JPWO2018047785A1 - Collagen-like polypeptide - Google Patents
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Abstract
（ａ） 下記式（１）〜（３）Ｈ − （ Ｘ − Ｙ − Ｇｌｙ ）ｎ − ＯＨ （１）Ｈ − （ Ｇｌｙ − Ｘ − Ｙ ）ｎ − ＯＨ （２）Ｈ − （ Ｙ − Ｇｌｙ − Ｘ ）ｎ − ＯＨ （３）（式（１）〜（３）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｎは１〜１０の整数である。）で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマー、又は（ｂ） 上記式（１）〜（３）で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマーと、下記式（４）〜（１０）Ｈ − （ Ｚ ） − ＯＨ （４）（式（４）中、Ｚは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表す。）Ｈ − （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｐ− ＯＨ （５）Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ）ｐ− ＯＨ （６）Ｈ − （ Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ ）ｐ− ＯＨ （７）（式（５）〜（７）中、ｐは１〜１０の整数である。）Ｈ − （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｒ− ＯＨ （８）Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｚ２−Ｈｙｐ ）ｒ− ＯＨ （９）Ｈ − （ Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｚ２）ｒ− ＯＨ （１０）（式（８）〜（１０）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｒは１〜１０の整数である。）で表される少なくとも１種のアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドとを有機塩基を用いてｐＨ３〜１０に調整した水系溶媒中で縮合反応させることによりポリペプチドを製造する方法によれば、実用上十分な耐熱性を有するコラーゲン様ポリペプチドを安定的に製造することができる。(A) The following formulas (1) to (3) H-(X-Y-Gly) n-OH (1) H-(Gly-X-Y) n-OH (2) H-(Y-Gly-X At least represented by n-OH (3) (wherein X and Y each independently represent Hyp or Pro, and n is an integer of 1 to 10 in formulas (1) to (3)) 1 type of peptide oligomer, or (b) at least one type of peptide oligomer represented by the above formulas (1) to (3), and the following formulas (4) to (10) H-(Z)-OH (4) In the formula (4), Z is Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Hyp, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, From Val, Arg-Gly-Asp, and ε-polylysine Represents an amino acid residue, a peptide oligomer residue or a peptide residue selected from the group consisting of: H- (Pro-Lys-Gly) p-OH (5) H- (Gly-Pro-Lys) p-OH (6) H- (Lys-Gly-Pro) p-OH (7) (in the formulas (5) to (7), p is an integer of 1 to 10) H- (Z2-Hyp-Gly) r -OH (8) H- (Gly-Z2-Hyp) r-OH (9) H- (Hyp-Gly-Z2) r-OH (10) (In the formulas (8) to (10), Z2 is Ala. , An amino acid residue selected from the group consisting of Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, and Val; r is an integer of 1 to 10 According to the method of producing a polypeptide by condensation reaction of at least one type of amino acid, a peptide oligomer or a peptide represented by (IV) in an aqueous solvent adjusted to pH 3 to 10 with an organic base, A collagen-like polypeptide having heat resistance sufficient for practical use can be stably produced.
Description
本発明は、高耐熱性コラーゲン様ポリペプチドを安定的に製造することができる方法、この方法により得られる高耐熱性コラーゲン様ポリペプチド、及びこのポリペプチドを用いて製造される架橋ポリペプチドに関する。 The present invention relates to a method capable of stably producing a highly thermostable collagen-like polypeptide, a highly thermostable collagen-like polypeptide obtainable by this method, and a crosslinked polypeptide produced using this polypeptide.
典型的なコラーゲン分子は、３アミノ酸ごとにグリシンが存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、３本のポリペプチド鎖がらせんを巻いた特徴的なコラーゲンヘリックス構造を採っている。生体内では、３本鎖はコラーゲン繊維を形成し、さらに３次元的なコラーゲンマトリクスを形成している。コラーゲンマトリクスは、そこに細胞が接着して増殖や分化を行う足場として機能している。 A typical collagen molecule is a polypeptide having an amino acid sequence in which glycine is present every three amino acids, and has a characteristic collagen helical structure in which three polypeptide chains are helically wound. In vivo, the three chains form collagen fibers and further form a three-dimensional collagen matrix. The collagen matrix functions as a scaffold on which cells adhere and proliferate and differentiate.
コラーゲンは、その高い生体親和性から、医療・組織工学用のバイオマテリアルとして汎用されている。
しかし、天然のコラーゲンは熱に弱く、哺乳類由来のコラーゲンでも３０℃〜４０℃で三重らせん構造がほどけてランダムコイル状に変性する。バイオマテリアルとして利用するには加熱滅菌できることが求められるため、天然のコラーゲンをバイオマテリアルとして利用することは困難である。Collagen is widely used as a biomaterial for medical and tissue engineering because of its high biocompatibility.
However, natural collagen is weak to heat, and even mammalian-derived collagen denatures into a triple coil at 30 ° C. to 40 ° C. to denature into a random coil. It is difficult to use natural collagen as a biomaterial because heat sterilization is required to be used as a biomaterial.
そこで、合成コラーゲン様ポリペプチドの製造方法が、種々試みられている。合成コラーゲン様ポリペプチドは、天然コラーゲンと異なり、感染症の危険性がないこと、工業的合成により得られるため安定な供給が可能であることなどの優れた性質を有する。
非特許文献１は、Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ（式中、Ｙは、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表す）のユニットからなるポリペプチドが三重らせん構造を有するコラーゲン様ポリペプチドであること、このコラーゲン様ポリペプチドが、天然コラーゲンに比べて熱安定性が高いことを記載している。しかし、その耐熱性は、加熱滅菌に耐えるほどの十分なものではない。Thus, various methods for producing synthetic collagen-like polypeptides have been attempted. Unlike natural collagen, the synthetic collagen-like polypeptide has excellent properties such as no risk of infection and stable supply because it is obtained by industrial synthesis.
Non-Patent Document 1 describes that a polypeptide consisting of a unit of Pro-Y-Gly (wherein Y represents Hyp or Pro) is a collagen-like polypeptide having a triple helical structure, and this collagen-like polypeptide is It has been described that the thermostability is higher than that of natural collagen. However, its heat resistance is not sufficient to withstand heat sterilization.
また、特許文献１は、−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−（式中、Ｙは、Ｈｙｐを表し、ｎは１〜２０の整数を表す。）と、−（Ｚ）ｒ−（式中、Ｚは、Ｇｌｙなどのアミノ酸残基又はペプチド鎖を表し、ｒは１〜２の整数を表す。）とを、１００：０〜７０：３０のモル比で有し、分子量２万〜１００万のコラーゲン様ポリペプチドを開示している（［請求項1］）。特許文献１は、通常のペプチド合成法、特に固相合成法により、このコラーゲン様ポリペプチドを製造できることを教えている（［0044］）。 In addition, Patent Document 1 describes-(Pro-Y-Gly) n- (wherein, Y represents Hyp, n represents an integer of 1 to 20), and-(Z) r- (wherein , Z represents an amino acid residue such as GIy or a peptide chain, r represents an integer of 1 to 2.) in a molar ratio of 100: 0 to 70:30, and has a molecular weight of 20,000 to 1,000,000. Collagen-like polypeptide of the present invention is disclosed ([Claim 1]). Patent Document 1 teaches that this collagen-like polypeptide can be produced by conventional peptide synthesis methods, in particular by solid phase synthesis methods ([0044]).
また、特許文献２は、Ｈ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−ＯＨ、Ｈ−（Ｙ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ）ｎ−ＯＨ、又はＨ−（Ｇｌｙ-Ｐｒｏ−Ｙ）ｎ−ＯＨ（式中、Ｙは、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）を、リン酸イオン濃度０．０１Ｍ未満の水系溶媒中で縮合させることにより、コラーゲン様ポリペプチドを製造する方法を開示している（［請求項1］）。特許文献２は、リン酸イオン濃度が低いほど高分子量のポリペプチドが得られることを教えている（［0040］）。 In addition, Patent Document 2 describes H- (Pro-Y-Gly) n-OH, H- (Y-Gly-Pro) n-OH, or H- (Gly-Pro-Y) n-OH (wherein Y discloses Hyp or Pro and n represents an integer of 1 to 10.) discloses a method for producing a collagen-like polypeptide by condensing in an aqueous solvent having a phosphate ion concentration of less than 0.01 M. ([Claim 1]). Patent Document 2 teaches that the lower the phosphate ion concentration, the higher the molecular weight polypeptide can be obtained ([0040]).
また、特許文献３は、−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−（式中、Ｙは、Ｐｒｏ又はＨｙｐを表し、ｎは１以上の整数である。）と多糖類由来の糖残基とを有する重合体が、コラーゲン様ポリペプチドの生体親和性と、多糖類由来の親水性とを兼ね備え、機械的強度が高い重合体であることを教えている（［0013］）。特許文献３は、一般的な縮合反応により、この重合体を製造できることを教えている（［0033］〜［0039］）。 In addition, Patent Document 3 describes-(Pro-Y-Gly) n- (wherein, Y represents Pro or Hyp, and n is an integer of 1 or more) and a saccharide residue derived from a polysaccharide. It is taught that the polymer possessing both the biocompatibility of collagen-like polypeptide and the hydrophilicity derived from polysaccharides is a polymer with high mechanical strength ([0013]). Patent Document 3 teaches that this polymer can be produced by a general condensation reaction ([0033] to [0039]).
しかし、これらの文献が教えるコラーゲン様ポリペプチドの製造方法では、縮合反応の進行が不十分でポリペプチド鎖が形成されなかったり、逆に、縮合反応が進行し過ぎて、過重合によりゲル状になってしまう場合がある。ゲル状になると、その後の精製が困難であり、また、構造や特性を分析できないため、バイオマテリアルに応用することができない。 However, in the collagen-like polypeptide production method taught by these documents, the progress of the condensation reaction is insufficient and the polypeptide chain is not formed, or conversely, the condensation reaction progresses too much, and it becomes gel due to overpolymerization. It may become Once gelled, it can not be applied to biomaterials because subsequent purification is difficult and the structure and characteristics can not be analyzed.
本発明は、実用上十分な耐熱性を有するコラーゲン様ポリペプチドを安定的に製造することができる方法、及びこの方法により得られる高耐熱性コラーゲン様ポリペプチドを提供することを主な課題とする。 The main object of the present invention is to provide a method capable of stably producing a collagen-like polypeptide having sufficient heat resistance for practical use, and a highly heat-resistant collagen-like polypeptide obtained by this method. .
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、
（ａ） 下記式（１）
Ｈ − （ Ｘ − Ｙ − Ｇｌｙ ） ｎ− ＯＨ （１）
（式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｎは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマー、下記式（２）
Ｈ − （ Ｇｌｙ − Ｘ − Ｙ ） ｎ− ＯＨ （２）
（式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｎは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマー、及び下記式（３）
Ｈ − （ Ｙ − Ｇｌｙ − Ｘ ） ｎ− ＯＨ （３）
（式（３）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｎは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドオリゴマー、又は
（ｂ） 上記式（１）で表されるペプチドオリゴマー、上記式（２）で表されるペプチドオリゴマー、及び上記式（３）で表されるペプチドオリゴマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドオリゴマーと、下記式（４）
Ｈ − （ Ｚ１ ） − ＯＨ （４）
（式（４）中、Ｚ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表す。）
で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチド、下記式（５）
Ｈ − （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｐ− ＯＨ （５）
（式（５）中、ｐは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマー、下記式（６）
Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ）ｐ− ＯＨ （６）
（式（６）中、ｐは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマー、下記式（７）
Ｈ − （ Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ ）ｐ− ＯＨ （７）
（式（７）中、ｐは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマー、下記式（８）
Ｈ − （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｒ− ＯＨ （８）
（式（８）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｒは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマー、下記式（９）
Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｚ２−Ｈｙｐ ）ｒ− ＯＨ （９）
（式（９）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｒは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマー、及び下記式（１０）
Ｈ − （ Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｚ２ ）ｒ− ＯＨ （１０）
（式（１０）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｒは１〜１０の整数である。）
で表されるペプチドオリゴマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドとを、有機塩基を用いてｐＨ３〜１０に調整した水系溶媒中で縮合反応させることにより、少なくとも一部が三重らせん構造を形成する、又は形成し得る重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００の高耐熱性のコラーゲン様ポリペプチドが得られることを見出した。
また、この製造方法によれば、縮合反応が過不足なく安定して進行し、高耐熱性のコラーゲン様ポリペプチドを効率よく製造できることを見出した。In order to solve the above-mentioned problems, the inventor repeated studies.
