JPWO2018216792A1 - Agent for improving stability of RNA in blood and method of administration - Google Patents
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Abstract
本発明は、血中におけるＲＮＡの安定性の改善剤および投与方法を提供する。より具体的には、本発明によれば、カチオン性ポリマーを含む、RNAの血中安定性の改善剤が提供される。本発明によればまた、カチオン性ポリマーとRNA（特にキャリアに内包されたRNA）とを含むRNA溶液が提供される。The present invention provides an agent for improving the stability of RNA in blood and an administration method. More specifically, the present invention provides an agent for improving the stability of RNA in blood, comprising a cationic polymer. According to the present invention, there is also provided an RNA solution containing a cationic polymer and RNA (particularly, RNA encapsulated in a carrier).
Description
本発明は、血中におけるＲＮＡの安定性の改善剤および投与方法に関する。 The present invention relates to an agent for improving the stability of RNA in blood and an administration method.
治療用核酸の送達は、現在難治である様々な疾患の治療を実現する可能性を有しているため注目を集めている。核酸による治療はDNAやmRNAといった核酸を疾患に運ぶことで治療用タンパクを得ることや、siRNAやアンチセンスオリゴ核酸などを疾患に運び原因遺伝子をダウンレギュレーションすることで達成される。しかしながら核酸は生体内で分解されやすい物質であるゆえ、疾患部位まで活性を保ちつつ送り届けることは一般的に困難である。特にmRNAは、非分裂細胞に対しても遺伝子発現が可能、またDNAのようにゲノムインテグレーションを誘起しないことから有用な治療用核酸として注目を集めているのだが、その生体内安定性は極めて低く、疾患部位までmRNAの活性を保ちつつ運ぶことがmRNAによる治療実現に際するボトルネックであると言えよう。 The delivery of therapeutic nucleic acids has attracted attention because of its potential for the treatment of a variety of currently intractable diseases. The treatment with a nucleic acid is achieved by obtaining a therapeutic protein by delivering a nucleic acid such as DNA or mRNA to a disease, or by carrying siRNA or an antisense oligonucleic acid to a disease and down-regulating a causative gene. However, since nucleic acids are substances that are easily degraded in vivo, it is generally difficult to deliver nucleic acids to a disease site while maintaining their activity. In particular, mRNA is attracting attention as a useful therapeutic nucleic acid because it can express genes even in non-dividing cells and does not induce genomic integration like DNA, but its in vivo stability is extremely low It can be said that carrying the mRNA to the disease site while maintaining its activity is a bottleneck in realizing treatment with mRNA.
治療用核酸の送達に関して、各種技術が開発されている。例えば、mRNAを効率良く生体内に送達できるポリイオンコンプレックスとして特許文献１が開発されている。この技術においては、mRNAとカチオン性ポリマーと含むポリイオンコンプレックス型ミセルを体内に投与する。また、特許文献２では、カチオン性ポリアミノ酸セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーと、核酸とを含む構造体が開示され、この構造体中では、該カチオン性ポリアミノ酸セグメントの正電荷と該核酸の負電荷とが相殺されて電気的に中性であり、該核酸が該親水性ポリマー鎖セグメントに覆われているものが開示されている。
Various techniques have been developed for the delivery of therapeutic nucleic acids. For example,
本発明は、血中におけるＲＮＡの安定性の改善剤および投与方法を提供する。 The present invention provides an agent for improving the stability of RNA in blood and an administration method.
発明者らは、カチオン性ポリマーを先行投与した対象にＲＮＡを投与すると、ＲＮＡの血中安定性が劇的に向上することを見出した。本発明者らはまた、ＲＮＡを薬剤送達用キャリアに内包させ、得られたＲＮＡ内包キャリアとカチオン性ポリマーとを混ぜて投与すると、ＲＮＡの血中安定性が向上することも見出した。発明者らはさらに、過剰量のカチオン性ポリマーがｍＲＮＡの血中安定性の向上に必要であることを見出した。本発明はこのような知見に基づく発明である。 The present inventors have found that administration of RNA to a subject to which a cationic polymer has been previously administered dramatically improves the stability of RNA in blood. The present inventors have also found that, when RNA is encapsulated in a carrier for drug delivery and the resulting RNA-encapsulated carrier and a cationic polymer are mixed and administered, the blood stability of RNA is improved. The inventors have further found that an excess amount of the cationic polymer is necessary for improving the blood stability of mRNA. The present invention is an invention based on such knowledge.
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）ＲＮＡの血中安定性を向上させることに用いるための組成物であって、カチオン性ポリマーを含む、組成物。
（２）ＲＮＡを内包した薬剤送達用のキャリアと併用される、上記（１）に記載の組成物。
（３）裸のＲＮＡと併用される、上記（１）に記載の組成物。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物であって、ＲＮＡの投与に先だって投与されることを特徴とする、組成物。
（５）カチオン性ポリマーが、非電荷親水性ポリマーブロックとのブロック共重合体の形態である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）非電荷親水性ポリマーブロックが、ポリエチレングリコールブロックである、上記（５）に記載の組成物。
（７）カチオン性ポリマーが、アミノ基を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含むペプチドである、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物。
（８）薬剤送達用のキャリアに内包されたＲＮＡとカチオン性ポリマーとを含む、医薬製剤。
（９）薬剤送達用のキャリアに内包されたＲＮＡとカチオン性ポリマーとの組合せ。
（１０）血中の裸のＲＮＡの安定性を向上させることに用いるための、カチオン性ポリマーを含む組成物。
（１１）血中の薬剤送達用のキャリアに内包されたＲＮＡの安定性を向上させることに用いるための、カチオン性ポリマーを含む、組成物。That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
(1) A composition for use in improving blood stability of RNA, comprising a cationic polymer.
(2) The composition according to the above (1), which is used in combination with a carrier for drug delivery containing RNA.
(3) The composition according to the above (1), which is used in combination with naked RNA.
(4) The composition according to any one of the above (1) to (3), which is administered prior to the administration of RNA.
(5) The composition according to any one of the above (1) to (4), wherein the cationic polymer is in the form of a block copolymer with an uncharged hydrophilic polymer block.
(6) The composition according to the above (5), wherein the non-charged hydrophilic polymer block is a polyethylene glycol block.
(7) The composition according to any one of (1) to (6), wherein the cationic polymer is a peptide containing, as a monomer unit, an amino acid having an amino group in a side chain.
(8) A pharmaceutical preparation comprising RNA and a cationic polymer encapsulated in a carrier for drug delivery.
(9) Combination of RNA encapsulated in a carrier for drug delivery and a cationic polymer.
(10) A composition containing a cationic polymer for use in improving the stability of naked RNA in blood.
(11) A composition comprising a cationic polymer for use in improving the stability of RNA encapsulated in a carrier for drug delivery in blood.
本明細書では、「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物である。対象は、健常の対象であってもよいし、何らかの疾患に罹患した対象であってもよい。
対象は、哺乳動物、例えば、ヒトであり、特に、本発明の改善剤やＲＮＡ溶液の投与が有益である哺乳動物、例えば、ヒトであり得る。As used herein, a “subject” is a mammal, including a human. The subject may be a healthy subject or a subject suffering from any disease.
The subject can be a mammal, eg, a human, and in particular, a mammal, eg, a human, for whom administration of the ameliorating agent or RNA solution of the invention is beneficial.
本明細書では、「血中安定性」とは、血中における安定性を意味する。ＲＮＡの場合は、血中安定性が低いことが知られているが、これは、血中に大量に存在するＲＮＡ分解酵素によりＲＮＡが迅速に分解されていることが主要な原因と考えられている。
本明細書では、「血中安定性の改善剤」または「血中における安定化剤」とは、血中安定性を改善する、または向上させることに用いられる薬剤を意味し、「血中安定性を改善することに用いるための組成物」、「血中安定性を改善することに用いるための医薬組成物」、「血中において安定化することに用いるための組成物」、または「血中において安定化することに用いるための医薬組成物」と同義であり、これら用語と相互互換的に用いられる。As used herein, “blood stability” means stability in blood. In the case of RNA, it is known that the stability in blood is low, but this is thought to be mainly due to the rapid degradation of RNA by RNase present in a large amount in blood. I have.
As used herein, the term "agent for improving blood stability" or "stabilizer in blood" means an agent that improves or improves blood stability. A composition for use in improving blood stability, a `` pharmaceutical composition for use in improving blood stability, '' a `` composition for use in stabilizing in blood, '' Synonymous with "pharmaceutical composition for use in stabilizing", and are used interchangeably with these terms.
本明細書では、「キャリア」とは、薬剤送達用のキャリアを意味し、薬剤を内包できる微粒子、例えば、小胞、デンドリマー、ハイドロゲルおよびナノスフェアなどが挙げられる。薬剤輸送体は、一般的には、直径１０ｎｍ〜４００ｎｍの大きさを有する。 As used herein, “carrier” refers to a carrier for drug delivery, and includes microparticles capable of containing a drug, such as vesicles, dendrimers, hydrogels, and nanospheres. Drug transporters typically have a size between 10 nm and 400 nm in diameter.
本明細書では、「薬剤送達用の」とは、生体適合性であること、および、薬剤を小胞に内包できることを意味する。本明細書では、「薬剤送達用の」とは、薬剤の血中残存時間を、裸の薬剤の血中残存時間と比べて長期化する用途などを意味することがある。本明細書では、特にRNAの送達に適したキャリアに対して、「RNA送達用の」キャリアと述べることがある。 As used herein, "for drug delivery" means biocompatible and capable of encapsulating the drug in vesicles. As used herein, the term "for drug delivery" may mean, for example, an application in which the blood remaining time of a drug is made longer than that of a naked drug in blood. In this specification, a carrier "for RNA delivery" may be referred to as a carrier particularly suitable for delivering RNA.
本明細書では、「小胞」とは、物質を内包できる微粒子や中空微粒子を指す用語を意図して用いられる。小胞は、好ましくは生体適合性の外殻または修飾を有する。 As used herein, the term “vesicle” is intended to mean a fine particle or a hollow fine particle capable of containing a substance. The vesicles preferably have a biocompatible shell or modification.
本明細書では、「ミセル」とは、高分子などの分子が集合して形成される小胞を意味する。ミセルは、通常は１層の分子膜により形成される。ミセルとしては、界面活性剤などの両親媒性分子により形成されるミセル、および、ポリイオンコンプレックスにより形成されるミセル（ＰＩＣミセル）が挙げられる。ミセルは、生物学的利用能の改善の観点では、その外表面をポリエチレングリコール等の親水性ポリマーで修飾することが好ましい。 As used herein, the term “micelle” refers to a vesicle formed by assembling molecules such as macromolecules. A micelle is usually formed by one molecular film. Micelles include micelles formed by amphiphilic molecules such as surfactants, and micelles formed by polyion complexes (PIC micelles). From the viewpoint of improving bioavailability, micelles are preferably modified on the outer surface thereof with a hydrophilic polymer such as polyethylene glycol.
本明細書では、「リポソーム」とは、２層の分子膜により形成される小胞を意味する。分子膜は通常はリン脂質による二重膜である。 As used herein, “liposome” means a vesicle formed by a bilayer molecular membrane. Molecular membranes are usually bilayers of phospholipids.
本明細書では、「ポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム」（以下、「PICsome」ともいう）とは、ポリイオンコンプレックスにより形成される中空の微粒子を意味する。PICsomeは、生物学的利用能の改善の観点では、その外表面をポリエチレングリコール等の親水性ポリマーで修飾することが好ましい。 In the present specification, “polyion complex type polymersome” (hereinafter, also referred to as “PICsome”) means hollow fine particles formed by a polyion complex. From the viewpoint of improving bioavailability, PICsome preferably has its outer surface modified with a hydrophilic polymer such as polyethylene glycol.
