JPWO2019054409A1 - Ｈｌａタンパク質に相互作用する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キット - Google Patents

Ｈｌａタンパク質に相互作用する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キット Download PDF

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Abstract

ＨＬＡタンパク質に相互作用する薬物のスクリーニング方法は、（ａ）結合物質が結合したＨＬＡタンパク質を調製する工程と、（ｂ）ｐＨを弱酸性に調節する前又は後に被検物質を添加する工程と、（ｃ）弱酸性下において静置する工程と、（ｄ）ｐＨを中性に調節した後、１〜４８時間静置する工程と、（ｅ）ＨＬＡタンパク質と被検物質との結合の度合いを測定し、ＨＬＡタンパク質に被検物質が結合していると判断される場合、被検物質がＨＬＡタンパク質に相互作用していると判定する工程と、を含む。

Description

本発明は、ＨＬＡタンパク質に相互作用する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットに関する。
ヒト白血球型抗原−Ｉ（ＨＬＡ−Ｉ）は細胞膜貫通型の糖タンパク質分子であり、病原体由来の抗原をＣＤ８陽性Ｔ細胞上へ提示することで生体防御へと貢献している。
特定の型のＨＬＡ−Ｉを持つ場合にのみ低分子薬による副作用リスクが増大するという報告がある（非特許文献１）。代表例として、抗ＨＩＶ薬のアバカビルが挙げられる。アバカビルがＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１のペプチド収容溝へ特異的に結合することで、本来提示されるものとは異なる長さや配列のペプチド抗原が提示され、そのために異常な免疫応答が誘導され、過敏症を引き起こすことが知られている（非特許文献２、３）。その他、コホート研究によって、ＨＬＡに相互作用することで異常な免疫応答を引き起こす薬物がいくつか特定されている。
ＨＬＡ−Ｇは非古典的ＨＬＡクラスＩ分子の一種で、３つのドメイン（α１−α２−α３）からなる重鎖、ｈｕｍａｎ β２ ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ｈβ２ｍ）及びペプチドで構成される複合体分子である（図１）。発明者らは、可溶性ＨＬＡ−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）を関節炎モデルマウスに投与すると、受容体を介して免疫抑制効果を示すことや、その際に体重減少等の副作用が現れないことを見出している（非特許文献４）。
Ｂｈａｒａｄｗａｊ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５２，４０１−４３１（２０１２）． Ｏｓｔｒｏｖ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＭＨＣ−ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｓｅｌｆ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９，９９５９−９９６４（２０１２）． Ｉｌｌｉｎｇ，Ｐ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｅ ｓｅｌｆ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｄｒｕｇ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＨＬＡ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４８６，５５４−５５８（２０１２）． Ｋｕｒｏｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ ＨＬＡ−Ｇ ｄｉｍｅｒ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７４，４３３−４３８（２０１３）．
ＨＬＡに相互作用する薬物のスクリーニング系は、今まで報告がなされていなかった。ＨＬＡに相互作用し得る薬物が、ＨＬＡ分子の物理化学的特性に起因して、ＨＬＡのペプチド収容溝に安定的に収容され得ないと考えられているためである。また、コホート研究によって、ＨＬＡに相互作用することで異常な免疫応答を引き起こす薬物がいくつか特定されているものの、手間も時間も要するコホート研究では、ＨＬＡに相互作用する薬物を迅速かつ簡便にスクリーニングすることは到底なし得ないものであった。このため、ＨＬＡに相互作用する薬物のスクリーニング系の開発が待たれている状況にあった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ＨＬＡと相互作用する物質を迅速かつ簡便にスクリーニングすることができるスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るＨＬＡタンパク質に相互作用する物質のスクリーニング方法は、
（ａ）結合物質が結合したＨＬＡタンパク質を調製する工程と、
（ｂ）ｐＨを弱酸性に調節する前又は後に被検物質を添加する工程と、
（ｃ）弱酸性下において静置する工程と、
（ｄ）ｐＨを中性に調節した後、１〜４８時間静置する工程と、
（ｅ）前記ＨＬＡタンパク質と前記被検物質との結合の度合いを測定し、前記ＨＬＡタンパク質に前記被検物質が結合していると判断される場合、前記被検物質が前記ＨＬＡタンパク質に相互作用すると判定する工程と、
を含む。
例えば、前記工程（ｃ）において、静置時間は、３秒間〜５時間である。
例えば、前記工程（ｂ）において、前記ＨＬＡタンパク質に対する前記被検物質の添加量比は、１：１〜１：１０である。
例えば、前記工程（ｅ）において、沈殿法、ＤＳＦ及びＤＳＣからなる群より少なくとも１つ選択される方法によって前記ＨＬＡタンパク質と前記被検物質との結合の度合いを測定する。
例えば、前記工程（ｅ）において、前記被検物質の濃度依存的に前記ＨＬＡタンパク質と前記被検物質との結合の度合いが高くなる場合、前記被検物質が前記ＨＬＡタンパク質に相互作用すると判定する。
例えば、前記結合物質は、ペプチドである。
例えば、前記ＨＬＡタンパク質に前記被検物質が結合していると判断される場合、前記被検物質による副作用のリスクが高いと判定される。
例えば、前記工程（ａ）において、前記ＨＬＡタンパク質を宿主細胞に発現させる。
本発明の第２の観点に係るＨＬＡタンパク質に相互作用する物質のスクリーニング用キットは、結合物質が結合したＨＬＡタンパク質を含む。
例えば、前記結合物質は、ペプチドである。
本発明によれば、ＨＬＡと相互作用する物質を迅速かつ簡便にスクリーニングすることができるスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することができる。
ＨＬＡ−Ｇの細胞外ドメインの構造を模式的に表す図である。 本実施形態のスクリーニング方法の概略を模式的に説明する図である。 ＨＬＡ−Ｇが提示するペプチドの報告例を表す図である。 （ａ）はＨＬＡ−Ｇタンパク質の調製（発現、巻き戻し）を模式的に表す図であり、（ｂ）は一本鎖ＨＬＡの大腸菌発現用のコンストラクトを用いてＨＬＡ−Ｇタンパク質を調製する方法を模式的に表す図である。 （ａ）は大腸菌発現用プラスミドの構造を表す図であり、（ｂ）は陰イオン交換クロマトグラフィーによる分析結果を示す図であり、（ｃ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す図である。 （ａ）は各ｐＨ条件下でのＣＤスペクトル測定の結果を表す図であり、（ｂ）は各ｐＨ条件下での構造サンプルの割合を表す図であり、（ｃ）はＨＬＡ−Ｇのαヘリックス構造を模式的に表す図である。 （ａ）はｐＨ５．０条件下で抗原解離状態となったＨＬＡ−Ｇに、本来提示していたものとは異なる抗原を新たに添加することで、抗原がＨＬＡ−Ｇに結合するか否かについて模式的に表した図であり、（ｂ）はｐｅｐＷＴとｐｅｐＲ５Ｋとの配列を表す図であり、（ｃ）はｐｅｐＲ５Ｋを持つＨＬＡ−Ｇのゲル濾過クロマトグラフィーを行うと、ＨＬＡ−Ｇタンパク質由来の２８０ｎｍの吸収と同位置にＦＩＴＣ由来の４９４ｎｍの吸収が確認できることを表すグラフ図である。 ゲル濾過クロマトグラフィーによるＨＬＡ−Ｇ抗原間の相互作用解析の実験系を表す図である。 （ａ）はゲル濾過クロマトグラフィーによるＨＬＡ−Ｇ抗原間の相互作用解析の結果を表す図であり、（ｂ）は各系におけるＨＬＡ−Ｇ抗原間の相互作用の有無を表す図であり、（ｃ）は４９４ｎｍの吸収由来のシグナルと２８０ｎｍの吸収由来のシグナル面積比を表す図である。 （ａ）は抗原が再度結合したＨＬＡ−Ｇと抗原解離状態のＨＬＡ−Ｇの間で安定性に差が生じているか否かについて模式的に表した図であり、（ｂ）は示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）におけるタンパク質の状態と変性温度Ｔｍとの関係を表すグラフ図である。 （ａ）はＨＬＡ−Ｇを酸性条件に曝す際にＷＴのペプチドを加える系とコントロールとしてＤＭＳＯを加える系とを表す模式図であり、（ｂ）はＤＳＦ測定の結果を表す図であり、（ｃ）は変性温度（Ｔｍ）及び極大蛍光強度（ＦＩｍａｘ）を表す図である。 （ａ）は「ペプチドあり；＋」と「ペプチドなし；−」での溶液中のタンパク質の安定化について説明した図であり、（ｂ）はＨＬＡ−Ｇタンパク質溶液の３段階の希釈系列でのＤＳＦの結果を表す図である。 本実施形態のスクリーニング方法におけるＨＬＡ−Ｇタンパク質の安定化にについて模式的に表す図である。 本実施例のスクリーニング方法の工程を表す図である。 北大の既存薬ライブラリーを表す図である。 （ａ）は本実施例のスクリーニング方法の評価モデルを説明する図であり、（ｂ）は本実施例のスクリーニング方法の評価方法を説明する図である。 （ａ）は化合物の濃度依存性確認試験の概要を表す図であり、（ｂ）はｐｅｐＷＴ及びモックペプチドのＨＬＡ−Ｇへの結合性及び配列を表す図である。 （ａ）は化合物の濃度依存性確認試験の概要を表す図であり、（ｂ）はｐｅｐＷＴ及びモックペプチドのＤＳＦの結果を表す図であり、（ｃ）は変性温度（Ｔｍ）及び極大蛍光強度（ＦＩｍａｘ）を表す図である。 （ａ）は化合物の濃度依存性確認試験の概要を表す図であり、（ｂ）はｐｅｐＷＴ及びモックペプチドのＤＳＦの結果を表す図であり、（ｃ）は変性温度（Ｔｍ）及び極大蛍光強度（ＦＩｍａｘ）を表す図である。 ２６のヒット化合物の構造を示す図である。 ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１タンパク質の精製について示した図であり、（ａ）はゲル濾過クロマトグラフィーの結果、（ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した結果を示す図である。 （ａ）はアバカビルのＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１への結合確認試験の結果を表す図であり、（ｂ）は（ａ）のグラフの曲線を微分してピークを求めた結果を表す図であり、（ｃ）はＴｍを表す図である。
