JPWO2018165350A5

JPWO2018165350A5 -

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Publication number: JPWO2018165350A5
Application number: JP2019548596A
Authority: JP
Publication date: 2022-06-01
Anticipated expiration: 2038-03-08

Description

標的タンパク質、特に、現在の手法では容易に特徴づけられない測定が困難なトランスジェニックタンパク質あるいは膜結合性タンパク質の安定性および量を特徴づける方法とアッセイに対するニーズがある。
There is a need for methods and assays to characterize the stability and quantity of target proteins, in particular transgenic or membrane -bound proteins that are difficult to measure and are not easily characterized by current techniques.

本明細書に記載される実施形態は、高感受性ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳを使用して、標的タンパク質の安定性（消化性）および量を特徴づけるための新規な技術を提供する。例えば、食物、飼料、および環境上のリスクアセスメントは、植物の組織と種子内でのタンパク質の安定性と発現レベルを含むトランスジェニックタンパク質の完全な評価を必要とする。例えば、実際のサンプル中の標的タンパク質の量が検出レベルを欺くことがあるため、標的タンパク質の量は抗体を産生させるのに必要な量を欺くことがあるため、あるいは、標的タンパク質は選択的または高感受性なエピトープをもたらさないことがあるため、抗体はトランスジェニックタンパク質を特徴づけるのに必ずしも役立つとは限らない。確かに、特定の酵素のタンパク質の類似性は非特異的抗体交差反応をもたらす。さらに、緊密な膜結合性がエピトープを覆うため、抗体は多くの膜タンパク質を特徴づけるのに必ずしも役立つとは限らず、そのような膜タンパク質はしばしば低レベルで発現される。本実施形態が最小限の処理で総タンパク質抽出を利用するため、本明細書に記載されるＬＣＭＳ／ＭＳの方法をスケールアップして、ハイスループットを可能にすることができる。ゆえに、本実施形態は、測定が困難な標的タンパク質を評価するための都合の良い代替的な手法を提供する。
The embodiments described herein provide novel techniques for characterizing the stability (digestibility) and amount of target protein using the highly sensitive LC-MRM-MS. For example, food, feed, and environmental risk assessments require a complete assessment of transgenic proteins, including protein stability and expression levels in plant tissues and seeds. For example, because the amount of target protein in the actual sample can deceive the detection level, the amount of target protein can deceive the amount required to produce the antibody, or the target protein is selective or Antibodies do not always help characterize transgenic proteins because they may not result in highly sensitive epitopes. Indeed, protein similarities of certain enzymes result in non-specific antibody cross-reactivity. In addition, antibodies do not always help characterize many membrane proteins because of the tight membrane binding that covers the epitope, and such membrane proteins are often expressed at low levels. Since the present embodiment utilizes total protein extraction with minimal processing, the LC MS / MS methods described herein can be scaled up to enable high throughput. Therefore, the present embodiment provides a convenient alternative method for evaluating target proteins that are difficult to measure.

方法の１つの実施形態では、標的タンパク質はペプシンを用いて消化され、その後、トリプシンで完全に消化される。トリプシンペプチドの減少を、無傷のタンパク質の代理として使用することができ、消化性ペプチドの出現と消失を、標的タンパク質のインビトロの消化性を示すために使用することができる。この経時変化比較は、標的タンパク質の詳細な安定性の特徴づけをもたらす。測定が困難な／処理が困難なタンパク質を特徴づける際にこの手法はとりわけ有利である。
In one embodiment of the method, the target protein is digested with pepsin and then completely digested with trypsin. The reduction of tryptic peptides can be used as a surrogate for intact proteins and the appearance and disappearance of digestible peptides can be used to indicate the in vitro digestibility of the target protein. This time-varying comparison provides detailed stability characterization of the target protein. This technique is particularly advantageous when characterizing proteins that are difficult to measure / process.

