JPWO2017122583A1 - HPV infection vaccine containing HPVL2 peptide / HBs chimeric protein as active ingredient - Google Patents
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Abstract
ヒトパピローマウイルス（HPV）感染症を予防又は治療するためのHPV感染症用ワクチンを提供する。Ｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）のアミノ酸配列の142位と143位の間に、約20個のアミノ酸からなるHPVL2ペプチドが挿入されたキメラタンパク質、該キメラタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNA断片、該DNA断片が組み込まれた発現ベクター、該発現ベクターで形質転換されたキメラタンパク質産生細胞、並びに該キメラタンパク質を有効成分として含有するHPV感染症用ワクチン及びその製造方法。 A vaccine for HPV infection for preventing or treating human papillomavirus (HPV) infection is provided. A chimeric protein in which an HPVL2 peptide consisting of about 20 amino acids is inserted between positions 142 and 143 of the hepatitis B virus surface protein (HBs protein), and a base sequence encoding the amino acid sequence of the chimeric protein A DNA fragment comprising the expression vector, an expression vector incorporating the DNA fragment, a chimeric protein-producing cell transformed with the expression vector, a vaccine for HPV infection containing the chimeric protein as an active ingredient, and a method for producing the vaccine.
Description
本願発明は、ヒトパピローマウイルス（Human papillomavirus：HPV）感染症用ワクチンに関する。詳細には、HPVL2タンパク質由来のペプチド（以下、「HPVL2ペプチド」と称することもある）とヒトＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（以下、「HBsタンパク質」と称することもある）とのキメラタンパク質を有効成分とするワクチンに関する。 The present invention relates to a vaccine for human papillomavirus (HPV) infection. Specifically, a chimeric protein of a peptide derived from HPVL2 protein (hereinafter also referred to as “HPVL2 peptide”) and a human hepatitis B virus surface protein (hereinafter also referred to as “HBs protein”) is an active ingredient. It relates to the vaccine.
HPVは、パピローマウイルス科に属する小型の環状二本鎖DNAウイルスで、ヒト乳頭腫ウイルスとも呼ばれる。HPVは、ウイルスゲノムが外郭タンパク質（カプシドタンパク質：Capsid protein）で覆われた直径 50-55nmの正二十面体構造を取るが、カプシドを覆うエンベロープは存在しない。ゲノムサイズは種類により異なるが約8,000塩基ほどで、この中に初期タンパク質（E1, E2, E4, E5, E6及びE7）と後期タンパク質（L1及びL2）がコードされている。L1とL2でHPV粒子のカプシドが形成され、L2はカプシド形成に補助的に働いている。 HPV is a small circular double-stranded DNA virus belonging to the Papillomaviridae family and is also called human papilloma virus. HPV has an icosahedral structure with a diameter of 50-55 nm, in which the viral genome is covered with a capsid protein, but there is no envelope covering the capsid. Although the genome size varies depending on the type, it is about 8,000 bases, in which early proteins (E1, E2, E4, E5, E6 and E7) and late proteins (L1 and L2) are encoded. L1 and L2 form capsids of HPV particles, and L2 plays an auxiliary role in capsid formation.
HPVの宿主域は厳格でヒト以外の動物に感染しない。HPVは、接触感染により皮膚や粘膜に潜伏持続感染し、子宮頸がん（扁平上皮がん、腺がん）及びその前駆病変[cervical intraepithelial neoplasia (CIN) 2 及び3]、尖圭コンジローマ等を惹き起こす。日本では、年間19000人が子宮頸がんを発症し、5600人が死亡している（非特許文献５参照)。WHOによる推定では、世界の女性の悪性腫瘍の13％（53万人）にHPVの感染が関わっており、3億人がHPVのキャリアーであるとみられている（非特許文献４参照）。 The host range of HPV is strict and does not infect non-human animals. HPV is a persistent infection in the skin and mucous membranes caused by contact infection, and cervical cancer (squamous cell carcinoma, adenocarcinoma) and its precursor lesions [cervical intraepithelial neoplasia (CIN) 2 and 3], cuspid condyloma, etc. Raise. In Japan, 19000 people develop cervical cancer annually and 5600 people die (see Non-Patent Document 5). According to estimates by WHO, HPV infection is involved in 13% (530,000) of malignant tumors in women worldwide, and 300 million people are considered to be HPV carriers (see Non-Patent Document 4).
ウイルス増殖に関する研究によると、HPV感染細胞の分裂時にHPVゲノムは複製し、娘細胞に分配される。潜伏感染細胞が表皮形成の分化を始めると、分化終盤でウイルス増殖が起こる。しかしながら、HPVは、ウイルス粒子として分離されることは珍しく、ゲノムDNAのみがクローニングされている。これまでにHPVはカプシドタンパク質（L1）遺伝子の塩基配列の相同性に基づいて、100種類以上の遺伝子型に分類されている。HPVは、その遺伝子型により感染部位や発症する病気が異なり、皮膚病変に検出されるもの（皮膚型）と粘膜病変に検出されるもの（粘膜型）に大別され、更に、粘膜型のHPVは、種々の癌に検出される高リスク型と良性の尖形コンジローマ等の原因となる低リスク型に分類される。高リスク型HPVには、子宮頸がん、肛門周囲がん及び陰茎がんなどから検出される16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82型が含まれ、低リスク型HPVには、6及び11型等が含まれる（非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３参照）。
According to studies on viral growth, the HPV genome replicates and distributes to daughter cells when HPV-infected cells divide. When latently infected cells begin to differentiate into epidermal formation, viral growth occurs at the end of differentiation. However, HPV is rarely isolated as a viral particle, and only genomic DNA has been cloned. So far, HPV has been classified into over 100 genotypes based on the homology of the base sequence of the capsid protein (L1) gene. HPV has different infection sites and diseases depending on its genotype, and is broadly divided into those detected in skin lesions (skin type) and those detected in mucosal lesions (mucosal type). Are classified into a high-risk type detected in various cancers and a low-risk type causing benign cusp condyloma. For high-risk HPV, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58 detected from cervical cancer, perianal cancer, and penile cancer , 59, 66, 68, 73, and 82, and low-risk HPV includes
HPV感染予防ワクチンに関しては、2006年6月に米国メルク社により開発されたHPV6, 11, 16, 18型のウイルス様粒子（VLP）を混合したワクチン「商品名Gardasil（登録商標）（ガーダシル）」がアメリカ食品医薬品局（FDA）により承認され、2007年5月に英国グラクソ・スミスクライン社により開発されたHPV16, 18型のVLPを混合したワクチン「商品名Cervarix（サーバリックス）」が、オーストラリアの医薬品審査当局（TGA）により承認された。日本では、2009年10月にCervarix、2011年7月にGardasilが承認された。 HPV infection prevention vaccine is a vaccine that was mixed with virus-like particles (VLP) of HPV6, 11, 16, and 18 developed by Merck in the United States in June 2006 "Trade name Gardasil (registered trademark) (Gardashil)" Approved by the US Food and Drug Administration (FDA) and developed in May 2007 by GlaxoSmithKline in the UK, a vaccine that combines HPV16 and 18 type VLPs under the trade name Cervarix (Australia) Approved by the Pharmaceutical Review Authority (TGA). In Japan, Cervarix was approved in October 2009 and Gardasil was approved in July 2011.
これらは第一世代ワクチンと呼ばれ、L1タンパク質をコードする遺伝子を酵母菌や昆虫細胞に発現させ、VLPを作らせ、これにアジュバントを加えたものである（非特許文献６参照）。いずれも特定の遺伝子型により引き起こされる癌に対して承認されたものであり、Gardasilなら6、11、16及び18型、Cervarixなら16及び18型以外では、ごく一部の型に対する予防効果しか認定されていない（非特許文献新１２）。2014年12月にHPV31, 33, 45, 52及び58型のVLPを追加したGardasilの改良品「商品名Gardasil 9（登録商標）」がFDAにより承認され、日本では2015年7月にMSD株式会社より9種類のHPV型VLPを混合した「組換え沈降9価ヒトパピローマウイルス様粒子ワクチン」の製造販売承認申請が提出されているものの、依然として予防効果は特定のHPV型に限定される。したがって、HPV感染阻止、その後に誘発される癌の発症をより効率良く抑制するために、あらゆる種類の型のHPV感染に有効に働くワクチンの開発が求められる（非特許文献５及び非特許文献６参照）。
These are called first-generation vaccines, and a gene encoding L1 protein is expressed in yeast or insect cells to make VLP, and an adjuvant is added thereto (see Non-Patent Document 6). All are approved for cancers caused by specific genotypes, and only preventive effects against a few types other than Gardasil
かかる試みの一つとして、神田らの報告がある。彼らは、HPV16型のL2の64-81位及び108-120位のアミノ酸配列中に高リスク型HPVに共通の中和エピトープが存在すること、及びHPV16型のL2由来のペプチドを16型HPVのL1に挿入したキメラ蛋白の集合体であるVLPは、HPV16型、18型、31型、33型、35型、52型及び6型の感染を阻害することを明らかにした（特許文献１及び特許文献２参照）。更に、18-38位、56-75位及び96-115位の各L2ペプチドをL1ペプチドに挿入したキメラタンパク質からなるVLPについても同様の報告を行っている（非特許文献１３参照）。一方で、挿入ペプチドの長さが、エピトープ部分の抗原としての提示に影響することも報告している（特許文献１参照）。
One such attempt is the report of Kanda et al. HPV16 L2 has a neutralizing epitope common to high-risk HPV in the amino acid sequence at positions 64-81 and 108-120 of L2, and HPV16 L2-derived peptides It has been clarified that VLP, an aggregate of chimeric proteins inserted into L1, inhibits infection of HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 and 6 (
HPVのL1以外に、種々の粒子形成能を有するタンパク質に外来ペプチドを付加又は挿入して得られるキメラタンパク質の粒子形成やワクチンとしての有用性に関する研究が報告されている。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）の表面タンパク質（HBsタンパク質）のN末又はC末にHPV16型のL2の一部からなるペプチド（N末より、50−220アミノ酸領域及び100−220アミノ酸領域）を付加したキメラ蛋白質をマウスに免疫したところ、ELISAによりL2及びHBｓタンパク質に対する抗体の上昇が確認された（特許文献７参照）。米村らは、HPV16型L2タンパク質の56−75位のアミノ酸配列から成る領域を用いて同様の結果を得ている（特許文献８参照）。その他、HBsタンパク質の親水性領域やHBsAg-Sの外側ループ内の露出部位に外来遺伝子を挿入して得られるキメラタンパク質（特許文献３、特許文献４及び非特許文献１４参照）、及びHBsタンパク質のN末側に外来ペプチドを結合させたキメラタンパク質のVLP形成に関する報告がある（特許文献５及び特許文献６参照）。
In addition to HPV L1, studies have been reported on the formation of particles of chimeric proteins obtained by adding or inserting foreign peptides into proteins having various particle-forming abilities, and their usefulness as vaccines. For example, a peptide consisting of part of HPV16 type L2 at the N-terminus or C-terminus of the surface protein (HBs protein) of hepatitis B virus (HBV) (from the N-terminus, 50-220 amino acid region and 100-220 amino acid region) When mice were immunized with the chimeric protein with added, an increase in antibodies against L2 and HBs proteins was confirmed by ELISA (see Patent Document 7). Yonemura et al. Obtained similar results using a region consisting of the amino acid sequence at positions 56-75 of the HPV16 type L2 protein (see Patent Document 8). In addition, a chimeric protein obtained by inserting a foreign gene into the hydrophilic region of HBs protein or an exposed site in the outer loop of HBsAg-S (see
HBsタンパク質は、酵母由来の組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチンの有効成分として使用されるなど、ワクチンとしての効果や安全性が高いことが実証されている（非特許文献７参照）。しかしながら、外来ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質からなるVLPは、挿入される外来ペプチドの種類や長さの違いにより、VLPの安定性、細胞からの発現効率、発現されたものの構造変化等に影響を及ぼすことがあり、必ずしも、外来ペプチドをエピトープとするワクチンとしての有用性を担保するものではない（特許文献４参照）。 HBs protein has been demonstrated to be highly effective and safe as a vaccine, such as being used as an active ingredient of yeast-derived recombinant precipitated hepatitis B vaccine (see Non-Patent Document 7). However, VLPs composed of chimeric proteins of foreign peptides and HBs proteins affect the stability of the VLP, the expression efficiency from the cells, the structural changes in the expressed ones, etc., depending on the type and length of the foreign peptide inserted. However, the usefulness as a vaccine having an exogenous peptide as an epitope is not necessarily guaranteed (see Patent Document 4).
