JPWO2018056388A1 - Method of producing sesaminol or sesaminol glycoside - Google Patents
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Abstract
セサミノール配糖体およびセサミノールの新たな製造方法が求められていた。本発明は、セサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を切断する工程を含む、セサミノール配糖体および／またはセサミノールの製造方法を提供する。There has been a need for new methods for the preparation of sesaminol glycosides and sesaminol. The present invention provides a method for producing sesaminol glycoside and / or sesaminol, which comprises the step of cleaving at least one glucoside bond of sesaminol glycoside.
Description
本発明は、セサミノールまたはセサミノール配糖体の生産方法に関する。 The present invention relates to a process for the production of sesaminol or sesaminol glycosides.
ゴマ（Sesamum indicum）は、ゴマ科ゴマ属の一年性植物である。ゴマは約６０００年の歴史を有する最古の栽培油糧植物とされ、世界中で栽培されてきた。ゴマは、古来から貴重な食品であり、健康に良い食品として知られている。特に、ゴマの種子、ゴマの種子から得られる油、ゴマの種子の抽出物が利用されている。ゴマの種子に含まれる成分は、その約５０％が脂質であり、その主要成分は、オレイン酸およびリノール酸を主体とするトリグリセリドである。このほかに、ゴマの種子における特徴的な成分としてゴマリグナンが含まれている。 Sesame (Sesamum indicum) is a one-year-old plant of the sesame family Sesame. Sesame is considered to be the oldest cultivated oil plant with a history of about 6,000 years and has been grown worldwide. Sesame is a valuable food from ancient times and is known as a health food. In particular, sesame seeds, oil obtained from sesame seeds, extracts of sesame seeds are used. About 50% of the ingredients contained in sesame seeds are lipids, and the main ingredients are triglycerides based on oleic acid and linoleic acid. Besides this, sesame lignan is included as a characteristic component in sesame seeds.
リグナンは、植物の二次代謝物で、Ｃ６Ｃ３骨格を有するフェニルプロパノイド化合物２分子が、主としてこれらの８−８´位を介して重合（８，８´-結合）した化合物である。リグナンは植物における生体防御機構に寄与していると考えられている。ゴマに含まれるリグナンはゴマリグナンとよばれ、セサミン、セサミノール、セサモリン、ピノレジノール、およびセサモリノールがある（非特許文献１）。ゴマリグナンの１つであるセサミンは、多彩な生理活性を有しており、ゴマ種子またはゴマ種子の搾り粕から分離精製する方法がすでに実用化されている。Lignan is a secondary metabolite of plants and is a compound in which two phenylpropanoid compounds having a C 6 C 3 skeleton are polymerized (8, 8'-linked) mainly through their 8-8 'positions. . Lignans are thought to contribute to the defense mechanism in plants. The lignan contained in sesame is called sesame lignan, and includes sesamin, sesaminol, sesamorin, pinoresinol, and sesamomolol (Non-patent Document 1). Sesamin, which is one of sesame lignans, has a variety of physiological activities, and methods for separating and purifying sesame seeds or sesame seed pomace have already been put to practical use.
ゴマリグナンのうちのいくつかは配糖体として植物中に存在することが知られている。ゴマリグナンの中でもセサミノールは高い抗酸化活性を持つ。セサミノールはゴマ種子中にセサミノール配糖体として存在し、セサミノール配糖体には、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノールモノグルコシド、ＳＭＧ）、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２）-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノール（１−２）ジグルコシド、ＳＤＧ（１，２））、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-６）-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノール（１−６）ジグルコシド、ＳＤＧ（１，６））、およびセサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２）-Ｏ-（-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２））β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノールトリグルコシド、ＳＴＧ）などがある。 Some of the sesame lignans are known to exist in plants as glycosides. Among sesame lignans, sesaminol has high antioxidant activity. Sesaminol is present as a sesaminol glucoside in sesame seeds, and as the sesaminol glucoside, sesaminol 2′-O-β-D-glucopyranoside (sesaminol monoglucoside, SMG), sesaminol 2′- O-β-D-glucopyranosyl (1-2) -O-β-D-glucopyranoside (sesaminol (1-2) diglucoside, SDG (1, 2)), sesaminol 2'-O-β-D-glucopyranosyl (1-6) -O-β-D-glucopyranoside (sesaminol (1-6) diglucoside, SDG (1, 6)), and sesaminol 2'-O-β-D-glucopyranosyl (1-2)- There is O-(-β-D-glucopyranosyl (1-2)) β-D-glucopyranoside (sesaminol triglucoside, STG) and the like.
セサミノールは、また、ゴマ油の精製工程で、セサモリンから酸触媒反応によっても生成する。セサミノールには強い抗酸化活性があり、健康に好ましい生理活性が報告されている（非特許文献２）。セサミノールの生理活性は、糖部分が除去されたアグリコンで発揮される。 Sesaminol is also produced by acid catalysis from sesamoline in the process of refining sesame oil. Sesaminol has strong antioxidant activity, and a favorable physiological activity for health has been reported (Non-patent Document 2). The physiological activity of sesaminol is exerted on aglycones from which the sugar moiety has been removed.
また、ゴマ油製造の際に生じるゴマ搾り粕には、セサミノール配糖体が含まれるが、有効活用されていない。セサミノール配糖体を加水分解し、アグリコンであるセサミノールを得ることができれば、安価なゴマ搾り粕を原料としてセサミノールを生産することが可能である。セサミノール配糖体からセサミノールを取得する方法としては、真菌Aspergillus属微生物を用いる方法（特許文献１）や、バチルス属およびエンテロコッカス属菌の混合培養物を用いた発酵法（特許文献２）が開発されている。しかしながら、これらの方法ではセサミノール配糖体を完全に分解するためには長時間を要するなど、効率が低い。その他に、セサミノール配糖体からセサミノールを取得する方法として、Paenibacillus 属に属する細菌KB0549株由来のβ-グルコシダーゼを用いる方法が開示されている（特許文献３、非特許文献３）。この酵素は、セサミノール配糖体のβ−１、２−およびβ−１、６−グルコシド結合およびセサミノール−グルコース間β−グルコシド結合を切断する。ＳＴＧを基質とした場合、β−１、２−グルコシド結合をβ−１、６−グルコシド結合に比べて優先的に加水分解する。 In addition, sesame pomace produced during sesame oil production contains sesaminol glycosides, but is not effectively used. If sesaminol glycoside can be hydrolyzed to obtain aglycone sesaminol, it is possible to produce sesaminol from inexpensive sesame pomace as a raw material. As a method for obtaining sesaminol from sesaminol glycosides, a method using a fungus Aspergillus genus microorganism (Patent Document 1), and a fermentation method using a mixed culture of Bacillus and Enterococcus bacteria (Patent Document 2) can be used. It is being developed. However, in these methods, efficiency is low, for example, it takes a long time to completely decompose sesaminol glycoside. In addition, as a method for obtaining sesaminol from sesaminol glycoside, a method using β-glucosidase derived from the bacterium KB0549 strain belonging to the genus Paenibacillus has been disclosed (Patent Document 3, Non-patent Document 3). This enzyme cleaves sesaminol glycosides β-1, 2- and β-1, 6-glucosidic bonds and sesaminol-glucose β-glucosidic bonds. When STG is used as a substrate, β-1,2-glucosidic bond is preferentially hydrolyzed as compared to β-1,6-glucosidic bond.
上記のような状況の下、セサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の新たな生産方法が求められていた。 Under the circumstances as described above, a new production method of sesaminol and / or sesaminol glycoside has been desired.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、麹菌由来のグリコシドヒドロラーゼであるＡＯＢＧＬ１１ｐが、セサミノールトリグルコシドを加水分解し、セサミノールおよびセサミノール配糖体を生成する活性を有することなどを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors hydrolyze sesaminol triglucoside, AOBGL11p, which is a glycosidic hydrolase derived from bacilli, to form sesaminol and sesaminol glycosides. It has been found that it has activity and the like, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１） 以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質と、少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体を反応させて、基質セサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含む、生成セサミノールまたは生成セサミノール配糖体の製造方法。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質
（２） 前記基質セサミノール配糖体が、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノールモノグルコシド、ＳＭＧ）、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２）-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノール（１−２）ジグルコシド、、ＳＤＧ（１，２））、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-６）-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノール（１−６）ジグルコシド、ＳＤＧ（１，６））、およびセサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２）-Ｏ-（-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２））β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノールトリグルコシド、ＳＴＧ）からなる群より選択されるいずれか一つである、上記（１）に記載の方法。
（３） 前記基質セサミノール配糖体がセサミノールトリグルコシド（ＳＴＧ）である、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４） 前記生成セサミノールまたは生成セサミノール配糖体が、ＳＤＧ（１，６）、ＳＤＧ（１，２）およびセサミノールから成る群より選択されるいずれか１つ以上である、上記（１）または（２）に記載の方法。
（５） 前記少なくとも１つのグルコシド結合が、セサミノール２´位に結合したグルコースとアグリコンとの間のグルコシド結合、セサミノール２´位に結合したゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、セサミノール２´位に結合したソホロースのβ−１，２結合、またはセサミノールに２´位に結合した分岐三糖のβ−１，６−グルコシド結合もしくはβ−１，２結合からなる群より選択されるいずれか１つである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６） 宿主細胞に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体と接触させて、基質セサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含む、生成セサミノールまたは生成セサミノール配糖体の製造方法。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（７） 前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、上記（６）に記載の方法。
（８） 前記形質転換細胞が、形質転換植物、形質転換大腸菌、形質転換細菌、形質転換酵母、形質転換糸状菌からなる群から選択される、上記（６）または（７）に記載の方法。
（９） 前記基質セサミノール配糖体が、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノールモノグルコシド、ＳＭＧ）、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２）-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノール（１−２）ジグルコシド、ＳＤＧ（１，２））、セサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-６）-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノール（１−６）ジグルコシド、ＳＤＧ（１，６））、およびセサミノール２´-Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２）-Ｏ-（-β-Ｄ-グルコピラノシル（１-２））β-Ｄ-グルコピラノシド（セサミノールトリグルコシド、ＳＴＧ）からなる群より選択されるいずれか一つである、上記（６）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０） 前記生成セサミノールまたは生成セサミノール配糖体が、ＳＤＧ（１，６）、ＳＤＧ（１，２）およびセサミノールから成る群より選択されるいずれか１つ以上である、上記（６）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１） 前記少なくとも１つのグルコシド結合が、セサミノール２´位に結合したグルコースとアグリコンとの間のグルコシド結合、セサミノール２´位に結合したゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、セサミノール２´位に結合したソホロースのβ−１，２結合、またはセサミノールに２´位に結合した分岐三糖のβ−１，６−グルコシド結合もしくはβ−１，２結合からなる群より選択されるいずれか１つである、上記（６）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２） 以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、生成セサミノールまたは生成セサミノール配糖体の生産方法。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（１３） 前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、上記（１０）に記載の方法。
（１４） 前記形質転換体が、形質転換植物、形質転換大腸菌、形質転換細菌、形質転換酵母、形質転換糸状菌からなる群から選択される、上記（１２）または（１３）に記載の方法。
（１５） 前記少なくとも１つのグルコシド結合が、セサミノール２´位に結合したグルコースとアグリコンとの間のグルコシド結合、セサミノール２´位に結合したゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、セサミノール２´位に結合したソホロースのβ−１，２結合、またはセサミノールに２´位に結合した分岐三糖のβ−１，６−グルコシド結合もしくはβ−１，２結合からなる群より選択されるいずれか１つである、上記（１２）〜（１４）のいずれかに記載の方法。That is, the present invention is as follows.