少なくとも１つの実施形態は、以下の工程を含む標的タンパク質の安定性を特徴づけるための方法を提供する：標的タンパク質をペプシン消化に晒す工程、ペプシン消化からサンプルの経時変化を得る工程、各経時変化サンプルの一部をトリプシン消化に晒す工程、ペプシン・トリプシン消化のサンプルの経時変化を得る工程、各ペプシンおよびペプシン・トリプシンのサンプルについてＬＣ－ＭＳ／ＭＳのデータを集める工程；および、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータから、標的タンパク質消化の速度論と、標的タンパク質の特定領域のタンパク質分解に対する感受性とを決定する工程。
At least one embodiment provides a method for characterizing the stability of a target protein, which comprises the following steps: exposing the target protein to pepsin digestion, obtaining a sample over time from pepsin digestion, changes over time . The step of exposing a part of the sample to trypsin digestion, the step of obtaining the time course of the pepsin / trypsin digestion sample, the step of collecting LC-MS / MS data for each pepsin and pepsin / trypsin sample; and LC-MS /. The process of determining the rate of digestion of a target protein and its susceptibility to proteolysis of a particular region of the target protein from MS data.

Ｈｉｓ－ＰａｖｓａΔ４Ｄのペプシン消化後に特徴づけられ、定量化されたペプチドのうち４つは、切断変異体であった（図３１Ａ）。図３１Ａのパネル（Ａ）→（Ｂ）およびパネル（Ｇ）→（Ｈ）における黒色の矢印は、左のパネルに表示されたペプチドがペプシンによってさらに切断されて、右パネル中のペプチドを産出したことを示す。モニタリングされたすべての消化性ペプチドが、急速に（＜１５分）生成され、その多くがこの時間枠で平衡に達した。しかし、ペプシンが比較的非特異的であるため、モニタリングされた消化性ペプチドは、完全に切断された最終産物とならないこともある。場合によっては、ペプチド量の減少が経時的に認められた。例えば、ＰＲＬＡＰＬＶＫＡＥＬ（ａａ４０１－４１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：７）（図３１（Ｃ））は５分後に減少し、その産物であるＡＰＬＶＫＡＥＬ（ａａ４０４－４１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：７）は、減少する前に１０分－１５分間増加した。さらに、ＡＰＬＶＫＡＥＬ（ａａ４０４－４１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：７）は、モニタリングされなかったさらに小さなペプチド断片、例えばＬＶＫＡＥＬ／ＶＫＡＥＬ（ａａ４０６４１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：７）／（ａａ４０７４１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：７）を産出するために、さらに切断され得る。未切断（ペプチド配列中の下線が引かれたフォントによって示される）を含み、したがって、さらなる分解を受けやすいペプシンタンパク質分解産物の他のいくつかの例をモニタリングした（図３１Ａ、パネル（Ａ）、（Ｃ）－（Ｈ））。実際に、１つのＰａｖｓａ－Δ４Ｄペプチド、ＴＲＫＤＶＡＤＲＰＤＬ（ａａ２６－３６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７）だけが、予測された第２の切断部位を含まない（図３０Ｂ）。消化中のこれらのペプチドの出現は、Ｐａｖｓａ－Δ４Ｄタンパク質の分解、したがって、Ｐａｖｓａ－Δ４Ｄタンパク質の消化性の証拠としてみなされる。モニタリングされた８つのペプチドのうち６つが５分でピークに達した。残りの２つのペプチドは、ペプシン経時変化中の５分までに最大の反応の７０％に達し、３０分までにピークに達した（図３０Ｃ）。これらの２つのペプチドは、無傷のＰａｖｓａΔ４Ｄタンパク質の中央領域に位置した（表１８）。
Four of the peptides characterized and quantified after pepsin digestion of His-PavsaΔ4D were cleavage variants (FIG. 31A). The black arrows in panels (A) → (B) and panels (G) → (H) of FIG. 31A indicate that the peptide displayed in the left panel was further cleaved by pepsin to produce the peptide in the right panel. Show that. All monitored digestible peptides were rapidly produced (<15 minutes), many of which reached equilibrium during this time frame. However, due to the relatively non-specific nature of pepsin, monitored digestible peptides may not be the final product of complete cleavage. In some cases, a decrease in the amount of peptide was observed over time. For example, PRLAPLVKAEL (aa 401-411, SEQ ID NO: 7) (FIG. 31 (C)) decreases after 5 minutes, and its product APLVKAEL (aa 404-411, SEQ ID NO: 7) decreases. Increased 10-15 minutes before. In addition, APLVKAEL (aa 404-411, SEQ ID NO: 7) is a smaller peptide fragment that was not monitored, such as LVKAEL / VKAEL (aa 406 411, SEQ ID NO: 7) / (aa 407 411, SEQ ID NO). : Can be further cut to produce 7). Several other examples of pepsin proteolytic products containing uncut (indicated by the underlined font in the peptide sequence) and therefore susceptible to further degradation were monitored (FIG. 31A, panel (A), (C)-(H)). In fact, only one Pavsa-Δ4D peptide, TRKDVADRPDL (aa 26-36, SEQ ID NO: 7), does not contain the predicted second cleavage site (FIG. 30B). The appearance of these peptides during digestion is regarded as evidence of the degradation of the Pavsa-Δ4D protein, and thus the digestibility of the Pavsa-Δ4D protein. Six of the eight monitored peptides peaked in 5 minutes. The remaining two peptides reached 70% of the maximum reaction by 5 minutes and peaked by 30 minutes during pepsin aging (Fig. 30C). These two peptides were located in the central region of the intact PavsaΔ4D protein (Table 18).