HPVL2ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質を有効成分とするHPV感染症及び／又はB型肝炎用ワクチン（特許文献８参照）は、本願の実施例７に示したように、HBsタンパク質で免疫したマウスにおいてHPVL2ペプチドに対する免疫を誘導することができない。結果、該ワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）に対する免疫を保有する対象に対して有効に作用しないことが危惧される。したがって、本願発明の目的は、HBVに対する免疫を保有する対象においても有効なHPV感染症ワクチンを提供することにある。 A vaccine for HPV infection and / or hepatitis B (see Patent Document 8) comprising a chimeric protein of HPVL2 peptide and HBs protein as an active ingredient, as shown in Example 7 of the present application, is a mouse immunized with HBs protein Inability to induce immunity against HPVL2 peptide. As a result, it is feared that the vaccine does not effectively act on subjects who possess immunity against hepatitis B virus (HBV). Therefore, an object of the present invention is to provide an HPV infection vaccine that is effective even in subjects possessing immunity against HBV.
本願発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、HBsタンパク質のアミノ酸配列の142位と143位の間に、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるHPVL2ペプチド（アミノ酸数20個）が挿入されたキメラタンパク質は、ウイルス様粒子(VLP)を形成すること、及びHBsタンパク質に対する抗体を保有するマウスに投与してもHPVL2ペプチドに対する抗体を誘導することを見出した。一方で、HBsタンパク質の同じ部位にGly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr（配列番号４）で示されるHPVL2ペプチド（アミノ酸数11個）が挿入されたキメラタンパク質では良好な結果が得られないことを発見し、本願発明を完成するに至った。
As a result of intensive studies to achieve the above object, the inventors of the present application have found that between the
本願発明に従えば、Ｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）のアミノ酸配列の142位と143位の間に、約20個のアミノ酸からなるHPVL2ペプチドが挿入されたキメラタンパク質、該キメラタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNA断片、該DNA断片が組み込まれた発現ベクター、該発現ベクターで形質転換されたキメラタンパク質産生宿主、並びに該キメラタンパク質を有効成分として含有するHPV感染症用ワクチン及びその製造方法が提供される。本願発明のキメラタンパク質及び該キメラタンパク質を発現するベクターは、HPV感染症の予防や治療に有効に利用され得るものである。また、HPVL2ペプチドの代わりに他の外来ペプチドが挿入されたキメラタンパク質を免疫抗原として用いることにより、外来ペプチドの免疫原性を向上させる方法が提供される。
According to the present invention, a chimeric protein in which an HPVL2 peptide consisting of about 20 amino acids is inserted between
したがって、本願発明は、以下の通りである。
[１]Ｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）のアミノ酸配列の142位と143位の間に、下記（１）から（５）の何れかのアミノ酸配列から成るペプチドが挿入されたキメラタンパク質を有効成分として含有するヒトパピローマウイルス（HPV）感染症用ワクチン；
（１）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号３）からなるアミノ酸配列、
（２）配列番号３の配列において１〜５個のアミノ酸が付加、置換若しくは欠失され、且つGly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列を含むアミノ酸配列、
（３）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa（配列番号６）なる配列で示され、X1aaがThr又はSer、X2aaがSer, Thr又はAla、X3aaがThr又はSer、X4aaがSer, Thr又はAla、X5aaがIle又はVal、X6aaがLeu又はIleであるアミノ酸配列、
（４）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列が３個連結されたアミノ酸配列、及び
（５）前記（４）の配列において、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列のＮ末側若しくはＣ末側に１〜５個の任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
[２]前記（２）及び（５）のアミノ酸配列で示されるペプチドが、20個のアミノ酸からなる、[１]に記載のHPV感染症用ワクチン。
[３]前記HBsタンパク質が、下記（１）又は（２）のアミノ酸配列である、[１]又は[２]に記載のHPV感染症用ワクチン；
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１で示される配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列。
[４]HPV感染症の予防薬である、[１]から[３]の何れかに記載のHPV感染症用ワクチン。
[５]HPV感染症の治療薬である、[１]から[３]の何れかに記載のHPV感染症用ワクチン。
[６]Ｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）のアミノ酸配列の142位と143位の間に、下記（１）から（５）の何れかのアミノ酸配列から成るペプチドが挿入されたキメラタンパク質；
（１）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号３）からなるアミノ酸配列、
（２）配列番号３の配列において１〜５個のアミノ酸が付加、置換若しくは欠失され、且つGly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列を含むアミノ酸配列、
（３）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa（配列番号６）なる配列で示され、X1aaがThr又はSer、X2aaがSer, Thr又はAla、X3aaがThr又はSer、X4aaがSer, Thr又はAla、X5aaがIle又はVal、X6aaがLeu又はIleであるアミノ酸配列、
（４）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列が３個連結されたアミノ酸配列、及び
（５）前記（４）の配列において、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列のＮ末側若しくはＣ末側に１〜５個の任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
[７]前記（２）及び（５）のアミノ酸配列で示されるペプチドが、20個のアミノ酸からなる、[６]に記載のキメラタンパク質。
[８]前記HBsタンパク質が、下記（１）又は（２）のアミノ酸配列である、[６]又は[７]に記載のキメラタンパク質；
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１で示される配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列。
[９][６]から[８]の何れかに記載のキメラタンパク質をコードするDNA断片。
[１０][９]に記載のDNA断片が組み込まれた発現ベクター。
[１１][１０]に記載の発現ベクターで形質転換されたキメラタンパク質産生宿主。
[１２][１０]に記載の発現ベクターを有効成分として含有する、HPV感染症用DNAワクチン。
[１３]下記（１）〜（５）の工程を含む、[１]から[３]の何れかに記載のHPV感染症用ワクチンの製造方法；
（１）[９]に記載のDNA断片を調製する工程、
（２）[１０]に記載の発現ベクターを調製し、該発現ベクターで宿主を形質転換する工程、
（３）前記（２）により得られる形質転換宿主を培養し、キメラタンパク質産生形質転換宿主を選択する工程、
（４）前記（３）により得られるキメラタンパク質産生形質転換宿主を拡張培養し、培養物から前記キメラタンパク質を精製する工程、及び
（５）前記（４）により得られる精製キメラタンパク質にアジュバント、安定化剤、緩衝剤、等張化剤及び保存剤から選択される添加剤を添加して、ワクチンとする工程。
[１４]外来ペプチドの免疫原性を向上させる方法であって、下記（１）又は（２）のアミノ酸配列からなるＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質（HBsタンパク質）の142位と143位の間に、任意の感染症に対する中和エピトープを含む外来ペプチドが挿入されたキメラタンパク質を免疫抗原として用いる、前記方法；
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１で示される配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列。
[１５]前記外来ペプチドが、20個のアミノ酸又は20±ｎ個のアミノ酸（ｎは、1〜５の整数）である、[１４]に記載の方法。
[１６]前記外来ペプチドが、下記（１）〜（５）の何れかである、[１４]に記載の方法；
（１）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号３）からなるアミノ酸配列、
（２）配列番号４の配列において１〜５個のアミノ酸が付加、置換若しくは欠失され、且つGly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列を含むアミノ酸配列、
（３）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa（配列番号６）なる配列で示され、X1aaがThr又はSer、X2aaがSer, Thr又はAla、X3aaがThr又はSer、X4aaがSer, Thr又はAla、X5aaがIle又はVal、X6aaがLeu又はIleであるアミノ酸配列、
（４）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列が３個連結されたアミノ酸配列、及び
（５）前記（４）の配列において、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列のＮ末側若しくはＣ末側に１〜５個の任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
[１７]前記（２）及び（５）のアミノ酸配列で示されるペプチドが、20個のアミノ酸からなる、[１６]に記載の方法。Therefore, the present invention is as follows.
[1] A chimeric protein in which a peptide comprising any one of the following amino acid sequences (1) to (5) is inserted between
(1) Amino acid consisting of Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu (SEQ ID NO: 3) Array,
(2) an amino acid sequence comprising a sequence represented by Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly, wherein 1 to 5 amino acids are added, substituted or deleted in the sequence of SEQ ID NO: 3;
(3) Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa (SEQ ID NO: 6) An amino acid sequence wherein X1aa is Thr or Ser, X2aa is Ser, Thr or Ala, X3aa is Thr or Ser, X4aa is Ser, Thr or Ala, X5aa is Ile or Val, and X6aa is Leu or Ile,
(4) an amino acid sequence in which three sequences represented by Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly are linked, and (5) in the sequence of (4), Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly An amino acid sequence in which 1 to 5 arbitrary amino acids are added to the N-terminal side or the C-terminal side of the sequence represented by.
[2] The vaccine for HPV infection according to [1], wherein the peptide represented by the amino acid sequences of (2) and (5) is composed of 20 amino acids.
[3] The vaccine for HPV infection according to [1] or [2], wherein the HBs protein has the following amino acid sequence (1) or (2):
(1) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (2) Amino acid sequence having 90% or more homology with the sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[4] The vaccine for HPV infection according to any one of [1] to [3], which is a preventive agent for HPV infection.
[5] The vaccine for HPV infection according to any one of [1] to [3], which is a therapeutic agent for HPV infection.
[6] A chimeric protein in which a peptide comprising any one of the following amino acid sequences (1) to (5) is inserted between
(1) Amino acid consisting of Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu (SEQ ID NO: 3) Array,
(2) an amino acid sequence comprising a sequence represented by Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly, wherein 1 to 5 amino acids are added, substituted or deleted in the sequence of SEQ ID NO: 3;
(3) Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa (SEQ ID NO: 6) An amino acid sequence wherein X1aa is Thr or Ser, X2aa is Ser, Thr or Ala, X3aa is Thr or Ser, X4aa is Ser, Thr or Ala, X5aa is Ile or Val, and X6aa is Leu or Ile,
(4) an amino acid sequence in which three sequences represented by Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly are linked, and (5) in the sequence of (4), Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly An amino acid sequence in which 1 to 5 arbitrary amino acids are added to the N-terminal side or the C-terminal side of the sequence represented by.