(1) By reacting a protein selected from the group consisting of the following (a) to (c) with a substrate sesaminol glucoside having at least one glucosidic bond, at least one of the substrate sesaminol glycosides: A method for producing formed sesaminol or formed sesaminol glycoside, comprising the step of hydrolyzing glucosidic bonds.
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) A substrate sesaminol glycoside comprising an amino acid sequence having 1 to 83 amino acids deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucosidic bond A protein having the activity of hydrolyzing glucosidic bonds of
(C) The activity of hydrolyzing the glucosidic bond of a substrate sesaminol glycoside having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucosidic bond A protein having semenolol (2) The semenolol glycoside is sesaminol 2'-O-β-D-glucopyranoside (sesaminol monoglucoside, SMG), sesaminol 2'-O-β-D-glucopyranosyl (1 -2) -O-β-D-glucopyranoside (sesaminol (1-2) diglucoside, SDG (1,2)), sesaminol 2'-O-β-D-glucopyranosyl (1-6) -O- β-D-glucopyranoside (sesaminol (1-6) diglucoside, SDG (1, 6)), and sesaminol 2′-O-β-D-glucopyranosyl (1-2) -O-(-β-D- Glucopyranosyl ( 1-2) The method according to (1) above, which is any one selected from the group consisting of β-D-glucopyranoside (sesaminol triglucoside, STG).
(3) The method according to (1) or (2) above, wherein the substrate sesaminol glycoside is sesaminol triglucoside (STG).
(4) The above-mentioned (1), wherein the produced sesaminol or the produced sesaminol glycoside is at least one selected from the group consisting of SDG (1, 6), SDG (1, 2) and sesaminol. Or the method described in (2).
(5) The at least one glucosidic bond is a glucosidic bond between glucose linked to sesaminol 2 ′ and aglycone, β-1,6-glucosidic bond of gentiobiose linked to sesaminol 2 ′, sesaminol Selected from the group consisting of β-1,2 bond of sophorose linked at 2 ′ position, or β-1,6-glucosidic bond or β-1,2 bond of branched trisaccharide linked at 2 ′ position to sesaminol The method according to any one of the above (1) to (4), which is any one of the above.
(6) An enzyme agent derived from a non-human transformed cell into which a polynucleotide selected from the group consisting of (a) to (e) below has been introduced into a host cell, a substrate sesami having at least one glucoside bond: A method for producing formed sesaminol or formed sesaminol glycoside, which comprises the step of contacting with a nor glycoside to hydrolyze at least one glucosidic bond of substrate sesaminol glycoside.
(A) a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(C) A substrate sesaminol glycoside comprising an amino acid sequence in which 1 to 83 amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucosidic bond A polynucleotide encoding a protein having an activity of hydrolyzing glucosidic bonds of
(D) The activity of hydrolyzing the glucosidic bond of a substrate sesaminol glycoside having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucosidic bond A polynucleotide encoding a protein having
(E) A polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under high stringency conditions, and which has at least one glucosidic bond, A polynucleotide (7) encoding a protein having an activity of hydrolyzing glucosidic bond of a nol glycoside The method according to the above (6), wherein the polynucleotide is inserted into an expression vector.
(8) The method according to (6) or (7) above, wherein the transformed cell is selected from the group consisting of transformed plants, transformed E. coli, transformed bacteria, transformed yeast, and transformed filamentous fungi.
(9) The substrate sesaminol glycoside is sesaminol 2'-O-β-D-glucopyranoside (sesaminol monoglucoside, SMG), sesaminol 2'-O-β-D-glucopyranosyl (1-2) -O-β-D-glucopyranoside (sesaminol (1-2) diglucoside, SDG (1, 2)), sesaminol 2'-O-β-D-glucopyranosyl (1-6) -O-β-D- Glucopyranoside (sesaminol (1-6) diglucoside, SDG (1, 6)), and sesaminol 2'-O-β-D-glucopyranosyl (1-2) -O-(-β-D-glucopyranosyl (1- 2) The method according to any one of the above (6) to (8), which is any one selected from the group consisting of β-D-glucopyranoside (sesaminol triglucoside, STG).
(10) The above (6), wherein the produced sesaminol or the produced sesaminol glycoside is any one or more selected from the group consisting of SDG (1, 6), SDG (1, 2) and sesaminol. The method in any one of-).
(11) The at least one glucosidic bond is a glucosidic bond between glucose linked to sesaminol 2 ′ and aglycone, β-1,6-glucosidic bond of geniobiose linked to sesaminol 2 ′, sesaminol Selected from the group consisting of β-1,2 bond of sophorose linked at 2 ′ position, or β-1,6-glucosidic bond or β-1,2 bond of branched trisaccharide linked at 2 ′ position to sesaminol The method according to any one of the above (6) to (10), which is any one of the above.
(12) A method for producing produced sesaminol or produced sesaminol glycoside, comprising culturing a non-human transformant into which a polynucleotide selected from the group consisting of (a) to (e) has been introduced: .
(A) a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(C) A substrate sesaminol glycoside comprising an amino acid sequence in which 1 to 83 amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucosidic bond A polynucleotide encoding a protein having an activity of hydrolyzing glucosidic bonds of
(D) The activity of hydrolyzing the glucosidic bond of a substrate sesaminol glycoside having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucosidic bond A polynucleotide encoding a protein having
(E) A polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under high stringency conditions, and which has at least one glucosidic bond, A polynucleotide encoding a protein having an activity of hydrolyzing glucosidic bond of a nor glycoside (13) The method according to the above (10), wherein the polynucleotide is inserted into an expression vector.
(14) The method according to the above (12) or (13), wherein the transformant is selected from the group consisting of transformed plants, transformed E. coli, transformed bacteria, transformed yeast, and transformed filamentous fungi.
(15) The at least one glucosidic bond is a glucosidic bond between glucose linked to sesaminol 2 ′ and aglycone, β-1,6-glucosidic bond of geniobiose linked to sesaminol 2 ′, sesaminol Selected from the group consisting of β-1,2 bond of sophorose linked at 2 ′ position, or β-1,6-glucosidic bond or β-1,2 bond of branched trisaccharide linked at 2 ′ position to sesaminol The method according to any one of the above (12) to (14), which is any one of the above.
本発明の方法により、セサミノールおよびセサミノール配糖体の新たな製造方法が提供される。
また、反応条件を選択することで、各種セサミノール配糖体を製造することができる。本願発明の一実施形態では、酵素濃度等の反応条件を選択することで、セサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の生成量を増加させることができる。また、本願発明の一実施形態により、ＳＤＧ（１，２）の生成量を選択的に増加させることができる。The method of the present invention provides a new method of producing sesaminol and sesaminol glycosides.
Moreover, various sesaminol glycosides can be manufactured by selecting reaction conditions. In one embodiment of the present invention, selection of reaction conditions such as enzyme concentration can increase the amount of sesaminol and / or sesaminol glucoside produced. In addition, according to an embodiment of the present invention, the amount of SDG (1, 2) produced can be selectively increased.
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。 なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１６年９月２３日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１６−１８６０６６号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. The following embodiment is an example for explaining the present invention, and it is not the meaning which limits the present invention only to this embodiment. The present invention can be practiced in various forms without departing from the scope of the invention. In addition, all the documents referred to in this specification, and the publication gazette, patent gazette, and other patent documents shall be incorporated in the present specification as a reference. In addition, the present specification includes the contents described in the specification and drawings of the Japanese Patent Application (Japanese Patent Application No. 2016-186066) based on the priority claim of the present application filed on September 23, 2016.
なお、以下において基質としてのセサミノール配糖体を「基質セサミノール配糖体」と呼び、生成物としてのセサミノール配糖体を「生成セサミノール配糖体」と呼ぶこともある。また、両者を「セサミノール配糖体」と総称することもある。 In addition, the sesaminol glycoside as a substrate may be called "substrate sesaminol glycoside" below, and the sesaminol glycoside as a product may be called "production sesaminol glycoside." Moreover, both may be generically called "sesaminol glycoside."
「ＡＯＢＧＬ１１ｐ」はグリコシドヒドロラーゼファミリー３（ＧＨ３）のβ-グルコシダーゼであり、そのｃＤＮＡ配列は配列番号１に、アミノ酸配列は配列番号２に、そしてゲノムＤＮＡ配列は配列番号３に示される。 “AOBGL11p” is a β-glucosidase of glycoside hydrolase family 3 (GH3), the cDNA sequence of which is shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence in SEQ ID NO: 2 and the genomic DNA sequence in SEQ ID NO: 3.
１．セサミノールおよび／またセサミノール配糖体の製造方法
本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」という）と、セサミノール配糖体を反応させて、少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含む、セサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の製造方法を提供する。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質1. The present invention relates to a protein selected from the group consisting of the following (a) to (c) (hereinafter referred to as "the protein of the present invention") and a sesaminol composition: The present invention provides a method for producing sesaminol and / or sesaminol glycoside, which comprises the steps of reacting a glycoconjugate and hydrolyzing at least one glucosidic bond.
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 1 to 83 amino acids consist of an amino acid sequence deleted, substituted, inserted and / or added, and at least one glucosidic bond of sesaminol glycoside is hydrolyzed A protein having an activity of degrading;
(C) A protein having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having an activity of hydrolyzing at least one glucosidic bond of sesaminol glycoside
上記（ｂ）または（ｃ）に記載のタンパク質は、代表的には、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体であるが、例えば、“Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol.4,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012”、”Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997”、”Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、”Gene, 34, 315 (1985)”、”Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、”Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。 The protein described in the above (b) or (c) is typically a variant of a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but, for example, “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 4, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012, "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997", "Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), "Gene, 34, 315 (1985)", "Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" , 82, 488 (1985) "and the like, which can be artificially obtained using site-directed mutagenesis.
「配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質」としては、配列番号２のアミノ酸配列において、例えば、１〜８３個、１〜８０個、１〜７５個、１〜７０個、１〜６５個、１〜６０個、１〜５５個、１〜５０個、１〜４９個、１〜４８個、１〜４７個、１〜４６個、１〜４５個、１〜４４個、１〜４３個、１〜４２個、１〜４１個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個（１〜数個）、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。 “In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence has 1 to 83 amino acids deleted, substituted, inserted and / or added, and hydrolyzes at least one glucosidic bond of sesaminol glycoside In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the “protein having activity” is, for example, 1 to 83, 1 to 80, 1 to 75, 1 to 70, 1 to 65, 1 to 60, 1 to 55 pieces, 1 to 50, 1 to 49, 1 to 48, 1 to 47, 1 to 46, 1 to 45, 1 to 44, 1 to 43, 1 to 42, 1 to 41 pieces, 1 to 40, 1 to 39, 1 to 38, 1 to 37, 1 to 36, 1 to 35, 1 to 34, 1 to 33, 1 to 32, 1 to 31 pieces, 1 to 30 pieces, 1 to 29 pieces, 1 to 28 pieces, 1 to 27 pieces, 1 to 26 pieces, 1 to 25 pieces, 1 to Four, 1 to 23, 1 to 22, 1 to 21, 1 to 20, 1 to 19, 1 to 18, 1 to 17, 1 to 16, 1 to 15, 1 to 14, 1 to 13, 1 to 12, 1 to 11, 1 to 10, 1 to 9 (1 to several), 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 A sesaminol glycoside consisting of an amino acid sequence in which 5 to 1, 4 to 3, 1 to 3, 1 to 2 or 1 amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added And proteins having the activity of hydrolyzing at least one glucosidic bond of The number of deletions, substitutions, insertions and / or additions of the above amino acid residues is generally preferably as small as possible.
