JPWO2018228622A5 - Method for detecting biotherapeutic substance aggregates in a sample - Google Patents
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Description
本発明は、試料中のバイオ治療物質凝集体を検知するための方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting biotherapeutic substance aggregates in a sample.
本発明の課題は、試料中におけるバイオ治療物質の凝集体の高感度の検知方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a highly sensitive method for detecting an aggregate of a biotherapeutic substance in a sample.
発明の説明
前記課題は、次のステップ：
ａ．基板上へ被検査試料をアプライするステップ、
ｂ．バイオ治療物質凝集体への特異的結合により凝集体を標識する、検知に適切なプローブを添加するステップ、
ｃ．標識されたバイオ治療物質凝集体を検知するステップ
を含み、ステップｂ）をステップａ）の前に行ってもよい、試料中におけるバイオ治療物質凝集体の検知方法によって解決される。
Description of the Invention The subject is the next step:
a. Steps to apply the sample to be inspected on the substrate,
b. Biotherapeutic substance A step of adding a probe suitable for detection , which labels the aggregate by specific binding to the aggregate,
c. It is solved by a method of detecting biotherapeutic substance aggregates in a sample, which comprises the step of detecting labeled biotherapeutic substance aggregates, and step b) may be performed before step a).
同種凝集体および異種凝集体の検知のため、特に定量的および／または定性的測定のための方法は、バイオ医薬品のおよびバイオ医薬品中の凝集体が、少なくとも１つの、プローブに対する結合部位を含有することを特徴とする。 For the detection of allogeneic and heterologous aggregates, especially for quantitative and / or qualitative measurements, the aggregates in biopharmacy and biopharmacy contain at least one binding site to the probe. It is characterized by that.
検出は、好ましくは、共焦点蛍光顕微鏡法、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、特に相互相関と組み合わせた蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、およびレーザースキャン顕微鏡（ＬＳＭ）によって行う。 Detection is preferably performed by confocal fluorescence microscopy, fluorescence correlation spectroscopy (FCS) , in particular fluorescence correlation spectroscopy (FCS) in combination with mutual correlation, and laser scan microscopy (LSM) .
本発明の一代案では、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いて検出または検知を行う。 In one alternative of the present invention, detection or detection is performed using a confocal laser scanning microscope.
さらなる一実施形態では、空間分解式の蛍光顕微鏡法（ｏｒｔｓａｕｆｌｏｅｓｅｎｄｅｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｚｅｎｚｍｉｋｒｏｓｋｏｐｉｅ）を利用して、好ましくはＴＩＲＦ顕微鏡、ならびにその、相応する超解像変種、例えば、ＳＴＯＲＭ、ｄＳＴＯＲＭにより検出または検知を行ってもよい。 In a further embodiment, detection or detection may be performed using a spatially resolved fluorescence microscope, preferably a TIRF microscope, and a corresponding super-resolution variant thereof, such as STORM, dSTORM. good.
本発明のさらなる主題は、任意の試料中においてバイオ医薬品のおよびバイオ医薬品中の同種および異種凝集体を検知するため、バイオ医薬品のおよびバイオ医薬品中の同種および異種凝集体を定量化（力価測定）するため、粒子数を直接的および／または絶対的に定量化するための、本発明による方法の使用である。 A further subject of the invention is the quantification (titer measurement) of allogeneic and heterologous aggregates in biopharmacy and biopharmacy in order to detect allogeneic and heterologous aggregates in biopharmacy and biopharmacy in any sample. ), The use of the method according to the invention to directly and / or absolutely quantify the number of particles.