まず、本実施形態のヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）タンパク質に相互作用する物質のスクリーニング方法について詳細に説明する。
本実施形態のＨＬＡタンパク質に相互作用する物質のスクリーニング方法は、
（ａ）結合物質が結合したＨＬＡタンパク質を調製する工程と、
（ｂ）ｐＨを弱酸性に調節する前又は後に被検物質を添加する工程と、
（ｃ）弱酸性下において静置する工程と、
（ｄ）ｐＨを中性に調節した後、１〜４８時間静置する工程と、
（ｅ）前記ＨＬＡタンパク質と前記被検物質との結合の度合いを測定し、前記ＨＬＡタンパク質に前記被検物質が結合していると判断される場合、前記被検物質が前記ＨＬＡタンパク質に相互作用すると判定する工程と、
を含む。
本実施形態のスクリーニング方法は、ＨＬＡタンパク質に相互作用する物質をスクリーニングするための方法である。ここでいう「物質」とは、ＨＬＡタンパク質に相互作用するあらゆる物質が含まれ、より具体的には、化合物（低分子化合物を含む）、核酸、ペプチド、抗体等及びこれらを含む医薬組成物；サプリメント；化粧品等が例示される。ＨＬＡのペプチド収容溝に特定の物質（例えば、化合物（低分子薬など））が特異的に結合することで、本来提示されるものとは異なる長さや配列のペプチド抗原が提示され、そのために異常な免疫応答が誘導され、過敏症などの副作用を引き起こすことが知られている。このような物質とＨＬＡとの相互作用を評価できる方法は、今まで報告がなされていなかった。本実施形態のスクリーニング方法によって、ＨＬＡと相互作用する物質を迅速かつ簡便にスクリーニングすることができ、該物質による副作用リスクの予測及び回避等に貢献することができる。
ＨＬＡ−Ｇを例にとって、本実施形態のスクリーニング方法を説明する。図２に示すように、ＨＬＡ−Ｇの細胞外ドメインを弱酸性下環境にさらすことによりＨＬＡ−Ｇの構造を不安定化させて、結合物質（ペプチド）を解離させる（図２において「ペプチドフリーＨＬＡ−Ｇ」）。そこへ、新たな抗原の代わりに被検物質（後述、図２において「ｄｒｕｇ」）を過剰量加え、かつ中性環境に戻すことで巻き戻りを起こす。ＨＬＡ−Ｇのペプチド収容溝に薬物が保持した安定的な構造体を形成した場合（図２において「Ｈｉｔ」）、該被検物質は「ＨＬＡ−Ｇと相互作用する物質」又は「ＨＬＡ−Ｇと相互作用し得る物質」と判定することができる。
本明細書において、「ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）タンパク質」には、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−Ｅ等、あらゆるタイプが含まれ、ＨＬＡクラスＩＩの全般もまた含まれ得る。また、本明細書において「ＨＬＡ」には、フルサイズのＨＬＡに加えて、相互作用する物質が結合する部位（例えば、ペプチド収容溝）が残存し、その結合能を維持している状態（例えば、ペプチド収容溝を残存させてサイズダウンした状態）のＨＬＡも包含される。
本明細書において、「結合物質」には、ＨＬＡタンパク質に結合し得るあらゆる物質が含まれ、より具体的には、ＨＬＡのペプチド収容溝に保持されて提示され得るペプチド、化合物等をいう。ＨＬＡ−Ｇの場合、図３に示されるペプチドが例示される。「結合物質」として、各種ＨＬＡのペプチド収容溝に保持されて提示され得るペプチド、化合物等であれば、特に制限なく用いることができる。なお、後述するカイコを用いた方法によって“結合物質が結合したＨＬＡタンパク質”を調製する場合、「結合物質」はカイコの体内物質由来のものであってもよい。
本明細書において、「被検物質」には、ＨＬＡタンパク質に相互作用し得るあらゆる物質が含まれ、より具体的には、化合物（低分子化合物を含む）、核酸、ペプチド、抗体等及びこれらを含む医薬組成物；サプリメント；化粧品等が例示される。
工程（ａ）において、結合物質が結合したＨＬＡタンパク質を調製する方法は、例えば、ＨＬＡタンパク質を宿主細胞に発現させる方法であってもよく、図４（ａ）に示すように、例えば、ＨＬＡ重鎖を封入体として大量発現させ、その後、希釈法による巻き戻しを行う方法が挙げられる。
ＨＬＡタンパク質の重鎖を大量発現させる方法としては、例えば、下記が挙げられる。
大腸菌を宿主細胞とする場合には、ベクターとしては、複製起点（ｏｒｉ）を有し、さらに形質転換された宿主を選択するための遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン又はクロラムフェニコールなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子など）を有していることが好ましい。また、発現ベクターの場合には、宿主においてＨＬＡタンパク質を効率よく発現させることができるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーターまたはＴ７プロモーターなどを持っていることが好ましい。このようなベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア）、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ（キアゲン）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１を使用することが好ましい）などが挙げられる。また、ベクターには、ＨＬＡタンパク質の収量をあげるためのシグナル配列などを付加することもできる。
宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。また、可溶性を向上させるためのタグ、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼやチオレドキシン、マルトース結合タンパク質をコードする配列が付加されていてもよい。また、精製を容易にすることを目的にした設計されたタグ、例えばポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃエピトープ、ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ、Ｔ７エピトープ、ＸｐｒｅｓｓタグやＦＬＡＧペプチドタグ、その他の既知のタグ配列をコードする配列が付加されていてもよい。
大腸菌以外にも、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えばＢａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、原核生物および真核生物のいずれでもよい。例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、あるいは昆虫細胞、例えば、カイコ、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５などを用いることができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）が知られている。原核細胞を使用する場合は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
なお、ＨＬＡタンパク質として、市販されているものを用いてもよく、オーダーメイドによって作製された「結合物質が結合したＨＬＡタンパク質」を用いてもよい。
希釈法による巻き戻しを行う方法としては、例えば、ＨＬＡ−Ｇの場合、一例として以下が挙げられる。ＨＬＡ−Ｇは、重鎖、ｈβ２ｍ及びペプチドからなるヘテロ３量体であるため、これらタンパク質を巻き戻すために、巻き戻りが起こりやすいｈβ２ｍ、ペプチド、重鎖の順で順次巻き戻しを行う。まず単独で安定に巻き戻るｈβ２ｍを巻き戻しバッファー（例えば、０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１Ｍ Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、３．７３ｍＭ ｃｙｓｔａｍｉｎｅ、６．７３ｍＭ ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ）を用いて、所定の希釈系列で希釈を行った後、４℃で巻き戻しを行う。２４時間後、同巻き戻しバッファーに１００％ＤＭＳＯで溶解した結合物質（ＨＬＡ−Ｇのペプチド収容溝に安定的に収容されるペプチド、化合物等）を加え、続いて、可溶化したＨＬＡ−Ｇの封入体にＤＴＴを加え、室温で１時間インキュベートしたタンパク質溶液に対し、同巻き戻しバッファーを１滴ずつ、ｇｕａｎｉｄｉｎｅ濃度が１．５Ｍになるまで加える。希釈後の溶液を巻き戻しバッファーに１滴ずつ加え、タンパク質の終濃度が１−２μＭとなるように希釈した後、４℃で７２時間攪拌する。巻き戻し後のタンパク質溶液はＶＩＶＡＦｌｏｗ ｓｙｓｔｅｍ（ＭＷＣＯ：１０，０００、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（ＭＷＣＯ：１０，０００Ｄａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で限外ろ過濃縮を行う。
なお、カイコを用いた方法によって、上記の巻き戻しの工程を経ずに、安定的に“結合物質が結合したＨＬＡタンパク質”を調製できることが期待される（Ｓａｓａｋｉ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．３８７，５７５−５８０（２００９）を参照）。