また、このようなタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。 Moreover, as such a protein, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99. A protein having an amino acid sequence having a sequence identity of 8% or more, or 99.9% or more, and having an activity of hydrolyzing at least one glucosidic bond of a sesaminol glycoside is mentioned. Generally, the larger the value for the sequence identity, the better.
ここで、「セサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合」とは、セサミノールに糖が結合した配糖体であるセサミノール配糖体において、アグリコンであるセサミノールと側鎖との間のグルコシド結合、および側鎖内のグルコシド結合を意味する。また、「少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性」とは、セサミノールに糖が結合した配糖体であるセサミノール配糖体において、アグリコンであるセサミノールと側鎖との間のグルコシド結合、および側鎖内のグルコシド結合のうち少なくとも１つを切断（加水分解）する活性を意味する。側鎖内のグルコシド結合の例としては、セサミノール２´位に結合したゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、セサミノール２´位に結合したソホロースのβ−１，２−グルコシド結合、セサミノール２´位に結合した分岐三糖のβ−１，２−グルコシド結合、および／または、セサミノール２´位に結合した分岐三糖のβ−１，６−グルコシド結合が挙げられる。ある実施形態において、すべてのグルコシド結合が加水分解され、セサミノール配糖体からセサミノールを生じる。別の実施形態では、セサミノール２´位に結合した分岐三糖のβ−１，６−グルコシド結合が優先して加水分解される。このようにして、一部の糖のみ切断された生成セサミノール配糖体又はすべての糖が切断されたセサミノールを生じる。 Here, “at least one glucosidic bond of sesaminol glycoside” means a sesaminol glycoside which is a glycoside obtained by bonding a saccharide to sesaminol, and between the aglycone sesaminol and the side chain. It means glucosidic bond and glucosidic bond in the side chain. In addition, “the activity to hydrolyze the glucosidic bond of the substrate sesaminol glycoside having at least one glucosidic bond” is an aglycone in the sesaminol glycoside which is a glycoside in which a saccharide is bonded to sesaminol. It means the activity of cleaving (hydrolyzing) at least one of the glucosidic bond between sesaminol and the side chain, and the glucosidic bond in the side chain. Examples of the glucosidic bond in the side chain include β-1,6-glucosidic bond of gentiobiose linked to the sesaminol 2 ′ position, β-1,2-glucosidic bond of sophorose linked to the sesaminol 2 ′ position, sesami These include the β-1,2-glucosidic bond of a branched trisaccharide linked to the 2′-position of the phenol and / or the β-1,6-glucosidic bond of a branched trisaccharide linked to the 2′-position of the sesaminol. In certain embodiments, all glucosidic bonds are hydrolyzed to yield sesaminol from a sesaminol glycoside. In another embodiment, the branched trisaccharide [beta] -l, 6-glucosidic bond attached to the sesaminol 2 'position is preferentially hydrolyzed. In this way, some saccharide-only cleaved sesaminol glycosides or all saccharides are cleaved sesaminol.
少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性は、本発明のタンパク質と、たとえばＳＴＧ、ＳＤＧ（１，２）、ＳＤＧ（１，６）、ＳＭＧからなる群より選択される少なくとも１つの基質セサミノール配糖体を反応させて、得られた反応生成物（セサミノールおよび／またはセサミノール配糖体）を精製し、精製したものを液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＬＣ）等の公知の手法により分析することで確認することができる。 The activity to hydrolyze the glucosidic bond of the substrate sesaminol glycoside having at least one glucosidic bond is a group consisting of the protein of the present invention and, for example, STG, SDG (1, 2), SDG (1, 6), SMG The reaction product (sesaminol and / or sesaminol glucoside) obtained by reacting at least one substrate sesaminol glycoside selected from among the above is purified, and the purified product is subjected to liquid chromatography (Liquid Chromatography) It can confirm by analyzing by well-known methods, such as: LC.
一実施形態において、本発明は、セサミノール配糖体のすべてのグルコシド結合を切断する工程を含むセサミノールの製造方法を提供する。別の実施態様では、本発明はセサミノール配糖体の特定の結合、例えば、セサミノール２´位に結合したグルコースとアグリコンとの間のグルコシド結合、セサミノール２´位に結合したゲンチオビオースのβ−１，６−グルコシド結合、セサミノール２´位に結合したソホロースのβ−１，２結合および／または、セサミノールに２´位に結合した分岐三糖のβ−１，６−グルコシド結合またはβ−１，２結合を切断する工程を含む、セサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の製造方法を提供する。なお、本発明において、セサミノール２´位に結合した分岐三糖を加水分解する場合は、β−１，２−結合よりもβ−１，６−結合を優先して加水分解する。 In one embodiment, the present invention provides a method of producing sesaminol comprising the step of cleaving all glucosidic bonds of sesaminol glycosides. In another embodiment, the present invention relates to a specific bond of sesaminol glycosides, such as a glucosidic bond between glucose and aglycone bound at sesaminol 2 'position, beta of gentiobiose bound at sesaminol 2' position. -1,6-glucosidic bond, β-1,2 bond of sophorose linked to sesaminol 2'-position and / or branched trisaccharide β-1,6-glucosidic bond linked to 2'-position to sesaminol or Provided is a method for producing sesaminol and / or sesaminol glycoside, which comprises the step of cleaving a β-1,2 bond. In the present invention, when hydrolyzing the branched trisaccharide bonded to the sesaminol 2'-position, the β-1, 6 bond is hydrolyzed preferentially to the β-1, 2 bond.
「配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加された」とは、同一配列中の任意かつ１〜８３個のアミノ酸配列中の位置において、１〜８３個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。 “In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 1 to 83 amino acid residues have been deleted, substituted, inserted and / or added” means any position in the same sequence and 1 to 83 amino acid sequences. Means that there are deletions, substitutions, insertions and / or additions of 1 to 83 amino acid residues, and two or more deletions, substitutions, insertions and additions may occur simultaneously.
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。 Below, examples of mutually replaceable amino acid residues are shown. Amino acid residues included in the same group can be mutually substituted.
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。Group A: leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
Group B: aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
Group C: asparagine, glutamine;
Group D: lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
Group E: proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline;
Group F: serine, threonine, homoserine;
Group G: phenylalanine, tyrosine.
本発明のタンパク質は、これをコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を適切な宿主細胞内で発現させることなどにより得ることができるが、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、ＡＡＰＰＴｅｃ ＬＬＣ製、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｃ．製、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．製、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。 The protein of the present invention can be obtained by, for example, expressing in a suitable host cell a polynucleotide encoding the same (see "polynucleotide of the present invention" described later), but the Fmoc method (fluorenylmethyl) It can also be produced by a chemical synthesis method such as oxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method) and the like. Also, AAPPTec LLC, Perkin Elmer Inc. , Protein Technologies Inc. Chemical synthesis can also be performed using a peptide synthesizer such as manufactured by PerSeptive Biosystems, manufactured by Applied Biosystems, manufactured by SHIMADZU CORPORATION.
本発明において、「セサミノール配糖体」とは、セサミノールに糖が結合した配糖体である。 In the present invention, “sesaminol glycoside” is a glycoside in which a sugar is bonded to sesaminol.
セサミノールおよびセサミノール配糖体の例は、下記一般式（Ｉ）で示される。なお、セサミノール２´位を式中に示した。本発明において、「分岐三糖」とは、下記一般式（Ｉ）においてＲ１の部分に付加されるもののうち三糖を構成するものをいう。
セサミノール配糖体の例としては、ＳＭＧ、ＳＤＧ（１，２）、ＳＤＧ（１，６）およびＳＴＧ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 Examples of sesaminol glycosides include, but are not limited to, SMG, SDG (1, 2), SDG (1, 6), STG, and the like.
本発明の一実施形態では本発明の酵素は配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質および／またはその変異体からなるタンパク質を用いる。別の実施形態では、基質としてセサミノール配糖体が利用可能である。ここで、セサミノール配糖体の例は前述のとおりである。本発明の一実施形態では、本発明の酵素を用いて、反応に添加する酵素量を調節したり、反応液中に有機溶媒を添加したり、反応温度を調節したりすることで反応条件を調節することにより、ゴマ油搾り粕にもっとも多く含まれるセサミノール配糖体であるＳＴＧを基質として、ＳＤＧ（１，２）やＳＤＧ（１，６）といった希少なセサミノール配糖体を生成することも可能である。 In one embodiment of the present invention, the enzyme of the present invention uses a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and / or a protein consisting of a variant thereof. In another embodiment, sesaminol glycosides are available as substrates. Here, examples of sesaminol glycosides are as described above. In one embodiment of the present invention, the reaction conditions are adjusted by adjusting the amount of enzyme added to the reaction, adding an organic solvent to the reaction solution, and adjusting the reaction temperature using the enzyme of the present invention. Adjusting rare earth sesaminol glycosides such as SDG (1, 2) and SDG (1, 6) using STG, which is the most abundant sesaminol glycoside contained in sesame oil pomace, as a substrate Is also possible.
本発明において、セサミノール配糖体を基質とした反応の酵素量、基質／酵素比、温度、ｐＨ、溶媒の有無、反応時間等は、当業者が適宜調整でき、これらを調整することによりセサミノール配糖体に結合している糖をどこまで切断するか分解度合を制御することが可能である。 In the present invention, the amount of enzyme in the reaction using sesaminol glycoside as a substrate, the substrate / enzyme ratio, temperature, pH, presence or absence of solvent, reaction time, etc. can be appropriately adjusted by those skilled in the art. It is possible to control the degree of degradation as to how far the sugar bound to the nor glycoside is cleaved.
本発明に係るセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の製造方法によって、セサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合が加水分解される。 At least one glucosidic bond of the sesaminol glycoside is hydrolyzed by the method for producing sesaminol and / or the sesaminol glycoside according to the present invention.
本発明の酵素を使用した場合、セサミノール配糖体および／またはセサミノールが生じる。
また、本発明の酵素は、セサミノール配糖体分子中の特定の結合を優先的に切断することが可能であり、これにより例えば、ＳＤＧ（１，２）を得ることができる。本願において、「セサミノール配糖体分子中の特定の結合を優先的に切断する」とは、セサミノール配糖体の特定のグルコシド結合を選択的に好んで加水分解することである。例えば、ＳＴＧを基質とした場合は、ＳＴＧのセサミノール２´位に結合した分岐三糖のβ−１，６結合が優先的に加水分解されたＳＤＧ（１，２）が生成する。「セサミノール配糖体分子中の特定の結合」としてはセサミノール２´位に結合した分岐三糖のβ−１，６結合等が挙げられる。When the enzyme of the present invention is used, sesaminol glycoside and / or sesaminol is produced.
In addition, the enzyme of the present invention can preferentially cleave a specific bond in a sesaminol glycoside molecule, whereby, for example, SDG (1, 2) can be obtained. In the present application, “preferentially cleaves a specific bond in a sesaminol glycoside molecule” is to selectively and preferably hydrolyze a specific glucosidic bond of a sesaminol glycoside. For example, when STG is used as a substrate, SDG (1, 2) in which the β-1, 6 bond of the branched trisaccharide bonded to the sesaminol 2 ′ position of STG is preferentially hydrolyzed is generated. Examples of “specific bond in sesaminol glycoside molecule” include β-1, 6 bond of branched trisaccharide bonded to sesaminol 2 ′ position.