凝集体を検知するために、空間分解式顕微鏡法（ｏｒｔｓａｕｆｇｅｌｏｅｓｔｅ Ｍｉｋｒｏｓｋｏｐｉｅ）を行った。この測定は、ＴＩＲＦ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）において、１００倍の油浸対物レンズを用いて行った。そのためには、マイクロタイタープレートのガラスボトムに、油浸オイルを十分に塗り付け、プレートを、顕微鏡の自動ステージに装入した。次いで、バックグラウンドシグナルのもとで個々の凝集体が検出可能になるほどに多数のデータ点を獲得するために、反応チャンバーごとに５ｘ５の位置で、２つの蛍光チャネル（Ｅｘ／Ｅｍ＝６３３／７１５ｎｍおよび４８８／５２５ｎｍ）で、それぞれ１つの画像（１０００ｘ１００ピクセル）を連続的に撮影した。最大レーザー出力（１００％）、５００ｍｓの露光時間、および８００というゲイン値を選択した。次いで、画像データを評価した。強度閾値は、チャネルごとに、該当するチャネルの平均陰性対照の０．０００１％グレースケールにセットした。評価ステップでは、まずチャネルごとの各画像に対して、強度閾値を適用し、続いて、同じ位置の画像を、両方の値において互いに比較した。画像ごとに、両方のチャネルにおいて、ちょうど同じ位置でピクセルがそのチャネルの強度閾値を上回るようなピクセルのみを数えた。最後に、各反応チャンバーのすべての画像にわたってピクセル数を平均してから、反復値（Ｒｅｐｌｉｋａｔｗｅｒｔ）の平均ピクセル数の平均値を求め、標準偏差を指定する。 Spatial resolution microscopy (ortsaufgeloste Mikroskopie) was performed to detect aggregates. This measurement was performed with a TIRF microscope (Leica) using a 100x oil immersion objective lens. For that purpose, the glass bottom of the microtiter plate was sufficiently smeared with oil-soaked oil, and the plate was placed in the automatic stage of the microscope. Two fluorescent channels (Ex / Em = 633/715 nm) are then obtained at 5x5 positions per reaction chamber in order to acquire enough data points to detect individual aggregates under background signal. And 488/525 nm), one image each (1000x100 pixels) was taken continuously. A maximum laser output (100%), an exposure time of 500 ms, and a gain value of 800 were selected. Then, the image data was evaluated. The intensity threshold was set for each channel to the 0.0001% grayscale of the mean negative control for that channel. In the evaluation step, an intensity threshold was first applied to each image for each channel, and then images at the same location were compared to each other at both values. For each image, we counted only the pixels in both channels where the pixels exceeded the intensity threshold of that channel at exactly the same position. Finally, the number of pixels is averaged over all the images in each reaction chamber, then the average number of average pixels of the repeat value is calculated, and the standard deviation is specified.
その場合、この較正シリーズは、バイオ治療物質、具体的には、試料である医薬品の溶液中にバイオ治療物質として存在し得て、かつ凝集体に基づいて検査されるＩｇＧの、より複雑な検知方法へのアプローチとして利用できる。その際、蛍光プローブ抗体は、捕捉分子に結合した単量体には結合できない。なぜなら、その結合部位が、捕捉分子によって埋まっているからである。その代わりに、プローブ抗体は、凝集体の単量体エピトープにしか結合しない。したがって、凝集体は、示した方法で定量化可能である。 In that case, this calibration series is a more complex detection of a biotherapeutic substance, specifically an IgG that can be present as a biotherapeutic substance in a solution of a sample drug and is tested on the basis of aggregates. It can be used as an approach to the method. At that time, the fluorescent probe antibody cannot bind to the monomer bound to the capture molecule. This is because the binding site is filled with trapping molecules. Instead, the probe antibody binds only to the monomeric epitope of the aggregate. Therefore, aggregates can be quantified by the methods shown.