トランスジェニック、あるいは測定が困難または膜結合性のω３ＬＣＰＵＦＡ酵素の安定性分析については、ω３ＬＣＰＵＦＡキャノーラにおいて設計された３つのフロントエンドのデサチュラーゼの代表としてＰａｖｓａ－Δ４Ｄタンパク質を使用した。フロントエンドのデサチュラーゼは、既存の二重結合と脂肪酸のカルボキシル末端の間に二重結合を導入する。さらに、フロントエンドのデサチュラーゼはすべて、デサチュラーゼ活性に必要な３つの保存されたヒスチジンモチーフを有するデサチュラーゼドメインと融合したＮ末端にシトクロムｂ５様ドメインを含む。Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，２００７．Δ４－、Δ５－、Δ６－、およびΔ８－デサチュラーゼを含むフロントエンドのデサチュラーゼは、藻類、珪藻、菌類、蘚類、細菌、ならびに植物を含む広範囲の生物中に存在する。これらのフロントエンドのデサチュラーゼのいくつかは、食品または食品生産においても一般的である。この実施例の結果は、完全長のＰａｖｓａ－Δ４Ｄタンパク質の８０％または９９％以上が１０分以内に消化され、および完全長のＰａｖｓａ－Δ４Ｄタンパク質の＞９３％または９９．６％は、ＬＣＭＳ／ＭＳによる分析時に、ペプシンにおけるインキュベーションの６０分以内に消化されたことを示した。組み合わせたペプシントリプシンアッセイは、無傷のタンパク質の存在の代理として使用されたトリプシンペプチドの急速な減少を示した。ＳＧＦ中の完全長のＰａｖｓａΔ４Ｄタンパク質の急速な消化に加えて、Ｐａｖｓａ－Δ４Ｄタンパク質は、トランスジェニックキャノーラ成熟種子に存在する総タンパク質のわずかな部分を表わす。
For the stability analysis of transgenic, or difficult to measure or membrane-bound ω3LCPUFA enzymes, the Pavsa-Δ4D protein was used as a representative of the three front-end desaturases designed in the ω3LCPUFA canola. The front-end desaturase introduces a double bond between the existing double bond and the carboxyl terminus of the fatty acid. In addition, all front-end desaturases contain a cytochrome b5-like domain at the N-terminus fused to a desaturase domain with the three conserved histidine motifs required for desaturase activity. Zhou et al. , 2007. Front-end desaturases, including Δ4-, Δ5-, Δ6-, and Δ8-desaturases, are present in a wide range of organisms, including algae, diatoms, fungi, mosses, bacteria, and plants. Some of these front-end desaturases are also common in food or food production. The results of this example show that 80% or 99% or more of the full length Pavsa-Δ4D protein is digested within 10 minutes, and> 93% or 99.6% of the full length Pavsa-Δ4D protein is LC MS. Upon analysis by / MS, it was shown to have been digested within 60 minutes of incubation with pepsin. The combined pepsin trypsin assay showed a rapid decrease in the trypsin peptide used as a surrogate for the presence of intact protein. In addition to the rapid digestion of full-length PavsaΔ4D protein in SGF, Pavsa-Δ4D protein represents a small portion of the total protein present in transgenic canola mature seeds.