本発明のセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の製造方法において、出発物質となるセサミノール配糖体は、ゴマ種子あるいはゴマ油搾り粕から適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルやその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、超高性能液体クロマトグラフィー （Ｕｌｔｒａ （Ｈｉｇｈ） Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＰＬＣ） 等の公知の方法によって抽出し、精製することによって入手することができる。あるいは、出発物質となるセサミノール配糖体は、市販のものでもよい。本発明の出発物質となるセサミノール配糖体としては、ＳＴＧ、ＳＤＧ（１，２）、ＳＤＧ（１，６）、ＳＭＧ等があげられ、β−１，２−グルコシド結合またはβ−１，６グルコシド結合、および／またはアグリコンであるセサミノールとの間のグルコシド結合の切断により、ＳＤＧ（１，２）、ＳＤＧ（１，６）、ＳＭＧ、セサミノールなどが生じる。 In the method for producing sesaminol and / or sesaminol glycosides according to the present invention, sesaminol glycosides as a starting material are sesame seed or sesame oil squeezed from a suitable solvent (aqueous solvent such as water or alcohol, ether, and Extraction with organic solvents such as acetone), ethyl acetate and other organic solvents: water gradient, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), Ultra (High) Performance Liquid chromatography: UPLC Etc.) and can be obtained by purification and purification. Alternatively, the starting sesaminol glycoside may be commercially available. Examples of sesaminol glycosides which become the starting material of the present invention include STG, SDG (1, 2), SDG (1, 6), SMG and the like, and β-1,2-glucosidic bond or β-1, Cleavage of the glucosidic bond between 6 glucosidic bond and / or sesaminol which is an aglycone results in SDG (1, 2), SDG (1, 6), SMG, sesaminol and the like.
本発明に係るセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の製造方法は、本発明のタンパク質と、セサミノール配糖体を反応させて、セサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含む。本発明の方法は、さらに、前記工程で生成した本発明のセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体を精製する工程を含んでいてもよい。 本発明のセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体は、適切な溶媒（水等の水性溶媒、またはアルコール、エーテル、アセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルやその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ （Ｈｉｇｈ） Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＰＬＣ）等の公知の方法によって精製することができる。 In the method for producing sesaminol and / or sesaminol glycoside according to the present invention, the protein of the present invention is reacted with sesaminol glycoside to hydrolyze at least one glucosidic bond of the sesaminol glycoside Including the steps. The method of the present invention may further include the step of purifying the present sesaminol and / or the sesaminol glycoside produced in the above step. The sesaminol and / or sesaminol glycosides of the present invention may be extracted with an appropriate solvent (aqueous solvent such as water or organic solvent such as alcohol, ether, acetone etc.), ethyl acetate and other organic solvents: gradient of water It can be purified by known methods such as high performance liquid chromatography (HPLC) and ultra high performance liquid chromatography (UPLC).
本発明に係るセサミノール配糖体および／またはセサミノールの製造方法は、基質を含む反応液に有機溶媒を添加した条件下で行うことができる。有機溶媒は、反応液全量に対し１％〜２０％の範囲とすることができ、好ましくは５％〜１５％、６〜１２％、より好ましくは８％である。有機溶媒は、一般的に入手可能なものでよく、好ましくは水と任意の割合で混合するものがよく、アセトニトリル等を用いることができる。有機溶媒は、反応液に予め添加してもよく、また反応の途中段階で添加してもよい。 The method for producing sesaminol glycoside and / or sesaminol according to the present invention can be carried out under the conditions in which an organic solvent is added to the reaction solution containing a substrate. The organic solvent can be in the range of 1% to 20%, preferably 5% to 15%, 6 to 12%, more preferably 8%, based on the total amount of the reaction solution. The organic solvent may be a generally available one, preferably mixed with water in an arbitrary ratio, and acetonitrile or the like can be used. The organic solvent may be added to the reaction solution in advance or may be added in the middle of the reaction.
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。 As used herein, "polynucleotide" means DNA or RNA.
配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。 Examples of a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 include, for example, a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1.
「配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質」としては、前述のものが挙げられる。 “In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence has 1 to 83 amino acids deleted, substituted, inserted and / or added, and hydrolyzes at least one glucosidic bond of sesaminol glycoside Examples of the "protein having activity" include those described above.
「配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質」としては、前述のものが挙げられる。 “A protein having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having an activity of hydrolyzing at least one glucosidic bond of a sesaminol glycoside”, Those mentioned above are mentioned.
本明細書中、「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、”Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 4, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2012”、”Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997”などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書中、「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６２℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。In the present specification, “a polynucleotide that hybridizes under high stringency conditions” refers to, for example, a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 A polynucleotide obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern hybridization method or the like, using as a probe all or part of a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the As a method of hybridization, for example, “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 4, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2012”, “Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997”. It is possible to use the method described in
In the present specification, “highly stringent conditions” means, for example, 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C., or 0.2 × SSC, 0.1% SDS, The conditions are 60 ° C., or 0.2 × SSC, 0.1% SDS, 62 ° C., or 0.2 × SSC, 0.1% SDS, 65 ° C., but not limited thereto. Under these conditions, it can be expected that DNA having higher sequence identity can be efficiently obtained as the temperature is raised. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can appropriately select these factors. It is possible to achieve similar stringency by doing this.
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５〜６０℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。あるいは、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列、または配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列の全部または一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。 In addition, when using a commercially available kit for hybridization, for example, Alkphos Direct Labeling and Detection System (GE Healthcare) can be used. In this case, according to the protocol attached to the kit, incubation with the labeled probe is performed overnight, and then the membrane is subjected to primary washing containing 0.1% (w / v) SDS at 55-60 ° C. After washing with buffer, hybridized DNA can be detected. Alternatively, a commercially available probe can be prepared based on all or part of the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 When the probe is labeled with digoxigenin (DIG) using a reagent (for example, PCR labeling mix (Roche Diagnostics), etc.), hybridization is performed using a DIG nucleic acid detection kit (Roche Diagnostics) Can be detected.
上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＢＬＡＳＴの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１の塩基配列のＤＮＡ、または配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと６０％以上、６１％以上、６２％以上、６３％以上、６４％以上、６５％以上、６６％以上、６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するＤＮＡをあげることができる。 As the hybridizable polynucleotide other than the above, the DNA of the base sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as calculated by homology search software of BLAST using default parameters DNA and 60% or more, 61% or more, 62% or more, 63% or more, 64% or more, 65% or more, 66% or more, 67% or more, 68% or more, 69% or more, 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more , 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99 There may be mentioned DNAs having a sequence identity of 7% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more.
なお、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90:5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。 In addition, the sequence identity of the amino acid sequence and the base sequence can be determined by the algorithm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90) by Karlin and Artur. 5873, 1993). When using BLAST, use the default parameters of each program.
上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法または公知の合成手法によって取得することが可能である。 The polynucleotide of the present invention described above can be obtained by known genetic engineering techniques or known synthetic techniques.
本発明のポリヌクレオチドは、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの５’末端に含まれる。分泌シグナルペプチドおよびそれをコードする塩基配列からポリヌクレオチドは、前記と同様である。 The polynucleotide of the present invention may further include a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence encoding a secretory signal peptide. Preferably, a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence encoding a secretion signal peptide is included at the 5 'end of the polynucleotide of the present invention. The secretion signal peptide and the nucleotide sequence encoding it are the same as described above.
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。 The polynucleotide of the present invention is preferably introduced into a host in a state of being inserted into an appropriate expression vector.
適切な発現ベクターは、通常、
（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。Suitable expression vectors are usually
(I) a promoter capable of transcription in a host cell;
(Ii) a polynucleotide of the present invention linked to the promoter; and (iii) the transcription termination and polyadenylation of an RNA molecule, comprising an expression cassette comprising a signal functioning in a host cell as a component .
発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージまたはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。 Examples of methods for producing expression vectors include, but are not limited to, methods using plasmids, phages, cosmids and the like.
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。 The specific type of vector is not particularly limited, and vectors that can be expressed in host cells can be appropriately selected. That is, according to the type of host cell, a promoter sequence is appropriately selected to ensure expression of the polynucleotide of the present invention, and a vector in which this and the polynucleotide of the present invention are incorporated into various plasmids is used as an expression vector. Good.
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーターおよび／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ ＲＮＡプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターの例としては、ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ（ＭＭＴＶ）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネインプロモーター及びヒートショックプロテインプロモーター等が挙げられる。 The expression vector of the present invention contains an expression control region (eg, a promoter, a terminator and / or an origin of replication, etc.) depending on the type of host to be introduced. Conventional promoters (for example, trc promoter, tac promoter, lac promoter etc.) are used as promoters for bacterial expression vectors, and examples of yeast promoters include glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter, PH05 promoter etc. Examples of such a promoter for filamentous fungi include amylase and trpC. Moreover, as an example of a promoter for expressing a target gene in plant cells, 35S RNA promoter of cauliflower mosaic virus, rd29A gene promoter, rbcS promoter, enhancer sequence of 35S RNA promoter of cauliflower mosaic virus is derived from Agrobacterium The mac-1 promoter etc. which were added to 5 'side of the mannopine synthetase promoter sequence of Examples of animal cell host promoters include viral promoters (eg, SV40 early promoter, SV40 late promoter, etc.). Examples of promoters that are inducibly activated by external stimuli include mouse mammalian tumor virus (MMTV) promoter, tetracycline responsive promoter, metallothionein promoter and heat shock protein promoter.
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ｕｒａ５、ｎｉａＤ）、薬剤耐性マーカー（ハイグロマイシン、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 337, 1984）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ， ＰＤＲ４）（それぞれ、猪腰淳嗣ら，生化学，vol. 64, p. 660, 1992; Hussain et al., Gene, vol. 101, p. 149, 1991）などが利用可能である。 Preferably, the expression vector comprises at least one selectable marker. Such markers include auxotrophic markers (ura5, niaD), drug resistance markers (hygromycin, zeocin), geneticin resistance gene (G418r), copper resistance gene (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 337, 1984, and cerulenin resistance genes (fas 2 m, PDR 4) (Fu. K. et al., Biochemistry, vol. 64, p. 660, 1992; Hussain et al., Respectively. , Gene, vol. 101, p. 149, 1991) and the like can be used.
本発明の形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。形質転換の対象となる細胞または生物としては、従来公知の各種細胞または生物を好適に用いることができる。形質転換の対象となる細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、糸状菌（麹菌Aspergillus oryzae、Aspergillus sojae）、植物細胞、ヒトを除く動物細胞等が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も、特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物または植物またはヒトを除く動物が挙げられる。形質転換体は、好ましくは、糸状菌、酵母または植物である。形質転換で用いられる宿主として、セサミノール配糖体のいずれかを生成するものを用いることもできる。ゴマのように、元来少なくとも１つのセサミノール配糖体を生成する植物だけではなく、本来セサミノール配糖体を生成しない細胞または生物に少なくとも１つのセサミノール配糖体の生成に必要な遺伝子を導入したものを宿主として用いることができる。「セサミノール配糖体の生成に必要な遺伝子」は、例えば、特開２００６−１２９７２８などに記載のセサミノール配糖体合成活性を有する遺伝子が挙げられる。 The method for producing the transformant of the present invention (production method) is not particularly limited, and examples thereof include a method in which an expression vector containing the polynucleotide of the present invention is introduced into a host for transformation. As cells or organisms to be transformed, various cells or organisms conventionally known can be suitably used. Examples of cells to be transformed include bacteria such as Escherichia coli, yeast (Saccharomyces cerevisiae, fission yeast Schizosaccharomyces pombe), filamentous fungi (Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae), plant cells, human Excluding animal cells and the like. Appropriate culture media and conditions for the above-described host cells are well known in the art. In addition, organisms to be transformed are not particularly limited, and examples thereof include various microorganisms or plants exemplified in the above-mentioned host cells, or animals other than humans. The transformant is preferably a filamentous fungus, yeast or plant. As a host used for transformation, one that produces any of sesaminol glycosides can also be used. Like sesame, a gene that is necessary not only for plants that originally produce at least one sesaminol glycoside, but also for cells or organisms that do not naturally produce sesaminol glycoside, for production of at least one sesaminol glycoside The one introduced can be used as a host. Examples of the “gene necessary for the production of sesaminol glycoside” include a gene having sesaminol glycoside synthesis activity described in JP-A-2006-129728 and the like.
宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, p. 4655-4661, 2000）、パーティクルデリバリー法（特開2005-287403「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.75, p. 1929, 1978）、酢酸リチウム法（J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983）、Methods in yeast genetics,2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。また、植物、もしくは植物に由来する組織や細胞への遺伝子導入の際には、例えばアグロバクテリウム法（Plant Molecular Biology Mannual, Gelvin, S.B.et al., Academic Press Publishers）、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポーレーション法などを適宜選択して用いることができる。 As a method for transforming host cells, commonly known methods can be used. For example, electroporation (Mackenxie, DA et al., Appl. Environ. Microbiol., Vol. 66, p. 4655-4661, 2000), particle delivery method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-287403 "breeding method of lipid producing bacteria" "The method described in", the spheroplast method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 75, p. 1929, 1978), the lithium acetate method (J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983). , Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A. Methods described in, for example, the Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual), but not limited thereto. In addition, when a gene is introduced into a plant or a tissue or cell derived from a plant, for example, the Agrobacterium method (Plant Molecular Biology Manual, Gelvin, SB et al., Academic Press Publishers), particle gun method, PEG method And the electroporation method can be appropriately selected and used.
非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を用いた本発明のセサミノール配糖体および／またはセサミノールの製造方法
本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させ、細胞を破砕することにより本発明のタンパク質を得ることができる。本発明のタンパク質を基質セサミノール配糖体と作用させることで、本発明のセサミノール配糖体および／またはセサミノールを生成することもできる。
具体的には、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤を、グルコシド結合を少なくとも１つを有するセサミノール配糖体と接触させることによりセサミノールを生成することができる。本発明のタンパク質は、酵母で発現させた場合にも麹菌で発現させた場合と同等の活性を示すことが実施例において確認されている。
「形質転換細胞に由来する酵素剤」は、形質転換細胞を用いて調製され、本発明のタンパク質を含むものであれば限定されないが、例えば、形質転換細胞自体、形質転換細胞の粉砕物自体、形質転換細胞の培養上清自体、およびこれらの精製物である。そこで、本発明は、宿主細胞に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、グルコシド結合を少なくとも１つを有するセサミノール配糖体と接触させて、少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する工程を含むセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の製造方法を提供する。（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつセサミノール配糖体の少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドMethod for Producing Sesaminol Glycoside and / or Sesaminol of the Present Invention Using Enzyme Agent Derived from Non-Human Transformed Cells The protein of the present invention is expressed in a host cell, and the cells are disrupted to disrupt the cell. Protein can be obtained. By reacting the protein of the present invention with a substrate sesaminol glycoside, the sesaminol glycoside of the present invention and / or sesaminol can also be produced.
Specifically, sesaminol can be produced by contacting an enzyme agent derived from the transformed cell of the present invention with a sesaminol glycoside having at least one glucosidic bond. It has been confirmed in the Examples that the protein of the present invention exhibits the same activity when expressed in yeast as it does in gonococci.
The “enzyme agent derived from transformed cells” is prepared using transformed cells and is not limited as long as it contains the protein of the present invention, for example, transformed cells themselves, disrupted transformed cells themselves, Culture supernatants of transformed cells are themselves and their purified products. Therefore, the present invention provides an enzyme agent derived from a non-human transformed cell into which a polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (e) has been introduced into a host cell, at least one glucoside bond: There is provided a process for producing sesaminol and / or sesaminol glycosides comprising the step of hydrolyzing at least one glucosidic bond by contacting with a sesaminol glycoside having (A) a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(C) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 1 to 83 amino acids consist of an amino acid sequence with deletion, substitution, insertion and / or addition, and at least one glucosidic bond of sesaminol glycoside is hydrolyzed A polynucleotide encoding a protein having an activity of degrading
(D) A protein protein having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having an activity of hydrolyzing at least one glucosidic bond of sesaminol glycosides Encoding polynucleotide;
(E) A polynucleotide which hybridizes with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under high stringency conditions, and at least one of the sesaminol glycosides Polynucleotide encoding a protein having an activity of hydrolyzing glucosidic bond
上記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドであり、前記と同様である。 The polynucleotide selected from the group consisting of the above (a) to (e) is a polynucleotide of the present invention, and is the same as the above.
「接触」とは、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤とグルコシド結合を少なくとも１つを有するセサミノール配糖体とを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤を含む容器に少なくとも１つのグルコシド結合を有するセサミノール配糖体を添加すること、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤と少なくとも１つのグルコシド結合を有するセサミノール配糖体とを混合すること、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤を少なくとも１つのグルコシド結合を有するセサミノール配糖体を含む容器に添加することが含まれる。 The term "contact" means that an enzyme agent derived from the transformed cell of the present invention and a sesaminol glycoside having at least one glucosidic bond are present in the same reaction system or culture system, for example, Adding a sesaminol glycoside having at least one glucosidic bond to a container containing an enzyme agent derived from the transformed cell of the present invention, an enzyme agent derived from the transformed cell of the present invention and at least one glucosidic bond And mixing the sesaminol glucoside with a sesaminol glycoside, and adding the enzyme agent derived from the transformed cell of the present invention to a container containing a sesaminol glycoside having at least one glucosidic bond.
形質転換体が、酵母または麹菌である場合、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された酵母または麹菌は、野生型と比べて本発明のタンパク質を多く発現する。このため、発現した本発明のタンパク質が、酵母または麹菌で生成されたセサミノール配糖体と反応し、セサミノールおよび／またはセサミノール配糖体が酵母または麹菌の細胞内または培養液中、好ましくは、培養液中に生成される。 When the transformant is yeast or bacillus, the yeast or bacillus transformed with the polynucleotide of the present invention expresses more of the protein of the present invention than the wild type. For this reason, the expressed protein of the present invention is reacted with a sesaminol glucoside produced by yeast or Bacillus, and sesaminol and / or sesaminol glycosides are preferably in the cells or culture solution of yeast or Bacillus. Is produced in the culture broth.
形質転換体が、植物である場合、本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。本発明のポリヌクレオチドが植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物（以下、「本発明の植物」）は、その野生型と比べて本発明のタンパク質を多く含む。このため、本発明のタンパク質が、本発明の植物で生成されたセサミノール配糖体と反応し、セサミノールが植物中に生成する。また、植物体のなかの環境が加水分解反応に最適でない場合は、セサミノール配糖体のグルコシド結合の加水分解反応は抑制され、グルコシド結合が切断されずに維持されたセサミノール配糖体やグルコシド結合の一部のみが切断されたセサミノール配糖体が生成する。 When the transformant is a plant, the plant to be transformed in the present invention is a whole plant body, plant organs (eg leaves, petals, stems, roots, seeds etc.), plant tissues (eg epidermis, phloem) Parenchyma, xylem, vascular bundles, palisade tissue, cancellous tissue etc.) or plant cultured cells, or plant cells of various forms (eg, suspension cultured cells), protoplasts, leaf sections, callus, etc. Also mean. The plant used for transformation may be any of a monocotyledonous plant or a plant belonging to a dicotyledonous plant class. Whether or not the polynucleotide of the present invention has been introduced into plants can be confirmed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization and the like. Once a transformed plant in which the polynucleotide of the present invention has been integrated into the genome is obtained, offspring can be obtained by sexual or asexual reproduction of the plant. In addition, for example, seeds, fruits, chopped ears, tubers, tubers, tubers, strains, calli, protoplasts and the like may be obtained from the plant body or its progeny or clones thereof, and the plant body may be mass-produced based on them. it can. A plant transformed with the polynucleotide of the present invention (hereinafter, "the plant of the present invention") contains more of the protein of the present invention than its wild type. Thus, the protein of the present invention reacts with the sesaminol glycoside produced by the plant of the present invention to produce sesaminol in the plant. In addition, when the environment in the plant is not optimal for the hydrolysis reaction, the hydrolysis reaction of the glucosidic bond of the sesaminol glucoside is suppressed, and the sesaminol glucoside or glucosidic bond which is maintained without being cleaved is A sesaminol glycoside in which only part of the glucosidic bond is cleaved is produced.
本発明のいくつかの態様の形質転換体またはその培養液は、その野生型と比べて本発明のセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の含有量が高く、その抽出物または培養液には、本発明のセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体が高濃度で含まれる。本発明の形質転換体の抽出物は、形質転換体をガラスビーズ、ホモジェナイザーまたはソニケーター等を用いて破砕し、当該破砕物を遠心処理し、その上清を回収することにより、得ることができる。本発明のセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により形質転換体と培養上清とを分離することにより、本発明のセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体を含む培養上清を得ることができる。 The transformant according to some embodiments of the present invention or the culture solution thereof has a higher content of sesaminol and / or sesaminol glycosides of the present invention compared to its wild type, and the extract or culture solution thereof Sesaminol and / or sesaminol glycosides of the invention are included in high concentrations. The extract of the transformant of the present invention can be obtained by disrupting the transformant using glass beads, a homogenizer, a sonicator or the like, centrifuging the disrupted material, and recovering the supernatant thereof. it can. When sesaminol and / or sesaminol glycosides of the present invention are accumulated in the culture solution, after completion of the culture, transformants and culture supernatant may be obtained by a conventional method (eg, centrifugation, filtration, etc.) Can be obtained to obtain a culture supernatant containing the sesaminol and / or the sesaminol glycoside of the present invention.
このようにして得られた抽出液もしくは培養上清は、さらに精製工程に供してもよい。本発明のセサミノールおよび／またはセサミノール配糖体の精製は、通常の分離および精製方法に従って行うことができる。具体的な方法は、前記と同様である。 The extract or culture supernatant thus obtained may be further subjected to a purification step. Purification of the sesaminol and / or sesaminol glycosides of the present invention can be carried out according to conventional separation and purification methods. The specific method is the same as described above.
「セサミノール配糖体」、「少なくとも１つのグルコシド結合を有するセサミノール配糖体」、及び「少なくとも１つのグルコシド結合を加水分解する活性」は、前記と同様である。 “Sesaminol glycoside”, “sesaminol glycoside having at least one glucosidic bond”, and “activity to hydrolyze at least one glucosidic bond” are the same as described above.
その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、”Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol.4, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012”、”Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY）”等を参照することができる。 For other general molecular biology methods, see “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 4, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012”, “Methods in Yeast Genetics, Laboratory manual (Cold Spring Harbor See, eg, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
このようにして得られた本発明のセサミノールおよび/またはセサミノール配糖体は、常法に従って、例えば、食品、甘味料、香料、医薬品、工業原料（化粧料、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。 The sesaminol and / or sesaminol glucosides of the present invention thus obtained can be used, for example, according to a conventional method to produce, for example, foods, sweeteners, flavors, medicines, industrial raw materials (cosmetics, raw materials such as soaps) It can be used for applications such as
食品の例としては、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、老人用食品等が挙げられる。本明細書中、食品は、固体、流動体、および液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称である。 Examples of food include specified health food, nutritive function food, functional indication food, nutritional supplement, health food, functional food, infant food, elderly food and the like. As used herein, food is a generic term for solids, fluids, and liquids, and mixtures thereof, which can be consumed.
