JPWO2017068614A1 - Gene therapy composition - Google Patents
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Abstract
【課題】複数の遺伝子の組み合わせからなるアポトーシス誘導遺伝子を癌細胞へ導入することにより癌細胞のアポトーシス活性を促す遺伝子治療用組成物、および該遺伝子治療用組成物を癌細胞へ導入するためのリポソームベクターおよびその形成方法を提供する。【解決手段】抗腫瘍遺伝子がアポトーシス誘導遺伝子からなる、癌の予防および／または治療用の遺伝子治療用組成物であって、前記アポトーシス誘導遺伝子は、ｐ５３の遺伝子、ＦＵＳ−１の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子からなる構成である。【選択図】 図１A gene therapy composition that promotes apoptosis activity of a cancer cell by introducing an apoptosis-inducing gene comprising a combination of a plurality of genes into the cancer cell, and a liposome for introducing the gene therapy composition into the cancer cell Vectors and methods for their formation are provided. A composition for gene therapy for cancer prevention and / or treatment, wherein the anti-tumor gene comprises an apoptosis-inducing gene, wherein the apoptosis-inducing gene is a p53 gene, a FUS-1 gene, or a TRAIL gene. It consists of a gene and a gene for IL-24. [Selection] Figure 1
Description
本発明は、遺伝子治療用組成物に関し、特に、特定のアポトーシス誘導遺伝子を癌細胞へ導入することにより癌細胞のアポトーシス活性を促すための遺伝子治療用組成物、および該遺伝子治療用組成物を癌細胞へ移送するためのリポソームベクターおよびその形成方法に関する。 The present invention relates to a composition for gene therapy, and in particular, a composition for gene therapy for promoting apoptosis activity of cancer cells by introducing a specific apoptosis-inducing gene into the cancer cells, and the composition for gene therapy as cancer. The present invention relates to a liposome vector for transfer to a cell and a method for forming the same.
従来より、癌治療の医療現場では、放射線療法をはじめとする様々な抗癌療法や、抗癌剤等の化学療法、その他手術療法が行われており、様々な療法や抗癌剤が研究され開発されている。現在の日本においては、２人に１人が癌に罹患し、３人に１人が癌により死亡しているという事実がある。癌は１個の細胞が複数の発癌に係る遺伝子異変を蓄積することにより発生し、他の臓器への転移等により宿主を死に至らしめる。 Conventionally, in the field of cancer treatment, various anticancer therapies including radiation therapy, chemotherapy such as anticancer agents, and other surgical therapies have been performed, and various therapies and anticancer agents have been researched and developed. . In Japan today, there is a fact that one in two people suffers from cancer and one in three people die from cancer. Cancer occurs when one cell accumulates genetic abnormalities related to multiple carcinogenesis, and causes the host to die by metastasis to other organs.
現在、癌治療の現場では、三大療法（手術療法、化学療法、放射線療法）が行われている。これらの抗癌治療には副作用が生じることが知られており、患者の肉体的負担をいかに軽減するかが課題となっている。特に、抗癌剤による化学療法では、吐き気、脱毛、白血球の減少など様々な副作用が生じるため、患者の負担が大きいという問題点があった。 Currently, three major therapies (surgical therapy, chemotherapy, and radiation therapy) are performed in the field of cancer treatment. These anticancer treatments are known to have side effects, and how to reduce the physical burden on patients has become a challenge. In particular, chemotherapy with an anticancer agent has various problems such as nausea, hair loss, and a decrease in white blood cells, which causes a problem that the burden on the patient is large.
また、手術療法もまた患者に負担がかかってしまうという問題点があった。更に、放射線療法は、患部を視認可能に撮影した画像等から確認し得る腫瘍をターゲットとした対症療法であるが、手術療法や放射線療法を実施した場合であっても、少なからず血行性移転やリンパ節移転を起こす。 In addition, there is a problem that the surgical treatment also puts a burden on the patient. Furthermore, radiation therapy is a symptomatic treatment targeting tumors that can be confirmed from images taken so that the affected area can be seen, but even if surgery or radiation therapy is performed, there are not a few hematogenous transfers, Causes lymph node transfer.
これらの各療法は、何れも遺伝子異変によって引き起こされた可視範囲内の腫瘍に対する対症療法に過ぎないため、癌を根治することが困難という問題点があった。 Each of these therapies is merely a symptomatic treatment for tumors in the visible range caused by genetic alterations, and there is a problem that it is difficult to completely cure cancer.
遺伝子治療とは、異常な遺伝子を持っているため機能不全に陥っている細胞の欠陥を、遺伝子あるいは遺伝子を導入した細胞を投与することにより修正して遺伝子異常を減らすことで癌を治療する療法であり、様々な遺伝子を用いた療法が開発されている。 Gene therapy is a therapy that treats cancer by correcting the defects of cells that have malfunctioned due to having an abnormal gene by administering the gene or a cell into which the gene has been introduced and reducing the gene abnormality. Therapies using various genes have been developed.
例えば、特表２０１０−５３７９７３号公報（特許５５２９０２１号）では、臍帯血由来の間葉系幹細胞を含む遺伝子治療用の組成物であって、脳腫瘍の診断、予防、治療、または治療経過モニタリングのための組成物またはキットに関する技術が開示されている。ここでは、サイトカインやインターロイキン遺伝子を用いたアポトーシス誘導因子遺伝子からなる抗腫瘍遺伝子を用いて癌細胞のアポトーシスを誘導・促進することにより、脳腫瘍を治療可能とする旨が示唆されている。 For example, in Japanese Translation of PCT International Publication No. 2010-537973 (Patent No. 5529021), a composition for gene therapy comprising mesenchymal stem cells derived from cord blood, for diagnosis, prevention, treatment, or monitoring of treatment progress of brain tumors Techniques relating to these compositions or kits are disclosed. Here, it is suggested that brain tumors can be treated by inducing and promoting apoptosis of cancer cells using an anti-tumor gene comprising an apoptosis-inducing factor gene using a cytokine or an interleukin gene.
しかしながら、この技術によれば確かに脳腫瘍（癌）を的確に消滅させることが可能となるが、患者の体質や癌の種類、進行状況等に応じた組成物の選択、すなわちカスタマイズを行う観点からでは不十分であった。また、抗腫瘍遺伝子を癌細胞で的確に導入するためのベクターが必要となるが、この点からも、不十分であった。 However, although this technique can surely eliminate the brain tumor (cancer), it is possible to select a composition according to the patient's constitution, type of cancer, progress, etc., that is, from the viewpoint of customization. It was not enough. In addition, a vector for accurately introducing the anti-tumor gene with cancer cells is required, but this point is also insufficient.
遺伝子治療を行う上では、アポトーシス誘導遺伝子を正確に癌細胞へ導入するためのベクターが必要となり、また、効果的に癌細胞のアポトーシス活性を促す組成物が要求される。これらの問題点を解消した遺伝子異常を回復させるための遺伝子治療用組成物の開発が待たれていた。
本発明は上記問題を解決するために、遺伝子治療用組成物であって、複数の遺伝子の組み合わせからなるアポトーシス誘導遺伝子を癌細胞へ導入することにより癌細胞のアポトーシス活性を促す遺伝子治療用組成物、および該遺伝子治療用組成物を癌細胞へ導入するためのリポソームベクターおよびその形成方法を提供する。 In order to solve the above problems, the present invention provides a gene therapy composition that promotes apoptosis activity of cancer cells by introducing an apoptosis-inducing gene comprising a combination of a plurality of genes into cancer cells. And a liposome vector for introducing the gene therapy composition into cancer cells and a method for forming the same.
上記の目的を達成するために本発明に係る遺伝子治療用組成物は、抗腫瘍遺伝子がアポトーシス誘導遺伝子からなる、癌の予防および／または治療用の遺伝子治療用組成物であって、前記アポトーシス誘導遺伝子は、ｐ５３の遺伝子、ＦＵＳ−１の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子からなる構成である。
また、前記アポトーシス誘導遺伝子は、ｐ５３の遺伝子、ＦＵＳ−１の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の各遺伝子の含有量が等量である構成である。In order to achieve the above object, a gene therapy composition according to the present invention is a gene therapy composition for preventing and / or treating cancer, wherein the antitumor gene comprises an apoptosis-inducing gene, wherein the apoptosis-inducing gene is used. The gene is composed of a p53 gene, a FUS-1 gene, a TRAIL gene, and an IL-24 gene.