本明細書では、「ＰＥＧ」とは、ポリエチレングリコールを意味する。本明細書では、「分岐ＰＥＧ」とは、２本以上のＰＥＧを有するＰＥＧを意味する。本明細書では、「分岐ＰＥＧ」と対比する際に、１本のＰＥＧ鎖のみを有するＰＥＧを１本鎖ＰＥＧと呼ぶことがある。 As used herein, “PEG” means polyethylene glycol. As used herein, “branched PEG” means a PEG having two or more PEGs. In the present specification, a PEG having only one PEG chain may be referred to as a single-chain PEG when compared with a “branched PEG”.
本明細書では、「分子量」または「平均分子量」は、ポリマーに関する文脈においては、特に断りの無い限り、数平均分子量を意味する。 As used herein, "molecular weight" or "average molecular weight" means, in the context of a polymer, the number average molecular weight, unless otherwise specified.
本明細書では、「重合度」または「平均重合度」は、ポリマーにおける単量体単位の数（数平均重合度）を意味し、「平均重合度」は、特に断りのない限り数平均重合度を意味する。 In the present specification, the “degree of polymerization” or “average degree of polymerization” means the number of monomer units (number average degree of polymerization) in the polymer, and the “average degree of polymerization” means the number average degree of polymerization unless otherwise specified. Degree means.
本明細書では、「ＲＮＡ」は、リボ核酸を意味する。ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、アンチセンスオリゴ核酸、および二本鎖ＲＮＡ、並びにＲＮＡの誘導体が挙げられる。本明細書では、遊離状態のＲＮＡを意味する用語として、「裸のＲＮＡ」という用語を用いる。 As used herein, "RNA" means ribonucleic acid. Examples of RNA include messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), ribosomal RNA (rRNA), non-coding RNA (ncRNA), siRNA, shRNA, aptamer, antisense oligonucleic acid, double-stranded RNA, and derivatives of RNA. Is mentioned. In the present specification, the term “naked RNA” is used as a term meaning free RNA.
本明細書では、「カチオン性ポリマー」とは、カチオン性の単量体を含む単量体単位を重合させて得られ、全体としてカチオン性であるポリマーを意味する。カチオン性ポリマーには、ホモカチオン性ポリマー、およびホモカチオン性ポリマーとＰＥＧなどの非電荷親水性ポリマーとが連結したポリマー等が挙げられる。カチオン性ポリマーが他のポリマーとブロック共重合体を形成しているとき、カチオン性ポリマー部分は、カチオン性ブロックと呼ばれることがある。本明細書では、カチオン性ポリマーは、薬学的に許容されるカチオン性ポリマーである。 As used herein, the term "cationic polymer" refers to a polymer that is obtained by polymerizing a monomer unit containing a cationic monomer and that is entirely cationic. Examples of the cationic polymer include a homocationic polymer, and a polymer in which a homocationic polymer and an uncharged hydrophilic polymer such as PEG are linked. When a cationic polymer forms a block copolymer with another polymer, the cationic polymer moiety may be referred to as a cationic block. As used herein, a cationic polymer is a pharmaceutically acceptable cationic polymer.
本明細書では、「親水性ポリマー」とは、分子全体として親水性であるポリマーを意味する。本明細書では、「非電荷親水性ポリマー」とは、ポリマーが局所的にも全体的にも中性の電荷を有し、かつ、水性媒体に対して溶解性を示すポリマーを意味する。非電荷親水性ポリマーは、局所的にも全体的にも電荷が中和されている限り、極性原子を有していてもよい。本発明では、非電荷親水性ポリマーは、薬学的に許容される非電荷親水性ポリマーである。 As used herein, "hydrophilic polymer" means a polymer that is hydrophilic as a whole molecule. As used herein, "uncharged hydrophilic polymer" means a polymer in which the polymer has a local and globally neutral charge and is soluble in aqueous media. The uncharged hydrophilic polymer may have polar atoms as long as the charge is neutralized locally and totally. In the present invention, the non-charged hydrophilic polymer is a pharmaceutically acceptable non-charged hydrophilic polymer.
本明細書では、「ＰＥＧを有する」または「分岐ＰＥＧを有する」という用語は、特に断りのない限り、ポリマーの一端においてＰＥＧを有する、または分岐ＰＥＧを有し、他端には有しないことを意味する。 As used herein, the term "having a PEG" or "having a branched PEG" refers to having a PEG at one end of the polymer or having a branched PEG and not at the other end, unless otherwise specified. means.
本明細書では、「併用」または「併用する」とは、ある薬剤を他の薬剤と組み合わせて対象に投与することを意味する。「併用」は、ある薬剤と他の薬剤とが同時に投与されること、および別々に（連続的にまたは逐次的に）投与されることの両方を含む意味で用いられる。 As used herein, “in combination” or “to use in combination” means that one agent is administered to a subject in combination with another agent. "Combination" is used in a sense that includes both the simultaneous administration of one agent and the other, and the separate (sequential or sequential) administration.
血中にはＲＮＡ分解酵素が含まれており、ＲＮＡは血中では極めて迅速に分解されることが知られている。従って、従来の手法では、ＲＮＡをキャリアに内包させて物理的バリアをＲＮＡに与え、予めＲＮＡを保護した上で投与することで、ＲＮＡ分解酵素がＲＮＡにアクセスすることを防ぐ戦略が採用されていた。しかし、本発明者らは、カチオン性ポリマーを先行投与した対象にＲＮＡを投与すると、ＲＮＡの血中安定性が劇的に向上することを見出した。 It is known that ribonuclease is contained in blood, and that RNA is extremely rapidly degraded in blood. Therefore, in the conventional method, a strategy is employed in which the RNA is included in a carrier to provide a physical barrier to the RNA, and the RNA is protected and administered beforehand, thereby preventing the RNase from accessing the RNA. Was. However, the present inventors have found that administration of RNA to a subject to which a cationic polymer has been previously administered dramatically improves the blood stability of RNA.
また、本発明者らは、ＲＮＡを薬剤送達用キャリアに内包させ、得られたＲＮＡ内包キャリアとカチオン性ポリマーとを混ぜて投与すると、ＲＮＡの血中安定性が向上することも見出している。この場合にも、カチオン性ポリマーを先行投与し、その後、ＲＮＡ内包キャリアを投与しても、ＲＮＡの血中安定性は向上した。このことから、カチオン性ポリマーは、薬剤送達用キャリアに内包させたＲＮＡの血中安定性を向上させる効果を有することが明らかとなった。 In addition, the present inventors have also found that when RNA is encapsulated in a carrier for drug delivery and the resulting RNA-encapsulated carrier and a cationic polymer are mixed and administered, the blood stability of RNA is improved. Also in this case, the stability of the RNA in blood was improved even if the cationic polymer was administered in advance and then the RNA-encapsulated carrier was administered. From this, it became clear that the cationic polymer has an effect of improving the blood stability of RNA encapsulated in the drug delivery carrier.
本発明では、カチオン性ポリマーを含む、ＲＮＡの血中安定性の改善剤が提供される。 The present invention provides an agent for improving the stability of RNA in blood, comprising a cationic polymer.
ＲＮＡの血中安定性の改善作用には、カチオン性ポリマーが嵩の大きな非電荷親水性ポリマーとのブロック共重合体の形態であることが好ましいことが明らかとなった。従って、本発明では、ＲＮＡの血中安定性の改善剤に含まれるカチオン性ポリマーは、非電荷親水性ポリマーの共重合体、特にＰＥＧとの共重合体、好ましくは分岐ＰＥＧとの共重合体であり得る。ここで、非電荷親水性ポリマーとしては、特に限定されないが、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリサッカライド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリ（２−メタクロイルオキシエチルホスホリルコリン）挙げられる。非電荷親水性ポリマーとしては、ポリアルキレングリコール、ポリ（２−オキサゾリン）が好ましく用いられ、ポリアルキレングリコールが特に好ましく用いられ得る。ポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリコールが好ましく用いられ得る。 It has been clarified that the cationic polymer is preferably in the form of a block copolymer with a bulky uncharged hydrophilic polymer for improving the blood stability of RNA. Therefore, in the present invention, the cationic polymer contained in the agent for improving the blood stability of RNA is a copolymer of an uncharged hydrophilic polymer, particularly a copolymer with PEG, preferably a copolymer with branched PEG. Can be Here, the non-charged hydrophilic polymer is not particularly limited. For example, polyalkylene glycol, poly (2-oxazoline), polysaccharide, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polyacrylamide, polymethacrylamide, polyacrylic acid ester, Polymethacrylic acid esters and poly (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine). As the non-charged hydrophilic polymer, polyalkylene glycol and poly (2-oxazoline) are preferably used, and polyalkylene glycol can be particularly preferably used. As the polyalkylene glycol, polyethylene glycol can be preferably used.
上記カチオン性ポリマーとＰＥＧを含む共重合体においては、ＰＥＧ部分の平均分子量は、例えば、１０ｋＤ以上、１５ｋＤ以上、２０ｋＤ以上、３０ｋＤ以上、または４０ｋＤ以上とすることができ、好ましくは、２０ｋＤ以上であり、より好ましくは３０ｋＤ以上である。カチオン性ポリマーは、平均重合度１５以上、２０以上、３０以上、または４０以上であり得る。ＰＥＧ部分の嵩を増す観点では、ＰＥＧ部分は、平均分子量の大きな、例えば、４０ｋＤ以上、５０ｋＤ以上、６０ｋＤ以上、または７０ｋＤ以上の平均分子量を有する一本鎖ＰＥＧとすることもできるし、１０ｋＤ以上、１５ｋＤ以上、２０ｋＤ以上、３０ｋＤ以上、または４０ｋＤ以上の平均分子量を有するＰＥＧ鎖を複数本有する分岐ＰＥＧとすることもできる。ＰＥＧ部分の嵩を増加させる観点では、分岐ＰＥＧは好ましく用いられ得る。
ある態様では、カチオン性ポリマーとＰＥＧを含む共重合体は、ＰＥＧ部分が、好ましくは、１０ｋＤ以上、１５ｋＤ以上、２０ｋＤ以上、３０ｋＤ以上、または４０ｋＤ以上の平均分子量を有するＰＥＧ鎖を複数本有する分岐ＰＥＧであり、カチオン性ポリマー部分が平均重合度１５以上、２０以上、３０以上、または４０以上であり得る。この特定の態様において、カチオン性ポリマーとＰＥＧを含む共重合体は、ＰＥＧ部分が、好ましくは、２０ｋＤ以上、３０ｋＤ以上、または４０ｋＤ以上の平均分子量を有するＰＥＧ鎖を複数本有する分岐ＰＥＧであり、カチオン性ポリマー部分が平均重合度２０以上、３０以上、または４０以上であり得る。ＰＥＧ部分の平均分子量の上限は、例えば、１５０ｋＤ、１４０ｋＤ、１３０ｋＤ、１２０ｋＤ、１１０ｋＤ、１００ｋＤ、９０ｋＤ、８０ｋＤ、７０ｋＤ、６０ｋＤ、５０ｋＤ、または４０ｋＤとすることができる。また、カチオン性ポリマー部分の平均重合度の上限は、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、または２０とすることができる。ある１つの好ましい態様では、カチオン性ポリマーとＰＥＧを含む共重合体は、ＰＥＧ部分が、１０ｋＤ〜５０ｋＤの平均分子量を有するＰＥＧ鎖を複数哺乳する分岐ＰＥＧであり、カチオン性ポリマー部分が、１０〜４０の平均重合度を有するカチオン性ポリマーであり得る。ある１つの好ましい態様では、カチオン性ポリマーとＰＥＧを含む共重合体は、ＰＥＧ部分が、１５ｋＤ〜４５ｋＤの平均分子量を有するＰＥＧ鎖を複数哺乳する分岐ＰＥＧであり、カチオン性ポリマー部分が、１５〜３０の平均重合度を有するカチオン性ポリマーであり得る。
ある態様では、カチオン性ポリマーとＰＥＧを含む共重合体は、ＰＥＧ部分が、４０ｋＤ以上、５０ｋＤ以上、６０ｋＤ以上、または７０ｋＤ以上の平均分子量を有する一本鎖ＰＥＧであり、カチオン性ポリマー部分が平均重合度１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上または７０以上であり得る。この特定の態様において、カチオン性ポリマーとＰＥＧを含む共重合体は、ＰＥＧ部分が、６０ｋＤ以上、または７０ｋＤ以上の平均分子量を有する一本鎖ＰＥＧであり、カチオン性ポリマー部分が平均重合度５０以上、６０以上または７０以上であり得る。ＰＥＧ部分の平均分子量の上限は、例えば、１５０ｋＤ、１４０ｋＤ、１３０ｋＤ、１２０ｋＤ、１１０ｋＤ、１００ｋＤ、９０ｋＤ、８０ｋＤ、７０ｋＤ、６０ｋＤ、５０ｋＤ、または４０ｋＤとすることができる。また、カチオン性ポリマー部分の平均重合度の上限は、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、または２０とすることができる。ある１つの好ましい態様では、カチオン性ポリマーとＰＥＧを含む共重合体は、ＰＥＧ部分が、５０ｋＤ〜１００ｋＤの平均分子量を有する１本鎖ＰＥＧであり、カチオン性ポリマー部分が、１０〜４０の平均重合度を有するカチオン性ポリマーであり得る。ある１つの好ましい態様では、カチオン性ポリマーとＰＥＧを含む共重合体は、ＰＥＧ部分が、６０ｋＤ〜９０ｋＤの平均分子量を有する１本鎖ＰＥＧであり、カチオン性ポリマー部分が、１５〜３０の平均重合度を有するカチオン性ポリマーであり得る。In the copolymer containing the cationic polymer and PEG, the average molecular weight of the PEG moiety can be, for example, 10 kD or more, 15 kD or more, 20 kD or more, 30 kD or more, or 40 kD or more, and preferably 20 kD or more. And more preferably at least 30 kD. The cationic polymer may have an average degree of polymerization of 15 or more, 20 or more, 30 or more, or 40 or more. From the viewpoint of increasing the bulk of the PEG moiety, the PEG moiety can be a single-chain PEG having a large average molecular weight, for example, an average molecular weight of 40 kD or more, 50 kD or more, 60 kD or more, or 70 kD or more, or 10 kD or more. , 15 kD or more, 20 kD or more, 30 kD or more, or a branched PEG having a plurality of PEG chains having an average molecular weight of 40 kD or more. From the viewpoint of increasing the bulk of the PEG moiety, a branched PEG can be preferably used.