(A) the following formula (1)
H-(X-Y-Gly) n-OH (1)
(In Formula (1), X and Y respectively independently represent Hyp or Pro, n is an integer of 1-10.)
Peptide oligomer represented by the following formula (2)
H-(Gly-X-Y) n-OH (2)
(In formula (2), X and Y respectively independently represent Hyp or Pro, n is an integer of 1-10.)
And a peptide oligomer represented by the following formula (3):
H- (Y-Gly-X) n-OH (3)
(In Formula (3), X and Y each independently represent Hyp or Pro, and n is an integer of 1 to 10).
Or at least one peptide oligomer selected from the group consisting of peptide oligomers represented by or (b) a peptide oligomer represented by the above formula (1), a peptide oligomer represented by the above formula (2), and the above formula (3) At least one peptide oligomer selected from the group consisting of peptide oligomers, and the following formula (4)
H − (Z 1 ) − OH (4)
In the formula (4), Z 1 represents Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Hyp, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr Represents an amino acid residue, a peptide oligomer residue or a peptide residue selected from the group consisting of: Val, Arg-Gly-Asp, and ε-polylysine.
Amino acid, peptide oligomer, or peptide represented by the following formula (5)
H- (Pro-Lys-Gly) p-OH (5)
(In the formula (5), p is an integer of 1 to 10)
Peptide oligomer represented by the following formula (6)
H- (Gly-Pro-Lys) p-OH (6)
(In the formula (6), p is an integer of 1 to 10)
Peptide oligomer represented by the following formula (7)
H- (Lys-Gly-Pro) p-OH (7)
(In the formula (7), p is an integer of 1 to 10).
Peptide oligomer represented by the following formula (8)
H - (Z 2 -Hyp-Gly ) r- OH (8)
(In the formula (8), Z 2 is selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, and Val Represents an amino acid residue selected from the group consisting of: r is an integer of 1 to 10)
Peptide oligomer represented by the following formula (9)
H - (Gly-Z 2 -Hyp ) r- OH (9)
(In the formula (9), Z 2 is selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, and Val Represents an amino acid residue selected from the group consisting of: r is an integer of 1 to 10)
And a peptide oligomer represented by the following formula (10):
H − (Hyp-Gly-Z 2 ) r-OH (10)
In the formula (10), Z 2 is selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, and Val Represents an amino acid residue selected from the group consisting of: r is an integer of 1 to 10)
At least a portion of at least one amino acid selected from the group consisting of peptide oligomers represented by and a peptide oligomer or peptide in an aqueous solvent adjusted to pH 3 to 10 with an organic base, It has been found that a highly heat-resistant collagen like polypeptide having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,500,000 can be formed or can form a triple helix structure.
In addition, according to this production method, it has been found that the condensation reaction proceeds stably without excess and deficiency, and high heat resistant collagen-like polypeptide can be efficiently produced.
本発明は、この知見に基づき完成されたものであり、以下のポリペプチドの製造方法、ポリペプチド、及び架橋ポリペプチドを提供する。
項１． （ａ） 下記式（１）〜（３）
Ｈ − （ Ｘ − Ｙ − Ｇｌｙ ）ｎ − ＯＨ （１）
Ｈ − （ Ｇｌｙ − Ｘ − Ｙ ）ｎ − ＯＨ （２）
Ｈ − （ Ｙ − Ｇｌｙ − Ｘ ）ｎ − ＯＨ （３）
（式（１）〜（３）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｎは１〜１０の整数である。）
で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマー、又は
（ｂ） 上記式（１）〜（３）で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマーと、下記式（４）〜（１０）
Ｈ − （ Ｚ１ ） − ＯＨ （４）
（式（４）中、Ｚ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表す。）
Ｈ − （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｐ− ＯＨ （５）
Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ）ｐ− ＯＨ （６）
Ｈ − （ Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ ）ｐ− ＯＨ （７）
（式（５）〜（７）中、ｐは１〜１０の整数である。）
Ｈ − （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｒ− ＯＨ （８）
Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｚ２−Ｈｙｐ ）ｒ− ＯＨ （９）
Ｈ − （ Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｚ２ ）ｒ− ＯＨ （１０）
（式（８）〜（１０）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｒは１〜１０の整数である。）
で表される少なくとも１種のアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドとを、
有機塩基を用いてｐＨ３〜１０に調整した水系溶媒中で縮合反応させることにより、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチドを得る工程を含むポリペプチドの製造方法。
項２． 有機塩基が第三級アミンである項１に記載の方法。
項３． 水系溶媒のｐＨを４〜８に調整する項１又は２に記載の方法。
項４． ペプチドオリゴマーを塩体として縮合反応に供する項１〜３の何れかに記載の方法。
項５． 項１〜４の何れかに記載の方法で製造される、下記式（１１）
― （ Ｘ − Ｙ − Ｇｌｙ ） ｍ ― （１１）
（式（１１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｍは、１０〜３６００の整数である。）
で表される少なくとも1種のユニットを有し、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチド。
項６． 円二色性スペクトルにおいて、波長２１０ｎｍ〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１８５ｎｍ〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す項５に記載のポリペプチド。
項７． 変性温度が５０℃〜１５０℃である項５又は６に記載のポリペプチド。
項８． 下記式（１５）
― （ Ｈｙｐ − Ｈｙｐ − Ｇｌｙ ） ｍ ― （１５）
（式（１５）中、ｍは１０〜３６００の整数である。）
で表されるユニットを有し、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチド。
項９． 下記式（１５）
― （ Ｈｙｐ − Ｈｙｐ − Ｇｌｙ ） ｍ ― （１５）
（式（１５）中、ｍは１０〜３６００の整数である。）
で表されるユニットと、下記式（１２）〜（１４）
― （ Ｚ１ ） ｌ ― （１２）
（式（１２）中、Ｚ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表し、ｌは、１〜３６０の整数である。）
― （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｑ― （１３）
（式（１３）中、ｑは１〜３６０の整数である。）
― （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｓ― （１４）
（式（１４）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｓは１〜３６０の整数である。）
で表される少なくとも１種のユニットとを有し、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチド。
項１０． 項５〜９の何れかに記載のポリペプチドを架橋してなる架橋ポリペプチド。
項１１． 変性温度が５０℃〜１５０℃である項１０に記載の架橋ポリペプチド。The present invention has been completed based on this finding, and provides the following polypeptide production methods, polypeptides, and cross-linked polypeptides.
Item 1. (A) The following formulas (1) to (3)
H- (X-Y-Gly) n-OH (1)
H-(Gly-X-Y) n-OH (2)
H- (Y-Gly-X) n-OH (3)
(In the formulas (1) to (3), X and Y each independently represent Hyp or Pro, and n is an integer of 1 to 10).
Or at least one peptide oligomer represented by the formulas (1) to (3), and the following formulas (4) to (10):
H − (Z 1 ) − OH (4)
In the formula (4), Z 1 represents Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Hyp, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr Represents an amino acid residue, a peptide oligomer residue or a peptide residue selected from the group consisting of: Val, Arg-Gly-Asp, and ε-polylysine.
H- (Pro-Lys-Gly) p-OH (5)
H- (Gly-Pro-Lys) p-OH (6)
H- (Lys-Gly-Pro) p-OH (7)
(In the formulas (5) to (7), p is an integer of 1 to 10)
H - (Z 2 -Hyp-Gly ) r- OH (8)
H - (Gly-Z 2 -Hyp ) r- OH (9)
H − (Hyp-Gly-Z 2 ) r-OH (10)
(In the formulas (8) to (10), Z 2 represents Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr And an amino acid residue selected from the group consisting of and Val, and r is an integer of 1 to 10.)
At least one amino acid represented by, a peptide oligomer, or a peptide,
A polypeptide having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,500,000 capable of at least partially forming a triple helix structure by condensation reaction in an aqueous solvent adjusted to pH 3 to 10 using an organic base A method of producing a polypeptide comprising the steps of
Item 2. Item 2. The method according to Item 1, wherein the organic base is a tertiary amine.
Item 3. Item 3. The method according to item 1 or 2, wherein the pH of the aqueous solvent is adjusted to 4 to 8.
Item 4. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the peptide oligomer is subjected to a condensation reaction as a salt form.
Item 5. The following formula (11) manufactured by the method according to any one of items 1 to 4.
-(X-Y-Gly) m-(11)
(In the formula (11), X and Y each independently represent Hyp or Pro, and m is an integer of 10 to 3600.)
A polypeptide having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,500,000, which has at least one type of unit represented by and at least a part of which can form a triple helical structure.
Item 6. 6. The polypeptide according to item 5, which exhibits positive cotton effect at a wavelength of 210 nm to 230 nm and negative cotton effect at a wavelength of 185 nm to 205 nm in a circular dichroism spectrum.
Item 7. 7. The polypeptide according to item 5 or 6, wherein the denaturation temperature is 50 ° C. to 150 ° C.
Item 8. Following formula (15)
-(Hyp-Hyp-Gly) m-(15)
(In the formula (15), m is an integer of 10 to 3600.)
A polypeptide having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,500,000, which has a unit represented by and at least a part of which can form a triple helical structure.
Item 9. Following formula (15)
-(Hyp-Hyp-Gly) m-(15)
(In the formula (15), m is an integer of 10 to 3600.)
And a unit represented by the following formulas (12) to (14)
― (Z 1 ) l ― (12)
In the formula (12), Z 1 represents Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Hyp, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr , An amino acid residue selected from the group consisting of: Val, Arg-Gly-Asp, and ε-polylysine, a peptide oligomer residue, or a peptide residue, and l is an integer of 1 to 360.)
-(Pro-Lys-Gly) q- (13)
(In the formula (13), q is an integer of 1 to 360.)
- (Z 2 -Hyp-Gly) s- (14)
(In the formula (14), Z 2 is selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, and Val Represents an amino acid residue selected from the group consisting of: s is an integer of 1 to 360)
And a polypeptide having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,500,000 having at least one type of unit represented by
Item 10. The crosslinked polypeptide formed by bridge | crosslinking the polypeptide in any one of claim | item 5-9.
Item 11. 11. The crosslinked polypeptide according to item 10, wherein the denaturation temperature is 50 ° C. to 150 ° C.
本発明のポリペプチドの製造方法によれば、縮合反応が過不足なく進行し、高耐熱性のコラーゲン様ポリペプチドを効率よく製造することができる。
即ち、従来の製造方法では、条件によっては、縮合反応が十分に進行せず、所望の分子量のポリペプチドが得られなかったり、未反応原料が残る場合がある。また、縮合反応が進み過ぎて、ポリペプチドがゲル状になる場合もある。ゲル状になると、その後の精製が困難であり、また、構造や特性を分析できないため、バイオマテリアルに応用することができない。
この点、本発明方法によれば、縮合反応が十分に進行しなかったり、未反応物が生成したり、過重合するといった事態が抑制されて、広範囲の条件下で、安定してコラーゲン様ポリペプチドを得ることができる。また、得られるポリペプチドは、精製、分析が可能であるため、ポリペプチドの構造や特性に応じたバイオマテリアルに応用することができる。また、本発明方法によれば、ポリペプチドの分子量を容易に制御できるため、目的とするバイオマテリアルに応じた分子量のポリペプチドを効率よく製造することができる。According to the method for producing the polypeptide of the present invention, the condensation reaction proceeds without excess and deficiency, and a highly heat-resistant collagen-like polypeptide can be efficiently produced.
That is, in the conventional production method, depending on the conditions, the condensation reaction may not proceed sufficiently, a polypeptide of a desired molecular weight may not be obtained, or an unreacted material may remain. In addition, the condensation reaction may proceed too much and the polypeptide may be gelled. Once gelled, it can not be applied to biomaterials because subsequent purification is difficult and the structure and characteristics can not be analyzed.