＜実施例５＞ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓｃｏｒｄａｔａ）Δ５エロンガーゼ（Ｐｙｒｃｏ－Δ５Ｅ）タンパク質のインビトロでの安定性
この実施例は、トランスジェニックキャノーラのエンジニアリングに含まれる微細藻類脂肪酸エロンガーゼ、Ｐｙｒｃｏ－Δ５Ｅを特徴づけて、ＤＰＡへのＥＰＡの伸長を触媒する（２０：５^{Δ５、８、１１、１４}、^１７→２２：５^{Δ７、１０、１３、１６、１９}）。この実施例は、正確な分解／消化の産物をモニタリングするためにＭＳ使用をして、ペプシン－トリプシンアッセイと組み合わせて、ペプシンを含む両方のＳＧＦにおけるこの測定が困難／処理が困難な膜結合性タンパク質のインビトロでの安定性を評価する。ペプシン産物の出現および消失、ならびに無傷のタンパク質の代理としてのトリプシンペプチド産物の消失によって、タンパク質消化の程度を評価した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの分析の使用によって、ペプシン消化およびトリプシン消化の両方に起因するペプチド産物を初めに質的に決定し、続いて、これらのペプチド断片の検出のために定量的ＬＣＭＳ／ＭＳを開発した。ＬＣ－ＭＳ分析は、タンパク質配列全体に及ぶペプチドを同時にモニタリングすることができ、それはタンパク質分解性消化によって生成される。この実施例における消化性を分析するアプローチは、腸の通過中にペプシン（胃）酵素およびトリプシン（腸管）酵素の両方に食物タンパク質をさらす典型的な哺乳類の消化器系を模倣する。本明細書に記載される結果は、７５％以上のＰｙｒｃｏ－Δ５Ｅタンパク質が５分以内に消化され、完全長のＰｙｒｃｏ－Δ５Ｅタンパク質がペプシンにおけるインキュベーションの６０分以内に急速に消化され、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用した分析時にタンパク質の全長に及ぶ一連のペプシンペプチド産物＜３，０００Ｄａを産生したことを示す。その結果は、この内在性膜タンパク質がペプシンまたはトリプシンにおいて容易に消化可能であったことを示す。完全長のタンパク質の急速な消化は、Ｐｙｒｃｏ－Δ５Ｅがヒトの健康に対する安全性への懸念をもたらす可能性が非常に低いことを示す。
<Example 5> In vitro stability of Pyramimonas cordata Δ5 erongase (Pyrco-Δ5E) protein This example characterizes the microalgae fatty acid erongase, Pyrco-Δ5E, which is included in the engineering of transgenic canolas. It catalyzes the extension of EPA to DPA (20: 5 Δ5, 8, 11, ¹⁴ , ¹⁷ → 22: 5 ^Δ7 , 10, 13, 16, 19). This example uses MS to monitor accurate degradation / digestion products and, in combination with the pepsin-trypsin assay, this difficult / difficult to measure membrane binding in both SGFs containing pepsin. Assess the in vitro stability of the protein. The degree of protein digestion was assessed by the appearance and disappearance of pepsin products and the disappearance of tryptic peptide products on behalf of intact proteins. By using LC-MS / MS analysis, peptide products resulting from both pepsin digestion and tryptic digestion are first qualitatively determined, followed by quantitative LC MS / MS for detection of these peptide fragments. Was developed. LC-MS analysis can simultaneously monitor peptides across the protein sequence, which are produced by proteolytic digestion. The approach to analyze digestibility in this example mimics the typical mammalian digestive system that exposes food proteins to both pepsin (stomach) and trypsin (intestinal) enzymes during intestinal transit. The results described herein indicate that 75% or more of the Pyrco-Δ5E protein is digested within 5 minutes and the full-length Pyrco-Δ5E protein is rapidly digested within 60 minutes of incubation in pepsin, LC-MS. / It is shown that a series of pepsin peptide products <3,000 Da over the entire length of the protein was produced during analysis using MS. The results indicate that this integral membrane protein was readily digestible in pepsin or trypsin. Rapid digestion of full-length protein indicates that Pyrco-Δ5E is very unlikely to raise safety concerns for human health.