In some embodiments, the copolymer comprising the cationic polymer and PEG comprises a branched PEG moiety having a plurality of PEG chains having an average molecular weight of preferably 10 kD or more, 15 kD or more, 20 kD or more, 30 kD or more, or 40 kD or more. PEG, and the cationic polymer moiety may have an average degree of polymerization of 15 or more, 20 or more, 30 or more, or 40 or more. In this particular embodiment, the copolymer comprising the cationic polymer and the PEG is a branched PEG wherein the PEG moiety has a plurality of PEG chains, preferably having an average molecular weight of at least 20 kD, at least 30 kD, or at least 40 kD; The cationic polymer portion can have an average degree of polymerization of 20 or greater, 30 or greater, or 40 or greater. The upper limit of the average molecular weight of the PEG moiety can be, for example, 150 kD, 140 kD, 130 kD, 120 kD, 110 kD, 100 kD, 90 kD, 80 kD, 70 kD, 60 kD, 50 kD, or 40 kD. The upper limit of the average degree of polymerization of the cationic polymer portion can be 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, or 20. In one preferred embodiment, the copolymer comprising the cationic polymer and the PEG is a branched PEG wherein the PEG moiety comprises a plurality of PEG chains having an average molecular weight of 10 kD to 50 kD, and the cationic polymer moiety comprises 10 to 10 kD. It may be a cationic polymer having an average degree of polymerization of 40. In one preferred embodiment, the copolymer comprising the cationic polymer and the PEG is a branched PEG wherein the PEG moiety is a plurality of PEG chains having an average molecular weight of 15 kD to 45 kD, and the cationic polymer moiety is 15 to 15 kD. It may be a cationic polymer having an average degree of polymerization of 30.
In some embodiments, the copolymer comprising a cationic polymer and PEG is a single-chain PEG wherein the PEG moiety has an average molecular weight of at least 40 kD, at least 50 kD, at least 60 kD, or at least 70 kD, wherein the cationic polymer moiety has an average molecular weight of at least 40 kD. The degree of polymerization may be 15 or more, 20 or more, 30 or more, 40 or more, 50 or more, 60 or more, or 70 or more. In this particular embodiment, the copolymer comprising the cationic polymer and the PEG is a single-chain PEG wherein the PEG moiety has an average molecular weight of at least 60 kD, or at least 70 kD, and the cationic polymer moiety has an average degree of polymerization of at least 50. , 60 or more or 70 or more. The upper limit of the average molecular weight of the PEG moiety can be, for example, 150 kD, 140 kD, 130 kD, 120 kD, 110 kD, 100 kD, 90 kD, 80 kD, 70 kD, 60 kD, 50 kD, or 40 kD. The upper limit of the average degree of polymerization of the cationic polymer portion can be 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, or 20. In one preferred embodiment, the copolymer comprising the cationic polymer and the PEG is a single-chain PEG wherein the PEG moiety has an average molecular weight of 50 kD to 100 kD and the cationic polymer moiety has an average polymerization of 10 to 40. It may be a cationic polymer having a degree. In one preferred embodiment, the copolymer comprising the cationic polymer and the PEG is a single-chain PEG wherein the PEG moiety has an average molecular weight of 60-90 kD and the cationic polymer moiety has an average polymerization of 15-30. It may be a cationic polymer having a degree.
本発明では、カチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤は、ＲＮＡ投与の前に投与しても、安定化効果を示す。従って、本発明では、カチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤は、ＲＮＡ投与の前に投与する、カチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤が提供される。ここで、カチオン性ポリマー、または上記改善剤は、ＲＮＡ投与の直前に投与することができ、３０秒以上前に投与することができ、１分以上、２分以上、３分以上、４分以上、または５分以上前に投与することができる。 In the present invention, the agent for improving the blood stability of a cationic polymer or an RNA containing the cationic polymer exhibits a stabilizing effect even when administered before the RNA administration. Therefore, in the present invention, the agent for improving the blood stability of a cationic polymer or an RNA containing a cationic polymer is an agent for improving the blood stability of an RNA containing a cationic polymer, which is administered before administration of the RNA. Provided. Here, the cationic polymer or the improving agent can be administered immediately before RNA administration, and can be administered 30 seconds or more, and can be administered for 1 minute or more, 2 minutes or more, 3 minutes or more, 4 minutes or more. Or more than 5 minutes before.
カチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤は、投与直前にＲＮＡと混合して、または混合せずに同時に投与してもよいであろう。 The cationic polymer, or an agent that improves the blood stability of RNA containing the cationic polymer, may be administered simultaneously with or without mixing with the RNA immediately before administration.
本発明によれば、カチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤は、薬剤送達用のキャリアに内包されたＲＮＡの血中安定性をも向上させることができた。従って、本発明によれば、薬剤送達用のキャリアに内包されたＲＮＡと同時にまたは別々に投与される、カチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤が提供される。 According to the present invention, a cationic polymer or an agent for improving blood stability of RNA containing a cationic polymer can also improve blood stability of RNA encapsulated in a carrier for drug delivery. . Therefore, according to the present invention, there is provided an agent for improving the stability of a cationic polymer or an RNA containing a cationic polymer in blood, which is administered simultaneously or separately with RNA encapsulated in a carrier for drug delivery. .
薬剤送達用のキャリアに内包されたＲＮＡは、裸のＲＮＡよりも高い安定性を有する。従って、薬剤送達用のキャリアに内包されたＲＮＡと、カチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤の投与順序は、任意に決定することができる。ある態様では、例えば、薬剤送達用のキャリアに内包されたＲＮＡを先に投与し、その後、カチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤を投与することができる。別のある態様では、例えば、カチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤を先に投与し、その後、薬剤送達用のキャリアに内包されたＲＮＡを投与することができる。別のある態様では、例えば、薬剤送達用のキャリアに内包されたＲＮＡとカチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤とを同時に投与することができる。ある態様では、カチオン性ポリマー、または上記改善剤は、ＲＮＡを内包した薬剤送達用のキャリア投与の直前に投与することができ、３０秒以上前に投与することができ、１分以上、２分以上、３分以上、４分以上、または５分以上前に投与することができる。ある態様では、ＲＮＡを内包した薬剤送達用のキャリアは、カチオン性ポリマー、または上記改善剤の投与５分前、４分前、３分前、２分前、１分前、３０秒前、または直前に投与することができ、キャリア投与からカチオン性ポリマーの投与までは短い方がよい。同時に投与する場合には、輸液バックに薬剤送達用のキャリアに内包されたＲＮＡとカチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤と混入させて投与することができる。 RNA encapsulated in a carrier for drug delivery has higher stability than naked RNA. Therefore, the order of administration of the RNA encapsulated in the carrier for drug delivery and the agent for improving the blood stability of the cationic polymer or the RNA containing the cationic polymer can be arbitrarily determined. In some embodiments, for example, RNA encapsulated in a carrier for drug delivery can be administered first, followed by administration of a cationic polymer or an agent comprising a cationic polymer that improves the blood stability of RNA. In another certain embodiment, for example, an agent for improving the blood stability of a cationic polymer or an RNA containing the cationic polymer is administered first, and then the RNA encapsulated in a carrier for drug delivery is administered. it can. In another aspect, for example, RNA encapsulated in a carrier for drug delivery and a cationic polymer, or an agent for improving the blood stability of RNA containing a cationic polymer can be administered simultaneously. In some embodiments, the cationic polymer or the ameliorating agent can be administered just prior to administration of the RNA-encapsulating carrier for drug delivery, can be administered 30 seconds or more ago, and can be administered for 1 minute or more and 2 minutes or more. The administration can be made 3 minutes or more, 4 minutes or more, or 5 minutes or more. In one embodiment, the RNA-encapsulated carrier for drug delivery is 5 minutes before, 4 minutes before, 3 minutes before, 2 minutes before, 1 minute, 30 seconds before administration of a cationic polymer or the above-mentioned improving agent, or It can be administered immediately before, and the shorter the period from the administration of the carrier to the administration of the cationic polymer, the better. In the case of simultaneous administration, the infusion bag may be mixed with RNA encapsulated in a carrier for drug delivery and a cationic polymer, or an agent for improving the stability of RNA containing the cationic polymer in blood, and administered.
輸液バックにＲＮＡとカチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤と混入させる場合には、先にカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤を混入させ、その後、ＲＮＡを混入させると、ＲＮＡの分解を防ぐ意味では好ましい。 When mixing the RNA and the cationic polymer, or the agent for improving the blood stability of RNA containing the cationic polymer into the infusion bag, first mix the agent for improving the blood stability of the RNA containing the cationic polymer. After that, it is preferable to mix RNA, in order to prevent RNA degradation.
カチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤は、血中において用量依存的に、裸のＲＮＡおよびキャリアに内包されたＲＮＡを安定化させる。従って、カチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤は、例えば、０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重で対象に投与され得る。カチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤の投与量は、対象の体重、年齢、性別、疾患の重篤度、該ポリマーの生体適合性の程度、または疾患の状態に基づいて医師により調整され得る。 An agent for improving the stability of a cationic polymer or RNA containing a cationic polymer in the blood stabilizes naked RNA and RNA encapsulated in a carrier in the blood in a dose-dependent manner. Accordingly, the agent for improving the blood stability of the cationic polymer or the RNA containing the cationic polymer can be administered to a subject at, for example, 0.1 to 1000 mg / kg body weight, more preferably 1 to 100 mg / kg body weight. The dose of the cationic polymer or the agent for improving the blood stability of the RNA containing the cationic polymer may vary depending on the body weight, age, sex, severity of the disease, degree of biocompatibility of the polymer, or disease. It can be adjusted by the physician based on the condition.