工程（ａ）における結合物質が結合したＨＬＡタンパク質を調製する方法としては、例えば、一本鎖ＨＬＡの大腸菌発現用のコンストラクトを用いる方法も採用し得る。例えば、ＨＬＡ−Ｇの場合、図４（ｂ）に示すように、ｈβ２ｍのＣ末端と重鎖Ｎ末端をペプチドリンカー（例えば、（ＧＧＧＧＳ）３、（リンカーについては、Ｆａｖｉｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６，６−１３，（２０１１）．；Ｖｅｓｔ Ｈａｎｓｅｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１，３２−３８，（２００１）．；Ｔａｆｕｒｏ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１，４４０−４４９，（２００１）．；Ｃｒｅｗ，ＭＤ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２，１２０５−１２１４，（２００５）．等を参照して配列及び長さを適宜設計し得る））で繋いだ一本鎖ＨＬＡ−Ｇ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ＨＬＡ−Ｇ；ｓｃＨＬＡ−Ｇ）の大腸菌発現用のコンストラクトを用いて、ペプチドが結合したＨＬＡ−Ｇを調製することができる。このような一本鎖ＨＬＡの大腸菌発現用のコンストラクトを用いて結合物質が結合したＨＬＡタンパク質を調製することで、従来と比較して調製が容易で、かつ調製コストの削減に繋がることが期待される。
工程（ｂ）において、工程（ａ）で得られた“結合物質が結合したＨＬＡタンパク質”に、被検物質が添加される。ＨＬＡタンパク質に対して過剰量の被検物質が加えられ、その量比は、例えば、ＨＬＡタンパク質：被検物質＝１：１〜１：１０、好ましくはＨＬＡタンパク質：被検物質＝１：１〜１：６である。工程（ｂ）の具体的な方法としては、各被検物質が分注された各ウェルに、工程（ａ）で調製したタンパク質を分注する方法が例示される。
工程（ｂ）における被検物質の添加は、ｐＨを弱酸性に調節する前又は後に行われる。つまり、工程（ａ）で得られた“結合物質が結合したＨＬＡタンパク質”に被検物質を添加した後にｐＨを弱酸性に調節してもよく、ｐＨを弱酸性に調節した後に工程（ａ）で得られた“結合物質が結合したＨＬＡタンパク質”に被検物質を添加してもよい。弱酸性のｐＨは、例えば、４．０以上７．０未満であり、例えば、ＨＬＡ−Ｇタンパク質の場合、好ましくはｐＨ５．０である。ｐＨを弱酸性に調節することで、ＨＬＡタンパク質の構造を不安定化させて、ＨＬＡタンパク質から結合物質を解離させることができる。例えば、ＨＬＡ−Ｇの場合、ｐＨを弱酸性に調節することで、ペプチド収容溝の領域にのみ存在するαヘリックス構造が消失し、結合物質が解離される。ｐＨは、例えば、１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅを添加することで弱酸性に調節される。弱酸性に調節することのできる物質であれば、特に制限されずに採用され得る。調節後のｐＨ値は、ＨＬＡの種類、ＨＬＡタンパク質の調製方法に依存して変動し、例えば、４．０以上７．０未満であり、例えば、ＨＬＡ−Ｇタンパク質の場合、好ましくはｐＨ５．０である。
工程（ｃ）は、弱酸性下で静置する工程である。
工程（ｃ）において、ｐＨを弱酸性下で、一定時間静置することで、ＨＬＡタンパク質に結合した結合物質と、被検物質と、が交換される。つまり、ＨＬＡタンパク質に相互作用する被検物質については、結合物質と交換されて、ＨＬＡタンパク質に結合する。静置時間については、ＨＬＡの種類、ＨＬＡタンパク質の調製方法に依存するが、数秒〜数時間、例えば３秒間〜５時間であり、例えば、ＨＬＡ−Ｇタンパク質の場合、好ましくは１〜３時間である。静置する際の温度は特に制限はなく、例えば室温である。弱酸性のｐＨは、前述同様である。
工程（ｄ）は、ｐＨを中性に調節した後、１〜４８時間静置する工程である。
工程（ｄ）において、ｐＨを中性に調節した後、１〜４８時間静置することで、ＨＬＡタンパク質と相互作用する被検物質の場合、ＨＬＡタンパク質のペプチド収容溝に被検物質が保持された状態で安定化される。ｐＨは、例えば、１Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ ｐＨ７．４、５Ｍ ＮａＣｌ及び超純水を加えて混合することで中性に調節される。中性に調節することのできる物質であれば、特に制限されずに採用され得る。調節後のｐＨ値は、ＨＬＡの種類、ＨＬＡタンパク質の調製方法に依存するが、例えば、７．０以上８．５未満であり、例えば、ＨＬＡ−Ｇタンパク質の場合、好ましくはｐＨ７．４である。静置時間についても、１〜４８時間の範囲内で、ＨＬＡの種類、ＨＬＡタンパク質の調製方法に依存し、例えば、ＨＬＡ−Ｇタンパク質の場合、１０〜２４時間である。静置する際の温度は特に制限はなく、例えば室温である。
工程（ｅ）は、ＨＬＡタンパク質と被検物質との結合の度合いを測定し、ＨＬＡタンパク質に被検物質が結合していると判断される場合、被検物質がＨＬＡタンパク質に相互作用すると判定する工程である。
工程（ｅ）において、「ＨＬＡタンパク質と被検物質との結合の度合いを測定」する方法として、例えば、以下の通り、沈殿法、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）等が例示される。例えば、沈殿法、ＤＳＦ及びＤＳＣからなる群より少なくとも１つ選択される方法によってＨＬＡタンパク質と被検物質との結合の度合いを測定してもよい。なお、ＨＬＡタンパク質と被検物質との結合の度合いを測定できる方法であれば、特に制限されることなく採用され得る。例えば、上記の沈殿法と組み合わせて、沈殿画分と分離した後の上清画分とに残存しているタンパク質量を定量することによりＨＬＡタンパク質と被検物質との結合の度合いを評価することができ、タンパク質量の定量には、例えばタンパク質濃度測定法（例えば、ＵＶスペクトル法、比色定量法など）を用いることができる。
沈殿法では、工程（ｄ）後の溶液を遠心分離し、沈殿が生じていない場合はＨＬＡタンパク質に被検物質が結合している、と判断できる。逆に、沈殿が生じている場合はＨＬＡタンパク質におおむね被検物質は結合していないが、中には結合しているものもある、と判断できる。沈殿法は、精度こそ高くはないが、一次スクリーニングとして簡便に用いることができる。
示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）では、タンパク質と蛍光色素とを含む試料の温度を経時的に変化させると、熱変性によってタンパク質内部の疎水性部位が露出し、ここに蛍光色素が相互作用することによる蛍光強度の増大が観察できる。ＤＳＦの利点として、少量の試料で測定が可能であること、短時間で多検体の測定が可能であることが挙げられ、これら利点からハイスループットな化合物スクリーニング手法として近年注目されている。ＤＳＦの方法としては、例えば、工程（ｄ）後の溶液を遠心分離して凝集体を除去し、上清にＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅを添加し、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ ｑＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、蛍光フィルター ＨＥＸ（Ｅｍ：５１５−５３５ｎｍ、Ｅｘ：５６０−５８０ｎｍ）を用いて、０．５℃／１５ｓｅｃ（２℃／ｍｉｎ）で１５℃から８５℃に温度変化させることで、変性温度Ｔｍ（温度を経時的に変化させると観察される蛍光強度の増大の変化の中点）及び相対蛍光強度の最大値ＦＩｍａｘを検証する方法が挙げられる。この場合、ネガティブコントロールに比して、変性温度Ｔｍ及び相対蛍光強度の最大値ＦＩｍａｘの少なくとも一方に変化がみられる場合、「ＨＬＡタンパク質に被検物質が結合する」又は「ＨＬＡタンパク質に被検物質が結合する可能性がある」と判断することができ、一方、測定開始時から高い蛍光強度を示す場合及びＴｍにもＦＩｍａｘにも変化がみられない場合、「ＨＬＡタンパク質に被検物質が結合していない」と判断することができる。図１６を例に挙げて説明すると、ＨＬＡタンパク質及び被検物質を添加せずにＤＳＦを行ったネガティブコントロール（図１６において「ＮＣ」）と比較して、Ｔｍ又はＦＩｍａｘに変化がみられる場合（図１６において「化合物Ａ」及び「化合物Ｂ」）に、「ＨＬＡタンパク質に被検物質が結合する」又は「ＨＬＡタンパク質に被検物質が結合する可能性がある」と判断することができる。一方で、測定開始時から高い蛍光強度を示す場合（図１６において「化合物Ｃ」）及びネガティブコントロールと比較してＴｍにもＦＩｍａｘにも変化がみられない場合（図１６において「化合物Ｄ」）、「ＨＬＡタンパク質に被検物質が結合していない」と判断することができる。また、さらに精度高くＨＬＡタンパク質への被検物質の結合を評価するために、被検物質の濃度を数段階変化させてＤＳＦを行い、Ｔｍ及びＦＩｍａｘの少なくとも一方に被検物質濃度依存的な変化がみられる場合に、「ＨＬＡタンパク質に被検物質が結合する」又は「ＨＬＡタンパク質に被検物質が結合する可能性がある」と判断してもよい。
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）では、ＤＳＦと同様にＨＬＡタンパク質への被検物質の結合の有無を判断することができ、ＤＳＦよりも精度高く結合性を判定することができる。ＤＳＣでは、Ｔｍ及び熱容量曲線の形状によって被検物質の結合の有無を判断することができる。
上記の通り工程（ｅ）において、ＨＬＡタンパク質と被検物質との結合の度合いを測定し、ＨＬＡタンパク質に被検物質が結合すると判断される場合、被検物質がＨＬＡタンパク質に相互作用していると判定することができる。本明細書において「被検物質がＨＬＡタンパク質に相互作用している」とは、被検物質がＨＬＡタンパク質に特異的に結合することを指し、例えば、被検物質がＨＬＡタンパク質のペプチド収容溝に特異的に結合することで、本来提示される抗原とは異なるものが提示されることをいう。
工程（ｅ）において、被検物質の濃度依存的にＨＬＡタンパク質と被検物質との結合の度合いが高くなる場合、被検物質がＨＬＡタンパク質に相互作用すると判定してもよい。より具体的には、工程（ｂ）においてＨＬＡタンパク質に対して、例えば３段階の希釈系例（例えば１、３、６等量）となるよう被検物質を添加し、例えばＤＳＦ測定によってＨＬＡタンパク質と被検物質との結合の度合いを測定し、被検物質の濃度依存的にＨＬＡタンパク質と被検物質との結合の度合いが高くなる場合、被検物質がＨＬＡタンパク質に相互作用すると判定することができる。被検物質の濃度依存性を検証することで、より高い精度で、ＨＬＡタンパク質への被検物質の結合の有無を判定することができる。