Further, the apoptosis-inducing gene is configured such that the content of each gene of p53 gene, FUS-1 gene, TRAIL gene and IL-24 is equal.
また、前記アポトーシス誘導遺伝子は、アポトーシス誘導の活性化を図るため、ｐ５３の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子が、ＦＵＳ−１の遺伝子の倍量である構成である。
また、前記アポトーシス誘導遺伝子は、ＭＤＭ２の活性化を抑制するとともにｐ５３依存性のアポトーシス誘導の活性化を図るため、ｐ５３の遺伝子およびＦＵＳ−１の遺伝子が、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子の倍量である構成である。In addition, the apoptosis-inducing gene has a configuration in which the p53 gene, the TRAIL gene, and the IL-24 gene are double the amount of the FUS-1 gene in order to activate apoptosis induction.
In addition, since the apoptosis-inducing gene suppresses activation of MDM2 and activates p53-dependent apoptosis induction, the p53 gene and the FUS-1 gene are TRAIL gene and IL-24 gene. The structure is double the amount.
また、前記アポトーシス誘導遺伝子は、非ｐ５３依存性のアポトーシス誘導の活性化を図るため、ｐ５３の遺伝子、ＦＵＳ−１の遺伝子およびＴＲＡＩＬの遺伝子が、ＩＬ−２４の遺伝子の倍量である構成である。
また、前記アポトーシス誘導遺伝子は、ｐ５３依存性のアポトーシス誘導の活性化を図るため、ｐ５３の遺伝子が、ＦＵＳ−１の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子の倍量である構成である。In addition, the apoptosis-inducing gene has a configuration in which the p53 gene, the FUS-1 gene, and the TRAIL gene are double the amount of the IL-24 gene in order to activate non-p53-dependent apoptosis induction. .
The apoptosis-inducing gene has a configuration in which the p53 gene is double the amount of the FUS-1, TRAIL, and IL-24 genes in order to activate p53-dependent apoptosis induction.
また、前記アポトーシス誘導遺伝子は、ＭＡＰＫ経路を通じた癌細胞の増殖を抑制するため、ＦＵＳ−１の遺伝子が、ｐ５３の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子の２倍乃至５倍量である構成である。
また、前記アポトーシス誘導遺伝子は、メラノーマに対する抗腫瘍効果を得るため、ＩＬ−２４の遺伝子が、ｐ５３の遺伝子、ＦＵＳ−１の遺伝子およびＴＲＡＩＬの遺伝子の倍量である構成である。In addition, since the apoptosis-inducing gene suppresses the growth of cancer cells through the MAPK pathway, the FUS-1 gene is 2 to 5 times the amount of the p53 gene, TRAIL gene, and IL-24 gene. It is a configuration.
The apoptosis-inducing gene has a structure in which the IL-24 gene is double the amount of the p53 gene, the FUS-1 gene and the TRAIL gene in order to obtain an antitumor effect against melanoma.
また、前記アポトーシス誘導遺伝子は、肺癌および／または乳がんに対する抗腫瘍効果を得るため、ＦＵＳ−１の遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子が、ｐ５３の遺伝子およびＴＲＡＩＬの遺伝子の倍量である構成である。
また、前記アポトーシス誘導遺伝子は、血管新生抑制作用および放射線療法への感受性を上げるため、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子が、ｐ５３の遺伝子およびＦＵＳ−１の遺伝子の倍量である構成である。In addition, the apoptosis-inducing gene has a configuration in which the FUS-1 gene and the IL-24 gene are double the amount of the p53 gene and the TRAIL gene in order to obtain an antitumor effect against lung cancer and / or breast cancer.
Further, the apoptosis-inducing gene has a structure in which the TRAIL gene and the IL-24 gene are double the amount of the p53 gene and the FUS-1 gene in order to increase the angiogenesis inhibitory effect and the sensitivity to radiation therapy. .
また、前記アポトーシス誘導遺伝子は、化学療法との併用による抗腫瘍効果および副作用の軽減のため、ｐ５３の遺伝子およびＴＲＡＩＬの遺伝子が、ＦＵＳ−１の遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子の倍量である構成である。
また、前記遺伝子治療用組成物は、更にｐ１６の遺伝子および＼またはｐ２１の遺伝子を含有し、各遺伝子の含有量が等量である構成でもある。In addition, the apoptosis-inducing gene is configured such that the p53 gene and the TRAIL gene are double the amount of the FUS-1 gene and the IL-24 gene in order to reduce the antitumor effect and side effects in combination with chemotherapy. It is.
The gene therapy composition further comprises a p16 gene and / or a p21 gene, and the content of each gene is equal.
また、前記遺伝子治療用組成物は、癌細胞をターゲットとするカチオン性脂質およびヘルパー脂質のリポソームからなる遺伝子治療用リポソームベクターによってカプセル化した構成である。
また、前記リポソームは、内部空洞を有する単層膜からなるとともに、該膜はリガンドが付着されたカプセル状のベクターからなり、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロールを含有する単層薄膜の化合物からなる構成である。The gene therapy composition is encapsulated by a gene therapy liposome vector comprising cationic lipid and helper lipid liposomes targeting cancer cells.
The liposome comprises a monolayer membrane having an internal cavity, and the membrane comprises a capsule-like vector to which a ligand is attached, and comprises a monolayer thin film containing dioleoylphosphatidylethanolamine and dimethylaminoethanecarbamoylcholesterol It consists of the compound of
また、前記遺伝子治療用組成物は、更に、癌原遺伝子をプラスミド化した遺伝子と、サイトカイン遺伝子とからなる構成である。
更に、前記サイトカイン遺伝子は、ＩＬ−１２の遺伝子またはＩＬ−１８の遺伝子からなる構成である。The gene therapy composition further comprises a gene obtained by plasmiding a proto-oncogene and a cytokine gene.
Furthermore, the cytokine gene is composed of an IL-12 gene or an IL-18 gene.
また、本発明に係る遺伝子治療用リポソームの形成方法はジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロールをクロロホルム中で混合して脂質溶液を生成する混合工程と、生成された前記溶液を乾燥して薄膜を生成する被膜生成工程と、生成された前記薄膜を真空維持する真空工程と、前記薄膜を水またはデキストロースまたはボルテックスを添加して再懸濁する再懸濁工程と、前記懸濁した懸濁体を４℃で培養する培養工程と、前記懸濁液または培養した懸濁液からリポソームを形成するために超音波照射処理を行う超音波工程と、生成するリポソームのサイズと同寸のポリカーボネートフィルターによりリポソームを押出し形成する形成工程と、からなる構成である。 Further, the method for forming a liposome for gene therapy according to the present invention comprises a mixing step of mixing dioleoylphosphatidylethanolamine and dimethylaminoethanecarbamoylcholesterol in chloroform to form a lipid solution, and drying the generated solution. A film forming step for producing a thin film, a vacuum step for maintaining the produced thin film in vacuum, a resuspension step for resuspending the thin film by adding water, dextrose, or vortex, and the suspended suspension. A culture step of culturing a suspension at 4 ° C., an ultrasonic step of performing ultrasonic irradiation treatment to form liposomes from the suspension or the cultured suspension, and a polycarbonate having the same size as the size of the liposomes to be produced And a forming step of extruding liposomes with a filter.