本発明では、カチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤と、ＲＮＡとを含むＲＮＡ溶液が提供される。本発明のＲＮＡ溶液では、溶液に含まれるカチオン性ポリマーは、例えば、０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重となる量で含まれる。ある態様では、カチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤とＲＮＡとの量比は、その電荷比において、例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、または１０以上であり得る。カチオン性ポリマーがアミノ基を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含むペプチドの場合には、カチオン性ポリマーとＲＮＡとの用量比は、Ｎ／Ｐ比において２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、または１０以上であり得る。ある特定の態様では、ＲＮＡは、薬剤送達用のキャリアに内包されている。ある特定の態様では、ＲＮＡは、キャリアに内包されていないＲＮＡ（裸のＲＮＡ）である。ある態様では、本発明のＲＮＡ溶液は、薬剤送達用キャリアに内包されたＲＮＡと、カチオン性ポリマーとを含む、ＲＮＡ溶液である。ある態様では、本発明のＲＮＡ溶液は、薬剤送達用キャリアに内包されたＲＮＡと、カチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤とを含む、RNA溶液である。ある態様では、本発明のＲＮＡ溶液は、薬剤送達用キャリアに内包されたＲＮＡと、カチオン性ポリマーとを混合して得られた、ＲＮＡ溶液である。ある態様では、本発明のＲＮＡ溶液は、薬剤送達用キャリアに内包されたＲＮＡと、カチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤とを混合して得られた、ＲＮＡ溶液である。ある態様では、本発明のＲＮＡ溶液は、薬剤送達用キャリアに内包されたＲＮＡと、カチオン性ポリマーとを混合して得られた、ＲＮＡ溶液であり、ここで、薬剤送達用キャリアの構成要素としてカチオン性ポリマーが含まれる。ある態様では、本発明のＲＮＡ溶液は、薬剤送達用キャリアに内包されたＲＮＡと、カチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤とを混合して得られた、ＲＮＡ溶液であり、ここで、薬剤送達用キャリアの構成要素としてカチオン性ポリマーが含まれる。本発明のある態様では、本発明のＲＮＡ溶液は、薬剤送達用キャリアに内包されたＲＮＡと、カチオン性ポリマーとを混合して得られた、ＲＮＡ溶液であり、ここで、薬剤送達用キャリアの構成要素としてカチオン性ポリマーが含まれ、当該薬剤送達用キャリアの構成要素としてのカチオン性ポリマーと、本発明の改善剤としてのカチオン性ポリマーとは、同一であるか、または異なる｛当該薬剤送達用キャリアの構成要素としてのカチオン性ポリマーまたは本発明の改善剤としてのカチオン性ポリマーが複数種のポリマーを含む場合、構成成分の全てが同じであるか、一部が同じであり、かつ他の一部が異なるか、または全てが異なる｝。本発明のある態様では、本発明のＲＮＡ溶液は、薬剤送達用キャリアに内包されたＲＮＡと、カチオン性ポリマーを含むＲＮＡの血中安定性の改善剤とを混合して得られた、ＲＮＡ溶液であり、ここで、薬剤送達用キャリアの構成要素としてカチオン性ポリマーが含まれ、当該薬剤送達用キャリアの構成要素としてのカチオン性ポリマーと、本発明の改善剤としてのカチオン性ポリマーとは、同一であるか、または異なる｛当該薬剤送達用キャリアの構成要素としてのカチオン性ポリマーまたは本発明の改善剤としてのカチオン性ポリマーが複数種のポリマーを含む場合、構成成分の全てが同じであるか、一部が同じであり、かつ他の一部が異なるか、または全てが異なる｝。 According to the present invention, there is provided an RNA solution containing a cationic polymer or an RNA containing the cationic polymer, and an RNA containing the same. In the RNA solution of the present invention, the cationic polymer contained in the solution is contained, for example, in an amount of 0.1 to 1000 mg / kg body weight, more preferably 1 to 100 mg / kg body weight. In one embodiment, the ratio of the cationic polymer or the agent for improving the blood stability of the RNA containing the cationic polymer to the RNA is, for example, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more in the charge ratio. It can be 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 10 or more. In the case where the cationic polymer is a peptide containing an amino acid having an amino group in a side chain as a monomer unit, the dose ratio of the cationic polymer to RNA is 2 or more, 3 or more, 4 or more in N / P ratio. It may be 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 10 or more. In certain aspects, the RNA is encapsulated in a carrier for drug delivery. In certain aspects, the RNA is non-carrier-encapsulated RNA (naked RNA). In one embodiment, the RNA solution of the present invention is an RNA solution containing RNA encapsulated in a drug delivery carrier and a cationic polymer. In one embodiment, the RNA solution of the present invention is an RNA solution containing RNA encapsulated in a drug delivery carrier and an agent for improving the blood stability of RNA containing a cationic polymer. In one aspect, the RNA solution of the present invention is an RNA solution obtained by mixing RNA encapsulated in a drug delivery carrier and a cationic polymer. In one embodiment, the RNA solution of the present invention is an RNA solution obtained by mixing RNA encapsulated in a drug delivery carrier and an agent for improving blood stability of RNA containing a cationic polymer. In one embodiment, the RNA solution of the present invention is an RNA solution obtained by mixing an RNA encapsulated in a drug delivery carrier and a cationic polymer, wherein the component is a component of the drug delivery carrier. Cationic polymers are included. In one embodiment, the RNA solution of the present invention is an RNA solution obtained by mixing RNA encapsulated in a drug delivery carrier and an agent for improving blood stability of RNA containing a cationic polymer, Here, a cationic polymer is included as a component of the carrier for drug delivery. In one embodiment of the present invention, the RNA solution of the present invention is an RNA solution obtained by mixing RNA encapsulated in a carrier for drug delivery and a cationic polymer, wherein the solution of the carrier for drug delivery is used. The cationic polymer as a component of the carrier for drug delivery and the cationic polymer as an improving agent of the present invention are the same or different from each other. When the cationic polymer as a component of the carrier or the cationic polymer as the improver of the present invention contains a plurality of types of polymers, all or some of the components are the same and the other components are the same. Different parts or all different. In one embodiment of the present invention, the RNA solution of the present invention is an RNA solution obtained by mixing RNA encapsulated in a carrier for drug delivery, and an agent for improving blood stability of RNA containing a cationic polymer. Here, a cationic polymer is included as a component of the drug delivery carrier, and the cationic polymer as a component of the drug delivery carrier and the cationic polymer as an improving agent of the present invention are the same. Or when the cationic polymer as a component of the carrier for drug delivery or the cationic polymer as an improving agent of the present invention includes a plurality of types of polymers, all of the components are the same, Some are the same and others are different or all are different.
本発明では、カチオン性ブロックとしては、例えば、カチオン性天然アミノ酸およびカチオン性非天然アミノ酸、例えば、ヒスチジン、トリプトファン、オルニチン、アルギニンおよびリジンなどのカチオン性天然アミノ酸、および／または、−（ＮＨ−（ＣＨ2）2）p−ＮＨ2で表される基｛ここで、ｐは１〜５の整数である。｝を側鎖として有するポリマーブロック、例えば、上記カチオン性の側鎖を有するカチオン性非天然アミノ酸のポリマーブロック、例えば、上記カチオン性の側鎖を有するアスパラギン酸またはグルタミン酸などのカチオン性非天然アミノ酸のポリマーブロックが挙げられる。本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、−（ＮＨ−（ＣＨ2）2）p−ＮＨ2で表される基｛ここで、ｐは１〜５の整数である。｝を側鎖として有するポリマーブロックである。ここで、カチオン性天然アミノ酸としては、好ましくはヒスチジン、トリプトファン、オルニチン、アルギニンおよびリジンが挙げられ、より好ましくはアルギニン、オルニチンおよびリジンが挙げられ、さらに好ましくはオルニチンおよびリジンが挙げられ、さらにより好ましくはリジンが挙げられる。本発明のある態様では、カチオン性ポリマーは、ポリリジンまたはポリオルニチンとすることができる。In the present invention, as the cationic block, for example, a cationic natural amino acid and a cationic unnatural amino acid, for example, a cationic natural amino acid such as histidine, tryptophan, ornithine, arginine and lysine, and / or-(NH- ( CH 2 ) 2 ) a group represented by p- NH 2 where p is an integer of 1 to 5;側 as a side chain, for example, a polymer block of a cationic unnatural amino acid having a cationic side chain, for example, a cationic unnatural amino acid such as aspartic acid or glutamic acid having a cationic side chain. Polymer blocks. In one aspect of the present invention, the polycation blocks, - (NH- (CH 2) 2) a group represented by {wherein at p -NH 2, p is an integer of 1 to 5.ポ リ マ ー is a polymer block having 側 as a side chain. Here, the cationic natural amino acid preferably includes histidine, tryptophan, ornithine, arginine and lysine, more preferably includes arginine, ornithine and lysine, further preferably includes ornithine and lysine, and still more preferably. Is lysine. In one aspect of the invention, the cationic polymer can be polylysine or polyornithine.
ポリカチオンブロックには、カチオン性アミノ酸およびカチオン性の側鎖を有するアミノ酸が混在していてもよい。すなわち、本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、カチオン性天然アミノ酸、カチオン性非天然アミノ酸、または、カチオン性天然アミノ酸およびカチオン性非天然アミノ酸を含むモノマー単位の重合体である。本発明のある態様では、ポリカチオンブロック中のモノマー単位間の結合はペプチド結合である。本発明の好ましい態様では、カチオン性非天然アミノ酸が、側鎖として−（ＮＨ−（ＣＨ2）2）p−ＮＨ2で表される基｛ここで、ｎは１〜５の整数である｝を有するアミノ酸である。また、本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、カチオン性天然アミノ酸並びに−（ＮＨ−（ＣＨ2）2）p−ＮＨ2で表される基｛ここで、ｐは１〜５の整数である。｝で修飾されたアスパラギン酸およびグルタミン酸が任意の順番で重合してなるポリカチオンブロックとすることができる。本発明のある態様では、ポリマー中のモノマー単位の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％が側鎖として−（ＮＨ−（ＣＨ2）2）p−ＮＨ2で表される基｛ここで、ｐは１〜５の整数である。｝を有する。In the polycation block, a cationic amino acid and an amino acid having a cationic side chain may be mixed. That is, in one aspect of the invention, the polycation block is a cationic natural amino acid, a cationic unnatural amino acid, or a polymer of monomer units comprising a cationic natural amino acid and a cationic unnatural amino acid. In one aspect of the invention, the bonds between the monomer units in the polycation block are peptide bonds. In a preferred embodiment of the present invention, the cationic unnatural amino acid is a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 as a side chain, where n is an integer of 1 to 5. Is an amino acid having Further, in some aspects of the present invention, the polycationic block is cationic natural amino acids as well as - (NH- (CH 2) 2 ) a group represented by {wherein at p -NH 2, p is an integer from 1 to 5 is there. The polycation block obtained by polymerizing aspartic acid and glutamic acid modified by｝ in an arbitrary order can be obtained. In one aspect of the present invention, 40% of the monomer units in the polymer, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% or 100% as a side chain - (NH- (CH 2 ) 2 ) a group represented by p- NH 2 , where p is an integer of 1 to 5. ｝.
本発明のある態様では、ポリカチオンブロックとしては、ポリ（Ａｓｐ（ジエチルトリアミン））（以下「ポリ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））」という）が用いられる。 In one embodiment of the present invention, poly (Asp (diethyltriamine)) (hereinafter referred to as “poly (Asp (DET))”) is used as the polycation block.