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。 In addition, all the documents referred to in this specification, and the publication gazette, patent gazette, and other patent documents shall be incorporated in the present specification as a reference.
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be more specifically described using examples, but the scope of the present invention is not limited by these examples.
[実施例１]
麹菌のβ‐グルコシダーゼ遺伝子の探索
麹菌ゲノムデータ（PRJNA28175）より、β−グルコシダーゼホモログを探索し、菌体内β‐グルコシダーゼのホモログであるAO090701000244（ＣＤＳ配列：配列番号１、推定アミノ酸配列：配列番号２、ＯＲＦ配列：配列番号３、ゲノムＤＮＡ配列：配列番号４）を見出した。これをＡＯＢＧＬ１１としてクローン化することにした。ＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列を図１に示す。Example 1
Search for β-glucosidase gene of Neisseria gonorrhoeae Search β-glucosidase homologs from Neisseria gonorrhoeae genome data (PRJNA 28175) and find the homolog of intracellular β-glucosidase AO090701000244 (CDS sequence: SEQ ID NO: 1, deduced amino acid sequence: SEQ ID NO: 2, ORF sequence: SEQ ID NO: 3, genomic DNA sequence: SEQ ID NO: 4) was found. It was decided to clone this as AOBGL11. The cDNA and amino acid sequences of AOBGL11 are shown in FIG.
ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡのクローニング
ＡＯＢＧＬ１１をクローニングするために、以下のプライマーを設計した。
ＡＯＢＧＬ１１−Ｆ：
5´‐ATGCCTCGTCTAGACGTCGAGAA‐3´（配列番号４）
ＡＯＢＧＬ１１−Ｒ：
5´‐TCACAGACCCAACCAGTAGCGA‐3´（配列番号５）
麹菌 Aspergillus oryzae var.Brunneus（ＩＦＯ３０１０２）の分生子を液体培地（１Ｌあたり、グルコース ２０ｇ、バクトトリプトン １ｇ、酵母エキス ５ｇ、ＮａＮＯ３ １ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ）１０ｍｌに植菌し、３０℃で１日間培養した。ろ過により菌体を集め、液体窒素中ですりつぶしたあと、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ゲノムＤＮＡを調製した。
ゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＡＯＢＧＬ１１−ＦとＡＯＢＧＬ１１−Ｒを用いて、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡）でＰＣＲを行った。得られた約２．５７ｋｂｐのＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン）を使ってクローン化し、プラスミドｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ１１ｇを得た。Cloning of AOBGL11 Genomic DNA In order to clone AOBGL11, the following primers were designed.
AOBGL11-F:
5'-ATGCCTCGTCTAGACGTCGAGAA-3 '(SEQ ID NO: 4)
AOBGL11-R:
5'-TCACAGACCCAACCAGTAG CGA-3 '(SEQ ID NO: 5)
Conidia of Aspergillus oryzae var. Brunneus (IFO 30102) liquid medium (per liter L: glucose 20 g, bacto tryptone 1 g, yeast extract 5 g, NaNO 3 1 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 · 7 H 2 O 0 The cells were inoculated in 10 ml of .5 g, 0.01 g of FeSO 4 · 7 H 2 O and cultured at 30 ° C. for 1 day. Bacterial cells were collected by filtration, ground in liquid nitrogen, and genomic DNA was prepared using DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN).
PCR was performed with KOD-plus (Toyobo) using genomic DNA as a template and primers AOBGL11-F and AOBGL11-R. The obtained about 2.57 kbp DNA fragment was cloned using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen) to obtain plasmid pCR-AOBGL11 g.
[実施例２]
麹菌によるＡＯＢＧＬ１１ｐの生産
麹菌発現用ベクターの構築
麹菌用ベクターｐＵＮＡ（酒類総合研究所）を制限酵素ＳｍａＩで消化して得られたＤＮＡ断片と、プラスミドｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ１１ｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し末端をＢｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）によって平滑化して得られた約２．５７ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＵＮＡ−ＡＯＢＧＬ１１ｇを得た。Example 2
Production of AOBGL11p by Bacillus subtilis Construction of a vector for expression of Bacillus subtilis A DNA fragment obtained by digesting the vector pUNA for Bacillus subtilis with the restriction enzyme SmaI and the plasmid pCR-AOBGL11g are digested with the restriction enzyme EcoRI and blunted at the end The approximately 2.57 kbp DNA fragment obtained by blunting with Kit (Takara Bio) was ligated to obtain plasmid pUNA-AOBGL11 g.
麹菌の形質転換
麹菌の形質転換は以下のとおり実施した。
宿主として、Aspergillus oryzae niaD300株（酒類総合研究所）を使用した。宿主株をＰＤＡプレートに植菌し、３０℃でおよそ１週間培養した。分生子懸濁液を得るために、０．１％ ｔｗｅｅｎ８０， ０．８％ ＮａＣｌを加え、分生子を懸濁した。ミラクロスでろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、０．１％ ｔｗｅｅｎ８０， ０．８％ ＮａＣｌで洗浄し、滅菌水に懸濁した・BR>B 分生子をＣＤプレート（１Ｌあたり、ＮａＮＯ３ ６ｇ、ＫＣｌ ０．５２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １．５２ｇ、グルコース １０ｇ、１Ｍ ＭｇＳＯ４ ２ｍｌ、Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１Ｌあたり、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ８．８ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．４ｇ、ＮａＢ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ ０．０５ｇ ） １ｍｌ、アガー ２０ｇ（ｐＨ６．５））に塗布し、パーティクルデリバリー法により、ＤＮＡの導入を行った。ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（バイオラッド）を使って、パーティクル：タングステンＭ−１０、ラプチャーディスク：１１００ｐｓｉ、距離：３ｃｍとした。形質転換株として、ＣＤプレートで生育するものを選抜した。プラスミドｐＵＮＡ−ＡＯＢＧＬ１１ｇにより形質転換して得られた形質転換株をＢＧＬ１１−１株、コントロールベクターｐＵＮＡにより形質転換して得られた形質転換株をＣ−１株とした。Transformation of Neisseria gonorrhoeae Transformation of Neisseria gonorrhoeae was performed as follows.
As a host, Aspergillus oryzae niaD300 strain (a liquor research institute) was used. The host strain was inoculated on a PDA plate and cultured at 30 ° C. for approximately one week. In order to obtain a conidia suspension, 0.1% tween 80, 0.8% NaCl was added to suspend the conidia. After filtration through Miracloth, conidia are recovered by centrifugation, washed with 0.1% tween 80, 0.8% NaCl, and suspended in sterile water. NaNO 3 6g, KCl 0.52g, KH 2 PO 4 1.52g, glucose 10g, 1M MgSO 4 2ml, Trace element solution ( per 1L, FeSO 4 · 7H 2 O 1g, ZnSO 4 · 7H 2 O 8.8g, CuSO 4 · 5H 2 O 0.4g, NaB 4 O 7 · 10H 2 O 0.1g, the (NH 4) 6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O 0.05g) 1ml, agar 20 g (pH 6.5)) It applied and introduced DNA by the particle delivery method. PDS-1000 / He (Bio-Rad) was used to make particles: tungsten M-10, rupture disk: 1100 psi, distance: 3 cm. Those grown on CD plates were selected as transformants. The transformant obtained by transforming with plasmid pUNA-AOBGL11g was transformed with strain BGL11-1 and the control strain obtained with control vector pUNA as strain C-1.
麹菌によるＡＯＢＧＬ１１ｐの発現
ＢＧＬ１１−１株またはＣ−１株をＣＤプレートに植菌し、３０℃で７日間培養し、分生子を形成させた。分生子懸濁液を得るために、０．１％ ｔｗｅｅｎ８０， ０．８％ ＮａＣｌを加え、分生子を懸濁した。ミラクロス（登録商標）でろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、０．１％ ｔｗｅｅｎ８０， ０．８％ ＮａＣｌで洗浄し、滅菌水に懸濁し、分生子懸濁液としたこの分生子懸濁液を酵素生産用液体培地（１Ｌあたり、マルトース １００ｇ、バクトトリプトン １ｇ、酵母エキス ５ｇ、ＮａＮＯ３ １ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ） に植菌し、３０℃で２日間振とう培養を行った。ミラクロス（登録商標）によりろ過して菌体を集めた。得られた湿菌体のうち約０．４ｇを液体窒素で凍結し、乳鉢ですりつぶした。すりつぶした菌体を５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、よく混合した後、遠心分離した。得られた上清を、アミコン（登録商標）ウルトラ−１５ ５０ｋ（メルク）で、限外ろ過により濃縮し、０．１％ ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０（バッファーＡ）で置換することにより、約１ｍｌの粗酵素液を得た。Expression of AOBGL11p by Aspergillus oryzae BGL11-1 strain or C-1 strain was inoculated on a CD plate and cultured at 30 ° C. for 7 days to form conidia. In order to obtain a conidia suspension, 0.1% tween 80, 0.8% NaCl was added to suspend the conidia. After filtration through Miracloth (registered trademark), conidia are recovered by centrifugation, washed with 0.1% tween 80, 0.8% NaCl, suspended in sterile water, and used as a conidia suspension. Suspension liquid for liquid medium for enzyme production (per liter of maltose 100 g, Bacto tryptone 1 g, yeast extract 5 g, NaNO 3 1 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 · 7 H 2 O 0.5 g, FeSO 4 Inoculate 7H 2 O 0.01 g) and shake culture at 30 ° C. for 2 days. The cells were collected by filtration through Miracross (registered trademark). About 0.4 g of the obtained wet cells was frozen with liquid nitrogen and then crushed with a mortar. The ground cells were suspended in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), mixed well, and centrifuged. The resulting supernatant is concentrated by ultrafiltration with Amicon (R) Ultra-15 50k (Merck) and replaced with 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.0 (Buffer A) containing 0.1% CHAPS. Thus, about 1 ml of crude enzyme solution was obtained.
タンパク質濃度の測定
粗酵素液のタンパク質濃度は、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（５倍濃縮）（ナカライテスク）を用いて定量した。その結果、ＢＧＬ１１−１粗酵素液 ６．４６ｍｇ／ｍｌ、Ｃ−１粗酵素液４ｍｇ／ｍｌであった。Measurement of Protein Concentration The protein concentration of the crude enzyme solution was quantified using a protein assay CBB solution (5-fold concentration) (Nacalai Tesque). As a result, it was 6.46 mg / ml of BGL11-1 crude enzyme solution and 4 mg / ml of C-1 crude enzyme solution.
[実施例３]
ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ分解活性
ｐＮＰ−β−Ｇｌｃの分解活性を検討した。粗酵素液１０μＬ、０．２Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）５０μＬ、２０ｍＭ ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ水溶液 ５０μＬ、水を加えてトータル２００μＬとし、３７℃で反応させた。なお、ＢＧＬ１１−１粗酵素液は活性が高かったため、粗酵素液を０．１％ ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）バッファーで１００倍に希釈したものを用いた。ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ が加水分解して遊離したｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）に基づく１分間あたりの４０５ｎｍの吸光度変化（Δ４０５）は、ＢＧＬ１１−１粗酵素液で０．２４４、Ｃ−１粗酵素液で０．０００であった。以上のことからも、ＡＯＢＧＬ１１ｐがβ−グルコシダーゼ活性を担っていることが示唆された。[Example 3]
pNP-β-Glc degradation activity The degradation activity of pNP-β-Glc was examined. 10 μL of crude enzyme solution, 50 μL of 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 7.0), 50 μL of 20 mM pNP-β-Glc aqueous solution, and water were added to make a total of 200 μL, and the reaction was performed at 37 ° C. Since the BGL11-1 crude enzyme solution had high activity, the crude enzyme solution was diluted 100 times with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) buffer containing 0.1% CHAPS and used. The absorbance change at 405 nm (Δ 405) per minute based on p-nitrophenol (pNP) released by hydrolysis of pNP-β-Glc was 0.244 in the BGL11-1 crude enzyme solution, C-1 crude enzyme It was 0.000 in the solution. From the above, it is also suggested that AOBGL11p is responsible for the β-glucosidase activity.