本発明は、上記詳述した通りの構成であるので、以下のような効果を奏する。
１．アポトーシス誘導遺伝子として、ｐ５３、ＦＵＳ−１、ＴＲＡＩＬおよびＩＬ−２４の各遺伝子を選択したため、効果的な癌細胞のアポトーシス活性を促すことが可能となる。
２．アポトーシス誘導遺伝子として、ｐ５３、ＦＵＳ−１、ＴＲＡＩＬおよびＩＬ−２４の各遺伝子を等量に混成したため、患者に急激なインパクトを与えることなく体に慣らすことが可能になるとともに、以後の治療において混成投与する前記各遺伝子の量の見極めを行う事が可能となる。
３．アポトーシス誘導遺伝子として、ｐ５３、ＴＲＡＩＬおよびＩＬ−２４の各遺伝子を、ＦＵＳ−１の遺伝子の倍量ほど含有する構成としたため、アポトーシス誘導の活性化を図ることが可能となる。Since the present invention is configured as described in detail above, the following effects can be obtained.
1. Since each gene of p53, FUS-1, TRAIL, and IL-24 was selected as an apoptosis-inducing gene, it becomes possible to promote effective apoptosis activity of cancer cells.
2. As an apoptosis-inducing gene, each gene of p53, FUS-1, TRAIL, and IL-24 is mixed in an equal amount, so that it becomes possible to acclimate to the body without giving a sudden impact to the patient, and in the subsequent treatment It is possible to determine the amount of each gene to be administered.
3. Since the p53, TRAIL, and IL-24 genes are contained as much as the FUS-1 gene as the apoptosis-inducing gene, activation of apoptosis induction can be achieved.
４．アポトーシス誘導遺伝子として、ｐ５３およびＦＵＳ−１の遺伝子を、ＴＲＡＩＬおよびＩＬ−２４の遺伝子の倍量ほど含有する構成としたため、ＭＤＭ２の活性化を抑制し、ｐ５３依存性のアポトーシス誘導の活性化することが可能となる。
５．アポトーシス誘導遺伝子として、ｐ５３、ＦＵＳ−１およびＴＲＡＩＬの遺伝子を、ＩＬ−２４の遺伝子の倍量ほど含有する構成としたため、ｐ５３の遺伝子に依存しないアポトーシス誘導を活性化することが可能となる。4). Since p53 and FUS-1 genes are contained as much as TRAIL and IL-24 genes as apoptosis-inducing genes, the activation of MDM2 is suppressed and p53-dependent apoptosis induction is activated. Is possible.
5. Since the p53, FUS-1 and TRAIL genes are contained as much as the amount of the IL-24 gene as the apoptosis-inducing gene, it is possible to activate apoptosis induction independent of the p53 gene.
６．アポトーシス誘導遺伝子として、ｐ５３の遺伝子を、ＦＵＳ−１、ＴＲＡＩＬおよびＩＬ−２４の遺伝子の倍量ほど含有する構成としたため、ｐ５３の遺伝子に依存したアポトーシス誘導の活性化を図ることが可能となる。
７．アポトーシス誘導遺伝子として、ＦＵＳ−１の遺伝子を、ｐ５３、ＴＲＡＩＬおよびＩＬ−２４の遺伝子の２倍乃至５倍量ほど含有する構成としたため、ＭＡＰＫ経路を通じた癌細胞の増殖を抑制することが可能となる。6). As the apoptosis-inducing gene, the p53 gene is configured to contain about double the amount of the FUS-1, TRAIL, and IL-24 genes, so that it is possible to activate apoptosis induction depending on the p53 gene.
7). As an apoptosis-inducing gene, the FUS-1 gene is contained in an
８．アポトーシス誘導遺伝子として、ＩＬ−２４の遺伝子を、ｐ５３、ＦＵＳ−１およびＴＲＡＩＬの遺伝子の倍量ほど含有する構成としたため、メラノーマに対する抗腫瘍効果を得ることが可能となる。
９．アポトーシス誘導遺伝子として、ＦＵＳ−１およびＩＬ−２４の遺伝子を、ｐ５３およびＴＲＡＩＬの遺伝子の倍量ほど含有する構成としたため、肺癌および／または乳がんに対する抗腫瘍効果を得ることが可能となる。8). As an apoptosis-inducing gene, an IL-24 gene is contained in an amount twice that of p53, FUS-1 and TRAIL genes, so that an antitumor effect against melanoma can be obtained.
9. Since the FUS-1 and IL-24 genes are contained as much as the amount of p53 and TRAIL genes as apoptosis-inducing genes, an antitumor effect against lung cancer and / or breast cancer can be obtained.
１０．アポトーシス誘導遺伝子として、ｐ５３およびＴＲＡＩＬの遺伝子を、ＦＵＳ−１およびＩＬ−２４の遺伝子の倍量ほど含有する構成としたため、化学療法との併用による抗腫瘍効果を得ることが可能になるとともに、副作用を軽減することが可能となる。
１１．アポトーシス誘導遺伝子として、ＴＲＡＩＬおよびＩＬ−２４の遺伝子を、ｐ５３およびＦＵＳ−１の遺伝子の倍量ほど含有する構成としたため、血管新生抑制作用および放射線療法への感受性を上げる効果を得ることが可能となる。10. As an apoptosis-inducing gene, the p53 and TRAIL genes are contained in an amount about double the amount of the FUS-1 and IL-24 genes, so that it is possible to obtain an antitumor effect in combination with chemotherapy and have side effects. Can be reduced.
11. As an apoptosis-inducing gene, the TRAIL and IL-24 genes are contained in double the amount of the p53 and FUS-1 genes, so that it is possible to obtain an anti-angiogenic action and an effect of increasing sensitivity to radiation therapy. Become.
１２．遺伝子治療用組成物として、更にｐ１６の遺伝子とｐ２１の遺伝子を含有させた上で、各遺伝子を等量に含有する構成としたため、あらゆる癌細胞のアポトーシス誘導の活性化を図ることが可能となる。
１３．各種遺伝子からなる遺伝子治療用組成物をリポソームからなる遺伝子治療用リポソームベクターによってカプセル化したため、遺伝子治療用組成物の安定性を確保可能となるとともに、確実に標的腫瘍細胞へ遺伝子治療用組成物を送達することが可能となる。12 Since the composition for gene therapy further contains the p16 gene and the p21 gene and each gene is contained in an equal amount, activation of apoptosis induction in all cancer cells can be achieved. .
13. Since the gene therapy composition comprising various genes is encapsulated by the liposome vector for gene therapy comprising liposomes, the stability of the gene therapy composition can be ensured and the gene therapy composition can be reliably applied to the target tumor cells. It becomes possible to deliver.
１４．リポソームを内部空洞を有する単層膜からなる構成としたため、内部に遺伝子治療用組成物を格納したベクターを構成することが可能となる。
１５．遺伝子治療用組成物として、更に癌原遺伝子をプラスミド化した遺伝子と、サイトカイン遺伝子とからなる構成としたため、腫瘍細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導することが可能となる。14 Since the liposome is composed of a monolayer membrane having an internal cavity, it is possible to construct a vector in which the composition for gene therapy is stored.
15. Since the composition for gene therapy further comprises a gene obtained by plasmiding a proto-oncogene and a cytokine gene, it is possible to suppress the growth of tumor cells and induce apoptosis.
１６．サイトカイン遺伝子として、ＩＬ−１２またはＩＬ−１８の遺伝子を選択したため、効果的なアポトーシスを誘導することが可能となる。
１７．超音波照射処理によって懸濁液からリポソームを形成するため、２００ｎｍ程度のサイズのリポソームを形成することが可能となる。16. Since IL-12 or IL-18 gene is selected as the cytokine gene, it becomes possible to induce effective apoptosis.
17. Since the liposome is formed from the suspension by the ultrasonic irradiation treatment, the liposome having a size of about 200 nm can be formed.
以下、本発明に係る遺伝子治療用組成物を、図面に示す実施例に基づいて詳細に説明する。
図１は、アポトーシス誘導遺伝子の組み合わせを示す一覧である。Hereinafter, the gene therapy composition according to the present invention will be described in detail based on the examples shown in the drawings.
FIG. 1 is a list showing combinations of apoptosis-inducing genes.
