, about 750 mM to about 1000 mM NaCl, and at least about 55% (w / w) sucrose and the affinity resin is at least about about. The method according to any one of claims 1 to 20 , comprising contacting at a pH of 8.0. 溶出させることが、
（ａ）約２０ｍＭ～約１００ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ及び約７５ｍＭ～約２５０ｍＭのＮａＣｌを含み、かつ約７．５～約８．５のｐＨを有する緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させること、及び
（ｂ）約２０ｍＭ～約１００ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ、約４０％（ｗ／ｗ）～約６０％（ｗ／ｗ）のグリセロール、及び約５００ｍＭ～１０００ｍＭの塩を含み、かつ約７．５～約８．５のｐＨを有する第２の溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させること
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。 To elute
(A) Contacting the affinity resin with a buffer solution containing about 20 mM to about 100 mM arginine-HCl and about 75 mM to about 250 mM NaCl and having a pH of about 7.5 to about 8.5. , And
(B) Containing about 20 mM to about 100 mM arginine-HCl, about 40 % (w / w) to about 60% (w / w) glycerol, and about 500 mM to 1000 mM salt , and about 7. 21. The method of claim 21 , further comprising contacting the affinity resin with a second elution buffer having a pH of 5 to about 8.5. 前記ステップが連続して実行される、請求項２２に記載の方法。 22. The method of claim 22 , wherein the steps are performed sequentially. 溶出させることが、約２ｍＭの塩化マグネシウム、約５０ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ、約７５０ｍＭ～約１０００ｍＭのＮａＣｌ、及び少なくとも約５０％（ｗ／ｗ）のグリセロールを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を少なくとも約８．０のｐＨで接触させることを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。 The elution buffer containing at least about 2 mM magnesium chloride, about 50 mM arginine-HCl, about 750 mM to about 1000 mM NaCl, and at least about 50% (w / w) glycerol and the affinity resin is at least about about. The method according to any one of claims 1 to 20 , comprising contacting at a pH of 8.0. 溶出させることが、約２ｍＭの塩化マグネシウム、約５０ｍＭのタウリン、約６００ｍＭ～約１０００ｍＭのＮａＣｌ、約０．０５～約０．２％のオクチルグリコピラノシド、及び少なくとも約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を少なくとも約７．８のｐＨで接触させることを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。 Elution can be about 2 mM magnesium chloride, about 50 mM taurine, about 600 mM to about 1000 mM NaCl, about 0.05 to about 0.2% octylglycopyranoside, and at least about 60% (w / w). The method according to any one of claims 1 to 20 , which comprises contacting the elution buffer solution containing ethylene glycol of) with the affinity resin at a pH of at least about 7.8. 溶出させることが、約２０％（ｗ／ｗ）のスクロース、約１０％（ｗ／ｗ）のソルビトール、約５％（ｗ／ｗ）のマンニトールまたは約５％（ｗ／ｗ）のスクロース、約１５％（ｗ／ｗ）のグリセロール、約５０ｍＭのヒスチジン、及び約７５０ｍＭ～約１０００ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を少なくとも約７．８のｐＨで接触させることを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。 Elution can be about 20% (w / w) sucrose, about 10% (w / w) sorbitol, about 5% (w / w) mannitol or about 5% (w / w) sucrose, about. A claim comprising contacting the affinity resin with an elution buffer containing 15% (w / w) glycerol, about 50 mM histidine, and about 750 mM to about 1000 mM NaCl at a pH of at least about 7.8. The method according to any one of 1 to 20 . 溶出させることが、約１００ｍＭのグリシン－ＨＣｌ、及び約２００ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を約２．５のｐＨで接触させることを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。 Any one of claims 1-20 , wherein elution comprises contacting the affinity resin with an elution buffer containing about 100 mM glycine-HCl and about 200 mM NaCl at a pH of about 2.5. The method described in. 溶出させることが、０～１００％の勾配で２０～５０ｍＭの塩酸／０．５～２．０ｍＭの塩酸中の８００～１２００ｍＭのＮａＣｌを適用することをさらに含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。 Any of claims 1-20 , further comprising applying 800-1200 mM NaCl in 20-50 mM hydrochloric acid / 0.5-2.0 mM hydrochloric acid at a gradient of 0-100%. The method described in paragraph 1 . （ａ）前記ＡＡＶがＡＡＶ８であり、前記アフィニティ樹脂がＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８であり、前記溶出緩衝液が酸性でかつエチレングリコールを含まない；
（ｂ）前記ＡＡＶがＡＡＶ９であり、前記アフィニティ樹脂がＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９であり、前記溶出緩衝液が酸性でかつエチレングリコールを含まない；
（ｃ）前記ＡＡＶがＡＡＶ８であり、前記アフィニティ樹脂が、クロマトグラフィーマトリックス上に固定化されたタイプＡＤＫ８またはＡＤＫ８／９からのＡＡＶ８に対する固定化されたモノクローナル抗体からなる免疫アフィニティ樹脂である；または
（ｄ）前記ＡＡＶがＡＡＶ９であり、前記アフィニティ樹脂が、クロマトグラフィーマトリックス上に固定化されたタイプＡＤＫ９またはＡＤＫ８／９からのＡＡＶ９に対する固定化されたモノクローナル抗体からなる免疫アフィニティ樹脂である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。 (A) The AAV is AAV8, the affinity resin is POROS ™ CaptureSelect ™ AAV8, and the elution buffer is acidic and free of ethylene glycol;
(B) The AAV is AAV9, the affinity resin is POROS ™ CaptureSelect ™ AAV9, and the elution buffer is acidic and free of ethylene glycol ;
(C) The AAV is AAV8 and the affinity resin is an immunoaffinity resin consisting of a monoclonal antibody immobilized against AAV8 from type ADK8 or ADK8 / 9 immobilized on a chromatographic matrix; or
(D) A claim that the AAV is AAV9 and the affinity resin is an immunoaffinity resin consisting of a monoclonal antibody immobilized against AAV9 from type ADK9 or ADK8 / 9 immobilized on a chromatographic matrix. The method according to any one of 1 to 28 . 溶出させることが、約１ｍＭのＨＣｌを含む溶出液と前記アフィニティ樹脂を約３．２のｐＨで接触させることを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 20, wherein elution comprises contacting the affinity resin with an eluate containing about 1 mM HCl at a pH of about 3.2 . 溶出させることが、約３０ｍＭ～約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約７００～約９００ｍＭのＮａＣｌ、及び約４０％～６０％（ｗ／ｗ）のＤＭＳＯを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を約７．５～８．５のｐＨで接触させることを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。 The elution buffer containing about 30 mM to about 70 mM TrisHCl, about 700 to about 900 mM NaCl, and about 40% to 60% (w / w) DMSO and the affinity resin from about 7.5 to. The method according to any one of claims 1 to 20, comprising contacting at a pH of 8.5 . 溶出させることが、約２ＭのＭｇＣｌ ２ 、及び約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を約７．４のｐＨで接触させることを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
 17 . _ The method described .
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