なお、工程（ｅ）において、ＨＬＡタンパク質と被検物質との結合の度合いを測定し、ＨＬＡタンパク質に被検物質が結合すると判断される場合、被検物質による副作用のリスクが高いと判定されてもよい。被検物質がＨＬＡタンパク質に特異的に結合することで、本来提示される抗原とは異なるものが提示され、そのために異常な免疫反応が誘導され、過敏症などを引き起こし得る。本明細書において「被検物質による副作用のリスクが高い」とは、被検物質がＨＬＡタンパク質に特異的に結合することで、異常な免疫反応が誘導され、過敏症などの副作用を引き起こす可能性があることをいう。
次に、本実施形態のスクリーニング用キットについて説明する。
本実施形態のスクリーニング用キットは、ＨＬＡタンパク質に相互作用する物質のスクリーニングのために用いることができ、“結合物質が結合したＨＬＡタンパク質”を含む。“結合物質が結合したＨＬＡタンパク質”については、前述同様である。なお、スクリーニング用キットには、溶液の状態で“結合物質が結合したＨＬＡタンパク質”が含まれていてもよく、凍結乾燥された状態の“結合物質が結合したＨＬＡタンパク質”が含まれていてもよい。
以上説明したように、本実施形態のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットによって、ＨＬＡと相互作用する物質を迅速かつ簡便にスクリーニングすることができ、例えば薬物による副作用リスクの予測及び回避に貢献することができる。それによって、特定の型のＨＬＡを持つ人に対する低分子医薬品の処方への判断材料を提供することが可能になる。また、組織移植手術時に併用される薬剤や金属器具類等由来のアレルギー反応が起こらないかをチェックし、手術環境を改善することができる。また、化粧品や塗布薬などの開発において、ＨＬＡに結合、すなわちアレルギー反応を誘発する可能性がある化合物を除外すること等への応用が可能となる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
ＨＬＡ−Ｇ分子と相互作用する薬物を見出すことを目的とし、ＨＬＡ−Ｇと薬物との相互作用を評価するためのスクリーニング系を構築した。
各種評価を行うために必要なＨＬＡ−Ｇタンパクの調製を行った。以下の通り、大腸菌発現系を用いてＨＬＡ−Ｇ重鎖を封入体として発現させ、β２ｍ及びペプチドとともに希釈法による巻き戻しを行った（図４（ａ））。
ＨＬＡ−Ｇ組換えタンパク質は、以下の手法を用いて大腸菌内に封入体として発現させ、可溶化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、６Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）に完全に可溶化させた。
（大腸菌発現用プラスミド）
ＨＬＡ−Ｇ１はＮ末端からシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通領域、細胞内ドメインで構成されている。大腸菌体内に封入体として発現させるため、シグナルペプチド及び膜貫通領域以下を除去し、Ｎ末端にメチオニン残基を付加した各ＨＬＡ−Ｇ１の細胞外ドメイン部分（Ｇｌｙ２５−Ｇｌｎ３００）（ＨＬＡ−Ｇ）（遺伝子配列：配列番号１（始めの３塩基の開始コドン及び終わりの３塩基の終止コドンを含む）、アミノ酸配列：配列番号２）がｐＧＭＴ７ベクターのＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩサイト間に組み込まれたプラスミド（図５（ａ））を使用した。
（プラスミドの調製）
プラスミド０．５μＬを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル１００μＬに加え、氷上に約２０分静置した後、４２℃で４５秒間インキュベートして形質転換した。形質転換後の大腸菌を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し３７℃で一晩培養した。得られたシングルコロニーを、終濃度１００μｇ／ｍＬになるようにアンピシリンを加えた２×ＹＴ培地５ｍＬに植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍの条件で一晩振盪培養した。培養液１．４ｍＬを１３，２００ｒｐｍ、１分間の条件で遠心分離し、上清を除去した。得られた大腸菌のペレットからアルカリ−ＳＤＳ法とＰＣＩ抽出、アルコール沈殿を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。
（大腸菌発現系を用いた封入体の調製）
ＨＬＡ−Ｇ組み換えタンパク質は、大腸菌体内に封入体として発現させた。タンパク質の大腸菌発現用のプラスミドで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天培地に播種後、３７℃で一晩培養した。得られたコロニーを５０μｇ／ｍＬアンピシリン、２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール含有２×ＹＴ培地（１０ｍＬ）に植菌し、３７℃で２〜４時間振盪培養した（前培養）。次に、前培養した１０ｍＬの菌液を５０μｇ／ｍＬアンピシリン、２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール含有２×ＹＴ培地（１Ｌ）へと植菌し、３７℃で振盪培養した。対数増殖前期であるＯＤ６００＝０．４〜０．６に達したら、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように加えて組換えタンパク質の発現を誘導し、その後３７℃で４時間振盪培養した。培養後の菌液を遠心分離（５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して大腸菌を回収した。菌体を懸濁バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で懸濁して、氷上で超音波破砕を行った。破砕液を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）、得られた沈殿を洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で懸濁することによって洗浄し、懸濁液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）する洗浄作業を３回繰り返した。洗浄後、得られた沈殿から界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を除去するために、懸濁バッファーを用いて沈殿を懸濁後、懸濁液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）する洗浄操作を３回繰り返し、封入体を得た。得られた封入体に可溶化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、６Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を加えて一晩４℃で振盪し、完全に可溶化した。封入体を可溶化させた後、各封入体溶液の吸光度を１μＬ分光光度計（ＮＤ−１０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて測定した。
（巻き戻し法による各タンパク質の調製）
ＨＬＡ−Ｇ組換えタンパク質の調製は、以下の手法にて行った。陰イオン交換クロマトグラフィーによる２段階目の精製時、バッファーとしてＡ ｂｕｆｆｅｒに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、Ｂ ｂｕｆｆｅｒに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌ又はＡ ｂｕｆｆｅｒに１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ ｐＨ７．４、Ｂ ｂｕｆｆｅｒに１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ ｐＨ７．４、１Ｍ ＮａＣｌを用いて行った。
ＨＬＡ−Ｇ組換えタンパク質は、封入体から希釈法による巻き戻しを行うことで調製した。ＨＬＡ−Ｇは重鎖、ｈβ２ｍ及びペプチドからなるヘテロ３量体である。これらタンパク質を巻き戻すために、巻き戻りが起こりやすいｈβ２ｍ、ペプチド、重鎖の順で順次巻き戻しを行った。まず単独で安定に巻き戻るｈβ２ｍを巻き戻しバッファー（０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１Ｍ Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、３．７３ｍＭ ｃｙｓｔａｍｉｎｅ、６．７３ｍＭ ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ）を用いて、タンパク質の終濃度が１〜２μＭとなるように希釈を行った後、４℃で巻き戻しを行った。２４時間後、同巻き戻しバッファーに１００％ＤＭＳＯで溶解したペプチド（ｐｅｐＷＴ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社より購入）、配列番号３）を終濃度０．０１ｍｇ／ｍＬになるように加えた。続いて、可溶化したＨＬＡ−Ｇの封入体にＤＴＴを終濃度１０ｍＭとなるように加え、室温で１時間インキュベートしたタンパク質溶液に対し、同巻き戻しバッファーを１滴ずつ、ｇｕａｎｉｄｉｎｅ濃度が１．５Ｍになるまで加えた。希釈後の溶液を巻き戻しバッファーに１滴ずつ加え、タンパク質の終濃度が１〜２μＭとなるように希釈した後、４℃で７２時間攪拌した。巻き戻し後のタンパク質溶液はＶＩＶＡＦｌｏｗ ｓｙｓｔｅｍ（ＭＷＣＯ：１０，０００、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（ＭＷＣＯ：１０，０００Ｄａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で限外ろ過濃縮を行った。