ｐＮＰ−β−Ｇｌｃを基質として、ＡＯＢＧＬ１１ｐの至適温度、至適ｐＨおよび熱安
定性、ｐＨ安定性を調べた（図２（図２Ａ−図２Ｄ））。なお、ＢＧＬ１１−１粗酵素液はバッファーＡで５０００倍希釈したもの（タンパク質濃度 １．３μｇ／ｍｌ）を使用した。The optimum temperature, optimum pH, thermal stability, and pH stability of AOBGL11p were examined using pNP-β-Glc as a substrate (FIG. 2 (FIG. 2A-FIG. 2D)). In addition, the BGL11-1 crude enzyme solution used what was diluted 5000 times with buffer A (protein concentration 1.3 microgram / ml).
至適温度：反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ） ２０μｌ、０．２Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５） １００μｌ、２０ｍＭ ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ、水を加えてトータル４００μｌとし、反応開始から１５分、３０分、４５分に１００μｌをサンプリングして１００μｌ ０．２Ｍ 炭酸ナトリウム溶液と混合してから、４０５ｎｍの吸光度を測定し、Δ４０５を求めた。Δ４０５が最大となった４５℃を１として、各温度で反応させたときのΔ４０５の比率を図２Ａに示した。これにより、４５−５０℃が反応至適温度であることが分かった。 Optimal temperature: Add 20 μl of crude enzyme solution (1.3 μg / ml), 100 μl of 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.5), 20 mM pNP-β-Glc, and water to make the reaction volume 400 μl in total. 100 μl was sampled at 15 minutes, 30 minutes and 45 minutes from the start and mixed with 100 μl 0.2 M sodium carbonate solution, and then the absorbance at 405 nm was measured to determine Δ405. Assuming that 45 ° C. at which Δ405 is maximum is 1, the ratio of Δ405 when the reaction is performed at each temperature is shown in FIG. 2A. From this, it was found that 45-50 ° C. was the optimum reaction temperature.
至適ｐＨ：反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ） ２０μｌ、０．２Ｍ バッファー １００μｌ、２０ｍＭ ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ、水を加えてトータル４００μｌとした。バッファーは、ｐＨ４．０−６．０のとき酢酸ナトリウムバッファーを、ｐＨ６．０−８．０のときリン酸ナトリウムバッファーを用いた。上記と同様にサンプリング、測定を行い、Δ４０５の最大値に対する各ｐＨで反応させたときのΔ４０５の比率を図２Ｂに示した。これにより、ｐＨ６．０−７．０が反応至適ｐＨであることが分かった。 Optimal pH: The reaction solution was a total of 400 μl by adding 20 μl of crude enzyme solution (1.3 μg / ml), 100 μl of 0.2 M buffer, 20 mM pNP-β-Glc, and water. The buffer used was sodium acetate buffer at pH 4.0-6.0, and sodium phosphate buffer at pH 6.0-8.0. The sampling and measurement were performed in the same manner as above, and the ratio of Δ405 when reacted at each pH to the maximum value of Δ405 is shown in FIG. 2B. Thereby, it turned out that pH 6.0-7.0 is reaction optimum pH.
熱安定性：５０００倍希釈した粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ）を３０℃、３７℃、４５℃、５０℃でそれぞれ１０分間保持したあと氷冷した。反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ） ５μｌ、０．２Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５） １００μｌ、２０ｍＭ ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ、水を加えてトータル１００μｌとし、３７℃で４５分間反応させたあと、０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液 １００μｌを添加し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。熱処理しなかった酵素液による４５分後の４０５ｎｍの吸光度に対する各温度で処理したときの比率を求め、図２Ｃに示した。ＡＯＢＧＬ１１ｐは、１０分間の処理では３７℃まで安定であるが、４５℃での処理で約半分にまで失活し、５０℃の処理では、活性がほぼ失われることが分かった。 Thermal stability: The crude enzyme solution (1.3 μg / ml) diluted 5,000-fold was kept at 30 ° C., 37 ° C., 45 ° C. and 50 ° C. for 10 minutes and then ice cooled. The reaction solution contains 5 μl of crude enzyme solution (1.3 μg / ml), 100 μl of 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.5), 20 mM pNP-β-Glc and water to make a total of 100 μl, and it takes 45 minutes at 37 ° C. After the reaction, 100 μl of 0.2 M sodium carbonate solution was added, and the absorbance at 405 nm was measured. The ratio of the treatment at each temperature to the absorbance at 405 nm after 45 minutes with the enzyme solution not subjected to heat treatment was determined and is shown in FIG. 2C. It was found that AOBGL11p is stable up to 37 ° C. for 10 minutes of treatment, but inactivated to about half by treatment at 45 ° C. and almost lost activity at 50 ° C. of treatment.
ｐＨ安定性：粗酵素液を、ｐＨ４．５、５．０、５．５、６．０（０．２Ｍ酢酸バッファー）、ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０（０．２Ｍ リン酸ナトリウムバッファー）の各バッファーで５０００倍希釈し、３７℃で１時間保持したあと氷冷した。反応液は、粗酵素液（１．３μｇ／ｍｌ） ５μｌ、０．２Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５） １００μｌ、２０ｍＭ ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ、水を加えてトータル１００μｌとし、３７℃で４５分間反応させたあと、０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液 １００μｌを添加し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。活性のもっとも高かったｐＨ６．５で保持したときの吸光度に対する各ｐＨで保持したときの吸光度の比率を求め、図２Ｄに示した。ＡＯＢＧＬ１１ｐは、ｐＨ６．５付近で最も安定であることがわかった。 pH stability: The crude enzyme solution was pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 (0.2 M acetate buffer), pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8. It was diluted 5000 times with each buffer of 0 (0.2 M sodium phosphate buffer), kept at 37 ° C. for 1 hour, and then ice cooled. The reaction solution contains 5 μl of crude enzyme solution (1.3 μg / ml), 100 μl of 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.5), 20 mM pNP-β-Glc and water to make a total of 100 μl, and it takes 45 minutes at 37 ° C. After the reaction, 100 μl of 0.2 M sodium carbonate solution was added, and the absorbance at 405 nm was measured. The ratio of the absorbance when held at each pH to the absorbance when held at pH 6.5, which was the highest activity, was determined and is shown in FIG. 2D. AOBGL11p was found to be most stable around pH 6.5.
[実施例４]
ＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡのクローニング
ＢＧＬ１１−１株を酵素生産用培地１０ｍｌで培養し、ろ過により菌体を集めた。菌体を液体窒素で凍結し、乳鉢で菌体をすりつぶしてから、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ）でトータルＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ）により、ｃＤＮＡを合成した。これを鋳型として、プライマーＡＯＢＧＬ１１−ＦとＡＯＢＧＬ１１−Ｒを用いて、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡）でＰＣＲを行った。得られた約２．５２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン）を使ってＡＯＢＧＬ１１のｃＤＮＡをクローン化し、プラスミドｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ１１ｃＤＮＡを得た。塩基配列を確認したところ、配列番号１の通りであり、推定アミノ酸配列は配列番号２の通りであった。ＡＯＢＧＬ１１のゲノムＤＮＡ配列とｃＤＮＡ配列を比較したものを図３に示す。なお、すでにＳＴＧ加水分解活性が確認されているPaenibacillus 属に属する細菌KB0549株由来のβ-グルコシダーゼの推定アミノ酸配列との同一性は３０．３％であった。Example 4
Cloning of cDNA of AOBGL11 The BGL11-1 strain was cultured in 10 ml of a medium for enzyme production, and cells were collected by filtration. The cells were frozen in liquid nitrogen, the cells were ground in a mortar, and total RNA was extracted with RNeasy (QIAGEN). CDNA was synthesized by SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit (Life Technologies). Using this as a template, PCR was performed with KOD-plus (Toyobo) using primers AOBGL11-F and AOBGL11-R. The obtained about 2.52 kbp DNA fragment was used to clone AOBGL11 cDNA using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen) to obtain plasmid pCR-AOBGL11 cDNA. The nucleotide sequence was confirmed to be SEQ ID NO: 1, and the deduced amino acid sequence was SEQ ID NO: 2. What compared the genomic DNA sequence of AOBGL11 and cDNA sequence is shown in FIG. The identity with the estimated amino acid sequence of β-glucosidase derived from the bacterium KB0549 belonging to the genus Paenibacillus, for which STG hydrolysis activity has already been confirmed, was 30.3%.
[実施例５]
酵母でのＡＯＢＧＬ１１ｐの生産
酵母用発現ベクターの構築と酵母の形質転換
プラスミドｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ１１ ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して得られた約２．５２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、酵母発現ベクターｐＹＥ２２ｍ（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995）のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ＡＯＢＧＬ１１がベクターｐＹＥ２２ｍのＧＡＰＤＨプロモーターから発現する向きに挿入されたものを選抜し、ｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ３ｃとした。形質転換の親株として、S.cerevisiaeのＥＨ１３−１５株（ｔｒｐ１，ＭＡＴα）（Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989）を用いた。 プラスミドｐＹＥ２２ｍ（コントロール）、ｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ１１（ＡＯＢＧＬ１１発現用）をそれぞれ用いて酢酸リチウム法により、ＥＨ１３−１５株を形質転換した。形質転換株は、ＳＣ−Ｔｒｐ（１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、およびアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇを含む）寒天培地（２％アガー）上で生育するものを選抜した。[Example 5]
Production of AOBGL11p in Yeast and Construction of Yeast Expression Vector and Transformation of Yeast The DNA fragment of about 2.52 kbp obtained by digesting plasmid pCR-AOBGL11 cDNA with EcoRI was used to express yeast expression vector pYE22m (Biosci. Biotech. Biochem) , 59, 1221-1228 (1995), and those in which AOBGL11 was inserted in the direction of expression from the GAPDH promoter of vector pYE22m were selected and designated as pYE-AOBGL3c. As a parent strain for transformation, S. cerevisiae strain EH13-15 (trp1, MATα) (Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989) was used. The EH13-15 strain was transformed by the lithium acetate method using each of the plasmids pYE22m (control) and pYE-AOBGL11 (for AOBGL11 expression). Transformed strain: SC-Trp (per liter, 6.7 g of yeast nitrogen base w / o amino acids (DIFCO), 20 g of glucose, and amino acid powder (1. 25 g of adenine sulfate, 0.6 g of arginine, 3 g of aspartic acid, 3 g of glutamic acid, 0.6 g of histidine, 1.8 g of leucine, 0.9 g of lysine, 0.6 g of methionine, 1.5 g of phenylalanine, 11.25 g of serine, 0.9 g of tyrosine, 4.5 g of valine, 6 g of threonine, 0.6 g of uracil (Containing 1.3 g) was selected on the agar medium (2% agar).