Ｈｉｓ－Ｐｙｒｃｏ－Δ５Ｅタンパク質の消化性を評価するために、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、質量分析法（ＭＳ）の使用に基づいて標的ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法を開発した。ペプシン消化の経時変化中の消化性ペプチドの出現および増加を、タンパク質の消化性の証拠として使用した。さらに、ペプシン消化後のトリプシンペプチドの急速な減少は、タンパク質の消化性を確認するものとして役立った。この方法で定量化するペプチドを選択するために、ペプシン消化およびトリプシン消化の両方に起因する消化産物を特徴付けた。９５％の信頼度で同定され、かつＭＳにおいて強いシグナルをもたらしたペプシン由来のペプチドを、相対的な定量化のために選択した。Ｈｉｓ－Ｐｙｒｃｏ－Δ５Ｅタンパク質のペプシン消化から選択された８つのペプチド、および単一のトリプシンペプチドを表２１－２２にまとめた。選択したペプシン由来のペプチドは、タンパク質の長さに及んだ。
To assess the digestibility of the His-Pyrco-Δ5E protein, a targeted LC-MS / MS method was developed based on the use of multiple reaction monitoring (MRM), mass spectrometry (MS). The appearance and increase of digestible peptides over time in pepsin digestion was used as evidence of protein digestibility. In addition, the rapid decrease in tryptic peptides after pepsin digestion served as a confirmation of protein digestibility. To select the peptides to be quantified in this way, we characterized digestive products resulting from both pepsin digestion and tryptic digestion. Pepsin-derived peptides identified with 95% confidence and producing a strong signal in MS were selected for relative quantification. Eight peptides selected from the pepsin digestion of the His-Pyrco-Δ5E protein, and a single tryptic peptide are summarized in Table 21-22. The selected pepsin-derived peptides extended to the length of the protein.

Ｈｉｓ－Ｐｙｒｃｏ－Δ５Ｅタンパク質の場合には、小規模（６．７μｇ充填）消化、さらに、タンパク質配列内のトリプシン部位の分布により、単一のトリプシン産物だけを検出することができ、ＬＣ－ＭＳに適したペプチドをほとんどもたらさなかった。モニタリングされた単一のペプチドであるＳＱＰＦ↓ＧＬ↓Ｋ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６の残基６６－７２）は、２つのペプシン切断部位（矢印によって示されるように）を含んでおり、および、ペプシンがこのペプチドを切断し、ペプシン消化の経時変化にわたってペプチドの存在量の減少をもたらすことが予想された。５分後、ペプチドピーク領域が３倍に増加するが、次の５分にわたって比較的一定のままであり、次の５０分にわたってゆっくり減少することが認められた（図３６）。同様の現象がΔ４Ｄに由来するペプチドで以前に観察され、ここで、ペプシンを用いたタンパク質の５分のインキュベーション後に、トリプシンペプチド（ＷＥＧＥＰＩＳＫ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：７の残基２７４－２８１）のピーク領域の２倍の増加が認められた。両方のシナリオは、その天然の立体構造（ｎａｔｉｖｅｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）がトリプシン消化から部分的に保護される、分子の核内に存在するモニタリングされたペプチドから生じると仮定される。ペプシンを用いた短いインキュベーション（５分）後、タンパク質（Ｐｙｒｃｏ－Δ５Ｅ）の３次構造は破壊され、トリプシン部位への完全なアクセス、したがって、その最大のレベルでのトリプシンペプチド（ＳＱＰＦＧＬＫ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：６のａａ６６－７２）の遊離を可能にする（図３６）。Ｐｙｒｃｏ－Δ５Ｅタンパク質に由来する検出可能なトリプシンペプチドの不在は、Δ４－デサチュラーゼおよびω３－デサチュラーゼについて本明細書で決定されるような分解の最終的な割合（表Ｂ）の決定を妨げたが、ペプシン産物の出現（図３５）は、実験の経時変化にわたってＰｙｒｃｏ－Δ５Ｅタンパク質がペプシンによって消化され、Ｎ末端領域の＞７５％の切断が＜５分で達成されたことを示した（図３５Ａ－Ｂ）。
In the case of His-Pyrco-Δ5E protein, only a single trypsin product can be detected by small-scale (6.7 μg-filled) digestion and the distribution of tryptic sites in the protein sequence, resulting in LC-MS. It yielded few suitable peptides. A single monitored peptide, SQPPF ↓ GL ↓ K (SEQ ID NO: 6, residues 66-72), contains two pepsin cleavage sites (as indicated by the arrows) and pepsin. Was expected to cleave this peptide, resulting in a decrease in peptide abundance over time in pepsin digestion. After 5 minutes, the peptide peak region increased 3-fold, but remained relatively constant over the next 5 minutes and was found to decrease slowly over the next 50 minutes (FIG. 36). A similar phenomenon was previously observed with peptides derived from Δ4D, where the peak of tryptic peptide (WEGEPISK) (residues 274-281 of SEQ ID NO: 7) after 5 minutes incubation of the protein with pepsin. A double increase in region was observed. Both scenarios are assumed to result from monitored peptides present in the nucleus of the molecule, whose native conformation is partially protected from tryptic digestion. After a short incubation with pepsin (5 minutes), the tertiary structure of the protein (Pyrco-Δ5E) is disrupted and full access to the tryptic site, thus the tryptic peptide (SQPFGLK) (SEQ ID) at its highest level. Allows the release of NO: 6 aa 66-72) (FIG. 36). The absence of a detectable tryptic peptide derived from the Pyrco-Δ5E protein prevented the determination of the final rate of degradation (Table B) as determined herein for Δ4-desaturase and ω3-desaturase, although The appearance of pepsin products (FIG. 35) showed that the Pyrco-Δ5E protein was digested by pepsin over time in the experiment and> 75% cleavage of the N-terminal region was achieved in <5 minutes (FIG. 35A-). B).