参考文献
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なお、本願は、特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．次のステップ：
ａ．基板上へ被検査試料をアプライするステップ、
ｂ．バイオ治療物質凝集体への特異的結合により凝集体を標識する、検知に適切なプローブを添加するステップ、および
ｃ．標識されたバイオ治療物質凝集体を検知するステップ、
を含み、
ステップｂ）をステップａ）の前に行ってもよい、試料中におけるバイオ治療物質凝集体の検知方法。
２．ステップａ）の前に、基板上での、凝集体に対する捕捉分子の固定化を行うことを特徴とする、上記１に記載の方法。
３．試料の前処理を行うことを特徴とする、上記１または２に記載の方法。
４．ガラスでできた基板を使用することを特徴とする、上記１～３のいずれか一つに記載の方法。
５．プラスチックでできた基板を使用することを特徴とする、上記１～３のいずれか一つに記載の方法。
６．基板が、親水性コーティングを有することを特徴とする、上記１～５のいずれか一つに記載の方法。
７．基板がデキストランでコーティングされていることを特徴とする、上記１～６のいずれか一つに記載の方法。
８．基板がポリエチレングリコールでコーティングされていることを特徴とする、上記１～７のいずれか一つに記載の方法。
９．デキストランコーティングが、生体分子を結合するための官能基を有することを特徴とする、上記１～８のいずれか一つに記載の方法。
１０．ポリエチレングリコールコーティングが、生体分子を結合するための官能基を有することを特徴とする、上記１～９のいずれか一つに記載の方法。
１１．基板が、生体分子を結合するための官能基でコーティングされていることを特徴とする、上記１～１０のいずれか一つに記載の方法。
１２．親水性コーティングが、生体分子を結合するための官能基でコーティングされていることを特徴とする、上記１～１１のいずれか一つに記載の方法。
１３．捕捉分子が、基板またはコーティングに結合していることを特徴とする、上記１～１２のいずれか一つに記載の方法。
１４．捕捉分子が、抗体または抗体断片であることを特徴とする、上記１～１３のいずれか一つに記載の方法。
１５．捕捉分子がアプタマーであることを特徴とする、上記１～１４のいずれか一つに記載の方法。
１６．捕捉分子が、バイオ治療物質単量体の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合することを特徴とする、上記１～１５のいずれか一つに記載の方法。
１７．捕捉分子が、バイオ治療物質凝集体に特異的に結合することを特徴とする、上記１～１６のいずれか一つに記載の方法。
１８．プローブ分子が、バイオ治療物質単量体の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合することを特徴とする、上記１～１７のいずれか一つに記載の方法。
１９．プローブ分子が、バイオ治療物質凝集体に特異的に結合することを特徴とする、上記１～１８のいずれか一つに記載の方法。
２０．プローブ分子が、検出可能分子で標識されていることを特徴とする、上記１～１９のいずれか一つに記載の方法。
２１．プローブ分子が、蛍光色素で標識されていることを特徴とする、上記１～２０のいずれか一つに記載の方法。
２２．１種または複数の異なるプローブ分子を使用することを特徴とする、上記１～２１のいずれか一つに記載の方法。
２３．異なって標識された検出可能分子を有する異なるプローブ分子の混合物を使用することを特徴とする、上記１～２２のいずれか一つに記載の方法。
２４．異なって標識された検出可能分子を有する同じプローブ分子の混合物を使用することを特徴とする、上記１～２３のいずれか一つに記載の方法。
２５．空間分解式顕微鏡法を利用して検出を行うことを特徴とする、上記１～２４のいずれか一つに記載の方法。
２６．空間分解式蛍光顕微鏡法を利用して検出を行うことを特徴とする、上記１～２５のいずれか一つに記載の方法。
２７．共焦点蛍光顕微鏡法、任意選択的に相互相関および単一粒子免疫吸着レーザースキャニングアッセイ（Ｓｉｎｇｌｅ－Ｐａｒｔｉｃｌｅ－Ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖｅｎｔ Ｌａｓｅｒｓｃａｎｎｉｎｇ－Ａｓｓａｙ）と組み合わされた蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、レーザースキャン顕微鏡法（ＬＳＭ）、広視野顕微鏡法および／またはＴＩＲＦ顕微鏡法、ならびに相応する超解像変種のＳＴＥＤ、ＳＩＭ、ＳＴＯＲＭ、ｄＳＴＯＲＭを用いて検出を行うことを特徴とする、上記１～２６のいずれか一つに記載の方法。
２８．検出の際に、バックグラウンドシグナルの存在下で個々の凝集体の検出が可能であるほどに多数のデータ点を収集することを特徴とする、上記１～２７のいずれか一つに記載の方法。
２９．バイオ治療物質凝集体の定量化およびサイズ測定のために内部標準または外部標準を使用することを特徴とする、上記１～２８のいずれか一つに記載の方法。
３０．バイオ治療物質凝集体の定量化およびサイズ測定のための標準が、バイオ治療物質の単量体からなることを特徴とする、上記１～２９のいずれか一つに記載の方法。
３１．バイオ治療物質凝集体の定量化およびサイズ測定のための標準が、バイオ治療物質単量体からなり、共有結合で安定化されたことを特徴とする、上記１～３０のいずれか一つに記載の方法。
３２．バイオ治療物質凝集体の定量化およびサイズ測定のための標準が粒子であり、当該粒子には２つ以上の同一のまたは異なるポリペプチド配列が結合しており、当該ポリペプチド配列が、その配列に関して、捕捉分子および／またはプローブ分子によって結合される前記バイオ治療物質の単量体の配列と対応する部分領域において同一であることを特徴とする、上記１～３１のいずれか一つに記載の方法。