本発明のある側面では、薬剤送達用のキャリアに内包されたＲＮＡとカチオン性ポリマーとを含む、医薬製剤が提供される。医薬製剤は、薬学的に許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。医薬製剤は、適正製造基準（ＧＭＰ）準拠であり、通常は、該製剤に含まれる有効成分等の薬学的意義を有する成分の合成途上で生じる副産物を除去して得られる（但し、医薬製剤は、除去できないレベルの夾雑物または検出限界以下の夾雑物を含みうる）。医薬製剤は、静脈内投与用、筋肉内投与用、腫瘍内投与用、皮下投与用、脳室内投与用、心室内投与用などの非経口投与用に調製され得る。本発明の医薬製剤においては、カチオン性ポリマーは、例えば、上記で定義されたＰＥＧとのブロック共重合体の形態でありうる。カチオン性ポリマーは、キャリアの構成成分としてのカチオン性ポリマーとは同一であっても異なっていてもよい。 In one aspect of the invention, there is provided a pharmaceutical formulation comprising RNA and a cationic polymer encapsulated in a carrier for drug delivery. Pharmaceutical formulations may include pharmaceutically acceptable excipients. Pharmaceutical preparations are in compliance with Good Manufacturing Practices (GMP) and are usually obtained by removing by-products generated during the synthesis of pharmaceutically significant components such as active ingredients contained in the preparations (provided that pharmaceutical preparations are , Non-removable levels or below the detection limit). Pharmaceutical formulations can be prepared for parenteral administration, such as for intravenous, intramuscular, intratumoral, subcutaneous, intraventricular and intraventricular administration. In the pharmaceutical formulation of the present invention, the cationic polymer can be, for example, in the form of a block copolymer with PEG as defined above. The cationic polymer may be the same as or different from the cationic polymer as a component of the carrier.
本発明のある側面では、対象にＲＮＡを投与する方法であって、対象にカチオン性ポリマーを投与することと、対象にＲＮＡを投与することとを含む、方法が提供される。本発明のある態様では、カチオン性ポリマーとＲＮＡとは別々に投与される。本発明のある態様では、カチオン性ポリマーは、ＲＮＡと同時に、またはＲＮＡよりも先に対象に投与され得る。 In one aspect of the invention, there is provided a method of administering RNA to a subject, the method comprising: administering a cationic polymer to the subject; and administering the RNA to the subject. In one aspect of the invention, the cationic polymer and the RNA are administered separately. In certain aspects of the invention, the cationic polymer may be administered to the subject simultaneously with, or prior to, the RNA.
本発明のある側面では、対象にＲＮＡを投与する方法であって、対象にカチオン性ポリマーを投与することと、対象にＲＮＡを内包した薬剤送達用のキャリアを投与することとを含む、方法が提供される。本発明のある側面では、対象の組織にRNAを送達する方法であって、対象にカチオン性ポリマーを投与することと、対象にＲＮＡを内包した薬剤送達用のキャリアを投与することとを含む、方法が提供される。本発明のある態様では、カチオン性ポリマーは、ＲＮＡを内包した薬剤送達用のキャリアと同時にまたは別々に投与され得る。 In one aspect of the invention, a method of administering RNA to a subject, comprising administering to the subject a cationic polymer, and administering to the subject a carrier for RNA-encapsulated drug delivery. Provided. In one aspect of the invention, a method of delivering RNA to a tissue of a subject, comprising administering to the subject a cationic polymer, and administering to the subject a carrier for RNA-encapsulated drug delivery. A method is provided. In certain aspects of the invention, the cationic polymer may be administered simultaneously or separately with the RNA-encapsulating carrier for drug delivery.
本発明のある側面では、カチオン性ポリマーを含む、ＲＮＡまたはＲＮＡを内包した薬剤送達用のキャリアと併用するための組成物または医薬組成物が提供される。本発明の別の側面では、ＲＮＡまたはＲＮＡを内包した薬剤送達用のキャリアを含む、カチオン性ポリマーと併用するための組成物または医薬組成物が提供される。本発明の組成物または医薬組成物は、投与後のＲＮＡの血中安定性を高める効果を奏し得る。併用の方法は、上述の通りである。 In one aspect of the present invention, there is provided a composition or a pharmaceutical composition for use in combination with an RNA or an RNA-encapsulating carrier for drug delivery, comprising a cationic polymer. In another aspect of the present invention, there is provided a composition or a pharmaceutical composition for use in combination with a cationic polymer, comprising RNA or a carrier for drug delivery containing RNA. The composition or the pharmaceutical composition of the present invention can exhibit the effect of increasing the blood stability of RNA after administration. The method of combined use is as described above.
本発明のある側面では、ＲＮＡまたはＲＮＡを内包した薬剤送達用のキャリアと、カチオン性ポリマーを含む組成物または医薬組成物との組合せが提供される。本発明の組合せは、投与後のＲＮＡの血中安定性を高める効果を奏し得る。併用の方法は、上述の通りである。 In one aspect of the present invention, there is provided a combination of RNA or a carrier for drug delivery containing RNA and a composition or a pharmaceutical composition comprising a cationic polymer. The combination of the present invention can exhibit the effect of increasing the blood stability of RNA after administration. The method of combined use is as described above.
本発明では、カチオン性ポリマーやこれを含む組成物は、薬学上許容されるものである。「薬学上許容される」とは、許容されない毒性を奏しないこと、および／または、許容されない毒性を奏しない用量で投与されることを意味する。 In the present invention, the cationic polymer and the composition containing the same are pharmaceutically acceptable. "Pharmaceutically acceptable" means not exhibiting unacceptable toxicity and / or being administered at a dose that does not exhibit unacceptable toxicity.
実施例１：分岐ＰＥＧを有するブロックカチオマーによるｍＲＮＡの血中安定性Example 1: mRNA stability in blood by a block cationomer having a branched PEG
分岐ＰＥＧ（分子量37000×2）を有するブロックカチオマー、分岐ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（Ｌ−リジン） (重合度20) (以下、「bPEG-b-PLL」または「PEGasus-PLL」とも称する)、および、分岐ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（Ｌ−オルニチン） (重合度20) (以下、(bPEG-b-PLO)または「PEGasus-PLO」とも称する)を合成した。
日油より購入した末端に一級アミンの構造を持つBranchPoly(ethyleneglycol)(分子量37000×2)を開始剤として、非特許文献（J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. 2003, 41 1167-1187）に則りFuchs-Farthing法により合成したLysine(TFA)-NCA、Ornithine(TFA)-NCAをそれぞれ重合した後、塩基で処理することで得られる。
具体的には、bPEG-PLLの合成では、まず一級アミンを持つbPEG(740 mg, 0.010mmol)をナカライ社より購入したベンゼンにより凍結乾燥した。続いて反応溶媒として、シグマアルドリッチ社より購入したチオウレア(TU)を関東化学社より購入した脱水N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解させて1Mの濃度に調製したDMF(1M TU)を用意した。凍結乾燥させたbPEGは10 mLのDMF (1M TU)に溶解させた。続いて、Lys(TFA)-NCAをArバック中で59 mg (0.22 mmol)フラスコに測り、DMF 2 mLに溶解させた。調製したLys(TFA)-NCA溶液をAr雰囲気下でbPEG溶液に加え、25 ℃で3日間撹拌した。反応溶液は、メタノール（シグマアルドリッチ社）とジエチルエーテル（昭和エーテル社）の1:9混合溶液300 mLに対して滴定し、共重合体bPEG-PLL(TFA)を再沈殿させた。 得られたbPEG-PLL(TFA)を濾過によって回収し、真空乾燥した。得られたbPEG-PLL(TFA)を500 mg測りとり、25 mLのメタノールに溶解させた。続いてこのbPEG-PLL(TFA)溶液に1M NaOH を7.5 mL加えて35 ℃で12時間撹拌し、TFA基の脱保護を行った。反応後は、0.01 M HClに対して3回透析を行った後、水に対して3回透析を行い、凍結乾燥によりbPEG-PLLを回収した。得られたbPEG-PLLはGEヘルスケア社のカラムsuperdex 200を用いた SEC(LC2000 system, 日本分光社)、1H-NMR(ESC400, JEOL)により解析した。bPEG-PLOについても同様の工程で合成した。
mRNAは、テンプレートのDNAをmMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Ambion社) を用いてin vitroトランスクリプションする、またpoly(A) tail kit(Ambion社)を用いてpoly(A)修飾を施すことで調製した。またテンプレートのDNA作成には、New England Biolabs社より購入したpCMV-Gluc control plasmidを用いた。Block cationomer having branched PEG (molecular weight 37000 × 2), branched poly (ethylene glycol) -b-poly (L-lysine) (degree of polymerization 20) (hereinafter, “bPEG-b-PLL” or “PEGasus-PLL”) ) And branched poly (ethylene glycol) -b-poly (L-ornithine) (degree of polymerization 20) (hereinafter also referred to as (bPEG-b-PLO) or “PEGasus-PLO”).
A non-patent document (J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. 2003, 41 1167-1187) was started using BranchPoly (ethyleneglycol) having a primary amine structure at the terminal (molecular weight 37000 × 2) purchased from NOF. ), According to the Fuchs-Farthing method.
Specifically, in the synthesis of bPEG-PLL, first, bPEG (740 mg, 0.010 mmol) having a primary amine was freeze-dried with benzene purchased from Nacalai. Subsequently, as a reaction solvent, thiourea (TU) purchased from Sigma-Aldrich Co., Ltd. was dissolved in dehydrated N, N-dimethylformamide (DMF) purchased from Kanto Chemical Co., Ltd. to prepare DMF (1M TU) prepared at a concentration of 1M. did. Lyophilized bPEG was dissolved in 10 mL of DMF (1M TU). Subsequently, Lys (TFA) -NCA was weighed into a 59 mg (0.22 mmol) flask in an Ar bag and dissolved in 2 mL of DMF. The prepared Lys (TFA) -NCA solution was added to the bPEG solution under an Ar atmosphere, followed by stirring at 25 ° C. for 3 days. The reaction solution was titrated against 300 mL of a 1: 9 mixed solution of methanol (Sigma-Aldrich) and diethyl ether (Showa Ether) to reprecipitate the copolymer bPEG-PLL (TFA). The resulting bPEG-PLL (TFA) was collected by filtration and dried under vacuum. 500 mg of the obtained bPEG-PLL (TFA) was measured and dissolved in 25 mL of methanol. Subsequently, 7.5 mL of 1M NaOH was added to this bPEG-PLL (TFA) solution, and the mixture was stirred at 35 ° C. for 12 hours to deprotect the TFA group. After the reaction, dialysis was performed three times against 0.01 M HCl, then three times against water, and bPEG-PLL was recovered by freeze-drying. The obtained bPEG-PLL was analyzed by SEC (LC2000 system, JASCO Corporation) and 1 H-NMR (ESC400, JEOL) using superdex 200 column of GE Healthcare. bPEG-PLO was synthesized in the same process.
mRNA is prepared by in vitro transcription of template DNA using the mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Ambion) and poly (A) modification using the poly (A) tail kit (Ambion). did. In addition, pCMV-Gluc control plasmid purchased from New England Biolabs was used for template DNA preparation.
マウスに対して、尾静脈より200 ng/μLのmRNA溶液200 μLと、12.5 mg/mLのPEGasus-PLLまたはPEGasus-PLO溶液100 μL（すなわち、62.5 mg/kg体重）を混合して投与した。投与後2.5、5、10分後に尾の静脈より2.0 μLの血液を採取し、1%のメルカプトエタノールを含んだRLTバッファー350 μLに加えた。その後、RNeasy kit（Qiagen社）のプロトコールに則りRNAを抽出した。抽出したRNAはReverse Transfection kit (TOYOBO社)を用いてcDNAに逆転写した後、qRT-PCR（Biorad社）により定量した。陰性対照として、マウスに対して尾静脈より200 ng/μLのmRNA溶液200 μLを投与した。 To the mice, 200 μL of 200 ng / μL mRNA solution and 100 μL of 12.5 mg / mL PEGasus-PLL or PEGasus-PLO solution (that is, 62.5 mg / kg body weight) were mixed and administered from the tail vein. 2.5, 5, and 10 minutes after administration, 2.0 μL of blood was collected from the tail vein, and added to 350 μL of RLT buffer containing 1% mercaptoethanol. Then, RNA was extracted according to the protocol of RNeasy kit (Qiagen). The extracted RNA was reverse-transcribed into cDNA using Reverse Transfection kit (TOYOBO), and then quantified by qRT-PCR (Biorad). As a negative control, mice were administered 200 μL of a 200 ng / μL mRNA solution from the tail vein.