この実施例の結果は、実験の経時変化にわたってＨｉｓ－Ｐｙｒｃｏ－Δ５Ｅタンパク質が急速に消化され、Ｎ末端領域の＞７５％の切断が＜５分で達成されたことを示す。ペプシンインキュベーションの６０分以内に、ペプチド配列全体に及ぶ一連のペプシン産物＜３，０００Ｄａが産生された。ＳＧＦ中の完全長のＨｉｓ－Ｐｙｒｃｏ－Δ５Ｅタンパク質の急速な消化に加えて、Ｐｙｒｃｏ－Δ５Ｅタンパク質は、ω３ＬＣＰＵＦＡキャノーラ成熟種子の中に存在する総タンパク質のわずかな部分を表わした。急速な消化および低い発現レベルは、Ｐｙｒｃｏ－Δ５Ｅタンパク質のタンパク質の安全性を示す多くの要因のうちの２つである。
The results of this example show that the His-Pyrco-Δ5E protein was rapidly digested over time in the experiment and> 75% cleavage of the N-terminal region was achieved in <5 minutes. Within 60 minutes of pepsin incubation, a series of pepsin products <3,000 Da over the entire peptide sequence was produced. In addition to the rapid digestion of the full-length His-Pyrco-Δ5E protein in SGF, the Pyrco-Δ5E protein represented a small portion of the total protein present in the mature seeds of the ω3 LCPUFA canola. Rapid digestion and low expression levels are two of the many factors that indicate the protein safety of the Pyrco-Δ5E protein.

Ｐｉｃｐａ－ω３Ｄタンパク質の消化性を評価するために、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）（Ｌａｎｇｅｅｔａｌ．，２００８）質量分析法（ＭＳ）の使用に基づいた標的ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法を開発した。ペプシン消化の経時変化中の消化性ペプチドの出現および増加を、タンパク質の消化性の証拠として使用した。さらに、ペプシン消化に続くトリプシンペプチドの急速な減少は、タンパク質の消化性を確認するものとして役立った。
To assess the digestibility of the Picpa-ω3D protein, a targeted LC-MS / MS method was developed based on the use of multiple reaction monitoring (MRM) (Lange et al., 2008) mass spectrometry (MS). The appearance and increase of digestible peptides over time in pepsin digestion was used as evidence of protein digestibility. In addition, the rapid decrease in tryptic peptides following pepsin digestion served as a confirmation of protein digestibility.