In this respect, according to the method of the present invention, the condensation reaction does not proceed sufficiently, generation of an unreacted product, and overpolymerization are suppressed, and the collagen-like poly is stabilized under a wide range of conditions. Peptides can be obtained. In addition, since the obtained polypeptide can be purified and analyzed, it can be applied to biomaterials according to the structure and characteristics of the polypeptide. Further, according to the method of the present invention, since the molecular weight of the polypeptide can be easily controlled, it is possible to efficiently produce a polypeptide having a molecular weight according to the target biomaterial.
また、本発明方法によれば、変性温度が通常５０℃以上の高耐熱性のコラーゲン様ポリペプチドが得られる。製造条件によっては、変性温度が１２０℃以上の超高耐熱性のコラーゲン様ポリペプチドが得られる場合もあり、この場合は、バイオマテリアルの汎用の滅菌方法であるオートクレーブ滅菌にも耐えるものとなる。 Moreover, according to the method of the present invention, a highly heat-resistant collagen-like polypeptide having a denaturation temperature of usually 50 ° C. or higher can be obtained. Depending on the production conditions, a collagenous polypeptide having a very high heat resistance at a denaturation temperature of 120 ° C. or higher may be obtained, and in this case, it can withstand autoclave sterilization, which is a general sterilization method of biomaterials.
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）ポリペプチドの製造方法
本発明の製造方法は、
（ａ） 下記式（１）〜（３）
Ｈ − （ Ｘ − Ｙ − Ｇｌｙ ） ｎ− ＯＨ （１）
Ｈ − （ Ｇｌｙ − Ｘ − Ｙ ） ｎ− ＯＨ （２）
Ｈ − （ Ｙ − Ｇｌｙ − Ｘ ） ｎ− ＯＨ （３）
（式（１）〜（３）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｎは１〜１０の整数である。）
で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマー、又は
（ｂ） 上記式（１）〜（３）で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマーと、下記式（４）〜（１０）
Ｈ − （ Ｚ１ ） − ＯＨ （４）
（式（４）中、Ｚ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表す。）
Ｈ − （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｐ− ＯＨ （５）
Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ）ｐ− ＯＨ （６）
Ｈ − （ Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ ）ｐ− ＯＨ （７）
（式（５）〜（７）中、ｐは１〜１０の整数である。）
Ｈ − （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｒ− ＯＨ （８）
Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｚ２−Ｈｙｐ ）ｒ− ＯＨ （９）
Ｈ − （ Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｚ２ ）ｒ− ＯＨ （１０）
（式（８）〜（１０）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｒは１〜１０の整数である。）
で表される少なくとも１種のアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドとを、
有機塩基を用いてｐＨ３〜１０に調整した水系溶媒中で縮合反応させることにより、少なくとも一部分が三重らせん構造を形成する、又は形成し得る重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチドを得る工程を含むポリペプチドの製造方法である。Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(I) Method for Producing Polypeptide The production method of the present invention comprises
(A) The following formulas (1) to (3)
H-(X-Y-Gly) n-OH (1)
H-(Gly-X-Y) n-OH (2)
H- (Y-Gly-X) n-OH (3)
(In the formulas (1) to (3), X and Y each independently represent Hyp or Pro, and n is an integer of 1 to 10).
Or at least one peptide oligomer represented by the formulas (1) to (3), and the following formulas (4) to (10):
H − (Z 1 ) − OH (4)
In the formula (4), Z 1 represents Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Hyp, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr Represents an amino acid residue, a peptide oligomer residue or a peptide residue selected from the group consisting of: Val, Arg-Gly-Asp, and ε-polylysine.
H- (Pro-Lys-Gly) p-OH (5)
H- (Gly-Pro-Lys) p-OH (6)
H- (Lys-Gly-Pro) p-OH (7)
(In the formulas (5) to (7), p is an integer of 1 to 10)
H - (Z 2 -Hyp-Gly ) r- OH (8)
H - (Gly-Z 2 -Hyp ) r- OH (9)
H − (Hyp-Gly-Z 2 ) r-OH (10)
(In the formulas (8) to (10), Z 2 represents Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr And an amino acid residue selected from the group consisting of and Val, and r is an integer of 1 to 10.)
At least one amino acid represented by, a peptide oligomer, or a peptide,
A polypeptide having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,500,000 in which at least a portion forms or can form a triple helix structure by condensation reaction in an aqueous solvent adjusted to pH 3 to 10 using an organic base A process for producing a polypeptide comprising the steps of
原料
本発明方法では、上記式（１）で表されるペプチドオリゴマー、上記式（２）で表されるペプチドオリゴマー、及び／又は上記式（３）で表されるペプチドオリゴマーが必須の原料である。式（１）、（２）、及び（３）中のＸとＹの組み合わせとしては、一方がＨｙｐで他方がＰｒｏである組み合わせ、双方がＨｙｐである組み合わせ、双方がＰｒｏである組み合わせがある。少なくとも一方がＨｙｐであれば、得られるペプチドの親水性が向上し、例えば、保水性が求められるバイオマテリアル、例えば、化粧品原料などに好適に応用できる。双方がＨｙｐであってもよい。 Materials In the method of the present invention, the peptide oligomer represented by the above formula (1), the peptide oligomer represented by the above formula (2), and / or the peptide oligomer represented by the above formula (3) are essential ingredients . As combinations of X and Y in formulas (1), (2) and (3), there is a combination in which one is Hyp and the other is Pro and a combination in which both are Hyp and a combination in which both are Pro. If at least one is Hyp, the hydrophilicity of the obtained peptide is improved, and it can be suitably applied to, for example, biomaterials for which water retention is required, such as cosmetic raw materials. Both may be Hyp.
式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーは、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。２種以上のペプチドオリゴマーを用いるときは、得られるポリペプチドが３重らせん構造をとり易くなるように、又は得られるポリペプチド中の３重らせん構造の部分を長くするために、式（１）〜（３）のペプチドオリゴマーの合計量に対して、Ｇｌｙの位置が同じであるペプチドオリゴマーを３５〜１００モル％、中でも５０〜１００モル％、中でも７０〜１００モル％、中でも８０〜１００モル％、中でも９０〜１００モル％用いることが好ましい。例えば、式（１）に包含されるペプチドオリゴマーはＧｌｙが３番目に存在する点で、Ｇｌｙの位置が同じであるペプチドオリゴマーである。式（２）に包含されるペプチドオリゴマー、及び式（３）に包含されるペプチドオリゴマーも同様である。式（１）に包含されるペプチドオリゴマー、式（２）に包含されるペプチドオリゴマー、又は式（３）に包含されるペプチドオリゴマーだけを用いることが最も好ましい。
式（１）、（２）、及び（３）において、ｎは、１〜５が好ましく、１〜３がより好ましい。また、ｎは、１、又は２であってもよい。The peptide oligomer represented by Formula (1)-(3) can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types. When two or more types of peptide oligomers are used, the formula (1) is used to facilitate formation of a triplex structure in the resulting polypeptide, or to lengthen a portion of the triplex structure in the resulting polypeptide. The total amount of peptide oligomers in (3) is 35 to 100 mol%, in particular 50 to 100 mol%, in particular 70 to 100 mol%, in particular 80 to 100 mol%, of the peptide oligomers having the same position of Gly. It is preferable to use 90-100 mol% among them. For example, the peptide oligomer included in the formula (1) is a peptide oligomer in which the position of Gly is the same in that Gly is present at the third position. The same applies to the peptide oligomer included in Formula (2) and the peptide oligomer included in Formula (3). It is most preferred to use only the peptide oligomers encompassed by Formula (1), the peptide oligomers encompassed by Formula (2), or the peptide oligomers encompassed by Formula (3).
In formulas (1), (2), and (3), n is preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3. Also, n may be 1 or 2.
また、本発明方法では、式（１）〜（３）で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマーに加えて、他のアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドを用いてもよい。他のアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドとしては、例えば、上記式（４）〜（１０）で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドが挙げられる。式（４）〜（１０）で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドは、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
式（４）〜（１０）で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドのうち、ポリペプチドを架橋して架橋ポリペプチドとする場合に反応点となり易い点で、極性アミノ酸が好ましく、酸性の極性アミノ酸又は塩基性の極性アミノ酸がより好ましく、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓがさらにより好ましい。
また、架橋ポリペプチドとする場合に反応点となりやすい点では、式（５）〜（７）のペプチドオリゴマー、又は式（８）〜（１０）においてＺ２がＧｌｕであるペプチドオリゴマーが好ましく、ポリペプチドの疎水性を調整できる点では式（８）〜（１０）においてＺ２がＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＩｌｅであるペプチドオリゴマーが好ましい。
また、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐは細胞接着活性配列であるＲＧＤモチーフであるため、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを用いることにより、得られるポリペプチドに細胞の接着生存促進作用などを付与できることが期待される。
式（４）中のε-ポリリジンは、特に限定されないが、例えば、約２５〜３０個のＬ−Ｌｙｓからなり、食品防腐剤などとして市販されているε-ポリリジンを用いることができる。In the method of the present invention, other amino acids, peptide oligomers or peptides may be used in addition to at least one peptide oligomer represented by formulas (1) to (3). As another amino acid, peptide oligomer, or peptide, the amino acid, peptide oligomer, or peptide represented by said Formula (4)-(10) is mentioned, for example. The amino acids, peptide oligomers or peptides represented by formulas (4) to (10) can be used alone or in combination of two or more.
Among the amino acids, peptide oligomers or peptides represented by the formulas (4) to (10), polar amino acids are preferred in that they are likely to be reactive points when the polypeptide is crosslinked to form a crosslinked polypeptide, and acidic polar Amino acids or basic polar amino acids are more preferred, Asp, Glu, Lys are even more preferred.
In addition, from the viewpoint of being likely to be a reaction point when forming a crosslinked polypeptide, peptide oligomers of formulas (5) to (7), or peptide oligomers in which Z 2 is Glu in formulas (8) to (10) are preferred. From the viewpoint of being able to adjust the hydrophobicity of the peptide, preferred is a peptide oligomer wherein Z 2 in the formulas (8) to (10) is Ala, Val, Leu or Ile.
In addition, since Arg-Gly-Asp is an RGD motif that is a cell adhesion activity sequence, it is expected that use of Arg-Gly-Asp can impart an adhesion survival promoting effect on cells to the obtained polypeptide.
Although ε-polylysine in the formula (4) is not particularly limited, for example, ε-polylysine which consists of about 25 to 30 L-Lys and which is commercially available as a food preservative or the like can be used.
また、式（４）中のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及び式（５）〜（１０）で表されるペプチドオリゴマーからなる群より選ばれるペプチドオリゴマーを２種以上用いるときは、得られるポリペプチドが３重らせん構造をとり易くなるように、又は得られるポリペプチド中の３重らせん構造の部分を長くするために、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及び式（５）〜（１０）のペプチドオリゴマーの合計量に対して、Ｇｌｙの位置が同じであるペプチドオリゴマーを３５〜１００モル％、中でも５０〜１００モル％、中でも７０〜１００モル％、中でも８０〜１００モル％、中でも９０〜１００モル％、中でも１００モル％用いることが好ましい。例えば、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐと、式（７）のペプチドオリゴマーと、式（１０）のペプチドオリゴマーとは、Ｇｌｙの位置が同じであるため、これらから選択されるペプチドオリゴマーの比率を上記範囲にすることが好ましい。また、式（５）のペプチドオリゴマーと、式（８）のペプチドオリゴマーはＧｌｙの位置が同じであり、式（６）のペプチドオリゴマーと、式（９）のペプチドオリゴマーはＧｌｙの位置が同じである。 In addition, when two or more peptide oligomers selected from the group consisting of Arg-Gly-Asp in formula (4) and peptide oligomers represented by formulas (5) to (10) are used, the obtained polypeptide is A total of Arg-Gly-Asp and a peptide oligomer of the formulas (5) to (10) so as to facilitate formation of a triple helix structure or to lengthen the triple helix structure in the resultant polypeptide 35-100 mol%, in particular 50-100 mol%, in particular 70-100 mol%, in particular 80-100 mol%, in particular 90-100 mol%, of the peptide oligomers having the same position of Gly relative to the amount It is preferable to use 100 mol%. For example, since Arg-Gly-Asp, the peptide oligomer of the formula (7) and the peptide oligomer of the formula (10) have the same position of Gly, the ratio of peptide oligomers selected therefrom is within the above range It is preferable to do. Moreover, the peptide oligomer of Formula (5) and the peptide oligomer of Formula (8) have the same position of Gly, and the peptide oligomer of Formula (6) and the peptide oligomer of Formula (9) have the same position of Gly. is there.