濃縮したタンパク質溶液はＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒシステム（ＧＥ社）を用いた２段階の液体クロマトグラフィーにて精製した。初めに、ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ社）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。この時、バッファーは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌを用いた。溶出画分の一部を使用し粗精製したＨＬＡ−ＧをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（ＭＷＣＯ：１０，０００Ｄａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で、限外ろ過法により脱塩処理及び濃縮操作を行い、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０にバッファー置換した濃縮タンパク質溶液を得た。この溶液をＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ １ｍＬカラム（ＧＥ社）を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。この時、Ａ ｂｕｆｆｅｒには２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、Ｂ ｂｕｆｆｅｒには２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌを用いて、Ｂ ｂｕｆｆｅｒが０％〜５０％／４０ｍＬの濃度となるようにグラジエントをかけて溶出を行った。精製後のタンパク質溶液の吸光度を１μＬ分光光度計（ＮＤ−１，０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて測定した。また、吸光度（Ａｂｓ）の測定値から紫外吸収法を用いて各タンパク質溶液の濃度を算出した。濃度算出時に用いたタンパク質の分子量は４３８０７Ｄａ、モル吸光係数は８９１５０Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍの値を用いた。
上記の通り、ゲル濾過クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーによる２段階の精製を行った。クロマトグラム（図５（ｂ））中に矢印で示したピークの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した結果、純度高くＨＬＡ−Ｇタンパク質が精製できていることを確認した（図５（ｃ））。
（遠紫外円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル測定による構造解析）
続いて、ＨＬＡ−Ｇが酸性条件下で構造変化を起こすか、それに伴いペプチドが解離するかを検討すべく、ｐＨ８．０、６．０、５．５及び５．０条件下でのＨＬＡ−ＧのＣＤスペクトル測定による構造解析を行った。
精製したＨＬＡ−Ｇタンパク質溶液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（ＭＷＣＯ：１０，０００ Ｄａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて、濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬになるまで限外ろ過濃縮を行うと同時に、以下の表（ＣＤスペクトル測定に用いた各バッファーの組成）に示す各バッファーに交換した。
バッファー交換後の溶液を室温で一晩インキュベートした後、溶液２００μＬを光路長１ｍｍの石英製角形キュベット（日本分光株式会社）に移し、円二色分散計（Ｊ−８２０、日本分光株式会社）を用いて測定を行った。測定は以下の表（ＣＤスペクトル測定条件）の条件で行い、測定で得られた楕円率θは、［θ］＝θ・１００／（ｌ・ｃ・Ａ）（ｌ：セル長（ｍ）、ｃ：残基モル濃度（Ｍ）、Ａ：吸光度（ｎｍ））の式により、平均モル残基楕円率［θ］（ｄｅｇ・ｃｍ２／ｄｍｏｌ）に換算して解析に用いた。
その結果、ｐＨ５．０条件下のＨＬＡ−Ｇでは、αヘリックス構造の消失を示唆するスペクトルが得られた（図６（ａ）、（ｂ））。ＨＬＡ−Ｇの立体構造より、らせん状のαヘリックス構造は、ペプチド収容溝の領域にのみ存在することがわかる（図６（ｃ））。このαへリックスは、抗原ペプチドと相互作用している。ｐＨ５．０条件下でαへリックスの消失が示唆されたことから（図６（ａ）、（ｂ））、ｐＨ５．０条件下で、ＨＬＡ−Ｇは抗原ペプチドを解離していることが示された。
次に、ｐＨ５．０条件下で抗原解離状態となったＨＬＡ−Ｇに、本来提示していたものとは異なる抗原（図７（ａ）において「抗原Ｂ」）を新たに添加することで、抗原がＨＬＡ−Ｇに結合するか否かについて検討すべく（図７（ａ））、抗原解離ＨＬＡ−Ｇと抗原の相互作用解析をゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）にて行った。抗原には、蛍光標識ペプチドＲ５Ｋ−ＦＩＴＣ（配列番号４）を用いた（図７（ｂ））。このペプチドはＷＴのペプチドの５番目のアルギニン残基を、側鎖アミノ基に蛍光化合物ＦＩＴＣが付加されたリシン残基に置き換えたペプチドである。以前より、このペプチドがＨＬＡ−Ｇに結合すること、このペプチドを持つＨＬＡ−Ｇのゲル濾過クロマトグラフィーを行うと、ＨＬＡ−Ｇタンパク質由来の２８０ｎｍの吸収と同位置にＦＩＴＣ由来の４９４ｎｍの吸収が確認できることが明らかとなっている（図７（ｃ））。このペプチドが抗原解離ＨＬＡ−Ｇに結合するか否かについて、ゲル濾過クロマトグラフィーにて検討した。
本実験には計５つの測定系を用意した（図８）。実験のコントロールとして、ＨＬＡ−Ｇを酸性条件下に曝した後、蛍光標識ペプチド（図８において「ｐｅｐＲ５Ｋ−ＦＩＴＣ」、以下同）を加えずに中性条件に戻した系（Ｉ）、蛍光標識ペプチドのみを測定した系（ＩＩ）、中性条件のＨＬＡ−Ｇに蛍光標識ペプチドを加えた系（ＩＩＩ）を用意した。これらに対し、抗原解離ＨＬＡ−Ｇと蛍光標識ペプチドの結合を評価する系として、ＨＬＡ−Ｇを酸性条件下に曝し、中性条件へ戻すとともに蛍光標識ペプチドを加えた系（ＩＶ）及びＨＬＡ−Ｇを酸性条件下に曝すと同時に蛍光標識ペプチドを加え、中性条件へ戻した系（Ｖ）を用意した。以上の計５つの測定系について評価を行った。なお、酸性条件下に曝したＨＬＡ−Ｇからは凝集体と思われる沈殿が確認できたため、これを遠心分離にて除いた後、測定を行った。
実験方法について説明する。上記の通り調製したＨＬＡ−Ｇタンパク質溶液（ペプチド：ｐｅｐＷＴ、バッファー：Ｔｒｉｓバッファー、タンパク質濃度：５．６ｍｇ／ｍＬ）１．５６μＬ（０．２ｎｍｏｌ）に対し酢酸塩バッファーを４６．８μＬ加えた（ａ）。この溶液を室温で２時間インキュベートした後、Ｔｒｉｓバッファーを６２．４μＬ加え（ｂ）、室温で一晩インキュベートした（図８において（Ｉ））。これと同時に（ａ）のタイミング（図８において（ＩＶ））又は（ｂ）のタイミング（図８において（ＩＩＩ））で蛍光ペプチドｐｅｐＲ５Ｋ−ＦＩＴＣ／１００％ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を０．９μＬ（６ｎｍｏｌ）加える系、及びこれら系のコントロールとして、ＨＬＡ−Ｇタンパク質溶液１．５６μＬにペプチドｐｅｐＲ５Ｋ−ＦＩＴＣ／１００％ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を０．９μＬ、Ｔｒｉｓバッファーを１１０．８μＬ加える系（図８において（ＩＩ））、Ｔｒｉｓバッファー１１０．８μＬにペプチドｐｅｐＲ５Ｋ−ＦＩＴＣ／１００％ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を０．９μＬ加える系（図８において（Ｖ））も併せて調製した。一晩後、各溶液を遠心分離（１３，２００ｒｐｍ、４℃、２５分間）し、遠心上清全量を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。サイズ排除クロマトグラフィーにはＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥ社）及びＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ社）、バッファーには２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを用いた。
結果を図９に示す。（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）の系において、ＨＬＡ−Ｇ単量体由来のＵＶ吸収（λ＝２８０ｎｍ）と同じ溶出位置にＦＩＴＣ由来の吸収（λ＝４９４ｎｍ）を確認できた（図９（ａ））。各シグナルの面積（Ａｒｅａ（ｍＡＵ×ｍＬ））を求め、４９４ｎｍの吸収由来のシグナルと２８０ｎｍの吸収由来のシグナル面積比を算出したところ、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）の値はそれぞれ、０．１６、０．２６、０．６２と算出された（図９（ｃ））。（Ｖ）の系の値は、図７（ｃ）で示した、蛍光標識ペプチドを持つＨＬＡ−Ｇのシグナル面積比０．６５と非常に近い値をとることが確認できた。一方で、（Ｉ）の系ではＨＬＡ−Ｇ単量体由来のＵＶ吸収が確認できたが、同位置にＦＩＴＣ由来の吸収は確認できなかった。また、（Ｖ）の系では、ＨＬＡ−Ｇ単量体由来のＵＶ吸収とＦＩＴＣ由来の吸収が確認できなかった。以上の結果より、（Ｖ）の系では、抗原解離状態のＨＬＡ−Ｇに抗原を加え、かつ中性条件に戻すことで、抗原がＨＬＡ−Ｇに結合することが確認できた。
続いて、抗原が再度結合したＨＬＡ−Ｇと抗原解離状態のＨＬＡ−Ｇとの間で安定性に差が生じているか否かについて検討を行った（図１０（ａ））。この検討には示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）を用いた。この測定では、タンパク質と蛍光色素とを含む試料の温度を経時的に変化させると、熱変性によってタンパク質内部の疎水性部位が露出し、ここに蛍光色素が相互作用することによる蛍光強度の増大が観察できる。この変化の中点を変性温度Ｔｍとし、簡易的にタンパク質の熱安定性を評価できる（図１０（ｂ））。ＤＳＦの利点として、少量の試料で測定が可能であること、短時間で多検体の測定が可能であることが挙げられ、これら利点からハイスループットな化合物スクリーニング手法として近年注目されている。この手法を用いて抗原結合の有無によるＨＬＡ−Ｇの安定性の差について検討した。