タンパク質の長さに及ぶ１１のペプチドをＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳによってモニタリングした。ペプシン消化後に特徴付けられ、かつ定量化された多くのペプチドが、切断変異体であった（図４４（Ａ）－（Ｂ）、（Ｃ）－（Ｄ）、（Ｉ）－（Ｊ））。図４４の黒色の矢印は、左パネル中のペプチドがペプシンによってさら切断されて、右パネル中のペプチドを産出することを示す。モニタリングされたすべての消化性ペプチドが、急速に（＜１５分）産生され、その多くがこの時間枠で平衡に達した。ペプシンが比較的非特異的であるため、モニタリングされた消化性ペプチドは、完全に切断された最終産物とならないこともある。ペプシンタンパク質分解産物のいくつかの例は未切断を含み、ペプチド配列中の赤色のフォント（予想された切断部位）またはオレンジ色のフォント（潜在的に妨げられた部位）によって示される。これらのペプチドはさらなる分解を受けやすく、図４４のパネル（Ｂ）、（Ｄ）、および（Ｊ）に例証される。実際、ペプチドＶＫＲＨＰＧＧＫＩＩＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）およびＤＮＶＡＨＡＰＥＫＫＭＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）だけが、予測される二次切断部位を含んでいない。消化におけるこれらのペプチドの出現は、Ｐａｖｓａ－Δ５Ｄタンパク質の分解、したがって、Ｐａｖｓａ－Δ５Ｄタンパク質の消化性の証拠としてみなされる。モニタリングされた１１のペプチドのうち７つが、５分で最大値に達した＞７５％をした。ペプシン経時変化において５分までに残りの５つのペプチドが最大のペプチド遊離の５５％に達し、６０分までに１１のすべてのペプチドがプラトーに到達した（図４４）。
Eleven peptides spanning protein length were monitored by LC-MRM-MS. Many peptides characterized and quantified after pepsin digestion were cleavage mutants (FIGS. 44 (A)-(B), (C)-(D), (I)-(J)). .. The black arrow in FIG. 44 indicates that the peptide in the left panel is further cleaved by pepsin to produce the peptide in the right panel. All monitored digestible peptides were produced rapidly (<15 minutes), many of which reached equilibrium during this time frame. Due to the relatively non-specific nature of pepsin, monitored digestible peptides may not be the final product of complete cleavage. Some examples of pepsin proteolytic products contain uncleaved and are indicated by a red font (expected cleavage site) or an orange font (potentially disturbed site) in the peptide sequence. These peptides are susceptible to further degradation and are illustrated in panels (B), (D), and (J) of FIG. In fact, only the peptides VKRHPPGKIIA (SEQ ID NO: 5) and DNVAHAPEKKMQ (SEQ ID NO: 5) do not contain the predicted secondary cleavage site. The appearance of these peptides in digestion is regarded as evidence of the degradation of the Pavsa-Δ5D protein, and thus the digestibility of the Pavsa-Δ5D protein. Seven of the 11 monitored peptides reached a maximum of> 75% in 5 minutes. By 5 minutes, the remaining 5 peptides reached 55% of the maximum peptide release over time in pepsin, and by 60 minutes, all 11 peptides had reached the plateau (Fig. 44).