３３．バイオ治療物質凝集体の定量化およびサイズ測定のための標準が、２つ以上のバイオ治療物質単量体が結合している粒子であることを特徴とする、上記１～３２のいずれか一つに記載の方法。
３４．シリカでできた粒子の選択を特徴とする、上記１～３３のいずれか一つに記載の方法。
３５．親水性コーティングを有する粒子の選択を特徴とする、上記１～３４のいずれか一つに記載の方法。
３６．次の成分：
・ 基板、
・ バイオ治療物質凝集体への特異的結合によって結合するプローブ分子、
・ 任意選択：標準、
・ 任意選択：捕捉分子
の１つまたは複数を含有する、上記１～３５のいずれか一つに記載のバイオ医薬品有効成分凝集体の選択的定量化のためのキット。
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Although the present application relates to the invention described in the claims, the following may be included as other aspects.
1. 1. Next step:
a. Steps to apply the sample to be inspected on the substrate,
b. Biotherapeutic substance Labeling aggregates by specific binding to aggregates, adding appropriate probes for detection, and
c. Steps to detect labeled biotherapeutic aggregates,
Including
A method for detecting biotherapeutic substance aggregates in a sample, wherein step b) may be performed before step a).
2. 2. The method according to 1 above, which comprises immobilizing a trapped molecule on an aggregate on a substrate before step a).
3. 3. The method according to 1 or 2 above, which comprises pretreating a sample.
4. The method according to any one of 1 to 3 above, which comprises using a substrate made of glass.
5. The method according to any one of 1 to 3 above, which comprises using a substrate made of plastic.
6. The method according to any one of 1 to 5 above, wherein the substrate has a hydrophilic coating.
7. The method according to any one of 1 to 6 above, wherein the substrate is coated with dextran.
8. The method according to any one of 1 to 7 above, wherein the substrate is coated with polyethylene glycol.
9. The method according to any one of 1 to 8 above, wherein the dextran coating has a functional group for binding a biomolecule.
10. The method according to any one of 1 to 9, wherein the polyethylene glycol coating has a functional group for binding a biomolecule.
11. The method according to any one of 1 to 10 above, wherein the substrate is coated with a functional group for binding a biomolecule.
12. The method according to any one of 1 to 11 above, wherein the hydrophilic coating is coated with a functional group for binding a biomolecule.
13. The method according to any one of 1 to 12 above, wherein the trapping molecule is bound to a substrate or a coating.
14. The method according to any one of 1 to 13 above, wherein the capture molecule is an antibody or an antibody fragment.
15. The method according to any one of 1 to 14 above, wherein the trapping molecule is an aptamer.
16. The method according to any one of 1 to 15 above, wherein the capture molecule specifically binds to one or more epitopes of the biotherapeutic substance monomer.