式（４）中のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及び式（５）〜（１０）で表されるペプチドオリゴマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドオリゴマーを用いるときは、さらに、式（１）、式（２）、及び／又は式（３）のペプチドオリゴマーも含む全ペプチドオリゴマーについて、Ｇｌｙの位置が同じであるペプチドオリゴマーを多くすることが好ましい。全ペプチドオリゴマー量に対する、Ｇｌｙの位置が同じであるペプチドオリゴマーの使用量は、３５〜１００モル％、中でも５０〜１００モル％、中でも７０〜１００モル％、中でも８０〜１００モル％、中でも９０〜１００モル％、中でも１００モル％が好ましい。例えば、式（１）で表されるペプチドオリゴマーと、式（５）で表されるペプチドオリゴマー、及び／又は式（８）で表されるペプチドオリゴマーとを組み合わせることが好ましい。 When at least one peptide oligomer selected from the group consisting of Arg-Gly-Asp in formula (4) and peptide oligomers represented by formulas (5) to (10) is used, formula (1) is further used. It is preferable to increase the number of peptide oligomers in which the position of Gly is the same among all the peptide oligomers including the peptide oligomers of formula (2) and / or formula (3). The amount of peptide oligomer having the same position of GIy relative to the total amount of peptide oligomer is 35 to 100 mol%, especially 50 to 100 mol%, especially 70 to 100 mol%, especially 80 to 100 mol%, especially 90 to 90 mol%. 100 mol%, preferably 100 mol% is preferred. For example, it is preferable to combine the peptide oligomer represented by Formula (1) with the peptide oligomer represented by Formula (5) and / or the peptide oligomer represented by Formula (8).
式（４）〜（１０）で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドを用いる場合のその合計使用量は、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーの合計量の１ｍｏｌに対して、０．００１ｍｏｌ以上、０．００２ｍｏｌ以上、０．０１ｍｏｌ以上、０．０２ｍｏｌ以上、又は０．０５ｍｏｌ以上とすることができる。この範囲であれば、用途に応じて得られるポリペプチドの反応性を調整する等の分子設計を行うことができる。
また、５ｍｏｌ以下、３ｍｏｌ以下、２ｍｏｌ以下、又は１ｍｏｌ以下とすることができる。この範囲であれば、得られるペプチドが三重らせんを形成し易くなる。The total amount of use of the amino acids, peptide oligomers, or peptides represented by formulas (4) to (10) is 1 mol of the total amount of peptide oligomers represented by formulas (1) to (3). Thus, the amount can be 0.001 mol or more, 0.002 mol or more, 0.01 mol or more, 0.02 mol or more, or 0.05 mol or more. Within this range, molecular design can be performed such as adjusting the reactivity of the polypeptide obtained depending on the application.
Further, it can be 5 mol or less, 3 mol or less, 2 mol or less, or 1 mol or less. Within this range, the resulting peptide is likely to form a triple helix.
式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマー、及び式（４）〜（１０）で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドは、塩の形態で縮合反応に供することができ、これにより、反応が一層円滑に進行する。
これら原料のアミノ基部分の塩としては、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、フタル酸塩、クエン酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、マンデル酸塩、グルタル酸塩、リンゴ酸塩、安息香酸塩、フタル酸塩、アスコルビン酸塩のような有機酸塩；炭酸塩、炭酸水素塩、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩のような無機酸塩などが挙げられる。
また、カルボキシル基部分の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；亜鉛塩；鉄塩；アンモニウム塩、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ｔ−ブチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ジメチルアンモニウム塩、ベンジルアミン塩、ピリジン塩、メチルピリジン（ピコリン）塩、キノリン塩、イソキノリン塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩のようなアミン塩などが挙げられる。
中でも、アミノ基部分の塩が好ましく、有機酸塩がより好ましく、塩酸塩、トリフルオロ酢酸塩がさらにより好ましく、トリフルオロ酢酸塩がさらにより好ましい。The peptide oligomer represented by the formulas (1) to (3) and the amino acid, peptide oligomer or peptide represented by the formulas (4) to (10) can be subjected to a condensation reaction in the form of a salt, The reaction progresses more smoothly.
As salts of the amino group portion of these raw materials, formate, acetate, trifluoroacetate, phthalate, citrate, propionate, lactate, tartrate, oxalate, maleate, fumaric acid Organic salts such as salts, mandelic salts, glutarates, malates, benzoates, phthalates, ascorbates; carbonates, hydrogencarbonates, hydrochlorides, sulfates, phosphates, nitrates And inorganic acid salts such as
Further, as salts of carboxyl group portion, alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; zinc salt; iron salt; ammonium salt, trimethylamine salt and triethylamine salt , Tetramethylammonium salt, tetraethylammonium salt, tetrabutylammonium salt, ethanolamine salt, diethanolamine salt, triethanolamine salt, t-butylamine salt, dicyclohexylamine salt, dimethylammonium salt, benzylamine salt, pyridine salt, methylpyridine ( Picolin) salts, quinoline salts, isoquinoline salts, benzyltrimethyl ammonium salts, benzyl triethyl ammonium salts, benzyl tributyl ammonium salts, and amino acids such as methyl trioctyl ammonium salts Salt and the like.
Among them, salts of amino group moieties are preferred, organic acid salts are more preferred, hydrochlorides and trifluoroacetates are even more preferred, and trifluoroacetates are even more preferred.
水系溶媒
水系溶媒としては、好ましくは、水を用いる。また、有機溶媒を含む水であってもよい。この場合、有機溶媒の含有量は、水系溶媒の全量に対して、５０容量％以下が好ましく、２５容量％以下がより好ましく、１０容量％以下がさらにより好ましく、５容量％以下がさらにより好ましい。
有機溶媒の種類は、水と混和するものであればよく、例えば、ジメチルホルムアミド、ジエチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチルウレア、ヘキサメチルホスホロアミドのようなアミド系溶媒；エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリンのような多価アルコール系溶媒；ジメチルスルホキシドのようなスルホキシド系溶媒；Ｎ−メチルピロリドン、ピリジンのような窒素含有環状化合物系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルのようなニトリル系溶媒；ジオキサン、テトラヒドロフランのようなエーテル系溶媒；メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコールのようなアルコール系溶媒；ギ酸、酢酸のようなカルボン酸系溶媒などが挙げられる。
有機溶媒は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
なお、水系溶媒は、縮合反応に関与しない成分や縮合反応を阻害しない成分であれば含んでいてもよいが、リン酸イオンを含まない水系溶媒とすることができる。 Aqueous Solvent As the aqueous solvent, water is preferably used. In addition, it may be water containing an organic solvent. In this case, the content of the organic solvent is preferably 50% by volume or less, more preferably 25% by volume or less, still more preferably 10% by volume or less, still more preferably 5% by volume or less based on the total amount of the aqueous solvent .
The type of the organic solvent may be any one miscible with water, for example, amide solvents such as dimethylformamide, diethylformamide, dimethylacetamide, tetramethylurea, tetramethylurea and hexamethylphosphoroamide; ethylene glycol, propylene glycol, diethylene glycol Polyhydric alcohol solvents such as dipropylene glycol and glycerin; sulfoxide solvents such as dimethyl sulfoxide; nitrogen-containing cyclic compound solvents such as N-methyl pyrrolidone and pyridine; nitrile compounds such as acetonitrile and propionitrile Solvents: ether solvents such as dioxane and tetrahydrofuran; alcohol solvents such as methanol, ethanol, propyl alcohol and isopropyl alcohol; carboxylic acid solvents such as formic acid and acetic acid Etc., and the like.
The organic solvents may be used alone or in combination of two or more.
The aqueous solvent may contain any component that does not participate in the condensation reaction or a component that does not inhibit the condensation reaction, but can be an aqueous solvent that does not contain phosphate ions.
縮合剤・縮合助剤
本発明において、脱水縮合反応によるペプチドの合成は、液相合成、固相合成の何れでも行える。低コストで大量合成を行える点では、液相合成が好ましい。
何れの場合も、脱水縮合反応は、通常、縮合剤の存在下、又は縮合剤と縮合助剤の存在下で行えばよい。縮合助剤を使用することにより、縮合反応が促進され、かつ、ラセミ化が抑制される。 Condensing Agent / Condensing Auxiliary Agent In the present invention, the synthesis of the peptide by the dehydration condensation reaction can be either liquid phase synthesis or solid phase synthesis. Liquid phase synthesis is preferred in that low-cost mass synthesis can be performed.
In any case, the dehydration condensation reaction may be carried out usually in the presence of a condensing agent or in the presence of a condensing agent and a condensation auxiliary. By using a condensation aid, the condensation reaction is promoted and racemization is suppressed.
縮合剤は、水系溶媒中で脱水縮合を行えるものであればよく、例えば、１-［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド（ＷＳＣＤ（ＥＤＣ））、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＤ・ＨＣｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ＣＭＥ-カルボジイミド）のようなカルボジイミド系縮合剤；Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールのようなイミダゾール系縮合剤；４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホニウム・クロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）、トリフルオロメタンスルホン酸（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）-(２−オクトキシ−２−オキソエチル）ジメチルアンモニウム（ＤＭＴ-ＭＭ）のようなトリアジン系縮合剤；{{[（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデン）アミノ]オキシ}−４−モルホリノメチレン}ジメチルアンモニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、クロロトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＣｌｏＰ）のようなフルオロホスフェート系縮合剤；Ｏ−（７−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩（ＴＳＴＵ）、Ｏ−（３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩（ＴＤＢＴＵ）のようなフルオロホウ酸塩系縮合剤；ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）などが挙げられる。
中でも、カルボジイミド系縮合剤が好ましく、ＷＳＣＤ、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ、ＤＣＣ、ＤＩＣがより好ましい。
縮合剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。The condensing agent may be any one capable of dehydration condensation in an aqueous solvent, for example, 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide (WSCD (EDC)), 1-ethyl-3-hydrochloride (3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide (WSCD.HCl), N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC), N-cyclohexyl-N '-(2-morpholinoethyl) carbodiimide Carbodiimide-based condensing agents such as met-p-toluenesulfonate (CME-carbodiimide); imidazole-based condensing agents such as N, N'-carbonyldiimidazole; 4- (4,6-dimethoxy-1,3, 5-Triazin-2-yl) -4-methylmorphonium chloride n-hydrate (DMT-MM) Triazine-based condensing agents such as trifluoromethanesulfonic acid (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-(2-octoxy-2-oxoethyl) dimethylammonium (DMT-MM); {{ [(1-Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidene) amino] oxy} -4-morpholinomethylene} dimethyl ammonium hexafluorophosphate (COMU), O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), O- (7-azabenzotriazol-1-yl-N, N, N', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate ( HATU), 1H-benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophore Fluorophosphate-based condensing agents such as sulfate, 1H-benzotriazol-1-yl-oxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP), chlorotripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyCloP); O- (7-succinimidyl ) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TSTU), O- (3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-yl) Fluoroborate-based condensing agents such as N-N, N, N ', N'- tetramethyluronium tetrafluoroborate (TDBTU); diphenylphosphoryl azide (DPPA) and the like.
Among them, carbodiimide type condensing agents are preferable, and WSCD, WSCD.HCl, DCC and DIC are more preferable.
The condensing agent can be used singly or in combination of two or more.
縮合剤の使用量は、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーの合計の１ｍｏｌに対して、０．１ｍｏｌ以上、０．２ｍｏｌ以上、０．３ｍｏｌ以上、０．５ｍｏｌ以上、又は１ｍｏｌ以上とすることができる。この範囲であれば、実用上十分な速度で反応が進行する。また、２０ｍｏｌ以下、１５ｍｏｌ以下、１０ｍｏｌ以下、８ｍｏｌ以下、又は６ｍｏｌ以下とすることができる。この範囲であれば、過重合を回避できる。 The amount of the condensing agent used is 0.1 mol or more, 0.2 mol or more, 0.3 mol or more, 0.5 mol or more, or 1 mol of the total of the peptide oligomers represented by the formulas (1) to (3) It can be 1 mol or more. Within this range, the reaction proceeds at a rate sufficient for practical use. Further, it can be 20 mol or less, 15 mol or less, 10 mol or less, 8 mol or less, or 6 mol or less. Within this range, overpolymerization can be avoided.
