JPWO2019130549A1 - モノクローナル抗体の検出結果を向上する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1. 以下のステップ:
(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、
(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び
(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によって検出するステップ
を含む、サンプル中のモノクローナル抗体の検出方法であって、ステップ(a)の後に、
(a')酸性条件下での還元反応を行うステップ
を更に含む、上記方法。
2. ステップ(a')を、有機リン系還元剤の存在下でのインキュベーションによって実施する、上記1記載の方法。
3. 有機リン系還元剤が、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(Tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP)又はその塩酸塩である、上記2記載の方法。
4. TCEPの濃度が100〜500 mMである、上記3記載の方法。
5. pH2.5以下の強酸性条件下でステップ(a')を実施する、上記1〜4のいずれか記載の方法。
6. ステップ(a')の還元反応の時間が10〜60分間である、上記1〜5のいずれか記載の方法。
7. LC-MSによって検出するペプチド断片が重鎖由来のものである、上記1〜6のいずれか記載の方法。
(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、
(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び
(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によって検出するステップ
を含む、サンプル中のモノクローナル抗体の検出方法であって、ステップ(a)の後に、
(a')酸性条件下での還元反応を行うステップ
を更に含む、上記方法を提供する。
本発明の方法のステップ(a)は、サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップに相当する。
本発明の方法では、上記のステップ(a)の後で、酸性条件下での還元反応を行うステップ(a')を実施する。
本発明の方法のステップ(b)は、上記ステップ(a)で得られたモノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップに相当する。
本発明の方法のステップ(c)は、選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によって検出するステップに相当する。
特に限定するものではないが、本発明の方法においては、LC-MSによって検出するペプチド断片を重鎖由来のものとすることが好ましい。
Immunoglobulin Collection Resin(本発明における多孔質体の懸濁液)
Wash Solution 1(洗浄溶液)
Wash Solution 2(洗浄溶液)
Reaction Solution(反応溶液)
Enhanced Reaction Solution(反応促進溶液)
Reaction Stop Solution(反応停止溶液)
FG Beads Trypsin DART(登録商標、プロテアーゼを固定したナノ粒子(粒径200nm)の懸濁液)
<ステップ(a)>
1.モノクローナル抗体が含まれる生物学的サンプル5-10μLを約10-20倍量のPBS+0.1% n-オクチルチオグリコシド (OTG)に希釈する。
2.Immunoglobulin Collection Resin (TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F, 50% slurry)を25μL加える。
3.5分程度穏やかにボルテックス攪拌する。
4.ウルトラフリーlow-protein binding Durapore PFDF (0.22μm)に全量回収する。
5.上清を遠心除去する(10,000g x 1分間)。
6.PBS+0.1% OTGを300μL加え、上清を遠心除去する(10,000g x 1分間)。
7.ステップ6を繰り返す。
8.界面活性剤を除くため、PBSを300μL加え、上清を遠心除去する(10,000g x 1分間)。
9.ステップ8を繰り返す。
10.Reaction solutionもしくはEnhanced Reaction Solutionを75-100μL加える。この溶液には10 fmol/μLのP14R合成ペプチドを添加しておく。
11.化学修飾トリプシンを固相したFG beads(0.5 mg/ml FGbeads懸濁液)を5-10μL加える。
12.飽和蒸気圧下50℃にて、穏やかに攪拌しながら4-6時間反応を行う。
13.反応液に10%ギ酸を10μL加えることで反応を停止する。
14.遠心ろ過(10,000g x 1分間)し、溶液を回収する。