本発明に係る遺伝子治療用組成物は、主に抗腫瘍遺伝子の作用によって癌を予防および／または治療するための組成物であり、該組成物をベクターを介することにより、腫瘍（癌細胞）に直接導入し、癌細胞を死滅させることにより治療を行うための組成物である。 The composition for gene therapy according to the present invention is a composition for preventing and / or treating cancer mainly by the action of an anti-tumor gene. By using this composition via a vector, it can be applied to a tumor (cancer cell). A composition for treatment by direct introduction and killing cancer cells.
前記抗腫瘍遺伝子は、アポトーシス特性を有するアポトーシス誘導遺伝子から構成されている。すなわち、アポトーシス誘導特性を有する遺伝子を癌細胞に導入することにより、癌細胞の自然死（自己死）を誘発して癌細胞を消滅させる構成である。すなわち、癌の予防および／または治療用の組成物からなる遺伝子治療用組成物を提供する事が出来る。 The anti-tumor gene is composed of an apoptosis-inducing gene having apoptosis characteristics. That is, by introducing a gene having apoptosis-inducing properties into cancer cells, the cancer cells are extinguished by inducing spontaneous death (self-death) of the cancer cells. That is, a composition for gene therapy comprising a composition for preventing and / or treating cancer can be provided.
前記アポトーシス誘導遺伝子は、本実施例では、ｐ５３の遺伝子、ＦＵＳ−１の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の４種類の遺伝子を全て含む組成からなる構成である。これらの誘導遺伝子は、何れも癌抑制遺伝子であり、これらを用いた癌細胞殺傷治療において抗腫瘍効果が高い事が実験により確認されたものである。本発明は、これら４種類の遺伝子を常に全て含んだ組成物であって、さらに、含有する割合（重量パーセント）を変更する事によりそれぞれ異なる特性の組成物となる事を解明追求している。 In this example, the apoptosis-inducing gene has a composition comprising all of the four genes p53, FUS-1, TRAIL, and IL-24. These induced genes are all tumor suppressor genes, and it has been experimentally confirmed that they have a high antitumor effect in cancer cell killing treatment using these genes. The present invention seeks to elucidate and pursue that the composition always contains all of these four types of genes, and that the composition has different properties by changing the content ratio (weight percent).
ｐ５３の遺伝子は、代表的な癌抑制遺伝子であり、小児期および成人期に様々な臓器で悪性腫瘍を多発するリスクとなる遺伝性疾患である、リ・フラウメニ（Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ）症候群の責任遺伝子である。実験においても、ｐ５３遺伝子を喪失させたｐ５３欠損マウスは生後早い段階で高頻度で腫瘍の発生がみられる事などから、癌抑制に重要な因子であることが実験的に証明されている。ｐ５３は、ＤＮＡ損傷や様々なストレスによって誘導され、細胞の核内で転写活性化因子として機能する。 The gene of p53 is a typical tumor suppressor gene, and is a responsible gene for Li-Fraumeni syndrome, which is a hereditary disease that is a risk of developing malignant tumors in various organs in childhood and adulthood. It is. Also in experiments, p53-deficient mice in which the p53 gene has been lost are experimentally proven to be an important factor for cancer suppression because of the occurrence of tumors at a high frequency at an early stage after birth. p53 is induced by DNA damage and various stresses, and functions as a transcriptional activator in the cell nucleus.
ｐ５３は、ＤＮＡ損傷刺激を受けた細胞において活性化し、細胞周期のチェックポイントの働きをコントロールして細胞分裂を停止するとともに、その間にＤＮＡの修復を促すことにより、ＤＮＡの変異を抑制する。この過程において、修復しきれない細胞であれば、アポトーシス（細胞死）を誘導して排除することにより、遺伝子の異変を防いでいる。ｐ５３は機能が欠失すると染色体が不安定になる事が実験から明らかになっている。また、正常細胞に癌遺伝子を発現させると、ｐ５３依存性のアポトーシスや細胞老化の誘導が起こる事が実験から明らかになっており、癌遺伝子の活性化した細胞を排除する事により、癌化を抑制していることが明らかとなっている。 p53 is activated in cells that have been stimulated by DNA damage, controls cell cycle checkpoints to stop cell division, and promotes DNA repair during that time, thereby suppressing DNA mutation. In this process, if the cells cannot be repaired, gene alteration is prevented by inducing and eliminating apoptosis (cell death). It has been clarified from experiments that p53 is unstable when its function is lost. In addition, experiments have shown that expression of oncogenes in normal cells leads to p53-dependent apoptosis and induction of cell senescence. By eliminating cells with activated oncogenes, canceration can be prevented. It is clear that it is suppressed.
ＦＵＳ−１の遺伝子は、ヒト染色体３ｐ２１．３領域に存在する癌抑制遺伝子であり、多くの癌で早期にＦＵＳ−１の対立遺伝子（対立形質を規定する個々の遺伝子）の消失や変異が認められるものであり、特に、肺癌、肺腫瘍、乳癌においてＦＵＳ−１タンパクの消失や現象が認められるものである。ＦＵＳ−１は、ミトコンドリア依存のＡｐａｆ−１関連経路の活性化や、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＡＫＴ、ｃ−Ａｂｌ、ｃ−Ｋｉｔを含むチロシンキナーゼタンパクの機能の抑制により、癌細胞をアポトーシスへと誘導することが明らかになっている。 The FUS-1 gene is a tumor suppressor gene present in the human chromosome 3p21.3 region, and the disappearance and mutation of FUS-1 alleles (individual genes that define alleles) are recognized early in many cancers. In particular, the disappearance or phenomenon of FUS-1 protein is observed in lung cancer, lung tumor and breast cancer. FUS-1 induces cancer cells to apoptosis by activating mitochondria-dependent Apaf-1-related pathways and suppressing the function of tyrosine kinase proteins including EGFR, PDGFR, AKT, c-Abl, and c-Kit It has become clear.
正常な細胞では、アポトーシス刺激やストレス等によりＦＵＳ−１が活性化し、内因性のミトコンドリアのアポトーシスを活性化する。また、ＦＵＳ−１の活性化は、ＭＤＭ２遺伝子によるｐ５３の活動の抑制をブロックし、ｐ５３依存性のアポトーシスを高めるという特性がある。 In normal cells, FUS-1 is activated by apoptosis stimulation, stress, etc., and activates apoptosis of endogenous mitochondria. In addition, activation of FUS-1 has the property of blocking the suppression of p53 activity by the MDM2 gene and enhancing p53-dependent apoptosis.
ＦＵＳ−１の遺伝子は、ＭＤＭ２の発現およびＥＧＦＲの異変による細胞増殖を抑制する機能を持つ遺伝子である。ＭＡＰＫ経路を通じた癌細胞の増殖を抑制する。ＦＵＳ−１遺伝子は、肺癌や乳癌に対する抗腫瘍効果を有する事が分かっている。 The FUS-1 gene is a gene having a function of suppressing cell proliferation due to MDM2 expression and EGFR mutation. Suppresses the growth of cancer cells through the MAPK pathway. The FUS-1 gene is known to have an antitumor effect on lung cancer and breast cancer.
ＴＲＡＩＬの遺伝子は、デスレセプターを介して細胞をアポトーシスへ導く特性を持つ遺伝子である。ＴＲＡＩＬ遺伝子は、様々な腫瘍細胞、異変を起こした細胞を選択的にアポトーシスへと導き、正常細胞に対しては働かないため、癌治療に特化した遺伝子として活用する事が可能である。ＴＲＡＩＬ遺伝子は、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーと相互に影響し合うホモ三量体のリガンドである。 The TRAIL gene is a gene having the property of leading cells to apoptosis via the death receptor. The TRAIL gene can be used as a gene specialized in cancer treatment because it selectively induces various tumor cells and abnormal cells to apoptosis and does not act on normal cells. The TRAIL gene is a homotrimeric ligand that interacts with members of the TNF receptor family.