また、原料として、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーに加えて、式（４）〜（１０）で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドを用いる場合は、縮合剤の使用量は、これら原料化合物の合計の１ｍｏｌに対して、０．１ｍｏｌ以上、０．２ｍｏｌ以上、０．３ｍｏｌ以上、０．５ｍｏｌ以上、又は１ｍｏｌ以上とすることができ、また、２０ｍｏｌ以下、１５ｍｏｌ以下、１０ｍｏｌ以下、８ｍｏｌ以下、又は６ｍｏｌ以下とすることができる。この範囲であれば、実用上十分な速度で反応が進行すると共に、過重合を回避できる。 Moreover, in addition to the peptide oligomer represented by Formula (1)-(3) as a raw material, when using the amino acid, peptide oligomer, or peptide represented by Formula (4)-(10), The amount used can be 0.1 mol or more, 0.2 mol or more, 0.3 mol or more, 0.5 mol or more, or 1 mol or more, relative to 1 mol of the total of these raw material compounds, and 20 mol or less, 15 mol or less Hereinafter, it can be 10 mol or less, 8 mol or less, or 6 mol or less. Within this range, the reaction proceeds at a practically sufficient speed, and overpolymerization can be avoided.
縮合助剤は、縮合反応を促進するものであればよく、例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＮＳｕ）、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）のようなＮ−ヒドロキシジカルボン酸イミド（Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類）系縮合助剤；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシアザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）のようなＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール系縮合助剤；３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯｂｔ）のようなトリアジン系縮合助剤；２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステルなどが挙げられる。
中でも、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール系縮合助剤が好ましく、ＨＯＢｔがより好ましい。
縮合助剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。The condensation aid may be any one that promotes the condensation reaction, for example, N such as N-hydroxysuccinimide (HONSu), N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide (HONB) -Hydroxydicarboxylic acid imide (N-hydroxy polyvalent carboxylic acid imides) type condensation aid; N-hydroxybenzotriazole type condensation aid such as 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 1-hydroxyazabenzotriazole (HOAt) Triazine-based condensation aids such as 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazine (HOObt); 2-hydroxyimino-2-cyanoacetic acid ethyl ester and the like Be
Among them, N-hydroxybenzotriazole condensation assistants are preferable, and HOBt is more preferable.
The condensation assistants may be used alone or in combination of two or more.
縮合助剤の使用量は、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーの合計の１ｍｏｌに対して、０．００１ｍｏｌ以上、０．００２ｍｏｌ以上、０．０１ｍｏｌ以上、０．０２ｍｏｌ以上、又は０．１ｍｏｌ以上とすることができる。この範囲であれば、実用上十分な速度で反応が進行し、ポリペプチドのラセミ化を抑制することができる。また、１０ｍｏｌ以下、８ｍｏｌ以下、５ｍｏｌ以下、２ｍｏｌ以下、又は１ｍｏｌ以下とすることができる。この範囲であれば、水系溶媒に均一に溶解させて、助剤として機能させることができる。 The amount of the condensation aid used is 0.001 mol or more, 0.002 mol or more, 0.01 mol or more, 0.02 mol or more, per 1 mol of the total of the peptide oligomers represented by the formulas (1) to (3). Or it can be 0.1 mol or more. Within this range, the reaction proceeds at a rate sufficient for practical use, and racemization of the polypeptide can be suppressed. Further, it can be 10 mol or less, 8 mol or less, 5 mol or less, 2 mol or less, or 1 mol or less. Within this range, it can be uniformly dissolved in an aqueous solvent to function as an auxiliary.
また、原料として、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーに加えて、式（４）〜（１０）で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドを用いる場合は、縮合助剤の使用量は、これら原料化合物の合計の１ｍｏｌに対して、０．００１ｍｏｌ以上、０．００２ｍｏｌ以上、０．０１ｍｏｌ以上、０．０２ｍｏｌ以上、又は０．１ｍｏｌ以上とすることができる。この範囲であれば、実用上十分な速度で反応が進行し、ポリペプチドのラセミ化を抑制することができる。また、１０ｍｏｌ以下、８ｍｏｌ以下、５ｍｏｌ以下、２ｍｏｌ以下、又は１ｍｏｌ以下とすることができる。この範囲であれば、水系溶媒に均一に溶解させて、助剤として機能させることができる。 Moreover, in addition to the peptide oligomer represented by Formula (1)-(3) as a raw material, when using the amino acid, peptide oligomer, or peptide represented by Formula (4)-(10), a condensation adjuvant is used. The use amount of can be 0.001 mol or more, 0.002 mol or more, 0.01 mol or more, 0.02 mol or more, or 0.1 mol or more with respect to 1 mol of the total of these raw material compounds. Within this range, the reaction proceeds at a rate sufficient for practical use, and racemization of the polypeptide can be suppressed. Further, it can be 10 mol or less, 8 mol or less, 5 mol or less, 2 mol or less, or 1 mol or less. Within this range, it can be uniformly dissolved in an aqueous solvent to function as an auxiliary.
ｐＨ調整
縮合反応を行う水系溶媒のｐＨは、約３〜１０に調整する。水系溶媒のｐＨは、約４以上、約５以上、又は約６以上とすることもできる。また、約９以下、約８以下、又は約７以下とすることもできる。
このｐＨは、ペプチドオリゴマー、又はさらにアミノ酸、ペプチドを含む原料に有機塩基を加えた後、縮合剤又はさらに縮合助剤を添加する前の反応液のｐＨを指す。即ち、有機塩基で中和した時の反応液のｐＨを指す。 The pH of the aqueous solvent in which the pH adjustment condensation reaction is performed is adjusted to about 3-10. The pH of the aqueous solvent can also be about 4 or more, about 5 or more, or about 6 or more. Also, it may be about 9 or less, about 8 or less, or about 7 or less.
This pH refers to the pH of the reaction solution before adding the condensing agent or further the condensation assistant after adding the organic base to the peptide oligomer, or the amino acid and the raw material containing the peptide. That is, it indicates the pH of the reaction solution when it is neutralized with an organic base.
本発明方法では、有機塩基を用いてｐＨを調整する。これにより、縮合反応を過不足なく安定して進行させることができ、構造を解析できるコラーゲン様ポリペプチドを効率良く得ることができる。
有機塩基は、縮合反応に関与しないもの、即ち、得られるペプチドに取り込まれないものであればよく、例えば、脂肪族アミン類（メチルアミン、エチルアミンのような第一級アミン；ジメチルアミン、ジエチルアミンのような第二級アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンのような第三級アミン）；芳香族アミン類（アニリン、トルイジンのような第一級アミンなど）；複素環式アミン類（ピロリジン、ピペリジン、モルホリンのような第二級アミン；ピペラジンのような第二級ジアミン；ピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン（コリジン）、２，６−ルチジン、キノリン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリンのような第三級アミンなど）；アルカノールアミン（モノエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、３−アミノ−１，２−プロパンジオール、３−ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオール、トリス(ヒドロキシメチルアミノ)メタンのような第一級アミン；ジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミンのような第二級アミン；トリエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン、Ｎ−ジメチルアミノエタノールのような第三級アミン）などが挙げられる。
中でも、第三級アミンが好ましく、脂肪族第三級アミン、複素環式第三級アミンがより好ましく、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリンがさらにより好ましい。
有機塩基は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。In the process of the invention, the pH is adjusted using an organic base. Thereby, the condensation reaction can be stably advanced without excess and deficiency, and a collagen like polypeptide whose structure can be analyzed can be efficiently obtained.
The organic base may be one which does not participate in the condensation reaction, ie, one which is not incorporated into the resulting peptide, for example, aliphatic amines (primary amines such as methylamine and ethylamine; dimethylamine and diethylamine) Secondary amines such as: trimethylamine, triethylamine, tripropylamine, tributylamine, tertiary amines such as diisopropylethylamine); aromatic amines (eg, primary amines such as aniline and toluidine); heterocyclic Amines (secondary amines such as pyrrolidine, piperidine, morpholine; secondary diamines such as piperazine; pyridine, 2,4,6-trimethylpyridine (collidine), 2,6-lutidine, quinoline, N-methyl Morpholine, tertiary amines such as N-ethylmorpholine, etc.); Lucanolamine (monoethanolamine, monoisopropanolamine, 2-amino-2-methyl-1-propanol, 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol, 3-amino-1,2-propanediol, 3 -Dimethylamino-1,2-propanediol, primary amines such as tris (hydroxymethylamino) methane; secondary amines such as diethanolamine, diisopropanolamine; triethanolamine, triisopropanolamine, N-dimethyl And tertiary amines such as aminoethanol).
Among them, tertiary amines are preferable, aliphatic tertiary amines and heterocyclic tertiary amines are more preferable, and triethylamine and N-methylmorpholine are even more preferable.
The organic bases can be used alone or in combination of two or more.
その他の反応条件
縮合反応において、原料濃度、即ち、水系溶媒中の式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーの濃度、又は式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーと式（４）〜（１０）で表されるアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドとの合計の濃度は、水系溶媒の全量に対して、１重量％以上、３重量％以上、５重量％、又は１０重量％以上とすることができる。この範囲であれば、実用上十分な速度で反応が進行する。また、７０重量％以下、６０重量％以下、５０重量％以下、４０重量％以下、３０重量以下、又は２０重量以下とすることができる。この範囲であれば、過重合を回避できる。 Other Reaction Conditions In the condensation reaction, the raw material concentration, ie, the concentration of the peptide oligomer represented by the formulas (1) to (3) in the aqueous solvent, or the peptide oligomer represented by the formulas (1) to (3) The total concentration of amino acids, peptide oligomers, or peptides represented by formulas (4) to (10) is 1% by weight or more, 3% by weight or more, 5% by weight, or 10% of the total amount of the aqueous solvent. It can be at least by weight. Within this range, the reaction proceeds at a rate sufficient for practical use. In addition, 70% by weight or less, 60% by weight or less, 50% by weight or less, 40% by weight or less, 30% by weight or less, or 20% by weight or less. Within this range, overpolymerization can be avoided.
反応温度は、−１０℃以上、−５℃以上、０℃以上、又は１０℃以上とすることができる。また、８０℃以下、７０℃以下、６０℃以下、５０℃以下、４０℃以下、又は３０℃以下とすることができる。この範囲であれば、縮合反応が効率よく進行する。
また、反応時間は、原料、縮合剤、縮合助剤、及び水系溶媒の種類や使用量、水系溶媒のｐＨなどによって異なるが、例えば、１時間以上、２時間以上、又は５時間以上とすることができ、また、１００時間以下、９０時間以下、８０時間以下、７０時間以下、６０時間以下、５０時間以下、４０時間以下、３０時間以下、又は２０時間以下とすることができる。The reaction temperature can be −10 ° C. or more, −5 ° C. or more, 0 ° C. or more, or 10 ° C. or more. Further, the temperature can be set to 80 ° C. or less, 70 ° C. or less, 60 ° C. or less, 50 ° C. or less, 40 ° C. or less, or 30 ° C. or less. Within this range, the condensation reaction proceeds efficiently.
The reaction time varies depending on the type and amount of the raw material, the condensing agent, the condensation aid, and the aqueous solvent, the pH of the aqueous solvent, etc. In addition, it can be 100 hours or less, 90 hours or less, 80 hours or less, 70 hours or less, 60 hours or less, 50 hours or less, 40 hours or less, 30 hours or less, or 20 hours or less.
精製
縮合反応による生成物には、通常、目的とするポリペプチドの他に、反応に用いた試薬や微量の未反応原料が残存している。従って、透析、限外ろ過、カラムクロマトグラフィーなどにより、目的ポリペプチドを精製することが望ましい。
また、ポリペプチドは、凍結乾燥などにより粉体とすれば、保存時の取り扱いが容易になり、また、その後の加工に使用し易くなる。
或いは、ポリペプチドを保存溶媒中で保存することもでき、これによりポリペプチドの構造が安定に保たれる。保存溶媒としては、水、生理食塩水、ｐＨ５〜８程度の緩衝液などが挙げられる。 In the purified condensation reaction product, usually, the reagent used for the reaction and a small amount of unreacted raw material remain in addition to the target polypeptide. Therefore, it is desirable to purify the target polypeptide by dialysis, ultrafiltration, column chromatography and the like.