[7] The chimeric protein according to [6], wherein the peptide represented by the amino acid sequences of (2) and (5) is composed of 20 amino acids.
[8] The chimeric protein according to [6] or [7], wherein the HBs protein has the following amino acid sequence (1) or (2):
(1) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (2) Amino acid sequence having 90% or more homology with the sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[9] A DNA fragment encoding the chimeric protein according to any one of [6] to [8].
[10] An expression vector in which the DNA fragment according to [9] is incorporated.
[11] A chimeric protein production host transformed with the expression vector according to [10].
[12] A DNA vaccine for HPV infection containing the expression vector according to [10] as an active ingredient.
[13] The method for producing a vaccine for HPV infection according to any one of [1] to [3], comprising the following steps (1) to (5);
(1) A step of preparing the DNA fragment according to [9],
(2) a step of preparing the expression vector according to [10] and transforming a host with the expression vector;
(3) culturing the transformed host obtained by (2) above and selecting a chimeric protein-producing transformed host;
(4) a step of expanding the chimeric protein-producing transformed host obtained by (3) and purifying the chimeric protein from the culture; and (5) an adjuvant and a stable agent for the purified chimeric protein obtained by (4). A step of adding an additive selected from an agent, a buffer, an isotonic agent and a preservative to form a vaccine.
[14] A method for improving the immunogenicity of a foreign peptide, which is located between
(1) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (2) Amino acid sequence having 90% or more homology with the sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[15] The method according to [14], wherein the foreign peptide is 20 amino acids or 20 ± n amino acids (n is an integer of 1 to 5).
[16] The method according to [14], wherein the foreign peptide is any one of the following (1) to (5);
(1) Amino acid consisting of Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu (SEQ ID NO: 3) Array,
(2) an amino acid sequence comprising a sequence represented by Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly, wherein 1 to 5 amino acids are added, substituted or deleted in the sequence of SEQ ID NO: 4;
(3) Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa (SEQ ID NO: 6) An amino acid sequence wherein X1aa is Thr or Ser, X2aa is Ser, Thr or Ala, X3aa is Thr or Ser, X4aa is Ser, Thr or Ala, X5aa is Ile or Val, and X6aa is Leu or Ile,
(4) an amino acid sequence in which three sequences represented by Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly are linked, and (5) in the sequence of (4), Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly An amino acid sequence in which 1 to 5 arbitrary amino acids are added to the N-terminal side or the C-terminal side of the sequence represented by.
[17] The method according to [16], wherein the peptide represented by the amino acid sequence of (2) and (5) is composed of 20 amino acids.
本願発明の一態様である、HBsタンパク質のアミノ酸配列の142位と143位の間に、
Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号３）からなるペプチドが挿入されたキメラタンパク質は、HBV免疫保有マウスにおいてHPVL2ペプチドに対する抗体を誘導することから、HBV抗体陽性の対象にも有効なHPV感染症用ワクチンの好適な材料となり得る。Between the 142nd and 143rd positions of the amino acid sequence of the HBs protein, which is one embodiment of the present invention,
A peptide consisting of Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu (SEQ ID NO: 3) is inserted. Since the chimeric protein induces antibodies against HPVL2 peptide in HBV-immunized mice, it can be a suitable material for a vaccine for HPV infection that is also effective for HBV antibody-positive subjects.
また、上記ペプチドのN末側６個のアミノ酸配列は、HPVの株間でよく保存されており、多くのHPV型に有効である。事実、実施例８に示されるように、本願発明のキメラタンパク質により誘導される抗体は複数の遺伝子型のHPVと反応する。したがって、本願発明に従えば、従来の型特異的なワクチンとは異なり、より広いスペクトルを持ったワクチンの提供が可能になる。
In addition, the amino acid sequence of the N-
また、HBsタンパク質のアミノ酸配列の142位と143位の間に、HPVL2ペプチドの代わりに任意の感染症に対するペプチド抗原を挿入することが可能であり、本願発明の方法は、HPV感染症に限らず、HBV免疫保有者を対象とした種々の感染症用ワクチンの作製に用いることができる。
Moreover, it is possible to insert a peptide antigen for any infectious disease instead of HPVL2 peptide between
本願発明により提供されるHPV感染症用ワクチンは、HBsタンパク質の特定の位置にHPVの感染防御に関与するHPVL2ペプチドが挿入されたキメラタンパク質を有効成分として用いることを特徴とするものである。 The vaccine for HPV infection provided by the present invention is characterized in that a chimeric protein in which an HPVL2 peptide involved in HPV infection protection is inserted at a specific position of the HBs protein is used as an active ingredient.
前述したように、HPVはウイルス粒子として回収することが難しく、カプシド（L1）遺伝子の塩基配列の相同性に基づいて遺伝子型が決定されており、これまでに100種類以上の遺伝子型が分離されている。例えば、HPVの16, 18, 31,33 ,35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82, （26, 53, 66）型が高リスク型のHPV群に、HPVの6及び11型が低リスク型のHPV群に分類される。HPVのL2タンパク質には、高リスク型のHPV群間で極めてよく保存されたアミノ酸配列からなる領域（以下、「コア配列領域」と称することもある）が存在しており、低リスク型のHPV群においても同様のコア配列領域が存在する。該コア配列領域のペプチド（以下、「HPVL2コアペプチド」と称することもある）は、HPVの感染防御に関与することが知られている（特許文献８参照）。したがって、本願発明には、HPVL2コアペプチドが使用される。このようなコア配列領域として、HPV16，31及び35型では56〜75番目の20アミノ酸、HPV39，45，51，52，56，58，66及び6型では55〜74番目の20アミノ酸、HPV73型では57〜76番目の20アミノ酸、及びHPV11型では54〜73番目の20アミノ酸が挙げられる。これらの20アミノ酸の配列は、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa（X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa及びX6aaは任意のアミノ酸とする）なる式で表示できる（配列番号６）。前記の任意のアミノ酸は、HPV株の型間で変異が認められる部位であり、
（１）X1aaはThr又はSer、
（２）X2aaはSer, Thr又はAla、
（３）X3aaはThr又はSer、
（４）X4aaはSer, Thr又はAla、
（５）X5aaはIle又はVal、及び
（６）X6aaはLeu又はIle
から選択される。As mentioned above, HPV is difficult to recover as virus particles, and the genotype has been determined based on the homology of the base sequence of the capsid (L1) gene. More than 100 genotypes have been isolated so far. ing. For example,
(1) X1aa is Thr or Ser,
(2) X2aa is Ser, Thr or Ala,
(3) X3aa is Thr or Ser,
(4) X4aa is Ser, Thr or Ala,
(5) X5aa is Ile or Val, and (6) X6aa is Leu or Ile
Selected from.
Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるHPVL2コアペプチドを、動物に免疫して得られた抗体は、一部に変異を有するコア配列領域のペプチドとも反応することから、HPV株の型間で全く変異が見られないN末側から６個のアミノ酸配列（Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly）に共通のエピトープが存在することは容易に推認される。したがって、本願発明に用いられるペプチドは、該６アミノ酸からなるペプチドのN末側及び／又はC末側に任意のアミノ酸が付加された種々のペプチドを包含する。該ペプチドは、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyなる共通配列を含む場合であっても10個及び11個のアミノ酸からなるHPVL2ペプチドが挿入されたキメランパク質では良好な結果が得られないことから（実施例２，５参照）、共有配列を含み、且つ一定の長さを有するペプチドであることが必須である。すなわち、本願発明には、20±ｎ個のアミノ酸（ｎは、０〜５の整数）の長さを有するHPVペプチドが用いられる。好ましくは、ｎは０〜３である。更に好ましくは、20個のアミノ酸である。該ペプチドのアミノ酸配列は、HPVL2タンパク質由来であることが好ましい。また、ペプチドサイズの観点から多くのHPV型に共通して存在するGly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyなる配列が３個連結したペプチドを使用しても良い。該ペプチドにおいて、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列のＮ末側若しくはＣ末側に１〜５個の任意のアミノ酸が付加されたペプチドも使用できる。 Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu (SEQ ID NO: 3) Since the antibody obtained by immunizing animals with the HPVL2 core peptide is also reactive with the peptide in the core sequence region having a mutation in part, from the N-terminal side where no mutation is found between HPV strain types It is easily inferred that there is a common epitope in the six amino acid sequences (Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly). Accordingly, the peptides used in the present invention include various peptides in which any amino acid is added to the N-terminal side and / or C-terminal side of the peptide consisting of 6 amino acids. Even if the peptide contains a consensus sequence of Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly, good results cannot be obtained with a chimeric protein into which HPVL2 peptides consisting of 10 and 11 amino acids are inserted. Therefore (see Examples 2 and 5), it is essential that the peptide contains a shared sequence and has a certain length. That is, in the present invention, an HPV peptide having a length of 20 ± n amino acids (n is an integer of 0 to 5) is used. Preferably, n is 0-3. More preferably, it is 20 amino acids. The amino acid sequence of the peptide is preferably derived from HPVL2 protein. Further, from the viewpoint of peptide size, a peptide in which three sequences of Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly existing in common in many HPV types may be used. In the peptide, a peptide having 1 to 5 arbitrary amino acids added to the N-terminal side or C-terminal side of the sequence represented by Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly can also be used.
上述のHPV感染症用ワクチンに用いるペプチドは、配列番号１又は配列番号１で示される配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列から成るHBsタンパク質の特定部位（配列番号１の142位と143位の間又は同等の位置）に挿入される。得られるキメラタンパク質はウイルス様粒子（VLP）の形状をしており、該VLPを投与されたマウスは、HPVL2ペプチドに対する抗体を誘導するが、HBsタンパク質に対する抗体をほとんど誘導しない。一方、事前にHBsタンパク質で免疫されたマウスは、HBｓタンパク質に対する抗体及びHPVL2ペプチドに対する抗体を誘導する（すなわち、本願発明のキメラタンパク質はHBs抗体を有するマウスに対しブースター効果を有する）。したがって、本願発明のキメラタンパク質は、HBVの免疫を保有する対象においてもHPV感染を予防するための免疫抗原として用いることができる。
The peptide used in the vaccine for HPV infection described above is a specific site of HBs protein consisting of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 90% or more homology with the sequence shown in SEQ ID NO: 1 (
本願発明により他の態様が提供される。すなわち、HPVL2コアペプチドの代わりに任意の感染症に対する中和エピトープを含む外来ペプチドをHBsタンパク質の142位と143位の間に挿入することにより、任意の感染症を予防するためのワクチン抗原を作製する方法が提供される。上述したように、得られるキメラタンパク質を投与されたHBs抗体未保有マウス及びHBs抗体保有マウスが、該外来ペプチドに対する抗体を誘導することは容易に推測される。したがって、本願発明の方法は、HBVの免疫を保有する対象において外来ペプチドの免疫原性を向上させる方法を提供するものである。具体的には、HPVL2コアペプチド、インフルエンザウイルスA型のM2のアミノ酸配列のうち、2〜24番目の23アミノ酸から成るペプチド、アミロイドβペプチドの1〜27番目のアミノ酸からなるペプチド等が挙げ得られる。該外来ペプチドは、20±ｎ個のアミノ酸（ｎは、０〜５の整数）からなるものが用いられる。好ましくは、20個のアミノ酸となるように調整したペプチドが用いられる。
Other aspects are provided by the present invention. In other words, a vaccine antigen for preventing any infectious disease is created by inserting a foreign peptide containing a neutralizing epitope for any infectious disease instead of HPVL2 core peptide between
本願発明のHPVL2コアペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質は以下の方法により、取得することができる。まず、キメラタンパク質の母体となるHBsタンパク質をコードする遺伝子（HBs遺伝子）が作製される。HBs遺伝子の塩基配列は、これまでに多くの特許文献、非特許文献及びデーターベース（例えば、非特許文献１０及び非特許文献１１参照）に開示されているので、該HBs遺伝子の塩基配列に基づいてSambrookらが述べている一般的な遺伝子組換え技術（Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989）を利用して容易に取得することができる。また、使用するHBs抗原は、Large、middle及びsmallのいずれを使用しても良い。 The chimeric protein of the HPVL2 core peptide of the present invention and the HBs protein can be obtained by the following method. First, a gene (HBs gene) encoding an HBs protein that serves as a matrix of a chimeric protein is prepared. The base sequence of the HBs gene has been disclosed in many patent documents, non-patent documents, and databases (see, for example, Non-patent document 10 and Non-patent document 11). Can be easily obtained by using a general gene recombination technique described by Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989). Moreover, the HBs antigen to be used may be any of Large, middle and small.