17. The method according to any one of 1 to 16 above, wherein the capture molecule specifically binds to a biotherapeutic substance aggregate.
18. The method according to any one of 1 to 17 above, wherein the probe molecule specifically binds to one or more epitopes of the biotherapeutic substance monomer.
19. The method according to any one of 1 to 18 above, wherein the probe molecule specifically binds to a biotherapeutic substance aggregate.
20. The method according to any one of 1 to 19 above, wherein the probe molecule is labeled with a detectable molecule.
21. The method according to any one of 1 to 20 above, wherein the probe molecule is labeled with a fluorescent dye.
22.1 The method according to any one of 1 to 21 above, which comprises using one or a plurality of different probe molecules.
23. The method according to any one of 1 to 22 above, wherein a mixture of different probe molecules having differently labeled detectable molecules is used.
24. The method according to any one of 1 to 23 above, wherein a mixture of the same probe molecules having differently labeled detectable molecules is used.
25. The method according to any one of 1 to 24 above, which comprises performing detection by using a spatial decomposition type microscopy.
26. The method according to any one of 1 to 25 above, which comprises performing detection by using a spatial decomposition type fluorescence microscopy.
27. Confocal Fluorescence Microscopy, Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), Laser Scan Microscopy (LSM) in combination with Optional Mutual Correlation and Single-Particle-Immunosorbent Laserscanning-Assy. 1. the method of.
28. The method according to any one of 1 to 27 above, wherein at the time of detection, a large number of data points are collected so that individual aggregates can be detected in the presence of a background signal. ..
29. The method according to any one of 1 to 28 above, wherein an internal standard or an external standard is used for the quantification and size measurement of biotherapeutic substance aggregates.
30. The method according to any one of 1 to 29 above, wherein the standard for quantifying and sizing the biotherapeutic substance aggregate consists of a monomer of the biotherapeutic substance.
31. The standard for quantification and size measurement of biotherapeutic substance aggregates is described in any one of 1 to 30 above, which comprises a biotherapeutic substance monomer and is covalently stabilized. the method of.
32. The standard for quantification and size measurement of biotherapeutic substance aggregates is a particle, to which two or more identical or different polypeptide sequences are attached and the polypeptide sequence is such a sequence. , The method according to any one of 1-31 above, characterized in that it is identical in the corresponding partial region to the sequence of the monomer of the biotherapeutic substance bound by the capture molecule and / or the probe molecule. ..
33. Any one of 1-32 above, characterized in that the standard for quantification and size measurement of biotherapeutic substance aggregates is particles to which two or more biotherapeutic substance monomers are bound. The method described in.
34. The method according to any one of 1 to 33 above, which comprises selecting particles made of silica.
35. The method according to any one of 1 to 34 above, which comprises selecting particles having a hydrophilic coating.
36. Next ingredient:
・ Board,
・ Probe molecules that bind by specific binding to biotherapeutic substance aggregates,
・ Optional: Standard,
-Optional: Capture molecule
The kit for selective quantification of the biopharmaceutical active ingredient aggregate according to any one of 1 to 35 above, which comprises one or more of the above.