血中における投与後2.5、5、10分後のmRNAの残存率（％）は、図１Aに示される通りであった。図１Ａに示されるように、陰性対照では、僅か2.5分でｍＲＮＡは0.01%未満に急速に分解されたが、PEGasus-PLLまたはPEGasus-PLOと混合してから投与した群では、mRNAが顕著に安定化された。 The residual ratio (%) of mRNA at 2.5, 5, and 10 minutes after administration in blood was as shown in FIG. 1A. As shown in FIG. 1A, in the negative control, mRNA was rapidly degraded to less than 0.01% in only 2.5 minutes, whereas in the group administered with PEGasus-PLL or PEGasus-PLO, the mRNA was significantly reduced. Stabilized.
実施例２：分岐ＰＥＧを有するブロックカチオマーの先行投与によるｍＲＮＡの血中安定性
実施例１では、mRNAとPEGasus-PLLまたは-PLOを混合してから同時に投与した。本実施例では、PEGasus-PLLまたは-PLOを先行投与し、その後にmRNAを投与した。 Example 2: Blood stability of mRNA by prior administration of block cationomer having branched PEG In Example 1, mRNA was mixed with PEGasus-PLL or -PLO and then administered simultaneously. In this example, PEGasus-PLL or -PLO was administered in advance, followed by mRNA.
マウスに対して、尾静脈より12.5 mg/mLのPEGasus-PLLまたはPEGasus-PLO溶液100 μLを投与した（すなわち、62.5 mg/kg体重の投与量である）。５分後に、尾静脈より200 ng/μLのmRNA溶液200 μLを投与した。投与後2.5、5、10分後に尾の静脈より2.0 μLの血液を採取し、実施例１に記載される通りにmRNAを抽出して血中におけるmRNAの安定性を評価した。 The mice received 100 μL of a 12.5 mg / mL PEGasus-PLL or PEGasus-PLO solution via the tail vein (ie, a dose of 62.5 mg / kg body weight). Five minutes later, 200 μL of a 200 ng / μL mRNA solution was administered from the tail vein. 2.5, 5, and 10 minutes after the administration, 2.0 μL of blood was collected from the tail vein, mRNA was extracted as described in Example 1, and the stability of the mRNA in the blood was evaluated.
結果は、図１Ｂに示される通りであった。図１Ｂに示されるように、PEGasus-PLLまたはPEGasus-PLOは、mRNAと同時に投与しなくても、先に投与することでmRNAの安定化効果を示した。なお、PEGasus-PLLまたはPEGasus-PLOは、125 mg/kgの用量で投与しても、マウスに対する毒性（肝毒性、腎毒性）は観察されなかった。また、同じ用量のPEGasus-PLLまたはPEGasus-PLOを先に投与し、その後mRNAを投与した上記実施例においても、マウスにおける毒性は観察されなかった。 The results were as shown in FIG. 1B. As shown in FIG. 1B, PEGasus-PLL or PEGasus-PLO showed an mRNA stabilizing effect when administered first, even when not administered simultaneously with mRNA. Even when PEGasus-PLL or PEGasus-PLO was administered at a dose of 125 mg / kg, no toxicity (hepatotoxicity, nephrotoxicity) to mice was observed. In addition, no toxicity was observed in the mice in the above example in which the same dose of PEGasus-PLL or PEGasus-PLO was administered first and then mRNA was administered.
mRNAは、実施例１とは異なり、PEGasus-PLLまたはPEGasus-PLOとは会合していない状態で血中に投与された。mRNAは血中では瞬時に分解されて消失することが知られている。したがって、従来は、mRNAは裸で血中に投与してはならないと考えられており、何らかの複合体に組込んで安定化させてから投与することが常識的であった。しかしながら、本発明では、カチオン性ポリマーを先行して対象に投与し、その後mRNAを投与してもmRNAの血中安定性が顕著に改善することを示すものである。 Unlike Example 1, mRNA was administered to the blood in a state not associated with PEGasus-PLL or PEGasus-PLO. It is known that mRNA is immediately degraded and disappeared in blood. Therefore, it has conventionally been considered that mRNA should not be administered to the blood naked, and it has been common sense to administer the mRNA after stabilizing it by incorporating it into some complex. However, the present invention shows that the stability of mRNA in blood is significantly improved even if the cationic polymer is administered to the subject in advance and then the mRNA is administered.
実施例３：分岐ＰＥＧを有するブロックカチオマーによる、キャリア中のmRNAの安定化
本実施例では、分岐ＰＥＧを有するブロックカチオマーが、キャリアに内包されたmRNAを安定化するかを確かめた。 Example 3: Stabilization of mRNA in carrier by block cationomer having branched PEG In this example, it was confirmed whether block cationomer having a branched PEG stabilizes mRNA encapsulated in a carrier.
キャリアとしては、以下のポリプレックスミセルを用いた。ポリプレックスミセルは、Biomacromolecules, 2016, 17, 354-361の記載の通りに調製した。具体的には、まず、親水性ブロック−温度応答性ブロック-カチオン性ブロックからなる三元型共重合体を合成して、これを4℃においてmRNAとの電荷比（カチオン/mRNA）が2となるよう混合し、その後、37℃で静置することにより疎水性保護層を持つポリプレックスミセルとした。 The following polyplex micelles were used as carriers. Polyplex micelles were prepared as described in Biomacromolecules, 2016, 17, 354-361. Specifically, first, a ternary copolymer composed of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block is synthesized, and the terpolymer is converted into a charge ratio with mRNA (cation / mRNA) of 2 at 4 ° C. After mixing, the mixture was allowed to stand at 37 ° C. to obtain a polyplex micelle having a hydrophobic protective layer.
マウスに対して、尾静脈より200 ng/μLのmRNAを含むポリプレックスミセル溶液200 μLと、12.5 mg/mLのPEGasus-PLLまたはPEGasus-PLO溶液100 μLを混合して投与した（すなわち、6.25 mg/kg体重の投与量である）。投与後2.5、5、10分後に尾の静脈より2.0 μLの血液を採取し、実施例１に記載される通りにmRNAを抽出して血中におけるmRNAの安定性を評価した。陰性対照（"without"）としては、PEGasus-PLLまたはPEGasus-PLOを伴わずにポリプレックスミセル化したmRNAのみを投与した。 The mice were administered a mixture of 200 μL of a polyplex micelle solution containing 200 ng / μL mRNA and 100 μL of a 12.5 mg / mL PEGasus-PLL or PEGasus-PLO solution from the tail vein (ie, 6.25 mg). / kg body weight). 2.5, 5, and 10 minutes after the administration, 2.0 μL of blood was collected from the tail vein, mRNA was extracted as described in Example 1, and the stability of the mRNA in the blood was evaluated. As a negative control ("without"), only polyplex micellarized mRNA without PEGasus-PLL or PEGasus-PLO was administered.
結果は、図２Ａに示される通りであった。図２Ａに示されるように、PEGasus-PLLまたはPEGasus-PLOと混合すると、キャリアに内包されたmRNAが安定化する様子が観察された。 The results were as shown in FIG. 2A. As shown in FIG. 2A, when mixed with PEGasus-PLL or PEGasus-PLO, it was observed that the mRNA encapsulated in the carrier was stabilized.
実施例２と同様に、PEGasus-PLLまたは-PLOを先行投与し、その後にmRNAを内包したキャリアを投与した。具体的には、マウスに対して、尾静脈より12.5 mg/mLのPEGasus-PLLまたはPEGasus-PLO溶液100 μLを投与した（すなわち、62.5 mg/kg体重の投与量である）。５分後に、尾静脈より200 ng/μLのmRNAを含むポリプレックスミセル溶液200 μLを投与した。投与後2.5、5、10分後に尾の静脈より2.0 μLの血液を採取し、実施例１に記載される通りにmRNAを抽出して血中におけるmRNAの安定性を評価した。 In the same manner as in Example 2, PEGasus-PLL or -PLO was administered in advance, and then a carrier containing mRNA was administered. Specifically, mice were administered 100 μL of 12.5 mg / mL PEGasus-PLL or PEGasus-PLO solution via the tail vein (that is, a dose of 62.5 mg / kg body weight). Five minutes later, 200 μL of a polyplex micelle solution containing 200 ng / μL mRNA was administered from the tail vein. 2.5, 5, and 10 minutes after the administration, 2.0 μL of blood was collected from the tail vein, mRNA was extracted as described in Example 1, and the stability of the mRNA in the blood was evaluated.
結果は、図２Ｂに示される通りであり、PEGasus-PLLまたはPEGasus-PLOを先行投与してもキャリアに内包されたmRNAが安定化する様子が観察された。なお、キャリアとPEGasus-PLLまたはPEGasus-PLOとの物理的相互作用は検出できなかった。したがって、カチオン性ポリマーは、キャリアに取り込まれることによってＲＮＡの安定化効果を発揮したとは考えられない。本実施例において、投与に起因するマウスにおける毒性は観察されなかった。 The results are as shown in FIG. 2B, and it was observed that mRNA encapsulated in the carrier was stabilized even when PEGasus-PLL or PEGasus-PLO was administered in advance. Note that no physical interaction between the carrier and PEGasus-PLL or PEGasus-PLO could be detected. Therefore, it is not considered that the cationic polymer exerted the RNA stabilizing effect by being incorporated into the carrier. In this example, no toxicity in mice due to administration was observed.
実施例４：過剰量の分岐ＰＥＧを有するブロックカチオマーによる、キャリア内mRNAの安定化
実施例３に記載の通り、PEGasus-PLL、PEGasus-PLOおよびポリプレックスミセルを調製した。200 ng/μLのmRNA濃度に調製したポリプレックスミセル 10 μLと、0, 2, 10 または20 mg/mLのPEGasus-PLO溶液10 μLを 3 μg/mL(血清濃度)のRNase A溶液100 μLに加え、37 ℃で1時間静置した。その後、RNeasy kit（Qiagen社）のプロトコールに則りRNAを抽出した。抽出したRNAはReverse Transfection kit (TOYOBO社)を用いてcDNAに逆転写した後、qRT-PCR（Biorad社）により定量した。 Example 4: Stabilization of mRNA in carrier with block cationomer with excess branched PEG As described in Example 3, PEGasus-PLL, PEGasus-PLO and polyplex micelles were prepared. 10 μL of polyplex micelles adjusted to an mRNA concentration of 200 ng / μL and 10 μL of 0, 2, 10 or 20 mg / mL PEGasus-PLO solution in 100 μL of 3 μg / mL (serum concentration) RNase A solution In addition, it was left still at 37 ° C. for 1 hour. Then, RNA was extracted according to the protocol of RNeasy kit (Qiagen). The extracted RNA was reverse-transcribed into cDNA using Reverse Transfection kit (TOYOBO), and then quantified by qRT-PCR (Biorad).
結果は、図３Ａに示される通りであった。図３Ａに示されるようにPEGasus-PLOは用量依存的にmRNAの血中安定性の改善効果を奏した。また、その改善効果は、PEGasus-PLOの濃度が高まるにつれて飛躍的に向上した。 The results were as shown in FIG. 3A. As shown in FIG. 3A, PEGasus-PLO exerted an effect of improving the blood stability of mRNA in a dose-dependent manner. Further, the improvement effect was dramatically improved as the concentration of PEGasus-PLO was increased.