Ｈｉｓ_１０：：Ｐｙｒｃｏ－Δ６Ｅタンパク質の場合には、より少ないトリプシン産物が確信的に同定され、したがって、タンパク質消化のモニタリングに利用可能であった。これは、タンパク質配列内のトリプシン部位の頻度および分布の減少によるものであり、タンパク質の中央領域に限局されたＬＣ－ＭＳに適したペプチドをほとんどもたらさなかった。モニタリングされた最初のペプチドであるＧＱＤＰＦ↓Ｌ↓Ｌ↓Ｋ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）は、３つの潜在的ペプシン切断部位（矢印によって示される）を含み、および、ペプシンがこのペプチドを切断することが予想され、ペプシン消化の経時変化にわたるペプチド存在量の減少を結果的にもたらす。しかし、ペプチドピーク領域が、５分後に４倍に増加し、次の１０分にわたって比較的一定のままであり、次の４５分にわたってゆっくり減少することが認められた（図４７、パネル（Ａ））。同様の現象がＰｙｒｃｏ－Δ５Ｅに由来するペプチドで以前に観察され、ここで、ペプシンを用いたタンパク質の５分のインキュベーション後に、トリプシンペプチド（ＳＱＰＦＧＬＫ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）のピーク領域の３倍の増加が認められた。両方のシナリオは、その天然の立体構造がトリプシン消化から部分的に保護される、分子の核内に存在するモニタリングされたペプチドから生じると仮定される。ペプシンを用いた短いインキュベーション（５分）後、タンパク質（Ｐｙｒｃｏ－Δ６Ｅ）の３次構造が破壊され、トリプシン部位への完全なアクセスを可能にし、したがって、その最大レベルでのトリプシンペプチド（ＧＱＤＰＦＬＬＫ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）の遊離を可能にする（図４６）。同様のプロファイルが、ＶＩＷ↓ＩＦ↓Ｙ↓ＶＳＫおよびＹ↓ＳＦ↓Ｗ↓ＧＮＡＹ↓ＮＰＡＱＴＥＭＡＫ（図４７（Ｃ）－（Ｄ））で観察された。ＬＶＹ↓ＥＡＹ↓ＶＮＫ（図４７（Ｂ））の場合には、最大レベルが３０分で検出され、６０分で＞７０％減少した。Ｐｙｒｃｏ－Δ６Ｅタンパク質のＮ末端およびＣ末端に由来する検出可能なトリプシンペプチドの不在は、Ｐｉｃｐａ－ω３ＤおよびＰａｖｓａ－Δ４Ｄのために決定される最終的な分解率の決定を妨げ、ペプシン産物の出現（図４６）は、Ｐｙｒｃｏ－Δ６Ｅタンパク質が実験の経時変化にわたってペプシンによって消化され、＜５分でＮ末端およびＣ末端の領域の＞９５％の切断を達成したことを示した（図４６、パネル（Ａ）－（Ｃ）、（Ｌ））。
In the case of His ₁₀ :: Pyrco-Δ6E protein, fewer trypsin products were confidently identified and therefore available for monitoring protein digestion. This was due to a decrease in the frequency and distribution of tryptic sites within the protein sequence, resulting in little peptide suitable for LC-MS confined to the central region of the protein. The first monitored peptide, GQDPF ↓ L ↓ L ↓ K (SEQ ID NO: 4), contains three potential pepsin cleavage sites (indicated by arrows) and pepsin cleaves this peptide. Is expected, resulting in a decrease in peptide abundance over time in pepsin digestion. However, it was found that the peptide peak region increased 4-fold after 5 minutes, remained relatively constant over the next 10 minutes, and slowly decreased over the next 45 minutes (FIG. 47, panel (A)). ). A similar phenomenon was previously observed with peptides derived from Pyrco-Δ5E, where, after a 5-minute incubation of the protein with pepsin, 3 times the peak region of the trypsin peptide (SQPFGLK) (SEQ ID NO: 6). Was observed to increase. Both scenarios are assumed to arise from monitored peptides present in the nucleus of the molecule, whose natural conformation is partially protected from tryptic digestion. After a short incubation with pepsin (5 minutes), the tertiary structure of the protein (Pyrco-Δ6E) is disrupted, allowing full access to the tryptic site and thus the tryptic peptide (GQDPFLLK) at its maximum level (GQDPFLLK). It enables the release of SEQ ID NO: 4) (FIG. 46). Similar profiles were observed in VIW ↓ IF ↓ Y ↓ VSK and Y ↓ SF ↓ W ↓ GNAY ↓ NPAQTEMAK (FIGS. 47 (C)-(D)). In the case of LVY ↓ EAY ↓ VNK (FIG. 47 (B)), the maximum level was detected in 30 minutes and decreased by> 70% in 60 minutes. The absence of detectable tryptic peptides from the N-terminus and C-terminus of the Pyrco-Δ6E protein interferes with the determination of the final degradation rate determined for Pippa-ω3D and Pavsa-Δ4D, and the appearance of pepsin products ( FIG. 46) showed that the Pyrco-Δ6E protein was digested by pepsin over time in the experiment and achieved> 95% cleavage of the N-terminal and C-terminal regions in <5 minutes (FIG. 46). A)-(C), (L)).

Claims

A method for characterizing the stability of a target protein,
(A) A step of exposing the target protein to pepsin digestion to obtain at least one change over time in pepsin digestion,
(B) A step of exposing a part of each at least one time-varying sample to trypsin digestion to obtain a pepsin-digested trypsin-digested sample and a sample from pepsin-digestion / trypsin-digestion.
(C) LC-MS of each pepsin- digested sample and each pepsin-digested trypsin -digested sample without initially enriching the membrane and microsomal fractions or separating the putative target protein by electrophoresis. A step of directly collecting / MS data and ( d) determining the rate of digestion of the target protein and the susceptibility of the target protein to proteolysis of a particular region from the LC-MS / MS data. The reduction of trypsin peptides is a step used to show the appearance and disappearance of digestible proteins on behalf of intact proteins, to show the in vitro digestibility of the target protein.
Including, how.

The method of claim 1, wherein the target protein is a recombinant protein.

The method according to claim 1 or 2, wherein the target protein is a protein that is difficult to measure, that is , a membrane -binding protein.

The method according to any one of claims 1-3, wherein the target protein is obtained from a transgenic plant.

The method according to any one of claims 1 to 4 , wherein the target protein is obtained from a transgenic oilseed rape plant .

The method of claim 1, wherein after the pepsin digestion, it is completely digested with trypsin.

Peptides released from the pepsin digestion / trypsin digestion are protein extracts from the source, including total protein extracts from canola and recombinant proteins expressed in any yeast, bacterial or baculovirus expression system. The method according to claim 1, which is evaluated using an object.