実験手法として、ＨＬＡ−Ｇを酸性条件に曝す際にＷＴのペプチドを加える系（図１１（ａ）において、「ペプチドあり；＋」）及びコントロールとしてＤＭＳＯを加える系（図１１（ａ）において、「ペプチドなし；−」）を用意し、これらのＤＳＦを行った。
ＨＬＡ−Ｇタンパク質溶液（ペプチド：ｐｅｐＷＴ、バッファー：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、タンパク質濃度：７．２μＭ）１８μＬに１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ５．０バッファーを３．６μＬ加えた直後に、ペプチドｐｅｐＷＴ／１００％ＤＭＳＯ溶液（８．７ｍＭ）を０．２μＬ（１２ ｎｍｏｌ）加える系（＋）及び１００％ＤＭＳＯ溶液を０．２μＬ加える系（−）を作製した。これら溶液をよく混合した後、室温で２時間静置した。２時間後、混合溶液に１Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ ｐＨ７．４バッファー１９．８μＬ、５Ｍ ＮａＣｌ １．２μＬ、超純水２．２μＬを加え、室温で一晩静置した。翌日、混合溶液を遠心分離（３，０００ｇ、室温、３０分間）した。遠心上清３５μＬに、超純水で２５倍希釈した５０００×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を３．９μＬ加え（終濃度２０×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ）、この溶液を用いてＤＳＦ測定を行った。ＤＳＦ測定にはＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ ｑＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用い、蛍光強度をフィルター ＨＥＸ（励起５１５−５３５ｎｍ、検出５６０−５８０ｎｍ）にて検出した。測定は１５℃〜８５℃の範囲で、０．５℃／１５ｓｅｃ（２℃／ｍｉｎ）で行った。
その結果、「ペプチドなし；−」と比較し、「ペプチドあり；＋」ではＴｍに変化が生じていることが確認できた（図１１（ｂ）、（ｃ））。また、相対蛍光強度の最大値（以下、ＦＩｍａｘ）の値が増加という予想外の差も見出すことができた（図１１（ｂ）、（ｃ））。
ＦＩｍａｘに差が生じた原因として、「ペプチドあり；＋」と「ペプチドなし；−」では溶液中のタンパク質濃度に差が生じていたことが考えられた。ペプチド解離状態のＨＬＡ−Ｇは部分的に不安定化し、一部凝集が進行する。「ペプチドあり；＋」の系ではペプチドが加わることでＨＬＡ−Ｇが安定化するが、「ペプチドなし；−」の系では安定化は起こらず（図１２（ａ））、その結果、ＤＳＦ測定時の溶液濃度に差が生じたと考えられる。この仮説を検証すべく、ＨＬＡ−Ｇタンパク質溶液の３段階の希釈系列（０．９１μＭ、１．４μＭ、２．７μＭ）を作製し、前述同様にこれらのＤＳＦを行ったところ、タンパク質濃度の増加に伴いＦＩｍａｘの増加が確認できた（図１２（ｂ））。以上より、本評価系では、ＦＩｍａｘにも差が見られることが確認できた。
以上より、中性条件下で安定して存在するＨＬＡ−ＧをｐＨ５．０条件下に曝すことで、ＨＬＡ−Ｇ分子から抗原が解離し、分子は不安定化することが示唆された。この状態のＨＬＡ−Ｇに異なる抗原が結合することでＨＬＡ−Ｇ分子は再安定化され、抗原結合の有無で生じる安定性の差をＤＳＦにて検出できることを見出した（図１３）。以上の現象を利用したＨＬＡ−Ｇと相互作用する薬物のスクリーニング系の構築に成功した。
（実施例２）
前述の通り構築したスクリーニング系を用いて、図１４に示す工程に従って、ＨＬＡ−Ｇに結合する薬物のスクリーニングを行った。薬物は、北大の既存薬ライブラリーに属する約１６００種類を用いた（図１５）。なお、図１４において、「化合物」とは既存薬ライブラリーの薬物を表し、「ＨＬＡ−Ｇ」とは、実施例１と同様に調製されたペプチド（ｐｅｐＷＴ（配列番号３）が結合したＨＬＡ−Ｇを表す。
評価モデルとしては、図１６（ａ）に示すように、ＨＬＡ−Ｇに結合する既存薬Ａについては相互作用する候補として「Ｈｉｔ」とし、ＨＬＡ−Ｇに結合しない既存薬Ｄについては候補から除外した。
評価方法を以下に示す。図１６（ｂ）に示すように、ネガティブコントロールと比較した際にＴｍ又はＦＩｍａｘに変化が見られる化合物Ａ及び化合物ＢをＨｉｔとした。この際、点線で示したような測定開始時から高い蛍光強度を示した化合物Ｃや、Ｔｍ又は ＦＩｍａｘに変化が見られない化合物Ｄについては候補から除外した。
（既存薬ライブラリーを用いたＨＬＡ−Ｇ結合薬物の探索）
北大オリジナル化合物ライブラリーのうちの約１６００化合物から成る既存薬ライブラリーに属する化合物を０．４μＬ（０．８ｎｍｏｌ）ずつ、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３３６３ Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｖ−Ｂｏｔｔｏｍ ９６ Ｗｅｌｌ Ｃｌｅａｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（以下、反応用プレート）、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に分注を行った。この時、ポジティブコントロールにはペプチドｐｅｐＷＴ／１００％ＤＭＳＯ溶液（４．４ｍＭ）を０．４μＬ（１．８ｎｍｏｌ）、ネガティブコントロールには１００％ＤＭＳＯ溶液０．４μＬを用いた。次に、ＨＬＡ−Ｇタンパク質溶液（ペプチド：ｐｅｐＷＴ（配列番号３）、バッファー：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、タンパク質濃度：７．２μＭ）を調製した。反応用プレート１ウェルにつき、上記ＨＬＡ−Ｇタンパク質溶液１８μＬに１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ５．０バッファーを３．６μＬ加えた溶液を加え、よく混合した後、室温で２時間反応静置した。２時間後、各ウェルに１Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ ｐＨ７．４バッファー１９．８μＬ、５Ｍ ＮａＣｌ １．２μＬ、超純水２．２μＬを加え、室温で一晩静置した。翌日、反応溶液を遠心分離（３，０００ｇ、室温、３０分間）した。遠心上清３５μＬに、超純水で２５倍希釈した５０００×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅを３．９μＬ加え（終濃度２０×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ）、この溶液を用いて測定を行った。ＤＳＦ測定は前述と同様に行った。
約１６００から成る北大の既存薬ライブラリー全てに対する評価を行った結果、８４のＨｉｔ化合物を見出すことができた。
Ｈｉｔ化合物群より擬陽性化合物を除外すべく、化合物の濃度依存性確認試験を計画した。これに先立ち、スクリーニングに用いた指標であるＴｍ又はＦＩｍａｘが化合物濃度依存的に変化するか不明であったため、これを明らかにすべく、ペプチドを用いて濃度依存性確認試験を行った（図１７（ａ））。この試験では、抗原解離状態のＨＬＡ−Ｇに対し、ペプチドを６，３，１等量の計３段階の希釈系列で分注し、中性条件へと戻した後、前述同様にＤＳＦ測定を行った。ペプチドとして、ＨＬＡ−Ｇに結合することが既知であるｐｅｐＷＴ及び結合しないことが既知であるモックペプチド（配列番号５）の２種を用いた（図１７（ｂ））。
（濃度依存性確認試験）
酸性条件下での反応時に、ＨＬＡ−Ｇタンパク質に対し化合物を１，３，６等量となるように、化合物を０．４μＬずつ、３段階の希釈系列（０．８ｎｍｏｌ、０．４ｎｍｏｌ、０．１４ｎｍｏｌ）で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３３６３ Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｖ−Ｂｏｔｔｏｍ ９６ Ｗｅｌｌ Ｃｌｅａｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（以下、反応用プレート）、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に分注を行った。この時、ポジティブコントロールには、上記と同じ３段階の希釈系列のペプチドｐｅｐＷＴ／１００％ＤＭＳＯ溶液を０．４μＬずつ、ネガティブコントロールには１００％ＤＭＳＯ溶液を０．４μＬ用いた。次に、ＨＬＡ−Ｇタンパク質溶液（ペプチド：ｐｅｐＷＴ、バッファー：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、タンパク質濃度：７．２μＭ）を調製した。反応用プレート１ウェルにつき、上記ＨＬＡ−Ｇタンパク質溶液１８μＬに１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ５．０バッファーを３．６μＬ加えた溶液を加え、よく混合した後、室温で２時間反応静置した。２時間後、各ウェルに１Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ ｐＨ７．４バッファー１９．８μＬ、５Ｍ ＮａＣｌ １．２μＬ、超純水２．２μＬを加え、室温で一晩静置した。翌日、反応溶液を遠心分離（３，０００ｇ、室温、３０分間）した。遠心上清３５μＬに、超純水で２５倍希釈した５０００×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅを３．９μＬ加え（終濃度２０×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ）、この溶液を用いて測定を行った。ＤＳＦ測定は前述と同様に行った。
その結果、ペプチドＷＴを用いた系では、ネガティブコントロールの測定値と比較して、Ｔｍ及びＦＩｍａｘの値に濃度依存的な変化を確認できた（図１８（ｂ）、（ｃ））。一方、モックペプチドを用いた系からは、Ｔｍ及びＦＩｍａｘの値に濃度依存的な変化を確認できなかった（図１８（ｂ）、（ｃ））。以上の結果より、ＨＬＡ−Ｇに結合する化合物については、化合物の濃度依存的なＴｍ及びＦＩｍａｘの変化が生じることが示唆された。
この知見を用い、８４のＨｉｔ化合物に対する濃度依存性確認試験を前述同様に行った。その結果、８４化合物中、２６化合物にて、図１９（ｂ）、（ｃ）で示したような、化合物濃度依存的なＴｍ又はＦＩｍａｘの変化が確認できた。