次に、PCR法やDNA合成を用いた方法により、HPVL2ペプチドとHBsタンパク質とのキメラタンパク質をコードするDNA断片（以下、「キメラタンパク質DNA断片」と称することもある）が調製される。PCR法により、HBsタンパク質の内部にHPVL2ペプチドを付加したキメラタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA断片を調整する場合は以下の様に調製される。例えば、HBsタンパク質の142-143位の間にHPVL2ペプチドを挿入するときは、HBsタンパク質のＮ末から142位のアミノ酸配列をコードする塩基配列の3'側と143位からＣ末のアミノ酸配列をコードする塩基配列の5'側に、それぞれHPVL2ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を付加したプライマーを調製し、これらを用いてPCRを行うことで二つのDNA断片を得、更にPCRを行うことにより結合させて一つの断片とすることにより、HBｓタンパク質の142-143位の間にHPVL2ペプチドが挿入されたキメラタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA断片が調製される。
Next, a DNA fragment encoding a chimeric protein of HPVL2 peptide and HBs protein (hereinafter also referred to as “chimeric protein DNA fragment”) is prepared by a method using PCR or DNA synthesis. When a DNA fragment encoding the amino acid sequence of a chimeric protein in which an HPVL2 peptide is added to the inside of an HBs protein is prepared by PCR, it is prepared as follows. For example, when the HPVL2 peptide is inserted between positions 142-143 of the HBs protein, the amino acid sequence from the 3 ′ side of the base sequence encoding the amino acid sequence of the 142 position from the N-terminal of the HBs protein and the amino acid sequence from the 143 position to the C-terminal Prepare primers with nucleotide sequences encoding the amino acid sequence of HPVL2 peptide on the 5 'side of the encoded nucleotide sequence, and perform PCR using these to obtain two DNA fragments, and then perform PCR Thus, a DNA fragment encoding the amino acid sequence of the chimeric protein in which the HPVL2 peptide is inserted between
HPVL2コアペプチドをコードする塩基配列及びHBs遺伝子の塩基配列に基づき設計されるPCR用プライマーは、DNA合成受託機関（例えば、QIAGEN 社）などに依頼すれば容易に入手可能である。PCRにより増幅したDNA断片は、クローニングベクター、例えば、pUC119（タカラバイオ社）、pBlueScript（アジレント・テクノロジー社）、又はpCRII-TOPO（Invitrogen社）等にクローニングし、DNAシークエンサー（ABI Prism 377 アプライドバイオシステムズ社）により塩基配列の決定が行われる。目的のキメラタンパク質DNA断片の確認は、得られた塩基配列の結果と、設計されたPCR用プライマー配列及び既存のHBs遺伝子の塩基配列とを比較することにより行われる。 PCR primers designed based on the base sequence encoding the HPVL2 core peptide and the base sequence of the HBs gene can be easily obtained by requesting a DNA synthesis contracting organization (for example, QIAGEN). A DNA fragment amplified by PCR is cloned into a cloning vector such as pUC119 (Takara Bio), pBlueScript (Agilent Technology), or pCRII-TOPO (Invitrogen), and then a DNA sequencer (ABI Prism 377 Applied Biosystems). The base sequence is determined by the company. The target chimeric protein DNA fragment is confirmed by comparing the result of the obtained base sequence with the designed primer sequence for PCR and the base sequence of the existing HBs gene.
HBsタンパク質の内部にHPVL2ペプチドを付加したキメラタンパク質DNA断片は、全合成をしても良い。全合成はDNA合成受託機関（例えば、オペロン社）などに依頼すれば容易に入手可能である。 The chimeric protein DNA fragment in which the HPVL2 peptide is added to the inside of the HBs protein may be totally synthesized. Total synthesis can be easily obtained by requesting a DNA synthesis contractor (for example, Operon).
こうして得られた本願発明のキメラタンパク質DNA断片を適当な発現ベクターに組み込み、これを宿主に導入することによって、キメラタンパク質DNA断片の発現が行なわれる。発現ベクターとしては、プラスミドやウイルスベクター等を用いることができる。該発現ベクターに含まれるプロモーターは、宿主として用いる微生物又は動物細胞との組み合わせにより、Lac、tac、pho5、adh、SV40初期、SV40後期、及びβアクチンなどのプロモーターから選択することができる。宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが常用されるが、使用目的にあわせて選択すればよい。宿主細胞を形質転換するときには公知の方法を利用すればよい。例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、リポフェクチン系のリポソームを用いる方法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などが利用でき、使用する宿主細胞により適当な方法を選択すれば良い。 The chimeric protein DNA fragment of the present invention thus obtained is incorporated into an appropriate expression vector and introduced into a host to express the chimeric protein DNA fragment. As an expression vector, a plasmid, a viral vector, or the like can be used. The promoter contained in the expression vector can be selected from promoters such as Lac, tac, pho5, adh, early SV40, late SV40, and β-actin depending on the combination with the microorganism or animal cell used as the host. As the host, bacteria, yeast, animal cells, plant cells, insect cells and the like are commonly used, and may be selected according to the purpose of use. A known method may be used when transforming a host cell. For example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using lipofectin-based liposomes, a protoplast polyethylene glycol fusion method, an electroporation method, and the like can be used, and an appropriate method may be selected depending on the host cell to be used.
本願発明のキメラタンパク質を発現している形質転換細胞は、以下の２段階の方法でスクリーニングされる。まず、形質転換処理を行った細胞を10〜1,000 nmolのLメトトレキサート（MTX）と100〜1,000 μg/mLのジェネティシン（Geneticin G418 sulfate）を含む培地で一定期間培養して生存する細胞を選択／増殖させることにより形質転換細胞を選択する。ついで、得られた形質転換細胞中にキメラタンパク質が発現している該細胞が選択される。具体的には、本発明のキメラタンパク質は、培養上清や細胞破砕物につき、HPVL2ペプチド又はHBsタンパク質と特異的に結合する抗体を用いてELISAやWB等を行うことにより確認される。 Transformed cells expressing the chimeric protein of the present invention are screened by the following two-step method. First, cells that have undergone transformation treatment are cultured for a certain period in a medium containing 10-1,000 nmol of L methotrexate (MTX) and 100-1,000 μg / mL of Geneticin G418 sulfate. To select transformed cells. Next, the cells in which the chimeric protein is expressed are selected in the resulting transformed cells. Specifically, the chimeric protein of the present invention is confirmed by performing ELISA, WB, etc. on the culture supernatant and cell disruption using an antibody that specifically binds to HPVL2 peptide or HBs protein.
形質転換細胞の培養には、通常の細胞を培養するときに用いられる条件を用いれば良い。すなわち、T7m培地、Ex-cell SP2/0培地、YMM-01B培地、YMM-01C培地、OptiCHO培地、Ex-cell 302培地等、あるいはこれらのいくつかを混合した培地が使用される。これに、ウシ胎児血清、カルシウム、マグネシウム、アミノ酸、ビタミン等を添加することもある。培養温度は32℃〜38℃、培養期間は2〜20日間である。医薬品を製造する段階では、キメラタンパク質発現細胞を無血清培地で維持するのが好ましい。 For culturing transformed cells, the conditions used when culturing ordinary cells may be used. That is, T7m medium, Ex-cell SP2 / 0 medium, YMM-01B medium, YMM-01C medium, OptiCHO medium, Ex-cell 302 medium, etc., or a medium in which some of these are mixed is used. To this, fetal bovine serum, calcium, magnesium, amino acids, vitamins, etc. may be added. The culture temperature is 32 ° C to 38 ° C, and the culture period is 2 to 20 days. In the step of producing a pharmaceutical product, it is preferable to maintain the chimeric protein-expressing cells in a serum-free medium.
本願発明のキメラタンパク質の精製は、タンパク質化学において通常使用される方法、例えば、遠心分離、塩析法、限外ろ過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマト法、ゲルろ過クロマト法、アフィニティークロマト法、疎水クロマト法、ハイドロキシアパタイトクロマト法などを適宜組み合わせることにより達成される。得られたキメラタンパク質の量は、BCA Protein Assay Reagent Kit（Pierce Biotechnology, Inc）、プロテインアッセイキット（日本バイオ・ラッド株式会社）などを用いて測定される。 Purification of the chimeric protein of the present invention can be accomplished by methods commonly used in protein chemistry, such as centrifugation, salting-out, ultrafiltration, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography. This is achieved by appropriately combining a method, an affinity chromatography method, a hydrophobic chromatography method, a hydroxyapatite chromatography method and the like. The amount of the obtained chimeric protein is measured using a BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce Biotechnology, Inc), a protein assay kit (Nippon Bio-Rad Co., Ltd.) or the like.
本願発明のキメラタンパク質のワクチンとしての評価は、抗原を小動物、例えば、ニワトリ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、又はサルなどに免疫した後、in vitroの系においては、免疫動物から採血後、血清を分離し、当該血清中の本発明のキメラタンパク質に対する抗体力価やHPV及びＢ型肝炎ウイルスに対する中和抗体価を測定することにより、また、in vivoの系においては、前記免疫動物に擬似HPVを投与し、その後免疫動物の生死、病状等を観察することにより行われる。一般にin vitroの系における抗体の測定には、ELISA法、PHA法、プラークアッセイ法などが常用される。より具体的には、B型肝炎ウイルスに対する中和抗体はHBs抗体を測定することにより、また、HPVに対する中和抗体は、ウイルス様粒子（Virus like particle：VLP）や感染性偽ウイルス（Buck C B等、Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. J Virol 78: 751-757, 2004.）との結合能を測定することにより行われる。 Evaluation of the chimeric protein of the present invention as a vaccine is carried out by immunizing a small animal such as a chicken, mouse, rat, guinea pig, dog, or monkey with an antigen. And measuring the antibody titer against the chimeric protein of the present invention and the neutralizing antibody titer against HPV and hepatitis B virus in the serum, and in an in vivo system, the immunized animal is treated with pseudo-HPV. And then observing the life and death of immunized animals, disease states, and the like. Generally, ELISA, PHA, plaque assay, etc. are commonly used for measuring antibodies in an in vitro system. More specifically, the neutralizing antibody against hepatitis B virus is measured by measuring HBs antibody, and the neutralizing antibody against HPV is virus-like particle (VLP) or infectious pseudovirus (Buck CB). Etc., by measuring the binding ability with Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. J Virol 78: 751-757, 2004.).