In addition, when the polypeptide is made into powder by lyophilization etc., handling at the time of storage becomes easy, and it becomes easy to use for subsequent processing.
Alternatively, the polypeptide can be stored in a storage solvent, which keeps the structure of the polypeptide stable. As a preservation | save solvent, water, physiological saline, the buffer solution of pH about 5-8, etc. are mentioned.
（ＩＩ）ペプチド
本発明のポリペプチドは、少なくとも一部が三重らせん構造を形成可能であり、重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチドである。
下記式（１１）
― （ Ｘ − Ｙ − Ｇｌｙ ） ｍ ― （１１）
（式（１１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｍは、１０〜３６００の整数である。）
で表される少なくとも１種のユニットを有する場合、本発明のポリペプチドは少なくとも一部分が三重らせん構造を形成することができる。
式（１１）中、ｍは、１５以上、３０以上、１００以上、又は５００以上とすることができる。また、３５００以下、３０００以下、２０００以下、又は１０００以下とすることができる。 (II) Peptide The polypeptide of the present invention is a polypeptide capable of forming a triple helix structure at least partially and having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,500,000.
Following formula (11)
-(X-Y-Gly) m-(11)
(In the formula (11), X and Y each independently represent Hyp or Pro, and m is an integer of 10 to 3600.)
When having at least one type of unit represented by, the polypeptide of the present invention can form a triple helix structure at least partially.
In formula (11), m can be 15 or more, 30 or more, 100 or more, or 500 or more. Further, it can be 3500 or less, 3000 or less, 2000 or less, or 1000 or less.
また、上記式（１１）で表される少なくとも１種のユニットに加えて、下記式（１２）〜（１４）
― （ Ｚ１ ） ｌ ― （１２）
（式（１２）中、Ｚ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表し、ｌは、１〜３６０の整数である。）
― （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｑ― （１３）
（式（１３）中、ｑは１〜３６０の整数である。）
― （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｓ― （１４）
（式（１４）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｓは１〜３６０の整数である。）
で表される少なくとも１種のユニット（以下、「任意ユニット」と称することもある。）を有する場合もある。
式（１２）、（１３）及び（１４）中、ｌ、ｑ及びｓは、３以上、５以上、１０以上、又は２０以上とすることができる。また、３００以下、２５０以下、２００以下、又は１５０以下とすることができる。Moreover, in addition to at least 1 type of unit represented by the said Formula (11), following formula (12)-(14)
― (Z 1 ) l ― (12)
In the formula (12), Z 1 represents Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Hyp, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr , An amino acid residue selected from the group consisting of: Val, Arg-Gly-Asp, and ε-polylysine, a peptide oligomer residue, or a peptide residue, and l is an integer of 1 to 360.)
-(Pro-Lys-Gly) q- (13)
(In the formula (13), q is an integer of 1 to 360.)
- (Z 2 -Hyp-Gly) s- (14)
(In the formula (14), Z 2 is selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, and Val Represents an amino acid residue selected from the group consisting of: s is an integer of 1 to 360)
There may be a case where at least one type of unit represented by (hereinafter, may be referred to as "optional unit").
In formulas (12), (13) and (14), l, q and s can be 3 or more, 5 or more, 10 or more, or 20 or more. Moreover, it can be 300 or less, 250 or less, 200 or less, or 150 or less.
任意ユニットを有する場合のその合計含有比率は、式（１１）で表されるユニットの合計の１ｍｏｌに対して、０．００１ｍｏｌ以上、０．００２ｍｏｌ以上、０．０１ｍｏｌ以上、０．０２ｍｏｌ以上、又は０．０５ｍｏｌ以上とすることができ、また、５ｍｏｌ以下、３ｍｏｌ以下、２ｍｏｌ以下、又は１ｍｏｌ以下とすることができる。本発明のポリペプチドがこの任意ユニットを有する場合、上記式（１１）で表されるユニットと任意ユニットを交互に有することもできる。 The total content ratio when having an optional unit is 0.001 mol or more, 0.002 mol or more, 0.01 mol or more, 0.02 mol or more, or 1 mol of the total of the units represented by the formula (11) It can be 0.05 mol or more, and can be 5 mol or less, 3 mol or less, 2 mol or less, or 1 mol or less. When the polypeptide of the present invention has this optional unit, it is possible to alternate between the unit represented by the above formula (11) and the optional unit.
本発明は、
下記式（１５）
― （ Ｈｙｐ − Ｈｙｐ − Ｇｌｙ ） ｍ ― （１５）
（式（１５）中、ｍは１０〜３６００の整数である。）
で表されるユニットを有し、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチドを包含する。
式（１５）中、ｍは、１５以上、３０以上、１００以上、又は５００以上とすることができる。また、３５００以下、３０００以下、２０００以下、又は１０００以下とすることができる。The present invention
Following formula (15)
-(Hyp-Hyp-Gly) m-(15)
(In the formula (15), m is an integer of 10 to 3600.)
And a polypeptide having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,500,000, at least a portion of which can form a triple helix structure.
In Formula (15), m can be 15 or more, 30 or more, 100 or more, or 500 or more. Further, it can be 3500 or less, 3000 or less, 2000 or less, or 1000 or less.
また、本発明は、上記式（１５）で表されるユニットと、下記式（１２）〜（１４）
― （ Ｚ１ ） ｌ ― （１２）
（式（１２）中、Ｚ１はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表し、ｌは、１〜３６０の整数である。）
― （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｑ― （１３）
（式（１３）中、ｑは１〜３６０の整数である。）
― （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｓ― （１４）
（式（１４）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｓは１〜３６０の整数である。）
で表される少なくとも１種の任意ユニットとを有するポリペプチドであって、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチドを包含する。
式（１２）、（１３）、及び（１４）中、ｌ、ｑ、及びｓは、３以上、５以上、１０以上、又は２０以上とすることができる。また、３００以下、２５０以下、２００以下、又は１５０以下とすることができる。Further, the present invention provides a unit represented by the above formula (15) and the following formulas (12) to (14)
― (Z 1 ) l ― (12)
In the formula (12), Z 1 represents Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Hyp, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Represents an amino acid residue, a peptide oligomer residue or a peptide residue selected from the group consisting of Val, Arg-Gly-Asp, and ε-polylysine, and l is an integer of 1 to 360.)
-(Pro-Lys-Gly) q- (13)
(In the formula (13), q is an integer of 1 to 360.)
- (Z 2 -Hyp-Gly) s- (14)
(In the formula (14), Z 2 is selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, and Val Represents an amino acid residue selected from the group consisting of: s is an integer of 1 to 360)
And a polypeptide having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,500,000, at least a portion of which is capable of forming a triple helix structure. .
In formulas (12), (13) and (14), l, q and s can be 3 or more, 5 or more, 10 or more, or 20 or more. Moreover, it can be 300 or less, 250 or less, 200 or less, or 150 or less.
任意ユニットを有する場合のその合計含有比率は、式（１５）で表されるユニットの１ｍｏｌに対して、０．００１ｍｏｌ以上、０．００２ｍｏｌ以上、０．０１ｍｏｌ以上、０．０２ｍｏｌ以上、又は０．０５ｍｏｌ以上とすることができ、また、５ｍｏｌ以下、３ｍｏｌ以下、２ｍｏｌ以下、又は１ｍｏｌ以下とすることができる。本発明のポリペプチドがこの任意ユニットを有する場合、上記式（１５）で表されるユニットと任意ユニットを交互に有することもできる。 The total content ratio in the case of having an optional unit is 0.001 mol or more, 0.002 mol or more, 0.01 mol or more, 0.02 mol or more, or 0.1 mol or more per 1 mol of the unit represented by the formula (15). It can be set to 05 mol or more, and can be 5 mol or less, 3 mol or less, 2 mol or less, or 1 mol or less. When the polypeptide of the present invention has this optional unit, it is possible to alternate between the unit represented by the above formula (15) and the optional unit.
本発明のポリペプチドは、例えば、上記説明した本発明方法により製造することができる。 The polypeptide of the present invention can be produced, for example, by the method of the present invention described above.
本発明のポリペプチドは、天然のコラーゲン分子と同様に、三重らせん構造を採る、又は採り得る。三重らせん構造を採ることは、円二色性スペクトルにおいて、２１０ｎｍ〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、かつ１８５ｎｍ〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示すことにより確認できる。
ポリペプチドは、少なくともその一部分が三重らせん構造を採っていればよく、又は採り得ればよい。
また、本発明のポリペプチドは、直鎖状、又は分岐鎖であり得る。The polypeptides of the invention, like the naturally occurring collagen molecules, adopt or adopt triple helical structures. Taking a triple helical structure can be confirmed by showing a positive cotton effect at 210 nm to 230 nm and a negative cotton effect at 185 nm to 205 nm in a circular dichroism spectrum.
At least a part of the polypeptide may or may take a triple helical structure.
Also, the polypeptide of the present invention may be linear or branched.
本発明のポリペプチドは、非常に耐熱性が高く、高温下でも変性せず、三重らせん構造を維持することができる。その変性温度は、通常、５０℃以上であり得る。また、ポリペプチドを構成するユニットの種類や長さによっては、５５℃以上、６０℃以上、６５℃以上、７０℃以上、７５℃以上、８０℃以上、８５℃以上、９０℃以上、９５℃以上、１００℃以上、１０５℃以上、１１０℃以上、１１５℃以上、１２０℃以上、１３０℃以上、又は１４０℃以上であり得る。変性温度の上限は、通常、１５０℃程度である。変性温度は、原料の選択やポリペプチド鎖長の調整などにより、当業者が適宜制御することができる。
変性温度は、三重らせん構造を維持できる温度であり、円二色性スペクトルの正のピーク波長での吸光度を、温度を上昇させながら測定し、吸光度が急速に低下する変曲点の温度を指す。変性温度は、円二色性スペクトルの測定装置や測定条件によりほとんど変化しない値である。The polypeptide of the present invention is very heat resistant, can not be denatured even at high temperature, and can maintain a triple helical structure. The denaturation temperature may usually be 50 ° C. or higher. Furthermore, depending on the type and length of the unit constituting the polypeptide, 55 ° C., 60 ° C. or more, 65 ° C. or more, 70 ° C. or more, 75 ° C. or more, 75 ° C. or more, 80 ° C. or more, 85 ° C. or more, 90 ° C. or more, 95 ° C. The temperature may be higher than or equal to 100 ° C., 105 ° C. or higher, 110 ° C. or higher, 115 ° C. or higher, 120 ° C. or higher, 130 ° C. or higher, or 140 ° C. or higher. The upper limit of the denaturation temperature is usually about 150 ° C. The denaturation temperature can be appropriately controlled by those skilled in the art by selection of raw materials, adjustment of polypeptide chain length and the like.
The denaturation temperature is the temperature at which the triple helix structure can be maintained, and the absorbance at the positive peak wavelength of the circular dichroism spectrum is measured with increasing temperature, and indicates the temperature at the inflection point where the absorbance decreases rapidly. . The denaturation temperature is a value which hardly changes depending on the measuring device of the circular dichroism spectrum and the measuring conditions.
本発明のポリペプチドは、多様な長さのものとすることができる。ポリペプチド鎖の長さは、原料の種類や使用量、反応条件など、特に、縮合剤、縮合助剤の使用量を調整することにより制御できる。ペプチド鎖の長さ又は分子量は、当業者が、通常の知識により制御することができる。
上記説明した本発明方法により本発明のポリペプチドを製造する場合は、分子量の制御が非常に容易である。また、高分子量のポリペプチドも容易に製造できる。The polypeptides of the invention can be of various lengths. The length of the polypeptide chain can be controlled by adjusting the types and amounts of raw materials used, reaction conditions, etc., in particular, the amounts of condensation agent and condensation aid used. The length or molecular weight of the peptide chain can be controlled by those skilled in the art according to ordinary knowledge.
When the polypeptide of the present invention is produced by the method of the present invention described above, control of molecular weight is very easy. Also, high molecular weight polypeptides can be readily prepared.