ＩＬ−２４（インターロイキン−２４）の遺伝子は、第一染色体長腕（１ｐ３２）に存在し、メラノーマ、乳癌、肺癌などを含む多種類の癌細胞に対して増殖抑制作用とアポトーシス誘導作用を発揮する遺伝子である。ＩＬ−２４は、正常細胞に対しては作用せず、また、癌細胞の放射線に対する感受性を増強する作用を有する。ＩＬ−２４は、メラノーマや肺癌や乳癌に対する抗腫瘍効果を発揮する。また、血管新生抑制作用を有することが知られている。 The gene of IL-24 (interleukin-24) is present in the first long arm of chromosome 1 (1p32) and exhibits growth inhibitory action and apoptosis inducing action on various types of cancer cells including melanoma, breast cancer, lung cancer and the like. It is a gene to do. IL-24 does not act on normal cells and has an effect of enhancing the sensitivity of cancer cells to radiation. IL-24 exhibits an antitumor effect against melanoma, lung cancer and breast cancer. It is also known to have an angiogenesis inhibitory effect.
本発明に係る遺伝子治療用組成物は、遺伝子診断で得られた遺伝子異常や診断名、転移の有無などの情報を基にして、ｐ５３の遺伝子、ＦＵＳ−１の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子の４種類の遺伝子の含有量を特定することにより配分を決定している。本発明の一実施例では、アポトーシス誘導遺伝子を構成する上記ｐ５３の遺伝子、ＦＵＳ−１の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子を、それぞれ等量となるように含有する構成としている。このように、各遺伝子を等量に混成することにより、治療薬の体に対するインパクトを抑制して慣らすための組成物を構成することが可能となる。また、投与量を調整することにより、遺伝子治療用組成物の効果をバランスよく高めることが可能となる。また、ＭＤＭ２等の様々な遺伝子の発現を監視することで、次にどのような配分で上記各遺伝子を含有させるかを決定することが可能となる。 The gene therapy composition according to the present invention is based on information such as gene abnormality and diagnosis name obtained by gene diagnosis, presence or absence of metastasis, p53 gene, FUS-1 gene, TRAIL gene and IL- Allocation is determined by specifying the content of four genes of 24 genes. In one embodiment of the present invention, the p53 gene, FUS-1 gene, TRAIL gene, and IL-24 gene constituting the apoptosis-inducing gene are contained in equal amounts. Thus, by mixing each gene in equal amounts, it becomes possible to constitute a composition for suppressing the impact of the therapeutic agent on the body and accustoming it. Further, by adjusting the dose, it is possible to enhance the effect of the gene therapy composition in a balanced manner. In addition, by monitoring the expression of various genes such as MDM2, it is possible to determine the distribution of the above genes next.
本発明に係る遺伝子治療用組成物の他の実施例として、アポトーシス誘導遺伝子は、ｐ５３の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子をＦＵＳ−１の遺伝子の倍量含有する構成とすることが可能である。上記の各遺伝子を等量に含有した遺伝子治療用組成物を使用したとき、ｐ５３変異が認められると、ｐ５３を増量投与するとともにｐ５３非依存性のアポトーシス誘導を促進する必要が生ずる。この場合、ｐ５３の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子をＦＵＳ−１の遺伝子の倍量含有させることにより、ｐ５３並びにｐ５３非依存性のアポトーシス誘導の活性化を図ることが可能となり、より効果的な遺伝子治療用組成物の提供が可能となる。 As another example of the composition for gene therapy according to the present invention, the apoptosis-inducing gene may contain a p53 gene, a TRAIL gene, and an IL-24 gene in double the amount of the FUS-1 gene. Is possible. When a gene therapy composition containing equal amounts of each of the above genes is used, if a p53 mutation is observed, it is necessary to administer an increased amount of p53 and promote p53-independent apoptosis induction. In this case, p53 and p53-independent apoptosis induction can be activated by including the p53 gene, TRAIL gene and IL-24 gene in double amounts of the FUS-1 gene. An effective gene therapy composition can be provided.
また、本発明に係る更に他の実施例では、遺伝子治療用組成物のアポトーシス誘導遺伝子は、ｐ５３の遺伝子およびＦＵＳ−１の遺伝子を、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子の倍量含有する構成としている。上記各遺伝子を等量に含有した遺伝子治療用組成物を使用したとき、ＭＤＭ２、ＡＫＴ１（活性型キナーゼ）、ＥＧＦＲの何れかの過剰発現が認められると、細胞増殖の抑制やアポトーシス誘導を図る必要が生ずる。ＦＵＳ−１の遺伝子を、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子の倍量含有させることにより、ＭＤＭ２の発現を抑制しｐ５３依存性のカスパーゼ経路を活性化することができ、癌細胞をアポトーシスへ誘導する事が可能となる。また、ＦＵＳ−１の増量により、ＥＧＦＲの異変による細胞増殖を抑制することが可能となるため、腫瘍増殖抑制効果が期待できる。更に、ＭＤＭ２、ＡＫＴ１、ＥＧＦＲの過剰発現はｐ５３のアポトーシス誘導の抑制による癌細胞の増殖に影響を与えるため、ｐ５３を増量することにより、ｐ５３依存性のアポトーシス誘導の活性化を図ることが可能となり、より効果的な遺伝子治療用組成物の提供が可能となる。 In still another embodiment of the present invention, the apoptosis-inducing gene of the composition for gene therapy contains a p53 gene and a FUS-1 gene in double amounts of the TRAIL gene and the IL-24 gene. It is said. When a gene therapy composition containing equal amounts of each of the above genes is used, if overexpression of MDM2, AKT1 (active kinase), or EGFR is observed, it is necessary to suppress cell proliferation or induce apoptosis Will occur. By containing the FUS-1 gene twice as much as the TRAIL gene and the IL-24 gene, the expression of MDM2 can be suppressed and the p53-dependent caspase pathway can be activated, leading to apoptosis of cancer cells. It becomes possible to do. In addition, an increase in FUS-1 makes it possible to suppress cell growth due to EGFR abnormalities, and thus a tumor growth inhibitory effect can be expected. Furthermore, since overexpression of MDM2, AKT1, and EGFR affects the growth of cancer cells by inhibiting the induction of apoptosis by p53, it is possible to activate p53-dependent apoptosis induction by increasing the amount of p53. Thus, it is possible to provide a more effective composition for gene therapy.
更にまた、本発明に係る遺伝子治療用組成物のアポトーシス誘導遺伝子は、ｐ５３の遺伝子、ＦＵＳ−１の遺伝子およびＴＲＡＩＬの遺伝子を、ＩＬ−２４の遺伝子の倍量含有する構成とすることが可能である。前記遺伝子治療用組成物を使用したとき、ＢＣＬ２の過剰発現が認められると、抗アポトーシス活性を抑制する必要が生じる。このため、ｐ５３およびＦＵＳ−１の遺伝子を倍量含有させることにより、前述のように、癌細胞をアポトーシスへ誘導する事が可能となるとともに、腫瘍増殖抑制効果が期待できる。更に、ＴＲＡＩＬの遺伝子を倍量含有することにより、非ｐ５３依存性のアポトーシス誘導の活性化を図ることが可能となり、より効果的な遺伝子治療用組成物の提供が可能となる。 Furthermore, the apoptosis-inducing gene of the gene therapy composition according to the present invention can be configured to contain a p53 gene, a FUS-1 gene, and a TRAIL gene in double the amount of the IL-24 gene. is there. When overexpression of BCL2 is observed when the gene therapy composition is used, it is necessary to suppress anti-apoptotic activity. For this reason, by containing double amounts of the genes of p53 and FUS-1, cancer cells can be induced to apoptosis as described above, and a tumor growth inhibitory effect can be expected. Furthermore, by containing a double amount of the TRAIL gene, non-p53-dependent activation of apoptosis induction can be achieved, and a more effective gene therapy composition can be provided.