免疫方法（例えば、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、経鼻、経口、及び舌下等の投与部位、及び免疫期間等）は、ワクチン等の免疫原性を調べる時に常用される一般的な免疫手法が用いられる。免疫に用いる抗原には、その免疫能を高めるためにアジュバント、例えば、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムゲル、CpGオリゴヌクレオチド、MDP、QS21、MPL+TDMエマルジョン等、ヒトに対して使用できるものであればいずれのアジュバントを添加しても良い。更に抗原の安定性や形状維持のために医薬品の用途として許容できる種々の添加剤を加えることもある。このような添加剤として、安定化剤（アルギニン、ポリソルベート80、マクロゴール4000など）、賦型剤（マンニトール、ソルビトール、ショ糖、及び乳糖）、緩衝剤（リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化ナトリウムなど）、等張化剤（塩化ナトリウムなど）、保存剤（チメロサール、フェノキシエタノールなど）、不活化剤（ホルマリン、β−プロピオラクトンなど）等が挙げられる。
Immunization methods (for example, administration sites such as subcutaneous, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, nasal, oral, sublingual, and immunization periods) are commonly used when examining immunogenicity of vaccines and the like. Immunization techniques are used. Antigens used for immunization are those that can be used against humans, such as adjuvants such as aluminum hydroxide gel, aluminum phosphate gel, CpG oligonucleotide, MDP, QS21, MPL + TDM emulsion, in order to enhance their immunity. Any adjuvant may be added, if any. Furthermore, in order to maintain the stability and shape of the antigen, various additives that are acceptable for pharmaceutical use may be added. Such additives include stabilizers (arginine,
こうして得られる本発明のキメラタンパク質は、HPV感染の増殖阻止に有効な抗体産生能を有するものであり、HPV感染症の予防・治療薬の材料として、あるいはHPV及びB型肝炎ウイルスの検出系（例えば、ELISA法、ウェスタンブロット法、及びドットブロット法等の抗体測定法による検出系）を構築するための材料として使用することができる。 The chimeric protein of the present invention thus obtained has an antibody-producing ability effective in inhibiting the growth of HPV infection, and is used as a material for a preventive / therapeutic agent for HPV infection or a detection system for HPV and hepatitis B virus ( For example, it can be used as a material for constructing a detection system based on antibody measurement methods such as ELISA, Western blot, and dot blot.
また、キメラタンパク質をコードするDNA断片が、生体内に投与されたときに該キメラタンパク質を発現できる発現ベクターを用いてDNAワクチンとすることもできる。このような発現ベクターとして大腸菌由来のプラスミドが挙げられる。該プラスミドには哺乳類の細胞内で遺伝子を発現させるため、その上流に真核生物における強力なプロモーター、例えば、サイトメガロウイルスのIE(immediate-early)プロモーター、β-actinプロモーター、CAGプロモーター等が配される。また、該DNA断片をウイルスや細菌などに導入すれば、生ワクチンとすることもできる。このような発現ベクターとして、ウイルス（ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクター、麻しんウイルスベクター等）、細菌（サルモネラベクター等）、原虫（マラリア原虫ベクター等）等が挙げられる。例えば、本発明のキメラタンパク質をコードするDNA断片が組み込まれたワクシニアウイルスベクター（LC16m8株）を用いた場合、弱毒生ワクチンとしての機能だけでなく、痘瘡ワクチンとしての効果が期待できる。弱毒生ワクチンは、ワクチン材料の精製工程が簡略化でき、製造コストの低減に繋がる。HBsタンパク質が組み込まれた組換えワクシニアウイルスは、HBsタンパク質のみで構成された粒子を発現する（Vaccine 1987 Mar;5(1):65-70）。したがって、本願発明のキメラタンパク質DNA断片が組み込まれた組換えワクシニアウイルス（LC16m8株）は、同様に粒子を形成することが予測され、HPVL2ペプチドの強い免疫原性が保持された弱毒生ワクチンとなることが期待される。 In addition, a DNA vaccine can be prepared by using an expression vector capable of expressing a chimeric protein when the DNA fragment encoding the chimeric protein is administered in vivo. Examples of such an expression vector include a plasmid derived from E. coli. In order to express the gene in mammalian cells, the plasmid contains a strong promoter in eukaryotes such as cytomegalovirus IE (immediate-early) promoter, β-actin promoter, CAG promoter and the like. Is done. In addition, a live vaccine can be obtained by introducing the DNA fragment into a virus or a bacterium. Examples of such expression vectors include viruses (vaccinia virus vectors, herpes virus vectors, adenovirus vectors, Sendai virus vectors, measles virus vectors, etc.), bacteria (Salmonella vectors, etc.), protozoa (malaria protozoan vectors, etc.) and the like. For example, when a vaccinia virus vector (LC16m8 strain) in which a DNA fragment encoding the chimeric protein of the present invention is incorporated, not only a function as a live attenuated vaccine but also an effect as a pressure ulcer vaccine can be expected. The live attenuated vaccine can simplify the purification process of the vaccine material, leading to a reduction in production cost. Recombinant vaccinia virus in which HBs protein is incorporated expresses particles composed only of HBs protein (Vaccine 1987 Mar; 5 (1): 65-70). Therefore, the recombinant vaccinia virus (LC16m8 strain) into which the chimeric protein DNA fragment of the present invention is incorporated is predicted to form particles in the same manner, and becomes a live attenuated vaccine that retains the strong immunogenicity of the HPVL2 peptide. It is expected.
また、本願発明のキメラタンパク質を有効成分とするワクチンは、単独でHPV感染症を予防するためのワクチンとして使用してもよく、他のウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス等）、細菌（例えば、ヘモフィルスインフルエンザ菌、破傷風菌、ジフテリア菌等）及び原虫（例えば、マラリア等）感染症に対するワクチンよりなる群から選択される少なくとも１種類のワクチンと組み合わせることにより多価混合ワクチンとして使用することもできる。 The vaccine comprising the chimeric protein of the present invention as an active ingredient may be used alone as a vaccine for preventing HPV infection, and other viruses (for example, influenza virus, hepatitis A virus, Japanese encephalitis virus) Etc.), bacteria (for example, Haemophilus influenzae, tetanus, diphtheria, etc.) and protozoa (for example, malaria etc.) infectious disease, combined with at least one vaccine selected from the group consisting of vaccines It can also be used as
以下、実施例に従い、本願発明を更に詳細に説明するが、下記の実施例に何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
《動物細胞発現プラスミドの構築》
HBsタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）の各部位に、HPVL2タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の56-75位に相当する配列（配列番号３）、56-66位に相当する配列（配列番号４）及び56-65位に相当する配列（配列番号５）を挿入したDNA断片を全合成（オペロン社製）した（表１）。表１の「−」は未実施を意味する。<Construction of animal cell expression plasmid>
A sequence corresponding to positions 56-75 of the amino acid sequence of HPVL2 protein (SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO: 3) and a sequence corresponding to positions 56-66 (SEQ ID NO: 1) at each site of the amino acid sequence of HBs protein (SEQ ID NO: 1) The DNA fragment into which the sequence corresponding to positions 4) and 56-65 (SEQ ID NO: 5) was inserted was totally synthesized (Operon) (Table 1). “-” In Table 1 means not implemented.
次いで、上記の各DNA断片と、予め制限酵素 Sal Iで消化し、仔牛小腸由来アルカリホスファターゼ処理により末端脱リン酸化した動物細胞用発現プラスミドpCAGG-S1(Sal).dhfr.neo（WO2003/004641）をLigation High（東洋紡）で連結環状化し、各発現プラスミドを構築した。HBsタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）の127位と128位の間に配列番号３の配列を挿入した発現プラスミドは、米村らの方法に従って作製した（WO2014/103608号公報参照）。 Subsequently, each of the above DNA fragments and an animal cell expression plasmid pCAGG-S1 (Sal) .dhfr.neo (WO2003 / 004641) digested in advance with the restriction enzyme Sal I and terminally dephosphorylated by treatment with calf small intestine-derived alkaline phosphatase Were ligated and circularized with Ligation High (Toyobo) to construct each expression plasmid. An expression plasmid in which the sequence of SEQ ID NO: 3 was inserted between positions 127 and 128 of the amino acid sequence of the HBs protein (SEQ ID NO: 1) was prepared according to the method of Yonemura et al. (See WO2014 / 103608).
《チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を用いたキメラ遺伝子の発現》
実施例１で得られた動物細胞発現プラスミドをそれぞれ制限酵素Pvu Iで消化し線状化した。この線状化したプラスミドを用いて、CHO K1（FT Kao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60: 1275-1281p, 1968）をリポフェクチン法（LF2000 インビトロジェン）で形質転換処理した。形質転換処理後、薬剤または栄養枯渇により形質転換体を選択した。
得られた形質転換体を、0.25%トリプシンを用いて細胞剥離し、先述の選択培地を用いて細胞の拡張を行った。拡張後、PBS(-)で洗浄し、無血清培地に培地交換した。37℃で14日間培養後、培養上清中のキメラタンパク質の濃度をHPVL2タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチELISAで定量した。その結果、発現量はHBｓタンパク質の142/143位の間にHPVL2の56-75配列(20アミノ酸)を挿入したキメラタンパク質（HBs/HPVL2 142-20：配列番号７）が約24 μg/mL、HBｓタンパク質の127/128位の間にHPVL2の56-75配列(20アミノ酸)を挿入したキメラタンパク質（HBs/HPVL2 127-20：配列番号８）が約9μg/mL及びHBｓタンパク質の142/143位の間にHPVL2の56-66配列(11アミノ酸)を挿入したキメラタンパク質（HBs/HPVL2 142-11：配列番号９）が約3μg/mLであった。他のキメラタンパク質については、HBsタンパク質の終始コドン直後に挿入したキメラタンパク質（HBs/HPVL2 C-20及びHBs/HPVL2 C-11）を除き、発現量が低いか、検出されなかった。《Chimeric gene expression using Chinese hamster ovary (CHO) cells》
The animal cell expression plasmid obtained in Example 1 was digested with the restriction enzyme Pvu I and linearized. Using this linearized plasmid, CHO K1 (FT Kao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60: 1275-1281p, 1968) was transformed by the lipofectin method (LF2000 Invitrogen). After the transformation treatment, transformants were selected by drug or nutrient depletion.