以上より、本実施例のスクリーニング方法を用いることで、約１６００種の既存薬からＨＬＡ−Ｇとの薬物相互作用を有する２６の候補化合物を見出すことに成功した。
ＢＩＴＨＩＯＮＡＴＥ ＳＯＤＩＵＭ
ＣＨＬＯＲＡＭＰＨＥＮＩＣＯＬ
ＡＭＯＤＩＡＱＵＩＮＥ ＤＩＨＹＤＲＯＣＨＬＯＲＩＤＥ
ＢＵＳＵＬＦＡＮ
ＣＡＲＢＥＮＩＣＩＬＬＩＮ ＤＩＳＯＤＩＵＭ
ＣＯＬＩＳＴＩＭＥＴＨＡＴＥ ＳＯＤＩＵＭ
ＯＸＹＰＨＥＮＢＵＴＡＺＯＮＥ
ＡＺＥＬＡＩＣ ＡＣＩＤ
ＳＵＲＡＭＩＮ ＨＥＸＡＳＯＤＩＵＭ
ＣＹＣＬＯＳＰＯＲＩＮＥ
ＯＬＳＡＬＡＺＩＮＥ ＳＯＤＩＵＭ
ＮＩＴＡＺＯＸＡＮＩＤＥ
ＬＥＦＬＵＮＯＭＩＤＥ
ＤＯＣＵＳＡＴＥ ＳＯＤＩＵＭ
ＴＡＮＮＩＣ ＡＣＩＤ
ＣＡＮＤＥＳＡＲＴＡＮ ＣＩＬＥＸＴＩＬ
ＭＥＬＯＸＩＣＡＭ ＳＯＤＩＵＭ
ＡＭＩＮＯＰＥＮＴＡＭＩＤＥ ＳＵＬＦＡＴＥ
ＭＥＴＦＯＲＭＩＮ ＨＹＤＲＯＣＨＬＯＲＩＤＥ
ＤＩＡＴＲＩＺＯＩＣ ＡＣＩＤ
ＰＩＲＥＮＰＥＲＯＮＥ
ＢＥＮＺＢＲＯＭＡＲＯＮＥ
ＡＣＥＣＡＩＮＩＤＥ ＨＹＤＲＯＣＨＬＯＲＩＤＥ
ＴＨＩＯＰＥＮＴＡＬ ＳＯＤＩＵＭ
ＯＣＴＯＤＲＩＮＥ
ＮＩＦＬＵＭＩＣ ＡＣＩＤ
２６のヒット化合物の構造を図２０に示す。これらの化合物間において特に類似性はみられなかった。この中で、メロキシカム（図２０において（１７））は、副作用としてスティーブンス・ジョンソン症候群や中毒性表皮壊死症が報告されており、これらの重篤な副作用の発症には、クラスＩ分子であるＨＬＡ−ＡやＨＬＡ−Ｂとの強い関連性が示唆されている。本実施例のスクリーニングにより、メロキシカムの重篤な副作用にはＨＬＡ−Ｇも関与していることが示唆された。このように、複数種のＨＬＡと関与し副作用発症の前例のある化合物を見出すことができたことから、本実施例のスクリーニング法によって、ＨＬＡタンパク質に相互作用する薬物をスクリーニングできることが示された。
（実施例３）
エイズ治療薬であるアバカビルは、海外での臨床試験においてＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１を保有する患者に投与すると、薬剤特異的な過敏症が有意に発症することが示されている。前述の通り構築したスクリーニング系を用いて、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１にアバカビルが結合するか検証した。
各種評価を行うために必要なＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１タンパク（遺伝子配列：配列番号６（始めの３塩基の開始コドン及び終わりの３塩基の終止コドンを含む）、アミノ酸配列：配列番号７）の調製を行った。以下の通り、大腸菌発現系を用いてＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１重鎖を封入体として発現させ、β２ｍ及びペプチドとともに希釈法による巻き戻しを行った（図４（ａ）：ＨＬＡ−Ｇと概念は同じ）。
ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１組換えタンパク質は、以下の手法を用いて大腸菌内に封入体として発現させ、可溶化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、６Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ）に完全に可溶化させた。
（大腸菌発現用プラスミド）
ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１はＮ末端からシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通領域、細胞内ドメインで構成されている。大腸菌体内に封入体として発現させるため、シグナルペプチド及び膜貫通領域以下を除去し、Ｎ末端にメチオニン残基を付加した各ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１の細胞外ドメイン部分（Ｇｌｙ２５−Ｐｒｏ３００）（ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１）がｐＧＭＴ７ベクターのＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩサイト間に組み込まれたプラスミド（図５（ａ）：ｐＧＭＴ７ベクターとして同じ）を使用した。
（プラスミドの調製）
プラスミド０．５μＬを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル１００μＬに加え、氷上に約２０分静置した後、４２℃で４５秒間インキュベートして形質転換した。形質転換後の大腸菌を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し３７℃で一晩培養した。得られたシングルコロニーを、終濃度１００μｇ／ｍＬになるようにアンピシリンを加えた２×ＹＴ培地５ｍＬに植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍの条件で一晩振盪培養した。培養液１．４ｍＬを１３，２００ｒｐｍ、１分間の条件で遠心分離し、上清を除去した。得られた大腸菌のペレットからアルカリ−ＳＤＳ法とＰＣＩ抽出、アルコール沈殿を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。
（大腸菌発現系を用いた封入体の調製）
ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１組み換えタンパク質は、大腸菌体内に封入体として発現させた。タンパク質の大腸菌発現用のプラスミドで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天培地に播種後、３７℃で一晩培養した。得られたコロニーを５０μｇ／ｍＬアンピシリン、２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール含有２×ＹＴ培地（１０ｍＬ）に植菌し、３７℃で２〜４時間振盪培養した（前培養）。次に、前培養した１０ｍＬの菌液を５０μｇ／ｍＬアンピシリン、２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール含有２×ＹＴ培地（１Ｌ）へと植菌し、３７℃で振盪培養した。対数増殖前期であるＯＤ６００＝０．４〜０．６に達したら、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように加えて組換えタンパク質の発現を誘導し、その後３７℃で４時間振盪培養した。培養後の菌液を遠心分離（５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して大腸菌を回収した。菌体を懸濁バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で懸濁して、氷上で超音波破砕を行った。破砕液を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）、得られた沈殿を洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で懸濁することによって洗浄し、懸濁液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）する洗浄作業を３回繰り返した。洗浄後、得られた沈殿から界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を除去するために、懸濁バッファーを用いて沈殿を懸濁後、懸濁液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）する洗浄操作を３回繰り返し、封入体を得た。得られた封入体に可溶化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、６Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を加えて一晩４℃で振盪し、完全に可溶化した。封入体を可溶化させた後、各封入体溶液の吸光度を１μＬ分光光度計（ＮＤ−１０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて測定した。なお、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１の発現プラスミドについては、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ ＧＭ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６ １７７（６）：３８９３−９０２．を参照した。
（巻き戻し法による各タンパク質の調製）
ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１組換えタンパク質の調製は、以下の手法にて行った。
ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１組換えタンパク質は、封入体から希釈法による巻き戻しを行うことで調製した。ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１は重鎖、ｈβ２ｍ及びペプチドからなるヘテロ３量体である。これらタンパク質を巻き戻すために、巻き戻りが起こりやすいｈβ２ｍ、ペプチド、重鎖の順で順次巻き戻しを行った。まず単独で安定に巻き戻るｈβ２ｍを巻き戻しバッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１Ｍ Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、３．７３ｍＭ ｃｙｓｔａｍｉｎｅ、６．７３ｍＭ ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ）を用いて、タンパク質の終濃度が１〜２μＭとなるように希釈を行った後、４℃で巻き戻しを行った。２４時間後、同巻き戻しバッファーに１００％ＤＭＳＯで溶解したペプチド（ＬＦ９−ｐｅｐｔｉｄｅ：配列番号８）（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社より購入）（Ｃｈｅｓｓｍａｎ Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００８ ２８（６）：８２２−３２．）を終濃度０．０１ｍｇ／ｍＬになるように加えた。続いて、可溶化したＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１の封入体にＤＴＴを終濃度１０ｍＭとなるように加え、室温で１時間インキュベートしたタンパク質溶液に対し、同巻き戻しバッファーを１滴ずつ、ｇｕａｎｉｄｉｎｅ濃度が１．５Ｍになるまで加えた。希釈後の溶液を巻き戻しバッファーに１滴ずつ加え、タンパク質の終濃度が１〜２μＭとなるように希釈した後、４℃で７２時間攪拌した。巻き戻し後のタンパク質溶液はＶＩＶＡＦｌｏｗ ｓｙｓｔｅｍ（ＭＷＣＯ：１０，０００，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（ＭＷＣＯ：１０，０００Ｄａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で限外ろ過濃縮を行った。