本発明のポリペプチドの重量平均分子量は、１万以上である。また、例えば、２万以上、３万以上、５万以上、又は１０万以上であり得る。また、本発明のポリペプチドの重量平均分子量は、１５０万以下である。また、例えば、１３０万以下、１２０万以下、１１０万以下、又は１００万以下であり得る。
本発明において、重量平均分子量は実施例に記載の方法で測定した値である。The weight average molecular weight of the polypeptide of the present invention is 10,000 or more. Also, for example, it may be 20,000 or more, 30,000 or more, 50,000 or more, or 100,000 or more. In addition, the weight average molecular weight of the polypeptide of the present invention is 1.5 million or less. In addition, for example, it may be 1.3 million or less, 1.2 million or less, 1.1 million or less, or 1 million or less.
In the present invention, the weight average molecular weight is a value measured by the method described in the examples.
用途
本発明のポリペプチドは、コラーゲン様ポリペプチドであるため、生体親和性ないしは生体適合性が高い。しかも、コラーゲンと異なり原料に由来する感染の危険性がない。さらに、耐熱性が高いため加熱滅菌にも耐える。従って、バイオマテリアルとして好適に利用できる。発明のポリペプチドは、例えば、人工皮膚、人工血管、細胞増殖の足場、組織接着材、医療器材（手術用縫合糸、コンタクトレンズ、カニューレ、ステントなど）、これらの医療器材の被覆材、医薬品や化粧品の原料、食品添加剤などとして利用できる。 Applications The polypeptide of the present invention is a collagen-like polypeptide and is therefore highly biocompatible or highly biocompatible. Moreover, unlike collagen, there is no risk of infection derived from the raw material. Furthermore, it is resistant to heat sterilization because of its high heat resistance. Therefore, it can be suitably used as a biomaterial. The polypeptide of the invention includes, for example, artificial skin, artificial blood vessels, scaffolds for cell growth, tissue adhesives, medical equipment (surgical sutures, contact lenses, cannulas, stents, etc.), coverings for these medical equipment, medicines and the like It can be used as a cosmetic ingredient, food additive, etc.
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの形態で使用できるが、バイオマテリアルとして利用する場合は、架橋させた架橋ポリペプチドの形態で使用することが多い。
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの架橋に用いられる一般的な架橋剤を用いて架橋することができる。このような架橋剤として、例えば、１-［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド（ＷＳＣＤ（ＥＤＣ））、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＤ・ＨＣｌ）、グルタルアルデヒド、１，４−ジブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＧＥ）、エチレン性不飽和化合物−無水マレイン酸共重合体、カルボキシメチルセルロースなどの水溶性架橋剤が挙げられる。
架橋ポリペプチドの変性温度は、通常、５０℃以上であり得る。また、ポリペプチドを構成するユニットの種類や長さによっては、５５℃以上、６０℃以上、６５℃以上、７０℃以上、７５℃以上、８０℃以上、８５℃以上、９０℃以上、９５℃以上、１００℃以上、１０５℃以上、１１０℃以上、１１５℃以上、１２０℃以上、１３０℃以上、又は１４０℃以上であり得る。変性温度の上限は、通常、１５０℃程度である。
本発明のポリペプチドを架橋すると、ゲル状になり得る。架橋ポリペプチドゲルはそのまま、又は乾燥物などとして利用できる。The polypeptide of the present invention can be used in the form of a polypeptide, but when used as a biomaterial, it is often used in the form of a cross-linked cross-linked polypeptide.
The polypeptide of the present invention can be crosslinked using a general crosslinking agent used to crosslink the polypeptide. As such a crosslinking agent, for example, 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide (WSCD (EDC)), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSCD. And water soluble crosslinking agents such as HCl), glutaraldehyde, 1,4-dibutanediol diglycidyl ether (BDDGE), ethylenically unsaturated compound-maleic anhydride copolymer, carboxymethyl cellulose and the like.
The denaturation temperature of the crosslinked polypeptide may usually be 50 ° C. or higher. Furthermore, depending on the type and length of the unit constituting the polypeptide, 55 ° C., 60 ° C. or more, 65 ° C. or more, 70 ° C. or more, 75 ° C. or more, 75 ° C. or more, 80 ° C. or more, 85 ° C. or more, 90 ° C. or more, 95 ° C. The temperature may be higher than or equal to 100 ° C., 105 ° C. or higher, 110 ° C. or higher, 115 ° C. or higher, 120 ° C. or higher, 130 ° C. or higher, or 140 ° C. or higher. The upper limit of the denaturation temperature is usually about 150 ° C.
Crosslinking of the polypeptides of the invention can result in gelation. The crosslinked polypeptide gel can be used as it is or as a dried product.
本明細書において、アミノ酸残基は以下の略称で表記している。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン残基
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン残基
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン残基
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン残基
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン残基
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸残基
Ｇｌｙ：グリシン残基
Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン残基
Ｈｙｐ：Ｌ−ヒドロキシプロリン残基
Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン残基
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン残基
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン残基
Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン残基
Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン残基
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン残基
Ｔｈｒ：Ｌ−スレオニン残基
Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン残基
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン残基
Ｖａｌ：Ｌ−バリン残基In the present specification, amino acid residues are indicated by the following abbreviations.
Ala: L-alanine residue Arg: L-arginine residue Asn: L-asparagine residue Asp: L-aspartate residue Cys: L-cysteine residue Gln: L-glutamine residue Glu: L-glutamic acid residue Gly: glycine residue His: L-histidine residue Hyp: L-hydroxyproline residue Ile: L- isoleucine residue Leu: L-leucine residue Lys: L-lysine residue Met: L-methionine residue Phe: L-phenylalanine residue Pro: L-proline residue Ser: L-serine residue Thr: L-threonine residue Trp: L-tryptophan residue Tyr: L-tyrosine residue Val: L-valine residue
以下、実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
ポリペプチドの物性評価は、以下の方法で行った。
重量平均分子量測定
ポリペプチドの重量平均分子量を、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により決定した。測定条件は、以下の通りである。
装置：（株）島津製作所製LC-20Aシステム
カラム：TSKgel GMPWxl
温度：40℃
流速：1.0 mL/min
溶離液：0.2N 硝酸ナトリウム水溶液
分子量標準：Showdex製STD PシリーズHereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited thereto.
Physical properties of the polypeptide were evaluated by the following method.
Weight Average Molecular Weight Measurement The weight average molecular weight of the polypeptide was determined by gel permeation chromatography (GPC). The measurement conditions are as follows.
Device: LC-20A system manufactured by Shimadzu Corporation Column: TSKgel GMPWxl
Temperature: 40 ° C
Flow rate: 1.0 mL / min
Eluent: 0.2 N aqueous solution of sodium nitrate Molecular weight standard: STD P series manufactured by Showdex
三重らせん構造の確認
ポリペプチドの円二色性スペクトルを、円二色性分散計により決定した。測定条件は、以下のとおりである。
装置：（株）日本分光社製JASCO J720
波長範囲：185nm〜260nm
210〜230nmに正のコットン効果、185〜205nmに負のコットン効果が観測されることをもって、三重らせん構造を形成していることを確認した。The circular dichroism spectrum of the triple helical structure confirmation polypeptide was determined by a circular dichroism spectrometer. The measurement conditions are as follows.
Device: JASCO J720 manufactured by JASCO Corporation
Wavelength range: 185 nm to 260 nm
The positive cotton effect was observed at 210 to 230 nm, and the negative cotton effect at 185 to 205 nm was observed to confirm that a triple helical structure was formed.
耐熱性評価
ポリペプチドについて、波長225nmの吸光度を、30℃から150℃まで1℃/minの温度勾配で測定し、吸光度が急速に低下する変曲点を確認し、変曲点の温度をポリペプチドの変性温度(温度変性点)とした。 For the heat resistance evaluation polypeptide, the absorbance at a wavelength of 225 nm is measured at a temperature gradient of 1 ° C./min from 30 ° C. to 150 ° C., and the inflection point at which the absorbance rapidly decreases is confirmed. The denaturation temperature (temperature denaturation point) of the peptide was used.
実施例１
ペプチドオリゴマーとして、L-（4-ヒドロキシプロリル）-L-（4-ヒドロキシプロリル）-グリシン トリフルオロ酢酸塩 500mg（1.20 mmol）を4mlの蒸留水に溶解し、トリエチルアミンでpHを5に調整したのち、4℃に冷却した。その後、32.5mg（ 0.240 mmol）の1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、230 mg（1.2mmol）の1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル-カルボジイミド塩酸塩（WSCD・HCl）を添加して1時間攪拌した後、20℃に昇温し終夜攪拌した。得られた反応溶液を限外ろ過し、凍結乾燥することによってポリペプチド1を得た。得られたポリペプチド１の円二色性スペクトルを測定し、三重らせん構造を形成していることを確認した。 Example 1
As a peptide oligomer, 500 mg (1.20 mmol) of L- (4-hydroxyprolyl) -L- (4-hydroxyprolyl) -glycine trifluoroacetate is dissolved in 4 ml of distilled water, and the pH is adjusted to 5 with triethylamine. Then, it was cooled to 4 ° C. After that, 32.5 mg (0.240 mmol) of 1-hydroxybenzotriazole and 230 mg (1.2 mmol) of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl-carbodiimide hydrochloride (WSCD.HCl) are added and stirred for 1 hour Then, the temperature was raised to 20 ° C. and stirred overnight The resultant reaction solution was ultrafiltered and freeze-dried to obtain polypeptide 1. The circular dichroism spectrum of polypeptide 1 was measured. It confirmed that it formed the triple helix structure.
実施例２〜９
ペプチドオリゴマーの種類及び添加量、pH、WSCD・HClの添加量を表１に示すように変更し、また、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールとペプチドオリゴマーとのモル比が実施例１と同じになるように1-ヒドロキシベンゾトリアゾールの使用量を調整したことを除き、実施例1と同様の方法でポリペプチド２〜９を得た。得られたポリペプチド２〜９の円二色性スペクトルを測定し、三重らせん構造を形成していることを確認した。 Examples 2 to 9
The type and amount of addition of the peptide oligomer, pH, and addition amount of WSCD.HCl were changed as shown in Table 1, and the molar ratio of 1-hydroxybenzotriazole to the peptide oligomer was the same as in Example 1. Polypeptides 2 to 9 were obtained in the same manner as in Example 1, except that the amount of 1-hydroxybenzotriazole used was adjusted. The circular dichroism spectra of the resulting polypeptides 2 to 9 were measured to confirm that they formed a triple helical structure.
実施例１〜９の反応条件、及び得られたポリペプチドの物性を、下記表１に示す。変性温度の「−」は測定していないことを示す。
実施例１０
原料として、ペプチドオリゴマーのL-（4-ヒドロキシプロリル）-L-（4-ヒドロキシプロリル）-グリシン トリフルオロ酢酸塩 500mg（1.20 mmol）とアラニン10.7mg（0.12mmol）とを4mlの蒸留水に溶解し、トリエチルアミンでpHを7に調整したのち、4℃に冷却した。その後、35.7mg（ 0.264 mmol） の1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、430mg（2.24mmol） の1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（WSCD・HCl）を添加して1時間攪拌した後、20℃に昇温し終夜攪拌した。得られた反応溶液を限外ろ過し、凍結乾燥することによってポリペプチド1０を得た。得られたポリペプチド１０の円二色性スペクトルを測定し、三重らせん構造を形成していることを確認した。 Example 10
As a raw material, 500 mg (1.20 mmol) of peptide oligomer L- (4-hydroxyprolyl) -L- (4-hydroxyprolyl) -glycine trifluoroacetate and 10.7 mg (0.12 mmol) of alanine in 4 ml of distilled water The solution was adjusted to pH 7 with triethylamine and then cooled to 4 ° C. After that, 35.7 mg (0.264 mmol) of 1-hydroxybenzotriazole and 430 mg (2.24 mmol) of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (WSCD.HCl) are added and stirred for 1 hour After heating, the temperature was raised to 20.degree. C. and stirred overnight. The resulting reaction solution was ultrafiltered and lyophilized to obtain polypeptide 10. The circular dichroism spectrum of the obtained polypeptide 10 was measured, and it was confirmed that a triple helix structure was formed.