The obtained transformant was detached using 0.25% trypsin, and the cells were expanded using the above-described selective medium. After expansion, the plate was washed with PBS (−), and the medium was replaced with a serum-free medium. After culturing at 37 ° C. for 14 days, the concentration of the chimeric protein in the culture supernatant was quantified by sandwich ELISA using a monoclonal antibody against HPVL2 protein. As a result, the expression level was about 24 μg / mL of a chimeric protein (HBs / HPVL2 142-20: SEQ ID NO: 7) in which the HPVL2 56-75 sequence (20 amino acids) was inserted between
《細胞培養上清からキメラタンパク質の精製》
実施例２により得られた５種のキメラタンパク質及びHBsタンパク質のみを発現するCHO K1細胞を選択培地を用いて拡張した。拡張後、PBS(-)で洗浄後、無血清培地（T7m；Ex-cell SP2/0；YMM-01B 3種混合培地）に培地交換し、37℃、10日間以上培養した。培養液を遠心分離で清澄化した後、ベンゾナーゼ（Merck社製）共存下、排除限界1,000 kDaのカートリッジ式UF（ビバセル100；ザルトリウス製）で培養上清を濃縮した。濃縮後、PBS(-)にバッファ置換を実施し、塩化セシウムを1.2 g/Lの密度となるように添加した後、4℃、23,000×gで超遠心分離を行った。キメラタンパク質又はHBsタンパク質を含むバンドを抽出し、排除限界300ｋDaのUFカートリッジ（ビバスピン；ザルトリウス社製）による脱塩、PBS(-)へのバッファ置換後、60%、50%、40%、20%ショ糖を含むPBS(-)を重層した遠心管にキメラタンパク質又はHBsタンパク質を含むPBS(-)を加えた不連続密度勾配ショ糖の超遠心分離を行った。4℃、120,000×gの遠心条件で分離を行った後、キメラタンパク質又はHBsタンパク質を含むバンドを抽出し、排除限界300 kDaのUFカートリッジで脱糖、PBS(-)へのバッファ交換を行った。得られたキメラタンパク質及びHBsタンパク質は、いずれもウイルス様粒子(VPL)を形成していた。<< Purification of chimeric protein from cell culture supernatant >>
CHO K1 cells expressing only the five chimeric proteins and HBs protein obtained in Example 2 were expanded using a selective medium. After expansion, after washing with PBS (−), the medium was replaced with a serum-free medium (T7m; Ex-cell SP2 / 0; YMM-01B, 3 types mixed medium), and cultured at 37 ° C. for 10 days or more. After clarification of the culture solution by centrifugation, the culture supernatant was concentrated with a cartridge type UF (
《キメラタンパク質のマウスへの免疫》
実施例３で得られたキメラタンパク質及び別途調製された酵母由来HBsタンパク質にアルミニウムアジュバントを加えて25 μg/mlの各免疫原を調製し、各0.2 mlをメスBalb/cマウスの尾根部皮下に接種した（各群10匹ずつ）。接種後、3週目で採血して得た抗血清（１次免疫血清）及び初回接種日から3週目に同免疫原を上記と同様に接種後、さらに初回接種日から6週目で採血し、抗血清（２次免疫血清）を得た。《Immune of chimeric protein to mice》
25 μg / ml of each immunogen was prepared by adding aluminum adjuvant to the chimeric protein obtained in Example 3 and a separately prepared yeast-derived HBs protein, and 0.2 ml of each immunogen was subcutaneously applied to the ridge of female Balb / c mice. Inoculated (10 per group). After inoculation, blood was collected in the third week after the antiserum (primary immune serum) and the same immunogen were inoculated in the same manner as described above on the third week from the first inoculation day, and further on the sixth week from the first inoculation day. Antiserum (secondary immune serum) was obtained.
《HPV16型L2ペプチドと抗血清の反応性》
実施例４で得られた個体別の１次免疫血清を用いて、ELISAにより、HPVL2ペプチドに対する抗体産生能を評価した。より具体的には、96 well ELISAプレートの各wellに、PBSで希釈したHPV16型のL2タンパク質の56〜75番目の20アミノ配列からなる合成ペプチド（配列番号３）(1.0 μg/well)を加え、4℃で一晩静置した。1% BSAを含むブロッキング溶液で室温、1時間以上ブロッキングし、抗原固相化プレートとした。ブロッキング溶液で1:100に希釈した各血清を、固相化したペプチドと37℃で2時間反応させた。PBST（0.05% Tween20を含むPBS）で洗浄後、ブロッキング溶液で1:2000に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識ラット抗マウスIgG抗体（シグマ社製）を加え、37℃で1時間反応させた。PBSTで洗浄後、基質溶液（TMB：インビトロジェン社製）を加え、室温で30分反応させた後、450nmの吸光度を測定した。その結果、HBs/HPVL2 142-20キメラタンパク質で最も良好な抗体価の上昇が認められた（図１）。HBs/HPVL2 C-20キメラタンパク質では抗体価の上昇は認められたが、HBs/HPVL2 142-11キメラタンパク質及びHBs/HPVL2 C-11キメラタンパク質では抗体価の上昇は認められなかった（データ未記載）。<Reactivity of HPV16 L2 peptide and antiserum>
Using the individual primary immune sera obtained in Example 4, the antibody production ability against the HPVL2 peptide was evaluated by ELISA. More specifically, a synthetic peptide (SEQ ID NO: 3) (1.0 μg / well) consisting of the 56th to 75th amino acid sequences of HPV16 type L2 protein diluted with PBS was added to each well of a 96 well ELISA plate. And left at 4 ° C. overnight. Blocking with a blocking solution containing 1% BSA at room temperature for 1 hour or longer was used as an antigen-immobilized plate. Each serum diluted 1: 100 with a blocking solution was reacted with the immobilized peptide at 37 ° C. for 2 hours. After washing with PBST (PBS containing 0.05% Tween20), horseradish peroxidase (HRP) -labeled rat anti-mouse IgG antibody (Sigma) diluted 1: 2000 with blocking solution was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. . After washing with PBST, a substrate solution (TMB: manufactured by Invitrogen) was added and reacted at room temperature for 30 minutes, and then the absorbance at 450 nm was measured. As a result, the best increase in antibody titer was observed in the HBs / HPVL2 142-20 chimeric protein (FIG. 1). The HBs / HPVL2 C-20 chimeric protein showed an increase in antibody titer, but the HBs / HPVL2 142-11 chimeric protein and the HBs / HPVL2 C-11 chimeric protein showed no increase in antibody titer (data not shown) ).
《HBｓタンパク質に対する基礎免疫を有するマウスへのキメラタンパク質の免疫》
酵母由来HBsタンパク質にアルミアジュバントを加え、1 μg/mLとした免疫原を調製し、0.2 mLをメスBalb/cマウスの尾根部皮下に接種した。その5週間後に部分採血し、個々の血清中の抗HBs抗体価を市販キット「TOSOH」II(東ソー社)にて測定したところ、700 mIU/mL〜50,000 mIU/mLに上昇していることを確認した。<< Immunization of chimeric protein to mice with basic immunity against HBs protein >>
An immunoadjuvant was prepared at 1 μg / mL by adding aluminum adjuvant to yeast-derived HBs protein, and 0.2 mL was inoculated subcutaneously into the ridge of female Balb / c mice. Five weeks later, partial blood collection was performed, and the anti-HBs antibody titer in each serum was measured with a commercial kit “TOSOH” II (Tosoh Corp.). It was found that it increased from 700 mIU / mL to 50,000 mIU / mL. confirmed.
この値を基に抗体価の分布が均等になるように各群10匹ずつの3群に分け、HBs/HPVL2 127-20、HBs/HPVL2 142-20、HBs/HPVL2 C-20キメラタンパク質、酵母由来HBsタンパク質それぞれに、アルミニウムアジュバントを加えて25 μg/mLの各免疫原を調製し、各0.2 mlをメスBalb/cマウスの尾根部皮下に接種した。この接種日から3週目後に、部分採血（図１〜３において「初回免疫後三週経過時点」と記載）及び追加免疫を行った。この追加免疫からさらに3週後に部分採血し（図１〜３において「二回免疫後三週経過時点」と記載）、血清を得た。これらの血清中の抗HBs抗体価及び抗HPVL2抗体価を測定した。 Based on this value, the antibody titer distribution was divided into 3 groups of 10 animals each, HBs / HPVL2 127-20, HBs / HPVL2 142-20, HBs / HPVL2 C-20 chimeric protein, yeast To each derived HBs protein, aluminum adjuvant was added to prepare 25 μg / mL of each immunogen, and 0.2 ml of each was inoculated subcutaneously into the ridge of female Balb / c mice. Three weeks after the day of inoculation, partial blood collection (described as “3 weeks after initial immunization” in FIGS. 1 to 3) and booster immunization were performed. A further portion of blood was collected 3 weeks after this additional immunization (described as “3 weeks after the second immunization” in FIGS. 1 to 3) to obtain serum. The anti-HBs antibody titer and anti-HPVL2 antibody titer in these sera were measured.
《抗血清のHBｓタンパク質及びHPVL2ペプチドに対する抗体価測定》
実施例６で得られた個体別の免疫血清を用いて、ELISAにより、HPVL2ペプチドに対する抗体産生能及びHBｓタンパク質に対する抗体産生能を評価した。<Measurement of antibody titer against antiserum HBs protein and HPVL2 peptide>
Using the individual immune sera obtained in Example 6, the antibody-producing ability against HPVL2 peptide and the antibody-producing ability against HBs protein were evaluated by ELISA.
（１）HBｓ抗体価の測定
96 well ELISAプレートの各wellに、PBSで希釈した酵母由来HBsタンパク質(2 μg/well)を加え、4℃で一晩静置した。1% BSAを含むブロッキング溶液で室温、1時間以上ブロッキングし、抗原固相化プレートとした。ブロッキング溶液で1:1000に希釈した各血清を、固相化した酵母由来HBsタンパク質と室温で2時間反応させた。PBST（0.05% Tween20を含むPBS）で洗浄後、ブロッキング溶液で1:2000に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識ラット抗マウスIgG抗体（シグマ社）を加え、37℃で1時間反応させた。PBSTで洗浄後、基質溶液（TMB：インビトロジェン社製）を加え、室温で30分反応させた後、450nmの吸光度を測定した。その結果、各キメラタンパク質は2回免疫後三週経過時点の血清において、酵母由来HBｓタンパク質で免疫したマウス由来の血清と同等の抗HBs抗体価を示した(図２)。(1) Measurement of HBs antibody titer
To each well of a 96 well ELISA plate, yeast-derived HBs protein (2 μg / well) diluted with PBS was added and allowed to stand at 4 ° C. overnight. Blocking with a blocking solution containing 1% BSA at room temperature for 1 hour or longer was used as an antigen-immobilized plate. Each serum diluted 1: 1000 with a blocking solution was reacted with the immobilized yeast-derived HBs protein at room temperature for 2 hours. After washing with PBST (PBS containing 0.05% Tween20), horseradish peroxidase (HRP) -labeled rat anti-mouse IgG antibody (Sigma) diluted 1: 2000 with a blocking solution was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing with PBST, a substrate solution (TMB: manufactured by Invitrogen) was added and reacted at room temperature for 30 minutes, and then the absorbance at 450 nm was measured. As a result, each chimeric protein showed an anti-HBs antibody titer equivalent to that of serum derived from mice immunized with yeast-derived HBs protein in the serum after 3 weeks from the second immunization (FIG. 2).