また、本発明に係る遺伝子治療用組成物のアポトーシス誘導遺伝子は、ｐ５３の遺伝子を、ＦＵＳ−１の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子の倍量含有する構成とすることが可能である。前記遺伝子治療用組成物を使用した際に、ＡＰＣ遺伝子のメチル化や、癌抑制遺伝子であるＢＲＣＡ−１やＢＲＣＡ−２の変異が認められると、ｐ５３依存性のアポトーシス活性を高める必要が生ずる。このため、ｐ５３の遺伝子を他に比して倍量含有させることにより、ｐ５３依存性のアポトーシス誘導の活性化を図ることが可能となる。この場合、ｐ５３の遺伝子は、他の遺伝子と比べて２倍以上含有することが望ましい。 In addition, the apoptosis-inducing gene of the gene therapy composition according to the present invention can be configured such that the p53 gene contains double the amount of the FUS-1 gene, TRAIL gene, and IL-24 gene. . When methylation of the APC gene or mutation of BRCA-1 or BRCA-2 that is a tumor suppressor gene is observed when the gene therapy composition is used, it is necessary to enhance p53-dependent apoptotic activity. Therefore, p53-dependent activation of apoptosis induction can be achieved by containing a p53 gene in a double amount compared to the others. In this case, it is desirable that the p53 gene is contained twice or more in comparison with other genes.
また、本発明に係る遺伝子治療用組成物のアポトーシス誘導遺伝子は、ＦＵＳ−１の遺伝子を、ｐ５３の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子の２倍乃至５倍量含有する構成とすることが可能である。前記遺伝子治療用組成物を使用した際に、ＲＡＳ（Ｈ−ＲＡＳ、Ｋ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ）、ＭＡＰ２Ｋ５、ＭＡＰ３Ｋ１０、ＲＡＦ（Ｂ−ＲＡＦ、Ａ−ＲＡＦ）の何れかの過剰発現が認められると、ＭＡＰＫ経路を通じた癌細胞の増殖を抑制する必要が生ずる。このため、上記過剰発現した数に応じてＦＵＳ−１を２倍乃至５倍量含有する構成となっている。本実施例では、１個の過剰発現で２倍、３個までの過剰発現で３倍、５個までの過剰発現で４倍、５個を超える過剰発現で５倍へ増量する構成である。これにより、腫瘍増殖抑制効果が期待できる。 In addition, the apoptosis-inducing gene of the gene therapy composition according to the present invention is configured to contain the FUS-1 gene in an amount twice to five times that of the p53 gene, TRAIL gene, and IL-24 gene. Is possible. When the gene therapy composition is used, overexpression of any of RAS (H-RAS, K-RAS, N-RAS), MAP2K5, MAP3K10, RAF (B-RAF, A-RAF) is observed. Then, it is necessary to suppress the growth of cancer cells through the MAPK pathway. For this reason, it is the structure which contains 2 to 5 times amount of FUS-1 according to the said overexpressed number. In the present example, the amount is increased by 2 times by 1 overexpression, 3 times by 3 overexpression, 4 times by 5 overexpression, 5 times by 5 or more overexpression. Thereby, the tumor growth inhibitory effect can be expected.
また、本発明に係る遺伝子治療用組成物のアポトーシス誘導遺伝子は、ＩＬ−２４の遺伝子を、ｐ５３の遺伝子、ＦＵＳ−１の遺伝子およびＴＲＡＩＬの遺伝子の倍量含有する構成とすることが可能である。本実施例では、前記遺伝子治療用組成物を使用した際に、ＶＥＧＦ−Ａの過剰発現が認められると、血管新生抑制作用が期待できるため、ＩＬ−２４の遺伝子を倍量含有する構成となっている。これにより、血管の新生による癌組織の成長や転移を防ぐことが可能となる。また、ＩＬ−２４の遺伝子はメラノーマに対する抗腫瘍効果を発揮することから、ＩＬ−２４の遺伝子を倍量含有することにより、癌細胞のアポトーシス誘導や腫瘍増殖抑制効果が期待できる。 In addition, the apoptosis-inducing gene of the gene therapy composition according to the present invention can be configured so that the IL-24 gene contains double the amount of the p53 gene, the FUS-1 gene, and the TRAIL gene. . In this example, when an overexpression of VEGF-A is observed when the gene therapy composition is used, an anti-angiogenic action can be expected, so that the composition of IL-24 is doubled. ing. This makes it possible to prevent the growth and metastasis of cancer tissue due to the neovascularization. In addition, since the IL-24 gene exerts an antitumor effect against melanoma, it can be expected to induce apoptosis of cancer cells and suppress tumor growth by containing twice the amount of the IL-24 gene.
また、本発明に係る遺伝子治療用組成物のアポトーシス誘導遺伝子は、ＦＵＳ−１の遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子を、ｐ５３の遺伝子およびＴＲＡＩＬの遺伝子の倍量含有する構成である。ＦＵＳ−１およびＩＬ−２４の遺伝子は、肺癌や乳癌に対する抗腫瘍効果が期待できる。そのため、本実施例では、臨床診断名が肺癌および／または乳癌である場合、ＦＵＳ−１およびＩＬ−２４の遺伝子を倍量含有する構成となっている。これにより、特に肺癌および乳癌に対する癌細胞のアポトーシス誘導や腫瘍増殖抑制効果が期待できる。 Moreover, the apoptosis-inducing gene of the gene therapy composition according to the present invention is configured to contain FUS-1 gene and IL-24 gene in double amounts of p53 gene and TRAIL gene. The FUS-1 and IL-24 genes can be expected to have an antitumor effect on lung cancer and breast cancer. For this reason, in this example, when the clinical diagnosis name is lung cancer and / or breast cancer, the FUS-1 and IL-24 genes are contained in double amounts. As a result, cancer cell apoptosis induction and tumor growth-suppressing effects can be expected particularly for lung cancer and breast cancer.
また、本発明に係る遺伝子治療用組成物のアポトーシス誘導遺伝子は、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子を、ｐ５３の遺伝子およびＦＵＳ−１の遺伝子の倍量含有する構成とすることが可能である。転移巣がある場合や放射線療法を併用している場合、本実施例では、ＴＲＡＩＬおよびＩＬ−２４の遺伝子を倍量含有する構成となっている。この構成とする事により、血管新生抑制作用が期待できるとともに、放射線療法への感受性を上げることが可能になるという効果があるため、癌が進行した場合において、より効果的な癌細胞のアポトーシス誘導や腫瘍増殖抑制効果が期待できる。 Further, the apoptosis-inducing gene of the gene therapy composition according to the present invention can be configured to contain TRAIL gene and IL-24 gene in double amounts of p53 gene and FUS-1 gene. . When there is a metastatic lesion or when radiotherapy is used in combination, this example is configured to contain double amounts of TRAIL and IL-24 genes. By adopting this structure, an anti-angiogenic action can be expected, and the sensitivity to radiation therapy can be increased. Therefore, more effective cancer cell apoptosis induction when cancer has progressed. And tumor growth inhibitory effect.
また、本発明に係る遺伝子治療用組成物のアポトーシス誘導遺伝子は、ｐ５３の遺伝子およびＴＲＡＩＬの遺伝子を、ＦＵＳ−１の遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子の倍量含有する構成とすることが可能である。この構成とすることにより、化学療法との併用による抗腫瘍効果が期待できるとともに、副作用を軽減することが可能となる。 Further, the apoptosis-inducing gene of the gene therapy composition according to the present invention can be configured to contain a p53 gene and a TRAIL gene in double amounts of the FUS-1 gene and the IL-24 gene. . With this configuration, it is possible to expect an antitumor effect in combination with chemotherapy, and to reduce side effects.
本発明に係る遺伝子治療用組成物は、更にｐ１６の遺伝子および＼またはｐ２１の遺伝子を含有する構成とすることが可能である。ｐ１６の遺伝子は、癌抑制遺伝子であり、細胞周期の調整に重要な役割を果たす。ｐ１６の遺伝子の変異は、様々な癌、特にメラノーマの発生のリスクを高める。また、ｐ２１の遺伝子は、細胞周期の回転に影響を与えるサイクリン依存性キナーゼを阻害して細胞周期が進行するのを阻害する遺伝子である。これらを他の遺伝子と等量含有することにより、癌細胞のアポトーシス誘導や腫瘍増殖抑制効果が期待できる。 The composition for gene therapy according to the present invention can further comprise a p16 gene and / or a p21 gene. The gene for p16 is a tumor suppressor gene and plays an important role in the regulation of the cell cycle. Mutations in the p16 gene increase the risk of developing various cancers, particularly melanoma. In addition, the p21 gene is a gene that inhibits the progression of the cell cycle by inhibiting a cyclin-dependent kinase that affects the rotation of the cell cycle. By containing these in the same amount as other genes, apoptosis induction of tumor cells and tumor growth inhibitory effect can be expected.