また、33.3 ng/μL のmRNA濃度に調製したポリプレックスミセル 50 μLを37 ℃で10分間インキュベーションした。ここに25 μLの10 mM HEPESEバッファー、または12.5 mg/mLに調製したbPEG-b-PLL 溶液25 μLを加えた。続いて12 μg/mLのRNase A溶液25 μLを加え、37℃で静置した。10, 20, 30, 60, 90分後に10 μLサンプルを回収し、RNeasy kit（Qiagen社）のプロトコールに則りRNAを抽出した。抽出したRNAはReverse Transfectionkit (TOYOBO社)を用いてcDNAに逆転写した後、qRT-PCR（Biorad社）により定量した。 In addition, 50 μL of polyplex micelle adjusted to an mRNA concentration of 33.3 ng / μL was incubated at 37 ° C. for 10 minutes. 25 μL of a 10 mM HEPESE buffer or 25 μL of a bPEG-b-PLL solution adjusted to 12.5 mg / mL was added thereto. Subsequently, 25 μL of a 12 μg / mL RNase A solution was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. After 10, 20, 30, 60, and 90 minutes, a 10 μL sample was collected, and RNA was extracted according to the protocol of RNeasy kit (Qiagen). The extracted RNA was reverse-transcribed into cDNA using Reverse Transfection kit (TOYOBO) and quantified by qRT-PCR (Biorad).
結果は図３Ｂに示される通りであった。図３Ｂに示されるようにmRNAは、PEGasus-PLOを添加した群において顕著に安定化されていた。また、図３−２に示されるようにカチオン性ポリマーの添加によりmRNAの分解速度が低下した。 The results were as shown in FIG. 3B. As shown in FIG. 3B, the mRNA was significantly stabilized in the group to which PEGasus-PLO was added. Further, as shown in FIG. 3-2, the rate of mRNA degradation was reduced by the addition of the cationic polymer.
血中では、PEGasus-PLLまたはPEGasus-PLOは、ミセルに内包したmRNAとは相互作用しておらず、遊離状態にあると考えられる。このような遊離状態のPEGasus-PLLまたはPEGasus-PLOは、裸のmRNAおよびミセルに内包させたmRNAの両方をRNaseによる分解から保護することができた。このことは、遊離状態のPEGasus-PLLまたはPEGasus-PLOがＲＮＡの血中安定性を向上させる効果を有することを示唆する。本実施例において、投与に起因するマウスにおける毒性は観察されなかった。 In blood, PEGasus-PLL or PEGasus-PLO is considered to be in a free state without interacting with the mRNA contained in the micelle. Such a free PEGasus-PLL or PEGasus-PLO was able to protect both naked mRNA and mRNA encapsulated in micelles from degradation by RNase. This suggests that free PEGasus-PLL or PEGasus-PLO has the effect of improving the blood stability of RNA. In this example, no toxicity in mice due to administration was observed.
実施例５：mRNAの安定化に対する分岐ＰＥＧを有するブロックカチオマーの種類の影響
重合度の異なるPEG、重合度の異なるカチオマー、および分岐無しのPEGと比較することで各ブロックのmRNA安定性改善効果に対する重要性を調べた。 Example 5: Influence of the type of block cationomer having a branched PEG on the stabilization of mRNA The effect of improving the mRNA stability of each block by comparing with PEG having different degrees of polymerization, cationomer having different degrees of polymerization, and PEG having no branching The importance of was examined.
PEGasus-PLLは、分子量37kの2本のPEGが重合度20のポリ（Ｌ−リジン）（PLL20）に結合しているので37×2-PLL20と表記する。37×2-PLL10および37×2-PLL40は分子量37kの2本のPEGが重合度10、40のPLLに結合したポリマーをそれぞれ示し、21×2-PLL20は分子量21kの2本のPEGが重合度20のPLLに結合したポリマー、42-PLL20および42-PLL75は、分子量42kのPEGが重合度20、75のPLLに結合したポリマーをそれぞれ示す。これらは、日油より購入した末端に一級アミンの構造を持つBranchPoly(ethyleneglycol)(分子量37000×2, 21000×2)、またはPoly(ethyleneglycol)(分子量42000)を開始剤として、非特許文献（J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. 2003, 41 1167-1187）に則りFuchs-Farthing法により合成したLysine(TFA)-NCAを重合、その後塩基で処理することで得られる。
具体的には、42-PLL75の合成では、まず一級アミンを持つPEG(420 mg, 0.010mmol)をナカライ社より購入したベンゼンにより凍結乾燥した。続いて反応溶媒として、シグマアルドリッチ社より購入したチオウレア(TU)を関東化学社より購入した脱水N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解させて1Mの濃度に調製したDMF(1M TU)を用意した。凍結乾燥させたPEGは6 mLのDMF (1M TU)に溶解させた。続いて、Lys(TFA)-NCAをArバック中で220 mg (0.82 mmol)フラスコに測り、DMF 2 mLに溶解させた。調製したLys(TFA)-NCA溶液をAr雰囲気下でPEG溶液に加え、25℃で3日間撹拌した。反応溶液は、メタノール（シグマアルドリッチ社）とジエチルエーテル（昭和エーテル社）の1:9混合溶液300 mLに対して滴定し、共重合体PEG-PLL(TFA)を再沈殿させた。得られたPEG-PLL(TFA)を濾過によって回収し、真空乾燥した。得られたPEG-PLL(TFA)を500 mg測りとり、25 mLのメタノールに溶解させた。続いてこのPEG-PLL(TFA)溶液に1M NaOH を7.5 mL加えて35℃で12時間撹拌し、TFA基の脱保護を行った。反応後は、0.01 M HClに対して3回透析を行った後、水に対して3回透析を行い、凍結乾燥によりPEG-PLLを回収した。得られたPEG-PLLはGEヘルスケア社のカラムsuperdex 200を用いた SEC(LC2000 system, 日本分光社)、1H-NMR(ESC400, JEOL)により解析した。他のポリマーシリーズの合成についても、Lys(TFA)-NCA重合反応時の開始剤、モノマーの量を調節の上、同様のプロセスを行うことで得た。PEGasus-PLL is expressed as 37 × 2-PLL20 because two PEGs having a molecular weight of 37 k are bonded to poly (L-lysine) having a degree of polymerization of 20 (PLL20). 37 × 2-PLL10 and 37 × 2-PLL40 represent polymers in which two PEGs with a molecular weight of 37k are bonded to PLLs with polymerization degrees of 10 and 40, respectively, and 21 × 2-PLL20 is a polymer in which two PEGs with a molecular weight of 21k are polymerized. 42-PLL20 and 42-PLL75, polymers bound to a PLL with a degree of 20 respectively, represent polymers in which PEG with a molecular weight of 42k is bound to PLLs with a degree of polymerization of 20 and 75, respectively. These are described in Non-Patent Documents (J) using BranchPoly (ethyleneglycol) having a primary amine structure at the terminal purchased from NOF (molecular weight 37000 × 2, 21000 × 2) or Poly (ethyleneglycol) (molecular weight 42000) as an initiator. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. 2003, 41 1167-1187), obtained by polymerizing Lysine (TFA) -NCA synthesized by the Fuchs-Farthing method and then treating with a base.
Specifically, in the synthesis of 42-PLL75, PEG having a primary amine (420 mg, 0.010 mmol) was first freeze-dried with benzene purchased from Nacalai. Subsequently, as a reaction solvent, thiourea (TU) purchased from Sigma-Aldrich Co., Ltd. was dissolved in dehydrated N, N-dimethylformamide (DMF) purchased from Kanto Chemical Co., Ltd. to prepare DMF (1M TU) prepared at a concentration of 1M. did. Lyophilized PEG was dissolved in 6 mL of DMF (1M TU). Subsequently, Lys (TFA) -NCA was measured in a 220 mg (0.82 mmol) flask in an Ar bag and dissolved in 2 mL of DMF. The prepared Lys (TFA) -NCA solution was added to the PEG solution under an Ar atmosphere and stirred at 25 ° C. for 3 days. The reaction solution was titrated against 300 mL of a 1: 9 mixed solution of methanol (Sigma-Aldrich) and diethyl ether (Showa Ether) to reprecipitate the copolymer PEG-PLL (TFA). The obtained PEG-PLL (TFA) was collected by filtration and dried under vacuum. 500 mg of the obtained PEG-PLL (TFA) was measured and dissolved in 25 mL of methanol. Subsequently, 7.5 mL of 1 M NaOH was added to this PEG-PLL (TFA) solution, and the mixture was stirred at 35 ° C for 12 hours to deprotect the TFA group. After the reaction, dialysis was performed three times against 0.01 M HCl, then three times against water, and PEG-PLL was recovered by freeze-drying. The obtained PEG-PLL was analyzed by SEC (LC2000 system, JASCO Corporation) and 1 H-NMR (ESC400, JEOL) using superdex 200 column from GE Healthcare. The synthesis of other polymer series was obtained by performing the same process after adjusting the amounts of the initiator and the monomer during the polymerization reaction of Lys (TFA) -NCA.
投与するmRNAに対して実施例３と同じカチオン濃度となるように上記各ポリマーを調製した溶液100μLをマウスの尾静脈に投与した。5分後、200 ng/μLのmRNA濃度に調製したポリプレックスミセル 10 μLをマウスの尾静脈に投与した。投与2.5分後、5分後、10分後に尾の静脈より2.0 μLの血液を採取し、mRNAを実施例1記載の通りに抽出してｑRT-PCRにより定量した。 100 μL of a solution prepared with each of the above polymers so that the mRNA to be administered had the same cation concentration as in Example 3 was administered to the tail vein of the mouse. Five minutes later, 10 μL of polyplex micelle adjusted to an mRNA concentration of 200 ng / μL was administered to the tail vein of the mouse. 2.5, 5, and 10 minutes after administration, 2.0 μL of blood was collected from the tail vein, mRNA was extracted as described in Example 1, and quantified by qRT-PCR.
結果は、図４に示される通りであった。図４に示されるように、いずれのポリマーを用いた場合であっても、mRNAの血中安定性の向上効果が確認された。中でも、カチオマーブロック長が２０以上であるか、PEGが分岐PEGであるとmRNAの安定化効果が高いことが明らかとなった。カチオマーブロック長が２０以上であり、かつ、PEGが分岐PEGである場合にも非常に高いmRNAの血中安定性の向上効果が観察された。 The results were as shown in FIG. As shown in FIG. 4, the effect of improving the stability of mRNA in blood was confirmed regardless of which polymer was used. Among them, it was revealed that mRNA stabilizing effect was high when the cationomer block length was 20 or more, or when PEG was a branched PEG. When the cationomer block length was 20 or more and the PEG was a branched PEG, a very high effect of improving mRNA stability in blood was observed.
実施例６：ブロックカチオマーにおけるカチオンの種類とmRNAの安定化効果との関係
mRNAの安定化効果が、カチオンの種類に関わらず奏されるかを確認した。 Example 6: Relationship between cation type and mRNA stabilizing effect in block cationomer
It was confirmed whether the effect of stabilizing mRNA was exerted regardless of the type of cation.