濃縮したタンパク質溶液はＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒシステム（ＧＥ社）を用いた１段階の液体クロマトグラフィーにて精製した。ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ社）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。この時、バッファーは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを用いた。精製後のタンパク質溶液の吸光度を分光光度計（Ｕ−５１００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈｉｇｈ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）又は１μＬ分光光度計（ＮＤ−１，０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて測定した。また、吸光度（Ａｂｓ）の測定値から紫外吸収法を用いて各タンパク質溶液の濃度を算出した。濃度算出時に用いたタンパク質の分子量は４４６１７８Ｄａ、モル吸光係数は９０６７５Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍの値を用いた。
上記の通り、ゲル濾過クロマトグラフィーによる１段階の精製を行った。クロマトグラム（図２１（ａ））中に矢印で示したピークの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した結果、純度高くＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１タンパク質が精製できていることを確認した（図２１（ｂ））。
（結合実験）
図１４に示す工程に従ってＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１とアバカビルとの結合実験を行った。図１４において、「化合物」とは「アバカビル」を表し、「ＨＬＡ−Ｇ」の代わりに「ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１」を用いた。
０．４μＬ（０．８ｎｍｏｌ）のアバカビル（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社、ロット番号：１１７７８）を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３３６３ Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｖ−Ｂｏｔｔｏｍ ９６ Ｗｅｌｌ Ｃｌｅａｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（以下、反応用プレート）、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に分注した。この時、ポジティブコントロールにはペプチドｐｅｐＷＴ／１００％ＤＭＳＯ溶液（４．４ｍＭ）を０．４μＬ（１．８ｎｍｏｌ）、ネガティブコントロールには１００％ＤＭＳＯ溶液０．４μＬを用いた。次に、上述の通り得られたＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１タンパク質溶液（バッファー：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、タンパク質濃度：７．２μＭ）を調製した。反応用プレート１ウェルにつき、上記ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１タンパク質溶液１８μＬに１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ５．０バッファーを３．６μＬ加えた溶液を加え、よく混合した後、室温で２時間反応静置した。２時間後、各ウェルに１Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ ｐＨ７．４バッファー１９．８μＬ、５Ｍ ＮａＣｌ １．２μＬ、超純水２．２μＬを加え、室温で一晩静置した。翌日、反応溶液を遠心分離（３，０００ｇ、室温、３０分間）した。遠心上清３５μＬに、超純水で２５倍希釈した５０００×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅを３．９μＬ加え（終濃度２０×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ）、この溶液を用いて測定を行った。ＤＳＦ測定は前述と同様に行った。
解析結果を図２２（ａ）、（ｂ）に示す。アバカビルでは、ポジディブコントロールよりも高い蛍光強度を示したことから、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１にアバカビルが結合していることが示された。また、Ｔｍについても、アバカビルでは、ポジディブコントロールと同程度に変化することが明らかとなった。このように、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１に相互作用することが知られているアバカビルについて、本実施例のスクリーニング方法を用いることで、たしかにＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１に結合することが確認された。
以上より、本実施例のスクリーニング方法を用いることで、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１に相互作用することが知られているアバカビルが、たしかにＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１に結合することが実証された。
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。
本出願は、２０１７年９月１２日に出願された、日本国特許出願２０１７−１７４５２９号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１７−１７４５２９号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

Claims (10)

  1. （ａ）結合物質が結合したＨＬＡタンパク質を調製する工程と、
    （ｂ）ｐＨを弱酸性に調節する前又は後に被検物質を添加する工程と、
    （ｃ）弱酸性下において静置する工程と、
    （ｄ）ｐＨを中性に調節した後、１〜４８時間静置する工程と、
    （ｅ）前記ＨＬＡタンパク質と前記被検物質との結合の度合いを測定し、前記ＨＬＡタンパク質に前記被検物質が結合していると判断される場合、前記被検物質が前記ＨＬＡタンパク質に相互作用すると判定する工程と、
    を含むＨＬＡタンパク質に相互作用する物質のスクリーニング方法。
  2. 前記工程（ｃ）において、静置時間は、３秒間〜５時間である、
    ことを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
  3. 前記工程（ｂ）において、前記ＨＬＡタンパク質に対する前記被検物質の添加量比は、１：１〜１：１０である、
    ことを特徴とする請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
  4. 前記工程（ｅ）において、沈殿法、ＤＳＦ及びＤＳＣからなる群より少なくとも１つ選択される方法によって前記ＨＬＡタンパク質と前記被検物質との結合の度合いを測定する、
    ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
  5. 前記工程（ｅ）において、前記被検物質の濃度依存的に前記ＨＬＡタンパク質と前記被検物質との結合の度合いが高くなる場合、前記被検物質が前記ＨＬＡタンパク質に相互作用すると判定する、
    ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
  6. 前記結合物質は、ペプチドである、
    ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
  7. 前記ＨＬＡタンパク質に前記被検物質が結合していると判断される場合、前記被検物質による副作用のリスクが高いと判定される、
    ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
  8. 前記工程（ａ）において、前記ＨＬＡタンパク質を宿主細胞に発現させる、
    ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
  9. 結合物質が結合したＨＬＡタンパク質を含む、
    ことを特徴とするＨＬＡタンパク質に相互作用する物質のスクリーニング用キット。
  10. 前記結合物質は、ペプチドである、
    ことを特徴とする請求項９に記載のスクリーニング用キット。
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