プラスミドｐＹＥ２２ｍで形質転換して得られた株をＣ−Ｙ株、プラスミドｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ１１で形質転換して得られた株をＡＯＢＧＬ１１−Ｙ株とした。 選抜したＣ−Ｙ株とＡＯＢＧＬ１１−Ｙ株を、１Ｍリン酸カリウムバッファーを１／１０量添加したＳＣ−Ｔｒｐ液体培地１０ｍＬに１白金耳植菌し、３０℃、１２５ｒｐｍで２日間振とう培養した。得られた培養物を遠心分離により、培養上清と菌体に分けた。培養上清は、アミコン(登録商標)ウルトラ−１５ ５０ｋ（メルク）で限界ろ過に濃縮して０．１％ ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）でバッファー置換し、約１ｍｌの培養上清濃縮液を得た。 The strain obtained by transforming with the plasmid pYE22m was transformed with the C-Y strain and the plasmid pYE-AOBGL11, and the strain obtained with it was designated as the AOBGL11-Y strain. The selected strains C-Y and AOBGL11-Y were inoculated in 10 mL of SC-Trp liquid medium supplemented with 1/10 volume of 1 M potassium phosphate buffer, and shake cultured at 30 ° C., 125 rpm for 2 days . The resulting culture was separated into culture supernatant and cells by centrifugation. The culture supernatant is concentrated by ultrafiltration on Amicon (registered trademark) Ultra-15 50k (Merck), buffer-replaced with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1% CHAPS, and cultured about 1 ml The supernatant concentrate was obtained.
菌体は、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．１％ＣＨＡＰＳ溶液 １ｍｌに懸濁して、ガラスビーズにて菌体を破砕し、遠心分離して得られた上清を菌体破砕液とした。 培養上清濃縮液または菌体破砕液を２０μｌとり、２％ Ｘ‐β‐Ｇｌｃ／ＤＭＦ溶液を１μｌ添加し、室温で５分間反応させたところ、ＡＯＢＧＬ１１−Ｙ株由来の菌体破砕液のみ青色を呈し、Ｘ−β−Ｇｌｃ活性を有することが示唆された。 The cells are suspended in 1 ml of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), 0.1% CHAPS solution, the cells are disrupted with glass beads, and the supernatant obtained by centrifugation is disrupted. It was a liquid. When 20 μl of culture supernatant concentrate or cell lysate was taken, 1 μl of 2% X-β-Glc / DMF solution was added and reacted for 5 minutes at room temperature, only the cell lysate from AOBGL11-Y strain was blue And X-β-Glc activity was suggested.
ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ活性測定
ｐＮＰ−β−Ｇｌｃの分解活性を検討した。粗酵素液１０μＬ、０．２Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）５０μＬ、２０ｍＭ ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ水溶液 ５０μＬ、水を加えてトータル２００μＬとし、３７℃で反応させた。なお、ＢＧＬ１１−１粗酵素液は活性が高かったため、粗酵素液を０．１％ ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）バッファーで１００倍に希釈したものを用いた。ｐＮＰ−β−Ｇｌｃが加水分解して遊離したｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）に基づく１分間あたりの４０５ｎｍの吸光度変化（Δ４０５）は、ＡＯＢＧＬ１１−Ｙ粗酵素液で０．０６８、Ｃ−Ｙ粗酵素液で０．０００であった。pNP-β-Glc Activity Measurement The degradation activity of pNP-β-Glc was examined. 10 μL of crude enzyme solution, 50 μL of 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 7.0), 50 μL of 20 mM pNP-β-Glc aqueous solution, and water were added to make a total of 200 μL, and the reaction was performed at 37 ° C. Since the BGL11-1 crude enzyme solution had high activity, the crude enzyme solution was diluted 100 times with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) buffer containing 0.1% CHAPS and used. The absorbance change at 405 nm (Δ 405) per minute based on p-nitrophenol (pNP) liberated by hydrolysis of pNP-β-Glc is 0.068, C-Y crude enzyme with AOBGL11-Y crude enzyme solution It was 0.000 in the solution.
[実施例６]
ＡＯＢＧＬ１１ｐのセサミノール配糖体加水分解活性
基質としてはセサミノールトリグルコシド（ＳＴＧ）を用いた。ＳＴＧを５０μｇ／ｍＬ、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、上記ＢＧＬ１１−１粗酵素液またはその希釈液２０μＬで、全量１００μＬとし、３７℃で、１時間反応させた。コントロールとして、上記Ｃ−１粗酵素液も同様に反応させた。反応液を１００℃で３分間処理し反応を停止させた後、コスモスピンフィルターＨ（ナカライテスク）でろ過後、ＨＰＬＣに供した。[Example 6]
Sesaminol glucoside hydrolysis activity of AOBGL11 p Sesaminol triglucoside (STG) was used as a substrate. The STG was brought to a total volume of 100 μL with 50 μg / mL, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), 20 μL of the above BGL 11-1 crude enzyme solution or a diluted solution thereof, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. As a control, the above C-1 crude enzyme solution was similarly reacted. The reaction mixture was treated at 100 ° C. for 3 minutes to stop the reaction, filtered through Cosmo spin filter H (Nacalai Tesque), and subjected to HPLC.
ＨＰＬＣの分析条件は以下の通りである。
カラム：コスモシール５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ ４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５０ｍｍ（ナカライテスク）
移動相：Ａ；０．１％（v/v）トリフルオロ酢酸、２：８（ｖ/ｖ）アセトニトリル：水Ｂ；０．１％（v/v）トリフルオロ酢酸、８：２（ｖ/ｖ）アセトニトリル：水
Ｂ ｃｏｎｃ．１０％（０分―３分）→１００％ ２４分 ｌｉｎｅａｒ
ｇｒａｄｉｅｎｔ、 １００％（２４分―３５分）
流速：０．７ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：ＵＶ ２９０ｎｍ
結果を図４に示す。The analytical conditions of HPLC are as follows.
Column: Cosmo seal 5 C 18 -AR-II 4.6 mm I. D. x 250 mm (Nacalai Tesque)
Mobile phase: A; 0.1% (v / v) trifluoroacetic acid, 2: 8 (v / v) acetonitrile: water B; 0.1% (v / v) trifluoroacetic acid, 8: 2 (v / v v) acetonitrile: water
B conc. 10% (0 minutes-3 minutes) → 100% 24 minutes linear
gradient, 100% (24 minutes-35 minutes)
Flow rate: 0.7 ml / min Temperature: 40 ° C.
Detection: UV 290 nm
The results are shown in FIG.
１０倍希釈したＢＧＬ１１−１粗酵素液と反応させた場合、基質のＳＴＧの一部が加水分解され、ＳＤＧ（１，６）およびＳＤＧ（１，２）、およびアグリコンであるセサミノールも生成した（図４Ａ）。
また、ＢＧＬ１１−１粗酵素液を希釈せずに反応させた場合には、基質として添加したＳＴＧはほとんど加水分解され、ＳＤＧ（１，２）およびアグリコンであるセサミノールが生成した（図４Ｂ）。１０倍希釈したＢＧＬ１１−１粗酵素液と反応させた場合、ＳＤＧ（１，６）に比べてＳＤＧ（１，２）が多いことと、ＢＧＬ１１−１粗酵素液を希釈せずに反応させた場合、ＳＤＧ（１，６）は検出されずＳＤＧ（１，２）のみ検出されることから、ＡＯＢＧＬ１１ｐは、ＳＴＧの分岐した糖鎖の中のβ−１，２結合に比べてβ−１，６結合に対してよく作用することが示唆された。
以上の結果から、ＡＯＢＧＬ１１ｐは、β−１，２結合に比べてβ−１，６結合を優先して加水分解し、最終的にアグリコンであるセサミノールにまで加水分解する様式であることが示された。また、酵素液の濃度を調整することにより、セサミノール配糖体の加水分解の進行を制御することが可能であることが示された。なお、Ｃ−１粗酵素液とＳＴＧとの反応の結果は図４Ｃに示され、この結果により、Ｃ−１粗酵素液はＳＴＧの加水分解を進行させないことが示された。When reacted with a 10-fold diluted BGL11-1 crude enzyme solution, part of the substrate STG was hydrolyzed to produce SDG (1, 6) and SDG (1, 2), and the aglycone sesaminol (Figure 4A).
In addition, when BGL11-1 crude enzyme solution was reacted without dilution, STG added as a substrate was almost hydrolyzed and SDG (1, 2) and aglycone sesaminol were produced (FIG. 4B) . When it was made to react with 10 times diluted BGL11-1 crude enzyme solution, it was made to react without dilution of BGL11-1 crude enzyme solution that SDG (1, 2) is more than SDG (1, 6) In this case, since SDG (1, 6) is not detected but only SDG (1, 2) is detected, AOBGL11p is β-1, compared to β-1, 2 bond in branched sugar chains of STG. It was suggested that it works well for 6 bonds.
The above results indicate that AOBGL11p preferentially hydrolyzes the β-1,6 bond compared to the β-1,2 bond and finally hydrolyzes to the aglycone sesaminol. It was done. In addition, it was shown that it is possible to control the progress of hydrolysis of sesaminol glucoside by adjusting the concentration of the enzyme solution. In addition, the result of reaction of a C-1 crude enzyme liquid and STG is shown by FIG. 4C, This result showed that C-1 crude enzyme liquid did not advance the hydrolysis of STG.
本願発明は、麹菌由来のグルコシドヒドラーゼであるＡＯＢＧＬ１１ｐを用いて、セサミノールトリグルコシドを加水分解し、セサミノールおよび／またはセサミノール配糖体を生産する方法を提供する。 The present invention provides a method for producing sesaminol and / or sesaminol glucoside by hydrolyzing sesaminol triglucoside using AOBGL11p, which is a glucoside hydrolase derived from Aspergillus oryzae.
Claims (15)
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質A protein selected from the group consisting of (a) to (c) below is reacted with a substrate sesaminol glycoside having at least one glucosidic bond to obtain at least one glucoside bond of the substrate sesaminol glycoside: A process for producing product sesaminol or product sesaminol glycoside, comprising the step of hydrolyzing.
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) A substrate sesaminol glycoside comprising an amino acid sequence having 1 to 83 amino acids deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucosidic bond A protein having the activity of hydrolyzing glucosidic bonds of
(C) The activity of hydrolyzing the glucosidic bond of a substrate sesaminol glycoside having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucosidic bond Protein with
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドAn enzyme agent derived from a non-human transformed cell into which a polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (e) has been introduced into a host cell, a substrate sesaminol glycosyl having at least one glucoside bond: A method for producing formed sesaminol or formed sesaminol glycoside, which comprises the step of contacting with the body and hydrolyzing at least one glucosidic bond of substrate sesaminol glycoside.
(A) a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(C) A substrate sesaminol glycoside comprising an amino acid sequence in which 1 to 83 amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucosidic bond A polynucleotide encoding a protein having an activity of hydrolyzing glucosidic bonds of
(D) The activity of hydrolyzing the glucosidic bond of a substrate sesaminol glycoside having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucosidic bond A polynucleotide encoding a protein having
(E) A polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under high stringency conditions, and which has at least one glucosidic bond, Polynucleotide encoding a protein having an activity of hydrolyzing glucosidic bond of a nol glycoside
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜８３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ少なくとも１つのグルコシド結合を有する基質セサミノール配糖体のグルコシド結合を加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドA method for producing produced sesaminol or produced sesaminol glycoside, comprising culturing a non-human transformant into which a polynucleotide selected from the group consisting of (a) to (e) has been introduced.
(A) a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(C) A substrate sesaminol glycoside comprising an amino acid sequence in which 1 to 83 amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucosidic bond A polynucleotide encoding a protein having an activity of hydrolyzing glucosidic bonds of
(D) The activity of hydrolyzing the glucosidic bond of a substrate sesaminol glycoside having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having at least one glucosidic bond A polynucleotide encoding a protein having
(E) A polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under high stringency conditions, and which has at least one glucosidic bond, Polynucleotide encoding a protein having an activity of hydrolyzing glucosidic bond of a nol glycoside
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