本発明に係る遺伝子治療用組成物は、遺伝子治療用リポソームベクターによってカプセル化した構成とすることが可能である。本発明の遺伝子治療用組成物は、非ウイルスベクターであるリポソームによってカプセル化され、ターゲットである癌細胞に直接導入される構成となっている。 The composition for gene therapy according to the present invention can be configured to be encapsulated by a liposome vector for gene therapy. The gene therapy composition of the present invention is encapsulated by liposomes, which are non-viral vectors, and is directly introduced into target cancer cells.
遺伝子治療用リポソームベクターは、カチオン性脂質およびヘルパー脂質のリポソームからなり、内部空洞を有する単層薄膜の化合物によって構成されるカプセル状のベクターからなる。このリポソームは、本実施例では、直径７０ｎｍ乃至１００ｎｍ未満となっており、内空は平均５０ｎｍとなっている。この内部空洞にはプラスミドまたは遺伝子治療用組成物等の遺伝子が格納される構成である。 The liposome vector for gene therapy is composed of a cationic lipid and a helper lipid liposome, and is composed of a capsule-shaped vector composed of a monolayer thin film compound having an internal cavity. In this example, the liposome has a diameter of 70 nm to less than 100 nm, and the inner space has an average of 50 nm. In this internal cavity, a gene such as a plasmid or a composition for gene therapy is stored.
上記リポソームの単層膜には、リガンドが付着されている。これにより、特定のレセプター（癌細胞）への結合が期待でき、より効果的に遺伝子治療用組成物をターゲットである癌細胞へ導入することが可能となる。 A ligand is attached to the monolayer membrane of the liposome. Thereby, binding to a specific receptor (cancer cell) can be expected, and the composition for gene therapy can be more effectively introduced into the target cancer cell.
このリポソームは、本実施例では、少なくともジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロールを含有しており、これらによる膜融合を助けるための脂質としてカチオンで形成されている。その他、ホスファジルエタノールアミン等を含有する構成とすることが可能である。 In this example, the liposome contains at least dioleoylphosphatidylethanolamine and dimethylaminoethanecarbamoylcholesterol, and is formed with a cation as a lipid for assisting membrane fusion by these. In addition, it is possible to have a configuration containing phosphadylethanolamine or the like.
この構成とすることにより、遺伝子治療用組成物の安定性を確保することが可能となるとともに、細胞外のあらゆる障害から遺伝子治療用組成物を保護することが可能となり、確実にターゲットである癌細胞に治療用ＤＮＡまたはＲＮＡ（遺伝子治療用組成物）を導入することが可能となる。 With this configuration, the stability of the gene therapy composition can be ensured, and the gene therapy composition can be protected from any disorder outside the cell, which is surely the target cancer. It becomes possible to introduce therapeutic DNA or RNA (a composition for gene therapy) into cells.
本発明に係る遺伝子治療用組成物は、更に、癌原遺伝子をプラスミド化した遺伝子を含有させる構成とすることが可能である。遺伝子診断で得た癌原遺伝子をプラスミド化する事によりプラスミドが細胞の核内に取り込まれ、ＤＮＡから転写・翻訳のプロセスを経て内在性抗原としてタンパク質が生成される。その後、ＭＨＣクラス１分子によって抗原提示され、癌細胞の拒絶が起こり、キラーＴ細胞による細胞障害がおこる。また、内在性抗原としてのタンパクを持った細胞がアポトーシスを起こし、内在性抗原が細胞外へ放出されることにより、樹状細胞などの貪食細胞によって貪食され、ＭＨＣクラス２分子を介してヘルパーＴ細胞に提示される。これにより、キラーＴ細胞やマクロファージの活性化および抗体の量産が行われることになり、いわゆるＤＮＡワクチンとして癌細胞の減少や腫瘍増殖抑制効果が期待できる。
The composition for gene therapy according to the present invention may further comprise a gene obtained by converting a proto-oncogene into a plasmid. By converting the proto-oncogene obtained by genetic diagnosis into a plasmid, the plasmid is incorporated into the nucleus of the cell, and a protein is produced as an endogenous antigen from DNA through a transcription / translation process. Thereafter, antigens are presented by
また、遺伝子治療用組成物として更にサイトカイン遺伝子を含有させることが可能である。サイトカイン遺伝子として、本実施例では、ＩＬ−１２の遺伝子またはＩＬ−１８の遺伝子を含有する構成となっている。ＩＬ−１２は、Ｔ細胞や自然免疫の主要因子として働くナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）に対して細胞増殖の促進、細胞障害活性誘導などの作用を示す。このような細胞性免疫機能の役割を有することから、ＩＬ−１２は、感染防御や抗癌療法、免疫不全症の改善などにおいて効果が期待できる。 Moreover, it is possible to further contain a cytokine gene as a gene therapy composition. In this example, the cytokine gene contains an IL-12 gene or an IL-18 gene. IL-12 exhibits effects such as cell proliferation promotion and cytotoxic activity induction on T cells and natural killer cells (NK cells) that act as a major factor of innate immunity. Since it has such a role of cellular immune function, IL-12 can be expected to be effective in infection protection, anticancer therapy, improvement of immune deficiency, and the like.
また、ＩＬ−１８は、毒物刺激に応答するＩＮＦ−γの量産に関連する遺伝子であり、マクロファージを刺激して細菌を貪食殺菌させるものでもある。このような役割を有するため、ＩＬ−１８は、感染防御、抗癌療法などにおいて効果が期待できる。 IL-18 is a gene associated with mass production of INF-γ that responds to toxic stimulation, and stimulates macrophages to phagocytose bacteria. Since it has such a role, IL-18 can be expected to be effective in infection protection and anticancer therapy.
ＮＫ細胞は、ＩＬ−１２やＩＬ−１８のようなサイトカインの刺激により、Ｆａｓリガンドを発現する。Ｆａｓリガンドは、標的細胞の膜を貫通するＦａｓ受容体を三量体化することでシグナルを伝達することによりアポトーシスを誘導するサイトカインであり、細胞死誘導性のＴＨＦ受容体ファミリー分子でありＦａｓを発現している腫瘍細胞にアポトーシスを誘起する。すなわち、癌細胞の減少および腫瘍増殖抑制効果が期待できる。 NK cells express Fas ligand upon stimulation of cytokines such as IL-12 and IL-18. Fas ligand is a cytokine that induces apoptosis by transducing a signal by trimerizing a Fas receptor that penetrates the membrane of a target cell, and is a cell death-inducing THF receptor family molecule. Induces apoptosis in expressing tumor cells. That is, a reduction in cancer cells and a tumor growth inhibitory effect can be expected.