（２）HPVL2ペプチド抗体価の測定
実施例５に記載の方法により、HPVL2ペプチドに対する抗体価を測定した結果、HBs/HPVL2 142-20キメラタンパク質の二回免疫後三週経過時点の血清において、HBs/HPVL 127-20キメラタンパク質よりも優位な抗体価上昇を認めた(図３)。HBs/HPVL2 C-20キメラタンパク質では抗体の誘導は認められなかった（データ未記載）。(2) Measurement of HPVL2 peptide antibody titer The antibody titer against the HPVL2 peptide was measured by the method described in Example 5. As a result, HBs / HPVL2 142-20 chimeric protein was treated with HBs in the serum at 3 weeks after the second immunization. A significant increase in antibody titer was observed over the / HPVL 127-20 chimeric protein (FIG. 3). No antibody induction was observed in the HBs / HPVL2 C-20 chimeric protein (data not shown).
《異なる遺伝子型由来のHPV-偽ウイルス（PsV）に対する抗血清の中和能》
実施例４で得られたHBs/HPVL2 142-20及びHBs/HPVL2 127-20キメラタンパク質で免疫した個体別の２次免疫血清を等量ずつ混合したプール抗血清について、以下の方法により、HPV-PsVに対する中和能を評価した。
（１）PsVの作製
HPV16、18、33、35、51、52または58のHPVL1、及び、HPVL2発現プラスミドとルシフェラーゼ発現プラスミドを混合し、293FT細胞にトランスフェクションした。2日後に、細胞をLysis Buffer（0.35% Brij58、0.9mM CaCl2、10mM MgCl2、1μl Benzonaseを含むPBS）に溶解し、37℃で一晩インキュベートした。終濃度0.8Mになるように5M NaClを加え氷中に10分間静置した後、10,000g、4℃、10分間遠心し、上清を回収した。上清を、27%、33%、39%のiodixanol (0.8M NaCl in PBSで調整)の上に重層し、50,000rpm、16℃、3.5時間超遠心した。超遠心後、PsVを含むフラクションを回収した。
（２）中和試験
細胞培養用培地(10%FBSを含むフェノールレッド不含DMEM)で希釈した上記調製のPsVと、1:12.5から1:400まで同培地で段階希釈した各プール抗血清を等量ずつ混和し、4℃で1時間反応させた。その後、予め96ウェルプレートに準備した293FT細胞（1 X 104個/well）に感染させた。3日後に、培養上清中のルシフェラーゼ活性を、ワングローアッセイキット (プロメガ社)と発光プレートリーダー（MicroLumat Plus LB96V、ベルトールドジャパン株式会社）を用いて測定した。その結果、いずれの偽ウイルスに対しても、未免疫マウス血清と比較して明確な中和活性が認められた（図４）。《Neutralizing ability of antisera against HPV-pseudovirus (PsV) derived from different genotypes》
The pool antiserum obtained by mixing equal amounts of individual secondary immune sera immunized with HBs / HPVL2 142-20 and HBs / HPVL2 127-20 chimeric protein obtained in Example 4 was treated by the following method. The neutralizing ability against PsV was evaluated.
(1) Production of PsV
HPVL16, 18, 33, 35, 51, 52 or 58 HPVL1 and HPVL2 expression plasmids and luciferase expression plasmids were mixed and transfected into 293FT cells. Two days later, the cells were dissolved in Lysis Buffer (PBS containing 0.35% Brij58, 0.9 mM CaCl 2 , 10 mM MgCl 2 , 1 μl Benzonase) and incubated overnight at 37 ° C. After adding 5M NaCl to a final concentration of 0.8M and allowing to stand in ice for 10 minutes, the mixture was centrifuged at 10,000g, 4 ° C for 10 minutes, and the supernatant was collected. The supernatant was layered on 27%, 33%, and 39% iodixanol (adjusted with 0.8M NaCl in PBS), and ultracentrifuged at 50,000 rpm, 16 ° C. for 3.5 hours. After ultracentrifugation, the fraction containing PsV was collected.
(2) Neutralization test PsV of the above preparation diluted with cell culture medium (phenol-free DMEM containing 10% FBS) and each pooled antiserum diluted serially from 1: 12.5 to 1: 400 in the same medium. Equal amounts were mixed and reacted at 4 ° C. for 1 hour. Thereafter, the cells were infected with 293FT cells (1 × 10 4 cells / well) prepared in advance in a 96-well plate. Three days later, the luciferase activity in the culture supernatant was measured using a one-glow assay kit (Promega) and a luminescent plate reader (MicroLumat Plus LB96V, Bertoled Japan KK). As a result, a clear neutralizing activity was observed against any pseudovirus compared to the unimmunized mouse serum (FIG. 4).
《HBｓタンパク質に対する基礎免疫を有するサルへのキメラタンパク質の免疫効果》
（１）HBs/HPVL2 127-20の評価
2匹のカニクイザルに対してHBｓタンパク質に対する基礎免疫を誘導した後にHBs/HPVL2 127-20で免疫した。酵母由来HBsタンパク質にアルミアジュバントを加え、20 μg/mL、40 μg/mLとした免疫原を調製し、0.5 mLをカニクイザルの背部皮下に3週間隔を開けて2回投与した。2回目投与の2、3、4週間後に部分採血し、実施例7に記載のELISA法でHBｓ抗体価の測定を行ったところ、2匹のサルのいずれにおいてもHBs抗体価の上昇が確認された。《Immune effect of chimeric protein on monkeys with basic immunity against HBs protein》
(1) Evaluation of HBs / HPVL2 127-20
Two cynomolgus monkeys were immunized with HBs / HPVL2 127-20 after induction of basal immunity against HBs protein. An immunoadjuvant was prepared by adding aluminum adjuvant to yeast-derived HBs protein to 20 μg / mL and 40 μg / mL, and 0.5 mL was administered twice subcutaneously at the back of the cynomolgus monkey at intervals of 3 weeks. Partial blood collection was performed 2, 3, and 4 weeks after the second administration, and the HBs antibody titer was measured by the ELISA method described in Example 7. As a result, in both monkeys, an increase in the HBs antibody titer was confirmed. It was.
HBｓタンパク質に対する基礎免疫が誘導されていることが確認されたため、HBｓタンパク質2回目投与の5週後の時点でHBs/HPVL2 127-20を投与した。実施例2で得られたCHO細胞由来のHBs/HPVL2 127-20キメラタンパク質にアルミアジュバントを加え、20 μg/mLとした免疫原を調製し、0.5 mLをカニクイザルの背部皮下に3週間隔を開けて2回投与した。2回目投与の2、3、5, 6週間後に部分採血し、実施例5に記載の方法でHPVL2ペプチド抗体価の測定を行ったところ、HPVL2ペプチド抗体価の上昇は確認できなかった（図５）。この結果は、実施例7のマウスにおける評価結果と同様であって、マウスのみならずサルにおいてもHBsタンパク質で免疫した個体にはHPVL2ペプチドに対する免疫を誘導することができないことが確認された。HBs/HPVL2 127-20を用いたワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）に対する免疫を保有する対象に対して有効に作用しないことが更に危惧される結果となった。 Since it was confirmed that basic immunity against HBs protein was induced, HBs / HPVL2 127-20 was administered at 5 weeks after the second administration of HBs protein. Aluminum adjuvant is added to the CHO cell-derived HBs / HPVL2 127-20 chimeric protein obtained in Example 2 to prepare an immunogen to 20 μg / mL, and 0.5 mL is subcutaneously subcutaneously on the back of the cynomolgus monkey at intervals of 3 weeks. Was administered twice. Partial blood collection was performed 2, 3, 5, and 6 weeks after the second administration, and when the HPVL2 peptide antibody titer was measured by the method described in Example 5, no increase in the HPVL2 peptide antibody titer could be confirmed (FIG. 5). ). This result was the same as the evaluation result in the mouse of Example 7, and it was confirmed that not only the mouse but also the monkey could not induce immunity against the HPVL2 peptide in the individual immunized with the HBs protein. It was further feared that the vaccine using HBs / HPVL2 127-20 does not act effectively on subjects possessing immunity against hepatitis B virus (HBV).
（２）HBs/HPVL2 142-20の評価
HBｓタンパク質に対する基礎免疫を保有する4匹のカニクイザルに対してHBs/HPVL2 142-20を免疫した。はじめに、4匹の個々の血清中の抗HBs抗体価を実施例6と同様に市販キット「TOSOH」II(東ソー社)にて測定し、4匹の個体（No.5〜8）のHBs抗体価がそれぞれ、10,193 mIU/mL(No.5)、8,904 mIU/mL(No.6)、3,476 mIU/m(No.7)L、1346 mIU/mL(No.8)であることを確認し、いずれの個体もHBｓタンパク質に対する基礎免疫を有していることを確認した。(2) Evaluation of HBs / HPVL2 142-20
Four cynomolgus monkeys possessing basal immunity against HBs protein were immunized with HBs / HPVL2 142-20. First, anti-HBs antibody titers in four individual sera were measured with a commercially available kit “TOSOH” II (Tosoh Corporation) in the same manner as in Example 6, and HBs antibodies of four individuals (No. 5 to 8) Confirm that the values are 10,193 mIU / mL (No.5), 8,904 mIU / mL (No.6), 3,476 mIU / m (No.7) L, and 1346 mIU / mL (No.8), respectively. All individuals were confirmed to have basic immunity against HBs protein.
次に、実施例2で得られたCHO細胞由来のHBs/HPVL2 142-20キメラタンパク質をPBSで1回目は120 μg/mL，2回目以降は240 μg/mLに調製した。等量のアジュバント（1回目投与：CFA，2回目投与以降：IFA）に混和してエマルジョンとし最終抗原濃度を1回目は60 μg/mL，2回目以降は120 μg/mLに調製し、投与液を1回目は背部皮内及び背部皮下，2回目以降は背部皮下にそれぞれ5箇所以上に分けて投与した。投与容量は、1回目は皮内に0.5 mL，皮下に0.5 mL、2及び3回目は皮下（又は皮内）に0.5 mLを、3週間隔を開けて3回投与した。 Next, the CHO cell-derived HBs / HPVL2 142-20 chimeric protein obtained in Example 2 was prepared with PBS at 120 μg / mL for the first time and 240 μg / mL for the second time and thereafter. Mix with equal volume of adjuvant (first dose: CFA, second dose and later: IFA) to make an emulsion, and adjust the final antigen concentration to 60 μg / mL for the first and 120 μg / mL for the second and later. The first dose was administered into the back skin and subcutaneously in the back and the second and subsequent doses were subcutaneously divided into 5 or more sites. The administration volume was 0.5 mL intradermally for the first time, 0.5 mL subcutaneously, and 0.5 mL subcutaneously (or intradermally) for the second and third times, and 3 times at 3 week intervals.