カチオマーとしては以下のポリマーを用いた。
PLO24は、ポリ（Ｌ−オルニチン）が重合度24で連結したホモポリマーである。シグマアルドリッチ社より購入した11-azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amineを開始剤として用い、非特許文献（J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. 2003, 41 1167-1187）に則りFuchs-Farthing法により合成したOrnithine(TFA)-NCA(Orn(TFA)-NCA)を重合、その後塩基で処理することで得られる。具体的には、開始剤(55 mg, 0.25 mmol)をDMF (1M TU)に2 mLに溶解させた。別途Arバック中でOrn(TFA)-NCA(1.7 g, 6.3 mmol)をフラスコに測りとり、15 mLのDMF(1m TU)に溶解させた。調製したOrn(TFA)-NCA溶液を、Ar雰囲気下で開始剤溶液に加え、25℃で2日間撹拌して重合反応を行った。反応溶液を水に対して5回透析したのち、凍結乾燥することでPoly(L-ornithine)(TFA) (PLO(TFA))を得た。 得られたPLO(TFA)を500 mg測りとり、25 mLのメタノールに溶解させた。続いてこのPEG-PLL(TFA)溶液にWako社より購入した1M NaOH を7.5 mL加えて室温で12時間撹拌し、TFA基の脱保護を行った。反応後は、0.01 M HClに対して3回透析を行った後、水に対して3回透析を行い、凍結乾燥によりPLOを回収した。
DET56は、ポリ（アスパラギン酸−ジエチルトリアミン）が重合度56で連結したホモポリマーであり、中央化学製品株式会社より購入したBLA-NCAを重合して前駆体PBLAを合成、これに対してジエチレントリアミン(DET)によるエステルアミド交換反応（アミノリシス）により側鎖を修飾することで得られる。重合開始剤としては東京化成より購入したブチルアミンをナカライ社より購入したカルシウムハイドライドを乾燥剤として蒸留精製したものを用いた。ブチルアミン（7.4 mg, 0.10 mmol）を関東化学より購入した脱水ジクロロメタン20 mLに溶解した。Arバック中でモノマーBLA-NCA(1.6 g, 6.1 mmol)をフラスコに測りとり、関東化学より購入した脱水DMF 3mLに溶解した。Ar雰囲気下でBLA-NCA溶液を開始剤溶液に加え、35℃で3日間撹拌した。反応溶液をヘキサン／酢酸エチル=3/2の混合溶媒500 mLに滴定することでPBLAを沈殿させ、濾過および真空乾燥後に回収した。得られた前駆体PBLAを200 mgフラスコに測りとり、5 mLのNMPに溶解させた。続いて、ポリマー側鎖エステル構造のモル数に対して100等量のDETフラスコにとり、NMPで二倍に希釈した。Ar雰囲気下4℃のもと、DET溶液にゆっくりとPBLA溶液を加え、そのまま4 ℃で1時間撹拌し、アミノリシスを行った。アミノリシスに用いたNMPはWako社より購入、DETは東京化成より購入し、それぞれカルシウムハイドライド存在下で蒸留したものを用いた。氷上で塩酸を用いて反応溶液を中和、また0.01 M HClに対して透析を3回、水に対して透析を3回行った後、凍結乾燥によりDET56を回収した。
42-DET67は、ポリエチレングリコール（分子量42ｋ）に重合度67のポリ（アスパラギン酸−ジエチルトリアミン）が連結したポリマーであり、日油より購入した一級アミン末端を有する分子量42kのPEGを開始剤として、中央化学製品株式会社より購入したBLA-NCAを重合して前駆体PEG-PBLAを合成、これに対してジエチレントリアミン(DET)によるエステルアミド交換反応（アミノリシス）により側鎖を修飾することで得られる。重合開始剤のPEG（840 mg, 0.020 mmol）は、ナカライ社より購入したベンゼンを用いて凍結乾燥した後、関東化学より購入した脱水ジクロロメタン10 mLに溶解した。Arバック中でモノマーBLA-NCA(370 mg, 1.5 mmol)をフラスコに測りとり、関東化学より購入した脱水DMF 1.5 mLに溶解した。Ar雰囲気下でBLA-NCA溶液を開始剤溶液に加え、35 ℃で3日間撹拌した。反応溶液をヘキサン／酢酸エチル=3/2の混合溶媒300 mLに滴定することでPBLAを沈殿させ、濾過および真空乾燥後に回収した。得られた前駆体PEG-PBLAを200 mgフラスコに測りとり、5 mLのNMPに溶解させた。続いて、ポリマー側鎖エステル構造のモル数に対して100等量のDETをフラスコにとり、NMPで二倍に希釈した。Ar雰囲気下4 ℃のもと、DET溶液にゆっくりとPEG-PBLA溶液を加え、そのまま4 ℃で1時間撹拌し、アミノリシスを行った。アミノリシスに用いたNMPはWako社より購入、DETは東京化成より購入し、それぞれカルシウムハイドライド存在下で蒸留したものを用いた。氷上で塩酸を用いて反応溶液を中和、また0.01 M HClに対して透析を3回、水に対して透析を3回行った後、凍結乾燥により42-DET67を回収した。
PEIは、ポリエチレンイミンであり、invitrogen社より購入したものを用いた。
合成したポリマーシリーズはGEヘルスケア社のカラムsuperdex 200を用いた SEC(LC2000 system, 日本分光社)、1H-NMR(ESC400, JEOL)により解析した。The following polymers were used as cationomers.
PLO24 is a homopolymer in which poly (L-ornithine) is linked at a polymerization degree of 24. Non-patent literature (J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. 2003, 41 1167-1187) using 11-azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amine purchased from Sigma-Aldrich as an initiator. Ornithine (TFA) -NCA (Orn (TFA) -NCA) synthesized by the Fuchs-Farthing method according to the method described above, and then treated with a base. Specifically, the initiator (55 mg, 0.25 mmol) was dissolved in DMF (1M TU) in 2 mL. Separately, Orn (TFA) -NCA (1.7 g, 6.3 mmol) was measured in a flask in an Ar bag, and dissolved in 15 mL of DMF (1 m TU). The prepared Orn (TFA) -NCA solution was added to the initiator solution under an Ar atmosphere, and stirred at 25 ° C. for 2 days to perform a polymerization reaction. The reaction solution was dialyzed 5 times against water and freeze-dried to obtain Poly (L-ornithine) (TFA) (PLO (TFA)). 500 mg of the obtained PLO (TFA) was measured and dissolved in 25 mL of methanol. Subsequently, 7.5 mL of 1M NaOH purchased from Wako was added to the PEG-PLL (TFA) solution, and the mixture was stirred at room temperature for 12 hours to deprotect the TFA group. After the reaction, dialysis was performed three times against 0.01 M HCl, then three times against water, and PLO was recovered by freeze-drying.
DET56 is a homopolymer in which poly (aspartic acid-diethyltriamine) is linked at a degree of polymerization of 56, and synthesizes a precursor PBLA by polymerizing BLA-NCA purchased from Chuo Chemical Products Co., Ltd. It is obtained by modifying the side chain by an esteramide exchange reaction (aminolysis) using DET). As the polymerization initiator, butylamine purchased from Tokyo Kasei and distilled and purified using calcium hydride purchased from Nakarai as a desiccant was used. Butylamine (7.4 mg, 0.10 mmol) was dissolved in 20 mL of dehydrated dichloromethane purchased from Kanto Chemical. Monomer BLA-NCA (1.6 g, 6.1 mmol) was measured in a flask in an Ar bag, and dissolved in 3 mL of dehydrated DMF purchased from Kanto Chemical. Under an Ar atmosphere, the BLA-NCA solution was added to the initiator solution, and the mixture was stirred at 35 ° C. for 3 days. PBLA was precipitated by titrating the reaction solution into 500 mL of a mixed solvent of hexane / ethyl acetate = 3/2, and collected after filtration and vacuum drying. The obtained precursor PBLA was measured in a 200 mg flask and dissolved in 5 mL of NMP. Subsequently, the resultant was placed in a DET flask having an amount equivalent to 100 moles relative to the number of moles of the polymer side chain ester structure, and diluted twice with NMP. Under an Ar atmosphere at 4 ° C, the PBLA solution was slowly added to the DET solution, and the mixture was stirred at 4 ° C for 1 hour to perform aminolysis. NMP used for aminolysis was purchased from Wako, and DET was purchased from Tokyo Kasei and distilled in the presence of calcium hydride. The reaction solution was neutralized with hydrochloric acid on ice, dialyzed three times against 0.01 M HCl, and dialyzed three times against water, and then DET56 was recovered by freeze-drying.
42-DET67 is a polymer in which polyethylene glycol (molecular weight 42k) is linked with poly (aspartic acid-diethyltriamine) having a degree of polymerization of 67. The initiator is a PEG having a primary amine terminal and a molecular weight of 42k purchased from NOF. It is obtained by polymerizing BLA-NCA purchased from Chuo Chemical Products Co., Ltd. to synthesize a precursor PEG-PBLA, and modifying the side chain by transesterification (aminolysis) with diethylenetriamine (DET). PEG (840 mg, 0.020 mmol) of the polymerization initiator was freeze-dried using benzene purchased from Nakarai, and then dissolved in 10 mL of dehydrated dichloromethane purchased from Kanto Chemical. Monomer BLA-NCA (370 mg, 1.5 mmol) was measured in a flask in an Ar bag, and dissolved in 1.5 mL of dehydrated DMF purchased from Kanto Chemical. The BLA-NCA solution was added to the initiator solution under an Ar atmosphere, and the mixture was stirred at 35 ° C. for 3 days. PBLA was precipitated by titrating the reaction solution into 300 mL of a mixed solvent of hexane / ethyl acetate = 3/2, and collected after filtration and vacuum drying. The obtained precursor PEG-PBLA was weighed into a 200 mg flask, and dissolved in 5 mL of NMP. Subsequently, 100 equivalents of DET with respect to the number of moles of the polymer side chain ester structure was placed in a flask, and diluted twice with NMP. Under Ar atmosphere at 4 ° C, the PEG-PBLA solution was slowly added to the DET solution, and the mixture was stirred at 4 ° C for 1 hour to perform aminolysis. NMP used for aminolysis was purchased from Wako, and DET was purchased from Tokyo Kasei and distilled in the presence of calcium hydride. The reaction solution was neutralized with hydrochloric acid on ice, dialyzed three times against 0.01 M HCl and three times against water, and then 42-DET67 was recovered by freeze-drying.
PEI was polyethyleneimine, which was purchased from invitrogen.
The synthesized polymer series was analyzed by SEC (LC2000 system, JASCO Corporation) and 1 H-NMR (ESC400, JEOL) using GE Healthcare column superdex 200.
マウスに対して、実施例３と同じカチオン濃度となるよう濃度を調整したカチオマー溶液を100 μL投与した。五分後に200 ng/μLのmRNA濃度に調整したポリプレックスミセル溶液200 μLをマウス尾静脈より投与した。投与後2.5分後、5分後、10分後に尾の静脈より2.0 μLの血液を採取し、実施例１に記載の通りmRNAを定量した。 To the mice, 100 μL of a cationomer solution adjusted to have the same cation concentration as in Example 3 was administered. Five minutes later, 200 μL of a polyplex micelle solution adjusted to an mRNA concentration of 200 ng / μL was administered from the tail vein of the mouse. 2.5, 5, and 10 minutes after administration, 2.0 μL of blood was collected from the tail vein, and mRNA was quantified as described in Example 1.
結果は、図５に示される通りであった。図５に示されるようにいずれのカチオマーを用いた場合であっても陰性対照（"without"）に対してmRNAを安定化させた。このことから、カチオンの種類によらずカチオン性ブロックは、mRNAの安定化作用を有することが明らかとなった。 The results were as shown in FIG. As shown in FIG. 5, mRNA was stabilized against a negative control ("without") using either cationomer. From this, it became clear that the cationic block had an mRNA stabilizing action regardless of the type of cation.
これらの実施例により、ポリカチオンの先行投与とそれに続くmRNAの投与実験においてインビボでmRNAの血中安定性の改善効果が確認された。ポリカチオンは、ミセルに内包したmRNAの血中安定性を向上させる効果を有した。ポリカチオンはミセルとは相互作用していなかったことから、ポリカチオンは、キャリアに組込まれて機能を発揮したとは考えられず、この考えは、裸のmRNAの血中安定性をも改善させたことによって支持されるものである。いずれにしても、ポリカチオンは、裸のmRNAおよびキャリアに内包されたmRNAの血中安定性を向上させるものであった。 These examples confirmed the effect of improving the blood stability of mRNA in vivo in the pre-administration of polycation followed by the administration of mRNA. The polycation had an effect of improving the blood stability of the mRNA contained in the micelle. Since the polycation did not interact with the micelles, it was not considered that the polycation was incorporated into the carrier and exerted its function, and this idea also improved the stability of naked mRNA in blood. It is supported by that. In any case, the polycation improved the stability in blood of the naked mRNA and the mRNA encapsulated in the carrier.
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