本発明に係る遺伝子治療用組成物は、ＮＫ細胞とともに導入することにより、より高い効果が期待できることが分かっている。ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラス１分子の発現低下のためＴ細胞による免疫監視を逃れる異常細胞を選択的に除去する。しかしながら、ＭＨＣクラス１分子を発現していない一部の腫瘍細胞株や正常細胞は必ずしもＮＫ感受性ではないため、通常のＮＫ細胞を培養して癌細胞に導入しても、抗腫瘍効果という面では、ＮＫ細胞は活性化しない虞があった。本実施例では、遺伝子診断に基づき、体外で癌原遺伝子をＮＫ細胞に導入することで、癌細胞に発現しているタンパク（癌抗原、リガンド）に対する表面レセプターをＮＫ細胞に発現でき、例え癌細胞がＭＨＣクラス１分子を持っていたとしても、活性化ＮＫ受容体リガンドに結合する受容体が発現することになるため、ＮＫ細胞は特異的に癌細胞を殺傷することが可能となり、より効果的に癌細胞の減少や腫瘍増殖抑制を行う事ができる。
It has been found that the gene therapy composition according to the present invention can be expected to have a higher effect when introduced together with NK cells. NK cells selectively remove abnormal cells that escape immune surveillance by T cells due to decreased expression of
本発明に係る遺伝子治療用組成物は、更に、樹状細胞とともに導入することが可能である。樹状細胞は抗原提示細胞として機能する免疫細胞の一種であり、自分が取り込んだ抗原を他の免疫系の細胞に伝える役割をもっている。抗原を取り込むと樹状細胞は活性化し、リンパ節や脾臓などの二次リンパ器官に移動する。リンパ器官では、取り込んだ抗原に特異的なＴ細胞を活性化する。この活性化は効率的であるため、Ｔ細胞の活性化において、樹状細胞はマクロファージよりも優れていると言える。本実施例では、遺伝子診断により得られた癌原遺伝子を抗原として、プラスミドをリポソームに入れて樹状細胞へ導入している。これにより、癌組織の摘出が不要となるという利点がある。 The composition for gene therapy according to the present invention can be further introduced together with dendritic cells. Dendritic cells are a type of immune cell that functions as an antigen-presenting cell, and have a role of transmitting the antigen taken up to cells of other immune systems. When antigen is taken up, dendritic cells are activated and migrate to secondary lymphoid organs such as lymph nodes and spleen. In lymphoid organs, T cells specific for the incorporated antigen are activated. Since this activation is efficient, it can be said that dendritic cells are superior to macrophages in activating T cells. In this example, a proto-oncogene obtained by genetic diagnosis is used as an antigen, and a plasmid is placed in a liposome and introduced into dendritic cells. This has the advantage that it is not necessary to remove the cancer tissue.
本発明に係る遺伝子治療用組成物は、上記ＮＫ細胞または樹状細胞と一緒に導入することが可能であり、ＮＫ細胞および樹状細胞の両方とともに導入することも可能である。また、更に癌原遺伝子をプラスミド化した遺伝子（ＤＮＡワクチン）やサイトカイン遺伝子とともに導入することで、高い抗腫瘍効果が期待できる。 The gene therapy composition according to the present invention can be introduced together with the NK cell or dendritic cell, and can be introduced together with both the NK cell and the dendritic cell. Furthermore, a high antitumor effect can be expected by introducing a proto-oncogene together with a plasmided gene (DNA vaccine) or cytokine gene.
次に、本発明に係る遺伝子治療用組成物のベクターとなる遺伝子治療用リポソームの生成方法を、以下説明する。
遺伝子治療用リポソームは、混合工程と、被膜生成工程と、真空工程と、再懸濁工程と、培養工程と、超音波工程と、形成工程とからなる。混合工程は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロールをクロロホルム中で混合して脂質溶液を生成する工程である。これにより脂質溶液が生成される。Next, a method for producing a liposome for gene therapy that serves as a vector of the composition for gene therapy according to the present invention will be described below.
The liposome for gene therapy consists of a mixing process, a film production process, a vacuum process, a resuspension process, a culture process, an ultrasonic process, and a formation process. The mixing step is a step in which dioleoylphosphatidylethanolamine and dimethylaminoethanecarbamoylcholesterol are mixed in chloroform to form a lipid solution. This produces a lipid solution.
生成された脂質溶液は、次の被膜生成工程においてＮ２ガスブローによって乾燥する。これにより、薄膜が生成される。次の真空工程で、被膜生成工程において乾燥生成された薄膜を真空維持する。本実施例では、容器の開口部が覆われている状態で５時間真空状態を維持している。 The produced lipid solution is dried by N2 gas blowing in the next film production step. Thereby, a thin film is produced | generated. In the next vacuum process, the thin film dried and produced in the film production process is maintained in vacuum. In this embodiment, the vacuum state is maintained for 5 hours while the opening of the container is covered.
真空維持した薄膜は、再懸濁工程において懸濁化を行う。再懸濁は、本実施例では、水またはデキストロースまたはボルテックスの何れかを薄膜に添加することにより行っている。懸濁した懸濁体は、培養工程において培養する。本実施例では、４℃で２４時間培養する事としているが、これに限定されることはなく培養時間を適宜変更することが可能である。なお、本実施例では、この培養工程を行う事なく、次の超音波工程へ移行することが可能である。 The thin film kept in vacuum is suspended in a resuspension step. In this example, resuspension is performed by adding either water or dextrose or vortex to the membrane. The suspended suspension is cultured in the culture process. In this example, the culture is performed at 4 ° C. for 24 hours. However, the culture time is not limited to this, and the culture time can be appropriately changed. In this embodiment, it is possible to move to the next ultrasonic step without performing this culture step.
超音波工程では、懸濁液または培養工程を経て培養した懸濁液からリポソームを形成するために超音波照射処理を行う。超音波照射を行う事により、生成するリポソームのサイズを制御することが可能となる。本実施例では、２００ｎｍ（ナノメートル）のリポソームを形成することが可能となっている。形成工程では、リポソームの更なるサイズの制御を行うため、生成するサイズを決定した後、生成するリポソームのサイズと同寸のポリカーボネートフィルターによりリポソームを押出し形成する。本実施例では、リポソームの押出し形成時に温度管理を行っている。この工程により、単層リポソームが生成可能となる。なお、本実施例では、生成されたリポソームのサイズは、１００ｎｍ（ナノメートル）未満となっている。 In the ultrasonic process, ultrasonic irradiation treatment is performed to form liposomes from the suspension or the suspension cultured through the culture process. By performing ultrasonic irradiation, it is possible to control the size of the generated liposome. In this example, it is possible to form liposomes of 200 nm (nanometers). In the forming step, in order to further control the size of the liposome, after determining the size to be produced, the liposome is extruded and formed through a polycarbonate filter having the same size as the size of the liposome to be produced. In this example, temperature control is performed during the extrusion formation of liposomes. This step makes it possible to produce unilamellar liposomes. In the present example, the size of the generated liposome is less than 100 nm (nanometers).
この遺伝子治療用リポソームの生成方法により、遺伝子治療用組成物のベクターとしてのリポソームを確実に生成することが可能となり、遺伝子治療用組成物をターゲットである癌細胞に導入することを容易とすることが可能となった。 This gene therapy liposome production method makes it possible to reliably produce liposomes as vectors for gene therapy compositions, and facilitate introduction of gene therapy compositions into target cancer cells. Became possible.
Claims (17)
前記アポトーシス誘導遺伝子は、ｐ５３の遺伝子、ＦＵＳ−１の遺伝子、ＴＲＡＩＬの遺伝子およびＩＬ−２４の遺伝子からなることを特徴とする遺伝子治療用組成物。In a gene therapy composition for preventing and / or treating cancer, wherein the antitumor gene comprises an apoptosis-inducing gene,
The gene therapy composition, wherein the apoptosis-inducing gene comprises a p53 gene, a FUS-1 gene, a TRAIL gene, and an IL-24 gene.
生成された前記溶液を乾燥して薄膜を生成する被膜生成工程と、
生成された前記薄膜を真空維持する真空工程と、
前記薄膜を水またはデキストロースまたはボルテックスを添加して再懸濁する再懸濁工程と、
前記懸濁した懸濁体を４℃で培養する培養工程と、
前記懸濁液または培養した懸濁液からリポソームを形成するために超音波照射処理を行う超音波工程と、
生成するリポソームのサイズと同寸のポリカーボネートフィルターによりリポソームを押出し形成する形成工程と、
からなることを特徴とする遺伝子治療用リポソームの形成方法。
A mixing step of mixing dioleoylphosphatidylethanolamine and dimethylaminoethanecarbamoylcholesterol in chloroform to form a lipid solution;
A film production step of drying the produced solution to produce a thin film;
A vacuum process for maintaining the generated thin film in vacuum;
A resuspension step of resuspending the membrane by adding water or dextrose or vortex;
A culture step of culturing the suspended suspension at 4 ° C .;
An ultrasonic step of performing ultrasonic irradiation treatment to form liposomes from the suspension or the cultured suspension;
A forming process in which the liposome is extruded by a polycarbonate filter having the same size as the liposome to be produced;
A method for forming a liposome for gene therapy, comprising:
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