各投与過程において部分採血して得られた血清を検体として、実施例7に記載のELISA法でHBｓ抗体価を、実施例5に記載の方法でHPVL2ペプチド抗体価を測定した結果、4匹のサルのうち3匹について、投与回数に伴ってHB抗体の産生増強される中でもHPVL2ペプチド抗体価の上昇が確認された。HBs/HPVL2 142-20を用いたワクチンは、HBs/HPVL2 127-20と異なりＢ型肝炎ウイルス（HBV）に対する免疫を保有する対象に対しても有効に作用することが確認される結果となった（図6）。 As a result of measuring serum HBs antibody titer by ELISA method described in Example 7 and HPVL2 peptide antibody titer by method described in Example 5 using serum obtained by partial blood sampling in each administration process as a sample, In 3 of the monkeys, an increase in HPVL2 peptide antibody titer was confirmed even though the production of HB antibody was enhanced with the frequency of administration. Unlike HBs / HPVL2 127-20, the vaccine using HBs / HPVL2 142-20 was confirmed to work effectively against subjects with immunity against hepatitis B virus (HBV). (Figure 6).
《HBs/HPVL2 142-20の感染防御効果》
本発明のHBs/HPVL2 142-20キメラタンパク質が、HPV感染の増殖阻止に有効な抗体産生能を有するものであるかを確認するため、実施例８で調製したHPV-偽ウイルス（PsV）を用いた経腟感染試験を行った。《HBs / HPVL2 142-20 infection prevention effect》
In order to confirm whether the HBs / HPVL2 142-20 chimeric protein of the present invention has an antibody-producing ability effective in inhibiting the growth of HPV infection, the HPV-pseudovirus (PsV) prepared in Example 8 was used. A vaginal infection test was conducted.
（１）免疫マウスの調製
実施例３で得られたHBs/HPVL2 142-20キメラタンパク質にアジュバント（アルミニウムアジュバントとCFA(2回目以降はIFA)アジュバントの2条件を設定）を加えて25 μg/mlの各免疫原を調製し、各0.2 mlを6〜8週齢のメスBalb/cマウスの尾根部皮下に投与した（各5匹）。3週間隔で3回投与後の免疫マウスを経腟感染試験に用いた。(1) Preparation of immunized mouse Adjuvant (two conditions of aluminum adjuvant and CFA (IFA) adjuvant are set for the second and subsequent times) are added to the HBs / HPVL2 142-20 chimeric protein obtained in Example 3 and 25 μg / ml Each of the immunogens was prepared and 0.2 ml of each was administered subcutaneously to the tail of 6-8 week old female Balb / c mice (5 mice each). Immunized mice after 3 doses at 3 week intervals were used for the vaginal infection test.
（２）免疫マウスへのPsVによる経腟感染試験
上記（１）で得られた免疫マウス及びコントロールとして用いた未免疫マウスに酢酸メドロキシプロゲステロンを投与後、3日目に細胞採取用ブラシで膣内を擦過しその後ルシフェラーゼ発現プラスミドを含むHPV16型のPsVを経膣感染させた。その3日後に感染の有無をin vivoイメージアナライザー（IVIS Lumina XR, PerkinElmer社）で検出した。以下、免疫マウス及び未免疫マウスを単にマウスと称することもある。
その結果、未免疫マウス群では全例（5匹）で発光が確認され、免疫マウス群ではほぼ発光が確認されなかった。このことから免疫マウスはPsV16の感染を防御可能であることを確認した（図7）。この結果は、本願発明のHBs/HPVL2 142-20キメラタンパク質が、HPV感染症用ワクチンとして高い有効性を有することを示したものである。 As a result, luminescence was confirmed in all cases (5 mice) in the non-immunized mouse group, and almost no luminescence was confirmed in the immunized mouse group. This confirmed that immunized mice were able to protect against PsV16 infection (FIG. 7). This result indicates that the HBs / HPVL2 142-20 chimeric protein of the present invention has high effectiveness as a vaccine for HPV infection.
本願発明のキメラタンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルスへの免疫を保有する対象に有効なヒトパピローマウイルス（HPV）感染症に対する予防薬の材料に利用され得る。 The chimeric protein of the present invention can be used as a material for a prophylactic agent against human papillomavirus (HPV) infection effective for a subject possessing immunity to hepatitis B virus.
Claims (17)
（１）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号３）からなるアミノ酸配列、
（２）配列番号３の配列において１〜５個のアミノ酸が付加、置換若しくは欠失され、且つGly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列を含むアミノ酸配列、
（３）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa（配列番号６）なる配列で示され、X1aaがThr又はSer、X2aaがSer, Thr又はAla、X3aaがThr又はSer、X4aaがSer, Thr又はAla、X5aaがIle又はVal、X6aaがLeu又はIleであるアミノ酸配列、
（４）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列が３個連結されたアミノ酸配列、及び
（５）前記（４）の配列において、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列のＮ末側若しくはＣ末側に１〜５個の任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。A chimeric protein in which a peptide comprising any one of the following amino acid sequences (1) to (5) is inserted between positions 142 and 143 of the hepatitis B virus surface protein (HBs protein) as an active ingredient Contains human papillomavirus (HPV) infection vaccines;
(1) Amino acid consisting of Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu (SEQ ID NO: 3) Array,
(2) an amino acid sequence comprising a sequence represented by Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly, wherein 1 to 5 amino acids are added, substituted or deleted in the sequence of SEQ ID NO: 3;
(3) Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa (SEQ ID NO: 6) An amino acid sequence wherein X1aa is Thr or Ser, X2aa is Ser, Thr or Ala, X3aa is Thr or Ser, X4aa is Ser, Thr or Ala, X5aa is Ile or Val, and X6aa is Leu or Ile,
(4) an amino acid sequence in which three sequences represented by Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly are linked, and (5) in the sequence of (4), Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly An amino acid sequence in which 1 to 5 arbitrary amino acids are added to the N-terminal side or the C-terminal side of the sequence represented by.
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１で示される配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列。The vaccine for HPV infection according to claim 1 or 2, wherein the HBs protein has the following amino acid sequence (1) or (2):
(1) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (2) Amino acid sequence having 90% or more homology with the sequence represented by SEQ ID NO: 1.
（１）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号３）からなるアミノ酸配列、
（２）配列番号３の配列において１〜５個のアミノ酸が付加、置換若しくは欠失され、且つGly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列を含むアミノ酸配列、
（３）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa（配列番号６）なる配列で示され、X1aaがThr又はSer、X2aaがSer, Thr又はAla、X3aaがThr又はSer、X4aaがSer, Thr又はAla、X5aaがIle又はVal、X6aaがLeu又はIleであるアミノ酸配列、
（４）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列が３個連結されたアミノ酸配列、及び
（５）前記（４）の配列において、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列のＮ末側若しくはＣ末側に１〜５個の任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。A chimeric protein in which a peptide comprising any one of the following amino acid sequences (1) to (5) is inserted between positions 142 and 143 of the amino acid sequence of hepatitis B virus surface protein (HBs protein);
(1) Amino acid consisting of Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu (SEQ ID NO: 3) Array,
(2) an amino acid sequence comprising a sequence represented by Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly, wherein 1 to 5 amino acids are added, substituted or deleted in the sequence of SEQ ID NO: 3;
(3) Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa (SEQ ID NO: 6) An amino acid sequence wherein X1aa is Thr or Ser, X2aa is Ser, Thr or Ala, X3aa is Thr or Ser, X4aa is Ser, Thr or Ala, X5aa is Ile or Val, and X6aa is Leu or Ile,
(4) an amino acid sequence in which three sequences represented by Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly are linked, and (5) in the sequence of (4), Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly An amino acid sequence in which 1 to 5 arbitrary amino acids are added to the N-terminal side or the C-terminal side of the sequence represented by.
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１で示される配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列。The chimeric protein according to claim 6 or 7, wherein the HBs protein has the following amino acid sequence (1) or (2):
(1) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (2) Amino acid sequence having 90% or more homology with the sequence represented by SEQ ID NO: 1.
（１）請求項９に記載のDNA断片を調製する工程、
（２）請求項１０に記載の発現ベクターを調製し、該発現ベクターで宿主を形質転換する工程、
（３）前記（２）により得られる形質転換宿主を培養し、キメラタンパク質産生形質転換宿主を選択する工程、
（４）前記（３）により得られるキメラタンパク質産生形質転換宿主を拡張培養し、培養物から前記キメラタンパク質を精製する工程、及び
（５）前記（４）により得られる精製キメラタンパク質にアジュバント、安定化剤、緩衝剤、等張化剤及び保存剤から選択される添加剤を添加して、ワクチンとする工程。The manufacturing method of the vaccine for HPV infection in any one of Claim 1 to 3 including the process of following (1)-(5);
(1) a step of preparing the DNA fragment according to claim 9,
(2) preparing the expression vector according to claim 10 and transforming a host with the expression vector;
(3) culturing the transformed host obtained by (2) above and selecting a chimeric protein-producing transformed host;
(4) a step of expanding the chimeric protein-producing transformed host obtained by (3) and purifying the chimeric protein from the culture; and (5) an adjuvant and a stable agent for the purified chimeric protein obtained by (4). A step of adding an additive selected from an agent, a buffer, an isotonic agent and a preservative to form a vaccine.
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１で示される配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列。A method for improving the immunogenicity of a foreign peptide, wherein any infection occurs between positions 142 and 143 of a hepatitis B virus surface protein (HBs protein) comprising the following amino acid sequence (1) or (2): The above method, wherein a chimeric protein into which a foreign peptide containing a neutralizing epitope for infectious disease is inserted is used as an immunizing antigen;
(1) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (2) Amino acid sequence having 90% or more homology with the sequence represented by SEQ ID NO: 1.
（１）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu（配列番号３）からなるアミノ酸配列、
（２）配列番号３の配列において１〜５個のアミノ酸が付加、置換若しくは欠失され、且つGly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列を含むアミノ酸配列、
（３）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa（配列番号６）なる配列で示され、X1aaがThr又はSer、X2aaがSer, Thr又はAla、X3aaがThr又はSer、X4aaがSer, Thr又はAla、X5aaがIle又はVal、X6aaがLeu又はIleであるアミノ酸配列、
（４）Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列が３個連結されたアミノ酸配列、及び
（５）前記（４）の配列において、Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Glyで示される配列のＮ末側若しくはＣ末側に１〜５個の任意のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。The method according to claim 14, wherein the foreign peptide is any one of the following (1) to (5);
(1) Amino acid consisting of Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu (SEQ ID NO: 3) Array,
(2) an amino acid sequence comprising a sequence represented by Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly, wherein 1 to 5 amino acids are added, substituted or deleted in the sequence of SEQ ID NO: 3;
(3) Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa (SEQ ID NO: 6) An amino acid sequence wherein X1aa is Thr or Ser, X2aa is Ser, Thr or Ala, X3aa is Thr or Ser, X4aa is Ser, Thr or Ala, X5aa is Ile or Val, and X6aa is Leu or Ile,
(4) an amino acid sequence in which three sequences represented by Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly are linked, and (5) in the sequence of (4), Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly An amino acid sequence in which 1 to 5 arbitrary amino acids are added to the N-terminal side or the C-terminal side of the sequence represented by.
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