15.磁気スタンドに立て、約1-2分間静置し、余剰樹脂を除去する。
16.LCMS分析に供する。
測定対象としてトシリズマブを用い、「nSMOL Antibody BA Kit」(島津製作所)を使用して、サンプル中のトシリズマブの検出方法のためのプロトコルを検討した。
得られた懸濁液をフィルターカップに移し、遠心分離(10,000 g x 1 分間)して上清を除去した。
Wash Solution 2を300μL加えて遠心分離する操作を3回繰り返した。
Reaction Stop Solutionを5μL加え、遠心ろ過をして、磁気分離によって溶液を回収した。
測定は、トシリズマブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列に基づいて、以下の表1に示す5種のペプチドをFab領域に存在するモニターペプチドとして選択し、それぞれについて実施した。
TCEP添加による多孔質体からの抗体分子(トシリズマブ)の脱離の有無を確認するために、抗体分子を保持したImmunoglobulin Collection Resin懸濁液に250 mM TCEP(pH1.5又はpH7.0)を添加して30分間室温で静置した後、溶液(フロースルー)及びプロテインAビーズ上のタンパク質をSDS-PAGEにより分離した。対照として、25 mM Tris-HCl(pH8.0)を添加して同様に静置したものを泳動した。結果を図2に示す。
実施例1において良好な検出結果をもたらし、重鎖由来のペプチドであるVTMLR(配列番号2)をシグネチャーペプチドとして選択し、実施例1と同様の条件で、250 mM TCEP(pH1.5又はpH7.0)を添加したサンプルで測定を行った。
250 mM TCEP(pH1.5)を添加したサンプルで、室温で静置する時間(還元反応時間)を変えて、検出結果を比較した。測定は、VTMLR(配列番号2)をシグネチャーペプチドとして実施例1と同様にして行った。
血漿へのトシリズマブの添加量を変更して、250 mM TCEP(pH1.5)の添加による検出結果が低い抗体濃度においても向上することを確認した。測定は、VTMLR(配列番号2)をシグネチャーペプチドとして実施例1と同様にして行った。
250 mM TCEP(pH1.5)を添加して30分間静置するステップを含める以外は実施例1と同様の条件で、0.25〜300μg/mLの濃度範囲のトシリズマブを含有するサンプルを分析した。測定は、VTMLR(配列番号2)をシグネチャーペプチドとして実施例1と同様にして行った。
種々の抗体を用いて、250 mM TCEP(pH1.5)を添加して30分間静置するステップを含める以外は実施例1と同様の条件で測定を行った。セツキシマブ(ブリストル・マイヤーズスクイブ社)、リツキシマブ(全薬工業株式会社)、ブレンツキシマブ(武田薬品工業株式会社)、イピリムマブ(小野薬品工業株式会社)、ニボルマブ(小野薬品工業株式会社)、ベバシズマブ(中外製薬株式会社)、アダリムマブ(アッヴィ合同会社)、トラスツズマブ(中外製薬株式会社)、ラムシルマブ(日本イーライリリー株式会社)、インフリキシマブ(田辺三菱製薬株式会社)、メポリズマブ(グラクソ・スミスクライン株式会社)、モガムリズマブ(協和発酵キリン株式会社)のそれぞれについて、アミノ酸配列情報等に基づいて表3に示すシグネチャーペプチドを選択し、250 mM TCEP(pH1.5)の添加の有無での検出結果を比較した。
Claims (7)
- 以下のステップ:
(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、
(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行うステップ、及び
(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)によって検出するステップ
を含む、サンプル中のモノクローナル抗体の検出方法であって、ステップ(a)の後に、
(a')酸性条件下での還元反応を行うステップ
を更に含む、上記方法。 - ステップ(a')を、有機リン系還元剤の存在下でのインキュベーションによって実施する、請求項1記載の方法。
- 有機リン系還元剤が、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(Tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP)又はその塩酸塩である、請求項2記載の方法。
- TCEPの濃度が100〜500 mMである、請求項3記載の方法。
- pH2.5以下の強酸性条件下でステップ(a')を実施する、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- ステップ(a')の還元反応の時間が10〜60分間である、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- LC-MSによって検出するペプチド断片が重鎖由来のものである、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
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