実施例１１〜２２
ペプチドオリゴマーの種類及び添加量、アミノ酸又はペプチドオリゴマーの種類及び添加量、pH、WSCD・HClの添加量を表２に示すように変更し、また、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールとペプチドオリゴマーとのモル比が実施例１０と同じになるように1-ヒドロキシベンゾトリアゾールの使用量を調整したことを除き、実施例１０と同様の方法でポリペプチド１１〜２２を得た。得られたポリペプチド１１〜２２の円二色性スペクトルを測定し、三重らせん構造を形成していることを確認した。
実施例１０〜２２の反応条件、及び得られたポリペプチドの物性を、下記表２に示す。変性温度の「−」は測定していないことを示す。 Examples 11-22
The type and amount of peptide oligomer, the type and amount of amino acid or peptide oligomer, pH, and the amount of WSCD.HCl added are changed as shown in Table 2, and the molar ratio of 1-hydroxybenzotriazole to peptide oligomer Polypeptides 11 to 22 were obtained in the same manner as in Example 10, except that the amount of 1-hydroxybenzotriazole used was adjusted so as to be the same as in Example 10. The circular dichroism spectrum of the obtained polypeptides 11 to 22 was measured to confirm that they formed a triple helical structure.
The reaction conditions of Examples 10 to 22 and the physical properties of the obtained polypeptide are shown in Table 2 below. "-" Of denaturation temperature shows not measuring.
実施例２３、２４
実施例６において、トリエチルアミンに代えて、それぞれ、N-メチルモルホリン、及びジイソプロピルエチルアミンを用いてｐＨを調整したことを除き、実施例６と同様の方法で、ポリペプチド２３、及び２４を得た。得られたポリペプチド２３及び２４の円二色性スペクトルを測定し、三重らせん構造を形成していることを確認した。 Examples 23, 24
Polypeptides 23 and 24 were obtained in the same manner as in Example 6, except that the pH was adjusted with N-methylmorpholine and diisopropylethylamine, respectively, in place of triethylamine in Example 6. The circular dichroism spectra of the resulting polypeptides 23 and 24 were measured to confirm that they formed a triple helical structure.
比較例１、２
実施例６において、トリエチルアミンに代えて、それぞれ、水酸化ナトリウム、及び炭酸水素ナトリウムを用いてｐＨを調整したことを除き、実施例６と同様の方法で、比較ポリペプチド１、及び２を得た。
実施例２３、２４、比較例１、２の反応条件、及び得られたポリペプチドの物性を、下記表３に示す。変性温度は測定していない。
Comparative polypeptides 1 and 2 were obtained in the same manner as in Example 6, except that sodium hydroxide and sodium hydrogen carbonate were used instead of triethylamine in Example 6 to adjust the pH, respectively. .
The reaction conditions of Examples 23 and 24 and Comparative Examples 1 and 2 and the physical properties of the obtained polypeptides are shown in Table 3 below. The denaturation temperature was not measured.
実施例２５（架橋ポリペプチドの製造）
実施例１で得られたポリペプチド１の20 mg を１ m lの蒸留水に溶解し、ここに、架橋剤のカルボキシメチルセルロース10 mg を1 ml の蒸留水に溶解した水溶液を加え、室温で24時間攪拌することによって、架橋ポリペプチドゲル１を得た。 Example 25 (Production of Crosslinked Polypeptide)
An aqueous solution of 20 mg of polypeptide 1 obtained in Example 1 in 1 ml of distilled water, and 10 mg of carboxymethylcellulose as a crosslinking agent in 1 ml of distilled water is added thereto, and the solution is added for 24 hours at room temperature. The crosslinked polypeptide gel 1 was obtained by stirring.
実施例２６〜３０（架橋ポリペプチドの製造）
ポリペプチドの種類、又は架橋剤の種類を表４に示すように変更したことを除き、実施例２５と同様の方法で架橋ポリペプチドゲル２〜６を得た。
各架橋ポリペプチドゲルの変性温度をポリペプチドと同じ方法により測定した。結果を表４に示す Examples 26-30 (Production of Cross-Linked Polypeptides)
Crosslinked polypeptide gels 2 to 6 were obtained in the same manner as in Example 25 except that the type of polypeptide or the type of crosslinker was changed as shown in Table 4.
The denaturation temperature of each cross-linked polypeptide gel was measured by the same method as the polypeptide. The results are shown in Table 4
表１〜４の結果から明らかなように、本発明の各実施例の方法により、変性温度８７℃〜１２０℃という超高耐熱性のコラーゲン様ポリペプチドが得られた。また、ペプチドの重量平均分子量を１万〜９１万という広範囲に制御することができた。
また、無機酸塩を用いてｐＨ調整した比較例１、２では、縮合反応を制御することができなかったが、本発明の各実施例では、縮合反応を制御することができ、目的とする長さのコラーゲン様ポリペプチドを安定的に合成することができた。
また、本発明のポリペプチドを架橋することにより、変性温度が一層高い架橋ポリペプチドゲルを得ることができた。As is clear from the results in Tables 1 to 4, ultra-high heat resistant collagen-like polypeptides having a denaturation temperature of 87 ° C to 120 ° C were obtained by the methods of the respective examples of the present invention. Moreover, the weight average molecular weight of the peptide could be controlled in a wide range of 10,000 to 910,000.
In addition, in Comparative Examples 1 and 2 in which the pH was adjusted using an inorganic acid salt, the condensation reaction could not be controlled, but in each example of the present invention, the condensation reaction could be controlled, and the purpose was It was possible to stably synthesize a length of collagen-like polypeptide.
In addition, by crosslinking the polypeptide of the present invention, a crosslinked polypeptide gel having a higher denaturation temperature could be obtained.
本発明によれば、バイオマテリアルとして利用できる高耐熱性のコラーゲン様ポリペプチドを効率よく製造することができる。得られるコラーゲン様ポリペプチドは、人工皮膚、人工血管、細胞増殖の足場、組織接着材、医療器材（手術用縫合糸、コンタクトレンズ、カニューレ、ステントなど）、これらの医療器材の被覆材、医薬品や化粧品の原料、食品添加剤などとして利用できる。 According to the present invention, a highly heat-resistant collagen-like polypeptide that can be used as a biomaterial can be efficiently produced. The obtained collagen-like polypeptide includes artificial skin, artificial blood vessels, scaffolds for cell proliferation, tissue adhesives, medical devices (surgical sutures, contact lenses, cannulas, stents, etc.), coverings for these medical devices, medicines and the like It can be used as a cosmetic ingredient, food additive, etc.
Claims (11)
Ｈ − （ Ｘ − Ｙ − Ｇｌｙ ）ｎ − ＯＨ （１）
Ｈ − （ Ｇｌｙ − Ｘ − Ｙ ）ｎ − ＯＨ （２）
Ｈ − （ Ｙ − Ｇｌｙ − Ｘ ）ｎ − ＯＨ （３）
（式（１）〜（３）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｎは１〜１０の整数である。）
で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマー、又は
（ｂ） 上記式（１）〜（３）で表される少なくとも１種のペプチドオリゴマーと、下記式（４）〜（１０）
Ｈ − （ Ｚ１ ） − ＯＨ （４）
（式（４）中、Ｚ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表す。）
Ｈ − （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｐ− ＯＨ （５）
Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ ）ｐ− ＯＨ （６）
Ｈ − （ Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ ）ｐ− ＯＨ （７）
（式（５）〜（７）中、ｐは１〜１０の整数である。）
Ｈ − （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｒ− ＯＨ （８）
Ｈ − （ Ｇｌｙ−Ｚ２−Ｈｙｐ ）ｒ− ＯＨ （９）
Ｈ − （ Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｚ２ ）ｒ− ＯＨ （１０）
（式（８）〜（１０）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｒは１〜１０の整数である。）
で表される少なくとも１種のアミノ酸、ペプチドオリゴマー、又はペプチドとを、
有機塩基を用いてｐＨ３〜１０に調整した水系溶媒中で縮合反応させることにより、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチドを得る工程を含むポリペプチドの製造方法。(A) The following formulas (1) to (3)
H- (X-Y-Gly) n-OH (1)
H-(Gly-X-Y) n-OH (2)
H- (Y-Gly-X) n-OH (3)
(In the formulas (1) to (3), X and Y each independently represent Hyp or Pro, and n is an integer of 1 to 10).
Or at least one peptide oligomer represented by the formulas (1) to (3), and the following formulas (4) to (10):
H − (Z 1 ) − OH (4)
In the formula (4), Z 1 represents Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Hyp, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr Represents an amino acid residue, a peptide oligomer residue or a peptide residue selected from the group consisting of: Val, Arg-Gly-Asp, and ε-polylysine.
H- (Pro-Lys-Gly) p-OH (5)
H- (Gly-Pro-Lys) p-OH (6)
H- (Lys-Gly-Pro) p-OH (7)
(In the formulas (5) to (7), p is an integer of 1 to 10)
H - (Z 2 -Hyp-Gly ) r- OH (8)
H - (Gly-Z 2 -Hyp ) r- OH (9)
H − (Hyp-Gly-Z 2 ) r-OH (10)
(In the formulas (8) to (10), Z 2 represents Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr And an amino acid residue selected from the group consisting of and Val, and r is an integer of 1 to 10.)
At least one amino acid represented by, a peptide oligomer, or a peptide,
A polypeptide having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,500,000 capable of at least partially forming a triple helix structure by condensation reaction in an aqueous solvent adjusted to pH 3 to 10 using an organic base A method of producing a polypeptide comprising the steps of
― （ Ｘ − Ｙ − Ｇｌｙ ） ｍ ― （１１）
（式（１１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、Ｈｙｐ又はＰｒｏを表し、ｍは、１０〜３６００の整数である。）
で表される少なくとも１種のユニットを有し、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチド。The following formula (11) manufactured by the method according to any one of claims 1 to 4.
-(X-Y-Gly) m-(11)
(In the formula (11), X and Y each independently represent Hyp or Pro, and m is an integer of 10 to 3600.)
A polypeptide having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,500,000, which has at least one type of unit represented by and at least a part of which can form a triple helical structure.
― （ Ｈｙｐ − Ｈｙｐ − Ｇｌｙ ） ｍ ― （１５）
（式（１５）中、ｍは１０〜３６００の整数である。）
で表されるユニットを有し、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチド。Following formula (15)
-(Hyp-Hyp-Gly) m-(15)
(In the formula (15), m is an integer of 10 to 3600.)
A polypeptide having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,500,000, which has a unit represented by and at least a part of which can form a triple helical structure.
― （ Ｈｙｐ − Ｈｙｐ − Ｇｌｙ ） ｍ ― （１５）
（式（１５）中、ｍは１０〜３６００の整数である。）
で表されるユニットと、下記式（１２）〜（１４）
― （ Ｚ１ ） ｌ ― （１２）
（式（１２）中、Ｚ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及びε-ポリリジンからなる群より選択されるアミノ酸残基、ペプチドオリゴマー残基、又はペプチド残基を表し、ｌは、１〜３６０の整数である。）
― （ Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ ）ｑ― （１３）
（式（１３）中、ｑは１〜３６０の整数である。）
― （ Ｚ２−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ ）ｓ― （１４）
（式（１４）中、Ｚ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し、ｓは１〜３６０の整数である。）
で表される少なくとも１種のユニットとを有し、少なくとも一部が三重らせん構造を形成することができる重量平均分子量１０，０００〜１，５００，０００のポリペプチド。Following formula (15)
-(Hyp-Hyp-Gly) m-(15)
(In the formula (15), m is an integer of 10 to 3600.)
And a unit represented by the following formulas (12) to (14)
― (Z 1 ) l ― (12)
In the formula (12), Z 1 represents Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Hyp, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr , An amino acid residue selected from the group consisting of: Val, Arg-Gly-Asp, and ε-polylysine, a peptide oligomer residue, or a peptide residue, and l is an integer of 1 to 360.)
-(Pro-Lys-Gly) q- (13)
(In the formula (13), q is an integer of 1 to 360.)
- (Z 2 -Hyp-Gly) s- (14)
(In the formula (14), Z 2 is selected from Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, and Val Represents an amino acid residue selected from the group consisting of: s is an integer of 1 to 360)
And a polypeptide having a weight average molecular weight of 10,000 to 1,500,000, which has at least one type of unit represented by and at least a part of which can form a triple helical structure.
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