Claims (30)
次のステップ：
ステップａ．の前に、基板上での、凝集体に対する捕捉分子の固定化が行われ、前記捕捉分子はヒト抗体のＦＣ部分のＣＨ２ドメインに特異的に結合し、ただし、ステップａ）の前に前記基板上に親水層が施与され、前記捕捉分子は、この親水層に共有結合され、
ａ．基板の反応チャンバーに、試料としての医薬品の溶液中にバイオ治療物質として存在する被検査ＩｇＧ試料をアプライするステップ、
ｂ．ヒト抗体凝集体のＦＣ部分のＣＨ２ドメインへの特異的結合により凝集体を標識する、検知に適切なプローブ分子であって、そのためにＣＦ４８８およびＣＦ６３３蛍光色素で標識されている検知に適切なプローブ分子を添加するステップ、
ｃ．標識されたバイオ治療物質凝集体を検知するステップ、
ただし、ステップｂ）をステップａ）の前に行ってもよい、
ｄ．空間分解式のＴＩＲＦ顕微鏡法により、ステップｃ）に従い、標識された凝集体を検知し、および標識された個々の凝集体を検出するステップ、ただし、当該検出において、反応チャンバーごとに２つの蛍光チャネル（ＥＸ／ＥＭ＝６３３／７１５ｎｍおよび４８８／５２５ｎｍ）によってそれぞれ画像が連続的に撮影され、その結果、バックグラウンドシグナルの存在下で個々の凝集体の検出が行われ、評価が、蛍光チャネルごとに、強度閾値を、予め平均された陰性対照から設定し、そして、画像ごとに、ピクセルが両方の蛍光チャネルにおいてちょうど同じ位置で蛍光チャネルの強度閾値を上回るピクセルのみを数えることによって行われる、
を含む、前記の検知方法。 A method for detecting aggregates of human IgG antibody, which is a biotherapeutic substance, in a sample.
Next step:
Step a. Immobilization of the capture molecule to the aggregate is performed on the substrate prior to the capture molecule specifically binding to the CH2 domain of the FC portion of the human antibody, provided that the substrate is prior to step a). A hydrophilic layer is applied on top, and the trapping molecule is covalently bonded to this hydrophilic layer.
a. A step of applying an IgG sample to be tested , which is present as a biotherapeutic substance in a solution of a pharmaceutical product as a sample, to the reaction chamber of the substrate.
b. A probe molecule suitable for detection that labels the aggregate by specific binding of the FC portion of the human antibody aggregate to the CH2 domain , and is therefore labeled with CF488 and CF633 fluorescent dyes. Steps to add ,
c. Steps to detect labeled biotherapeutic aggregates ,
However, step b) may be performed before step a).
d. A step of detecting labeled aggregates and individual labeled aggregates according to step c) by spatially resolved TIRF microscopy, provided that in such detection, two fluorescent channels per reaction chamber. Images were taken continuously by (EX / EM = 633/715 nm and 488/525 nm) respectively, resulting in the detection of individual aggregates in the presence of a background signal and evaluation for each fluorescent channel. The intensity threshold is set from a pre-averaged negative control, and for each image, only pixels where pixels exceed the fluorescence channel intensity threshold at exactly the same position in both fluorescence channels are counted.
The above-mentioned detection method including .
バイオ治療物質凝集体の定量化およびサイズ測定のための標準が粒子であり、当該粒子には２つ以上の同一のまたは異なるポリペプチドが結合しており、当該ポリペプチドの配列が、それらのポリペプチドの配列に関して、捕捉分子によって結合される前記バイオ治療物質の単量体の配列と対応する部分領域において同一であることを特徴とする、請求項２２～２４のいずれか一つに記載の方法。Particles are the standard for the quantification and size measurement of biotherapeutic substance aggregates, to which two or more identical or different polypeptides are bound, and the sequence of the polypeptides is their poly. The method of any one of claims 22-24, wherein the sequence of the peptide is identical in the corresponding partial region to the sequence of the monomer of the biotherapeutic substance bound by the capture molecule. ..
・ 基板、
・ バイオ治療物質凝集体への特異的結合によって結合するプローブ分子、
の１つまたは複数を含有するか、あるいは次の成分：
・ 基板、
・ バイオ治療物質凝集体への特異的結合によって結合するプローブ分子
の１つまたは複数と、標準および／または捕捉分子とを含有する、
請求項１～２９のいずれか一つに記載の方法によるバイオ治療物質凝集体の選択的定量化のためのキット。 Next ingredient:
・ Board,
・ Probe molecules that bind by specific binding to biotherapeutic substance aggregates ,
Contains one or more of , or the following ingredients:
・ Board,
-Probe molecule that binds by specific binding to biotherapeutic substance aggregates
Containing one or more of the standard and / or capture molecules,
A kit for selective quantification of biotherapeutic substance aggregates by the method according to any one of claims 1 to 29 .
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